DE3650513T2

DE3650513T2 - Verzögerter immunologischer Test in fester Phase

Info

Publication number: DE3650513T2
Application number: DE3650513T
Authority: DE
Inventors: Richard Zahradnik
Original assignee: Nichols Institute Diagnostics
Current assignee: NICHOLS INSTITUTE DIAGNOSTICS SAN JUAN CAPISTRANO
Priority date: 1985-05-07
Filing date: 1986-05-06
Publication date: 1997-09-04
Anticipated expiration: 2006-05-07
Also published as: PT82517B; US4935339A; ATE137022T1; ES554741A0; ES8801865A1; PT82517A; ES8802346A1; AU591667B2; ES557705A0; GR861176B; DK212986D0; CA1286605C; EP0201079B1; EP0201079A3; DE3650513D1; AU5704686A; JPS6230963A; DK212986A; EP0201079A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen immunologischen Test, wobei ein Antigen/Antikörper-Immunkomplex gebildet wird, der unter Einsatz einer Biotin/Avidin-Assoziationsreaktion isoliert wird.
Immunologische Tests zum Nachweis von antigenen Substanzen oder Antikörpern in Proben sind bekannt. Z.B. offenbart Chu (US-Patent 4 289 747) einen immunometrischen Test (auch als "Sandwich-Test" bekannt) zum Nachweis verschiedener Stoffe in Körperflüssigkeiten. Bei dem im Patent von Chu beschriebenen Test werden nicht-spezielle ("unrestricted") polyclonale Antiseren von unterschiedlichen Arten eingesetzt, die mit der bestimmten antigenen Substanz ein Sandwich bilden. Anschließend wird das Sandwich aus der Lösung mittels einer Lectin/Zucker-Assoziationsreaktion entfernt. Bei dem Test wird insbesondere die geringe Bindungsaffinität zwischen Lectin und Zucker ausgenutzt, wodurch eine reversible Freisetzung des Immunkomplexes von der festen Phase, an die das Lectin oder der Zucker gebunden ist, erfolgen kann. Die Tests werden in Simultan-, Umkehr-Ausführung und in einer Ausführung mit aufeinanderfolgenden Schritten beschrieben.
Wolters et al., US-Patent 4 343 896, beschreiben auch einen Sandwich-Test. Das Sandwich wird in flüssiger Phase zwischen einem bestimmten Antigen und den in zwei verschiedenen Arten gegen dieses Antigen hervorgerufenen Antikörpern erzeugt. Die Reaktion zwischen diesen beiden Gruppen von Antikörpern, von denen eine markiert ist, und dem Antigen findet in flüssiger Phase statt, anschließend wird das Ganze mit einer Festphasen-Matrix in Kontakt gebracht, an die ein zweiter Antikörper (Anti-Globulin) gebunden ist, der mit den den Immunkomplex bildenden unmarkierten Antikörpern reagiert.
In Parikh et al., US-Patent 4 298 685, wird ein Test vom Nicht-Sandwich-Typ beschrieben, wobei Biotin und Avidin verwendet werden. Dieses Patent offenbart einen Kompetitionstest, wobei ein möglicherweise vorliegendes Antigen mit einem Enzymmarkierten Antigen um Bindungsstellen auf einem biotinylierten Antikörper konkurriert. Nach Inkubation dieser Reagenzien wird die flüssige Phase mit einer festen Phase, an die Avidin gebunden ist, in Kontakt gebracht, wodurch die Antikörper/Antigen-Komplexe aus der flüssigen Phase entfernt werden können.
Ein weiteres Beispiel eines Sandwich-Immuntests wird in David et al., US-Patent 4 376 110, beschrieben. Im hier beschriebenen Test werden zwei unterschiedliche monoclonale Antikörper aus zwei verschiedenen Hybridomen eingesetzt. Die David-Technik umfaßt einen monoclonalen Antikörper, der während des ganzen Tests an die feste Phase gebunden ist und nicht in einer homogenen Phase verwendet wird. Der monoclonale Antikörper 1 der festen Phase wird mit der flüssigen Phase umgesetzt, wobei das möglicherweise vorliegende Antigen nachgewiesen wird. Ein monoclonaler Antikörper 2, der markiert ist und in flüssiger Phase gelöst vorliegt, erzeugt in Gegenwart des Antigens einen Sandwich zwischen dem monoclonalen Antikörper 1 der festen Phase, dem Antigen und dem markierten monoclonalen Antikörper 2.
Katz et al., US-Patent 4 496 654, beschreiben ein Verfahren, in dem die Biotin-Avidin-Reaktion eingesetzt wird, um Antikörper fest an ein Festphasen-Substrat zu binden. Dieses Patent beschreibt die Beschichtung einer Avidin-behandelten festen Phase mit biotinyliertem Antikörper gegen ein spezifisches Antigen. Diese Antikörper-beschichtete feste Phase wird sodann mit einer Probe umgesetzt, die das spezifische Antigen und löslichen markierten Antikörper gegen das spezifische Antigen enthält. Nach der Inkubation wird der markierte Antikörper gemessen, der an die feste Phase gebunden oder in Lösung verblieben ist.
In Gallati et al., britische Patentanmeldung GB-2 074 727A, werden Sandwich-Tests beschrieben, die in flüssiger Phase zwischen (1) zwei monoclonalen Antikörpern, die für zwei unterschiedliche Epitope des gleichen Antigens spezifisch sind, und (2) einem monoclonalen Antikörper und polyclonalen Antikörpern, die in einer anderen Art gegen das gleiche Antigen hervorgerufen wurden, und (3) polyclonalen Antikörpern, die in zwei verschiedenen Arten hervorgerufen wurden und die gegen unterschiedliche Epitope des gleichen Antigens gerichtet sind, stattfinden können.
Ein Test zur Bestimmung von Allergen-spezifischem menschlichem IgE wird in Bennich et al., US-Patent 3 720 760, offenbart. Dieses Patent beschreibt einen Test, wobei eine Probe zuerst mit einer festen Phase, an die ein spezifisches Allergen gebunden ist, in Kontakt gebracht wird und sodann ein radioaktiv iodiertes Anti-Globulin gegen menschliches IgE zugegeben wird.
Die vorstehend beschriebenen Immuntests lassen sich in zwei Hauptkategorien einteilen. Die erste Kategorie umfaßt die Immuntests (David, Bennich, Katz), bei denen ein Partner des Bindungspaares, entweder ein Antigen oder ein Antikörper, an eine feste Phase gebunden ist, und ein zweiter Bindungspartner, der markiert ist, üblicherweise ein Antikörper, in der flüssigen Phase vorliegt. Wenn die Probe den nachzuweisenden Stoff enthält, wird ein Komplex gebildet, der aus dem ersten Bindungspartner der festen Phase, dem nachzuweisenden Stoff und dem nachweisbar markierten zweiten Bindungspartner zusammengesetzt ist. Zur zweiten Kategorie (Chu, Wolters, Gallati) zählen die Immuntests, bei denen der erste und zweite Bindungspartner beide in der flüssigen Phase frei reagieren, wodurch ein Immunkomplex erzeugt wird, sofern die Probe den nachzuweisenden Stoff enthält. Dieser Immunkomplex wird sodann aus der flüssigen Phase entfernt, indem einer der Bindungspartner an einen Träger gebunden wird, der so modifiziert ist, daß er den Immunkomplex binden kann. Dieser zweite Typ von Immuntest, bei dem anfangs keiner der Bindungspartner an eine feste Phase gebunden ist, wird hier als "Test mit verzögerter Bindung an die feste Phase" ("Delayed Solid Phase", DESP) bezeichnet. Solche Tests werden z.B. in DE-A-2 951 678 beschrieben, das die Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Lösung durch Enzymimmuntest mittels eines Lectins offenbart. US-A-4 228 237 beschreibt Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium unter Verwendung des Biotin-Avidin-Systems, wobei der nachzuweisende Ligand mit einer unlöslichen Phase in Kontakt gebracht wird, die eine für den Liganden spezifische bindende Substanz enthält.
Ein Hauptproblem der DESP-Tests nach dem Stand der Technik besteht darin, daß bei diesen Systemen als der erste und zweite Bindungspartner in flüssiger Phase nicht-spezielle polyclonale Antikörper verwendet werden. Als Folge kompetieren diese zwei Antikörper-Populationen häufig um dieselben Bindungsstellen (Epitope) auf dem Antigen in Lösung und vermindern dadurch insgesamt die Empfindlichkeit des Tests. Ein weiteres Problem bei diesen DESP-Immuntests nach dem Stand der Technik besteht darin, daß die Ligand-Reaktion, die zur Entfernung des Immunkomplexes aus der Lösung verwendet wird, nur eine geringe bis mittlere Affinität aufweist.
Keiner der im Stand der Technik beschriebenen DESP-Tests offenbart ein System, in dem ein monoclonaler Antikörper als erster Bindungspartner und ein nachweisbar markierter zweiter Bindungspartner, der ein polyclonaler Antikörper mit spezieller Spezifität ist, verwendet werden und wobei dieser Immunkomplex mittels eines Liganden mit hoher Affinität aus der flüssigen Phase entfernt wird.
In der vorliegenden Erfindung ist Biotin oder ein Biotinbindendes Protein an den ersten Bindungspartner gebunden, der während des ersten Teils des Tests in Lösung bleibt. Wenn der Test so durchgeführt wird, daß der erste Bindungspartner immobilisiert wird, bevor er in flüssiger Phase mit dem nachzuweisenden Stoff und dem zweiten Bindungspartner umgesetzt wird, ist die Empfindlichkeit des Tests viel geringer als wenn der biotinylierte (oder an Biotin-bindendes Protein gebundene) erste Bindungspartner und der markierte zweite Bindungspartner frei in Lösung vorliegen, wenn sie mit dem nachzuweisenden Stoff reagieren. Wenn man diese Reagenzien frei in Lösung miteinander reagieren läßt, erhält man bessere Reaktivitätskinetiken und einen besseren stereochemischen Zugang zu den Bindungsstellen auf dem nachzuweisenden Stoff als in einem Festphasen-System, wo die Reaktionspartner kinetisch zur festen Phase wandern müssen. Ferner wird die hohe Affinität und Spezifität der Biotin/Avidin-Reaktion genutzt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Bestimmung eines in einer Probe vorliegenden Stoffes bereit, umfassend:
(a) Inkontaktbringen einer Probe, die den Stoff enthält, mit:
(i) einem ersten immunologischen Bindungspartner für den Stoff, wobei der erste immunologische Bindungspartner an Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist,
(ii) einem zweiten immunologischen Bindungspartner für den Stoff, wobei der zweite immunologische Bindungspartner nachweisbar markiert ist, und
(iii) einem Biotin-bindenden Protein oder Biotin, an einen Träger gebunden;
(b) gleichzeitige oder getrennte Inkubation der Komponenten von Schritt (a) für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Stoff, dem ersten immunologischen Bindungspartner, dem zweiten immunologischen Bindungspartner und dem Träger ausreichend sind;
(c) Trennung des Trägers von der Probe; und
(d) Bestimmung des nachweisbar markierten zweiten immunologischen Bindungspartners entweder in der Probe oder auf dem Träger;
wobei der erste immunologische Bindungspartner einen oder mehrere monoclonale Antikörper darstellt und der zweite immunologische Bindungspartner ein bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper ist, wobei weiterhin der erste und zweite Bindungspartner mit unterschiedlichen Bereichen des Stoffes reagieren, so daß beide Partner an den Stoff binden können, und wobei die Reaktion zwischen dem ersten immunologischen Bindungspartner und dem Träger nach oder im wesentlichen gleichzeitig mit der Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem ersten immunologischen Bindungspartner und dem Stoff stattfindet.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, daß ein DESP-Test, bei dem ein monoclonaler Antikörper und ein markierter bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper eingesetzt wurden, viel empfindlicher war als ähnliche Tests, bei denen zwei unterschiedliche monoclonale Antikörper gegen unterschiedliche Epitope eingesetzt wurden, oder als Tests, bei denen nur polyclonale Antikörper als erster und zweiter Bindungspartner verwendet wurden.
Dies läßt sich auch auf einen Versuchsansatz übertragen, wobei das erste Reagens oder der erste Bindungspartner kein monoclonaler Antikörper sondern ein Antigen, wie z.B. ein Allergen, ist und der zweite Bindungspartner ein bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper ist, der für die nachzuweisende Antikörperklasse spezifisch ist.
Figur 1 zeigt die vergleichenden Reaktionskurven eines herkömmlichen Sandwich-Immuntests und eines DESP-Immuntests gemäß der vorliegenden Erfindung beim Nachweis von hGH.
Figur 2 zeigt die vergleichenden Reaktionskurven von drei verschiedenen DESP-Immuntests beim Nachweis von hGH.
Figur 3 zeigt die Empfindlichkeit von drei verschiedenen Immuntests beim Nachweis von Allergen-spezifischem menschlichem IgE.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Probe, die einen nachzuweisenden Stoff enthält, mit dem ersten Bindungspartner, dem zweiten Bindungspartner und einem Träger, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, in Kontakt gebracht. Der Stoff, der nachgewiesen werden soll, kann entweder ein Antigen oder ein Antikörper sein. Der erste und der zweite Bindungspartner reagieren jeweils mit unterschiedlichen Bereichen des Stoffes, so daß beide Partner an den Stoff binden können. Der erste Bindungspartner ist entweder an Biotin oder an ein Biotin-bindendes Protein gebunden. Dieser erste Bindungspartner ist entweder ein Antikörper, wenn der in der Probe nachzuweisende Stoff ein Antigen ist, oder eine Substanz, die durch einen Antikörper gebunden werden kann, wenn der nachzuweisende Stoff in der Probe ein Antikörper ist. Der zweite Bindungpartner ist ein nachweisbar markierter Antikörper, der für den in der Probe nachzuweisenden Stoff spezifisch ist. An den Träger ist Biotin gebunden, wenn der erste Bindungspartner mit einem Biotin-bindenden Protein verknüpft ist, oder an ihn ist ein Biotin-bindendes Protein gebunden, wenn der erste Bindungspartner mit Biotin verknüpft ist.
Es sollte so verstanden werden, daß der Begriff Biotin auch Derivate von Biotin umfaßt, wie z.B. den N-Hydroxysuccinimidester von Biotin. Der Begriff Biotin-bindendes Protein umfaßt Avidin, Streptavidin und dergleichen.
Die Bestimmung eines Stoffes in einer Probe unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in verschiedenen Ausführungsformen durchgeführt werden.
In einer ersten Ausführungsform wird eine Probe mit dem ersten und zweiten Bindungspartner inkubiert. Die Inkubation wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen fortgesetzt, die zur Umsetzung des Stoffes in der Probe und des ersten und zweiten Bindungspartners ausreichend sind. Nach der ersten Inkubation wird der Träger zum Reaktionsgemisch zugefügt und die Inkubation für einen Zeitraum durchgeführt, der zum Zustandekommen der Bindung zwischen dem Träger und dem ersten Bindungspartner ausreichend ist. Nach der zweiten Inkubation wird der Träger gewaschen, um unspezifisch gebundenen markierten Antikörper zu entfernen. Sodann wird der markierte Antikörper gemessen, der an den Träger gebunden ist oder in der Probe verbleibt. Bei Durchführung dieser Ausführungsform umfaßt das Verfahren, ausführlicher beschrieben, die folgenden Schritte:
(a) zuerst die Herstellung eines Gemisches aus der Probe und dem ersten und zweiten immunologischen Bindungspartner und Inkubation des Gemisches für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Umsetzung des nachzuweisenden Stoffes in der Probe mit dem ersten und zweiten immunologischen Bindungspartner ausreichend sind;
(b) Versetzen des Gemisches nach der Inkubationszeit von Schritt (a) mit dem Träger, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, und Inkubation des neuen Gemisches für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zum Zustandekommen der Bindung zwischen dem Träger und dem ersten immunologischen Bindungspartner ausreichend sind;
(c) Trennung des Trägers vom Gemisch; und
(d) Nachweis entweder des markierten zweiten Bindungspartners, der an den Träger gebunden ist, oder Nachweis des zweiten Bindungspartners, der nicht damit assoziiert ist.
In einer zweiten Ausführungsform wird die Probe anfangs mit dem Träger inkubiert, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, danach werden der erste und zweite immunologische Bindungspartner zugegeben, worauf eine Inkubation erfolgt. Bei Durchführung dieser Ausführungsform umfaßt das Verfahren, ausführlicher beschrieben, die folgenden Schritte:
(a) zuerst Herstellung eines Gemisches aus der Probe und dem Träger, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist;
(b) Versetzen des Gemisches von Schritt (a) mit dem ersten und zweiten immunologischen Bindungspartner und Inkubation des neuen Gemisches für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Umsetzung des nachzuweisenden Stoffes mit beiden Bindungspartner und zum Zustandekommen der Bindung zwischen dem Träger und dem ersten Bindungspartner ausreichend sind;
(c) Trennung des Trägers vom Gemisch; und
(d) Nachweis entweder des markierten zweiten Bindungspartners, der an den Träger gebunden ist, oder Nachweis des zweiten Bindungspartners, der nicht damit assoziiert ist.
In einer dritten Ausführungsform werden die Probe, der Träger, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, und der erste und zweite immunologische Bindungspartner gleichzeitig inkubiert. Diese Inkubation wird unter Bedingungen und für einen Zeitraum durchgeführt, die zur Umsetzung des nachzuweisenden Stoffes mit dem ersten und zweiten Bindungspartner und zum Zustandekommen der Bindung zwischen dem Träger und dem ersten Bindungspartner ausreichend sind.
Bei Durchführung dieser Ausführungsform umfaßt das Verfahren, ausführlicher beschrieben, die folgenden Schritte:
(a) gleichzeitige Herstellung eines Gemisches, umfassend die Probe, den Träger, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, und den ersten und zweiten immunologischen Bindungspartner;
(b) Inkubation des Gemisches von Schritt (a) für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Umsetzung des nachzuweisenden Stoffes mit beiden Bindungspartner und zum Zustandekommen der Bindung zwischen dem Träger und dem ersten Bindungspartner ausreichend sind;
(c) Trennung des Trägers vom Gemisch; und
(d) Nachweis entweder des markierten zweiten Bindungspartners, der an den Träger gebunden ist, oder Nachweis des zweiten Bindungspartners, der nicht damit assoziiert ist.
In einer vierten Ausführungsform wird die Probe anfangs mit dem Träger, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, und dem ersten immunologischen Bindungspartner inkubiert. Danach wird der Träger gewaschen, um alles ungebundene Material zu entfernen. Der zweite immunologische Bindungspartner wird sodann zugegeben und eine Inkubation für einen Zeitraum durchgeführt, der zum Zustandekommen der Bindung zwischen dem nachzuweisenden Stoff und dem zweiten immunologischen Bindungspartner ausreichend ist. Bei Durchführung dieser Ausführungsform umfaßt das Verfahren, ausführlicher beschrieben, die folgenden Schritte:
(a) zuerst Herstellung eines Gemisches aus der Probe, dem Träger, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, und dem ersten immunologischen Bindungspartner und Inkubation des Gemisches für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Umsetzung des nachzuweisenden Stoffes in der Probe mit dem ersten immunologischen Bindungspartner und zum Zustandekommen der Bindung zwischen dem Träger und dem ersten immunologischen Bindungspartner ausreichend sind;
(b) Versetzten des Gemisches von Schritt (a) mit dem zweiten immunologischen Bindungspartner und Inkubation des neuen Gemisches für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Umsetzung des nachzuweisenden Stoffes mit dem zweiten immunologischen Bindungspartner ausreichend sind;
(c) Trennung des Trägers vom Gemisch; und
(d) Nachweis entweder des markierten zweiten Bindungspartners, der an den Träger gebunden ist, oder Nachweis des zweiten Bindungspartners, der nicht damit assoziiert ist.
Es sollte beachtet werden, daß die vorstehend erwähnten Ausführungsformen auch hinsichtlich der Zugabe des Trägers, an den Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, variiert werden können. So können im ersten Ansatz der Träger und der erste immunologische Bindungspartner vor Zusatz des zweiten immunologischen Bindungspartners zu der Probe zugegeben werden; im zweiten Ansatz der Träger und der zweite immunologische Bindungspartner vor Zusatz des ersten immunologischen Bindungspartners zu der Probe zugegeben werden; im dritten Ansatz der Träger im wesentlichen gleichzeitig mit der Zugabe des ersten und zweiten immunologischen Bindungspartners zugegeben werden; und im vierten Ansatz kann der erste immunologischen Bindungspartner vor Zugabe des Trägers und des zweiten immunologischen Bindungspartners zur Probe zugegeben werden.
Die spezifischen Konzentrationen des ersten und zweiten immunologischen Bindungspartners, die Temperatur und die Inkubationszeit, äußerdem andere Testbedingungen können variiert werden, abhängig von Faktoren, wie Konzentration des Antigens in der Probe, der Natur der Probe usw.. Der Fachmann kann die wirksamen und optimalen Testbedingungen für die jeweilige Bestimmung unter Einsatz von Routineexperimenten ermitteln.
Z.B. kann der Immuntest bei 4 bis 37ºC, vorzugsweise bei 26ºC, durchgeführt werden, und jeder Inkubationsschritt kann 72 Stunden dauern.
Andere Schritte, wie z.B. Waschen, Rühren, Schütteln, Filtration oder eine Extraktion von Antigen oder Antikörper vor dem Test und dergleichen, können selbstverständlich in den Tests zusätzlich durchgeführt werden, sofern sie für eine bestimmte Situation gewünscht werden oder nötig sind.
Es gibt viele Träger, an die Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden werden kann und die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Bekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Träger kann für die erfindungsgemäßen Zwecke entweder zu einem bestimmten Grad löslich oder unlöslich sein. Der Fachmann kennt viele andere geeignete Träger für die Bindung von Biotin oder Biotin-bindenden Proteinen, oder er kann solche Träger unter Einsatz von Routineexperimenten ermitteln.
Der erste immunologische Bindungspartner kann einen oder mehrere monoclonale Antikörper oder eine Substanz, die durch einen Antikörper gebunden werden kann, darstellen und wird entweder an Biotin oder Biotin-bindende Proteine gebunden. Biotin kann an diesen Partner gebunden werden, wobei die nach dem Stand der Technik verfügbaren Techniken eingesetzt werden, wie z.B. in US-Patent Nr. 4 298 685 beschrieben.
Die Bindung von Avidin oder einem anderen Biotin-bindenden Protein an den ersten Bindungspartner kann einfach durchgeführt werden, indem herkömmliche Konjugationsverfahren eingesetzt werden, wie z.B. in Guesdon, J., et al., The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 27 (1979), 1131-1139, beschrieben.
Der zweite immunologische Bindungspartner ist ein bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper. Dieser Antikörper ist mit einem nachweisbaren Marker gekoppelt, wie z.B. einem Enzym, einem radioaktiven Isotop, einer Fluoreszenzverbindung, einer Chemilumineszenzverbindung oder einer Biolumineszenzverbindung.
Der durchschnittliche Fachmann kennt andere geeignete Marker zur Bindung an den zweiten Partner, oder er kann solche Marker anhand von Routineexperimenten ermitteln. Außerdem kann die Bindung dieser Marker an den zweiten Bindungspartner unter Verwendung von Stadardtechniken durchgeführt werden, die dem durchschnittlichen Fachmann geläufig sind.
Eine der Wege, wie der zweite immunologische Bindungspartner im Immuntest nachweisbar markiert werden kann, besteht in der Verknüpfung dieses Bindungspartners mit einem Enzym. Wenn dieses Enzym dann später mit seinem Substrat in Kontakt gebracht wird, reagiert es seinerseits mit dem Substrat, wodurch eine chemische Einheit erzeugt wird, die nachgewiesen werden kann, z.B. durch spektrophotometrische oder fluorometrische Verfahren. Beispiele von Enzymen, die zur nachweisbaren Markierung verwendet werden können, sind Malat-Dehydrogenase, Staphylococcus-Nuclease, Delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, Alpha-Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholin-Esterase.
Das Vorliegen des zweiten immunologischen Bindungspartners kann auch durch Markierung des zweiten immunologischen Bindungspartners mit einem radioaktiven Isotop nachgewiesen werden. Anschließend kann das Vorliegen des radioaktiven Isotops bestimmt werden, z.B. unter Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers. Isotope, die besonders geeignet sind, umfassen ³H, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³²P, ³&sup5;S, ¹&sup4;C, &sup5;¹Cr, ³&sup6;Cl, &sup5;&sup7;Co &sup5;&sup8;Co, &sup5;&sup9;Fe und &sup7;&sup5;Se.
Das Vorliegen des zweiten Bindungspartners kann ferner durch Markierung des zweiten Bindungspartners mit einer Fluoreszenzverbindung nachgewiesen werden. Wenn der fluoreszenzmarkierte zweite Bindungspartner einem Licht mit der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann sein Vorliegen aufgrund der Fluoreszenz des Farbstoffs nachgewiesen werden. Zu den wichtigsten Verbindungen zur Fluoreszenzmarkierung zählen Fluorescein- Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Eine andere Möglichkeit zur nachweisbaren Markierung des zweiten immunologischen Bindungspartners ist die Kopplung an eine Chemilumineszenzverbindung. Das Vorliegen des chemilumineszenzmarkierten zweiten immunologischen Bindungspartners wird sodann bestimmt, indem das Vorliegen von Lumineszenz nachgewiesen wird, die während des Ablaufs einer chemischen Reaktion auftritt. Beispiele von besonders nützlichen Verbindungen zur Chemilumineszenzmarkierung sind Luminol, Isoluminol, aromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalsäureester.
Genauso kann auch eine Biolumineszenzverbindung zur Markierung des zweiten immunologischen Bindungspartners eingesetzt werden. Biolumineszenz ist eine besondere Art von Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen vorkommt und wobei ein katalytisches Protein die Wirksamkeit der Chemilumineszenz-Reaktion erhöht. Das Vorliegen eines biolumineszierenden zweiten Bindungspartners kann durch Nachweis der Lumineszenz bestimmt werden. Wichtige Biolumineszenzverbindungen zur Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Für den erfindungsgemäßen Zweck kann der durch den Immuntest nachzuweisende Stoff in biologischen Flüssigkeiten und Geweben, außerdem in Proben vorliegen, die aus der Umwelt oder aus ökologischen Quellen stammen.
Jede Probe, die eine nachweisbare, noch unbekannte Menge eines Antigens oder Antikörpers enthält, kann eingesetzt werden. Normalerweise ist die Probe eine Flüssigkeit (wie z.B. Urin, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Blut, Serum und dergleichen) oder ein Feststoff oder ein halbfester Stoff (wie z.B. Gewebe, Fäces und dergleichen).
Wenn im erfindungsgemäßen Verfahren der erste und zweite Bindungspartner Antikörper sind, sollte der nachzuweisende Stoff mindestens zwei epitope Determinanten umfassen. Die erste oder die erste Gruppe dieser Determinanten wird durch den ersten Bindungspartner gebunden und die zweite oder die zweite Gruppe dieser Determinanten wird durch den zweiten Bindungspartner gebunden.
Wenn die vorliegende Erfindung so durchgeführt wird, daß nur der zweite Bindungspartner ein Antikörper ist, braucht der in der Probe nachzuweisende Stoff nur eine epitope Determinante aufzuweisen, die für den zweiten Bindungspartner spezifisch ist.
Der in dieser Erfindung verwendete Begriff "Epitop" soll eine beliebige Determinante umfassen, die für die spezifische Interaktion mit einem Antikörpermolekül verantwortlich ist. Epitope Determinanten bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven, auf der Oberflächen liegenden Molekülgruppen, wie z.B. Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und weisen spezifische dreidimensionale Strukturmerkmale und außerdem spezifische Ladungseigenschaften auf.
Monoclonale Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können verschiedenartig hergestellt werden, wobei Techniken eingesetzt werden, die dem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind und hier nicht wiederholt werden. Einzelheiten dieser Techniken werden in Büchern beschrieben, wie "Monoclonal Antibodies-Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis", Hrsg. Roger H. Kennett et al., Plenum Press (1980).
Der Begriff "bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper", der in der vorliegenden Erfindung zur Beschreibung des zweiten immunologischen Bindungspartners verwendet wird, bedeutet einen polyclonalen Antikörper, der vorher entsprechend absorbiert oder gereinigt wurde, so daß er an einen anderen Bereich des nachzuweisenden Stoffes bindet als der erste immunologische Bindungspartner.
Bei der Herstellung des bereichsspezifischen polyclonalen Antikörpers umfaßt das Verfahren:
(a) die Bindung eines Stoffes an einen Träger über einen oder mehrere monoclonale Antikörper, die für ein Epitop des Stoffes spezifisch sind, wobei der monoclonale Antikörper und der Stoff fest an den Träger gebunden werden;
(b) Bindung eines polyclonalen Antikörpers, der für den Träger-gebundenen Stoff spezifisch ist;
(c) Waschen des gebundenen polyclonalen Antikörpers;
(d) Elution des gebunden polyclonalen Antikörpers von der Substanz unter Bedingungen, so daß der monoclonale Antikörper und der Stoff am Träger gebunden bleiben; und
(e) Gewinnung des bereichsspezifischen polyclonalen Antikörpers.
Die spezifischen Konzentrationen des monoclonalen Antikörpers, des an den monoclonalen Antikörper gebundenen Stoffes und des polyclonalen Antikörpers, außerdem Parameter wie Inkubationstemperatur und Zeit für die Bindung der polyclonalen Antikörper sowie die Elutionsbedingungen können variiert werden.
Z.B. kann der für den Stoff spezifische polyclonale Antikörper an den Träger-gebundenen Stoff absorbiert werden, indem der polyclonale Antikörper und der Stoff bis zu 72 Stunden bei 4 bis 37ºC inkubiert werden. Der absorbierte polyclonale Antikörper kann sodann durch herkömmliche Techniken vom Träger-gebundenen Stoff eluiert werden, wie z.B. durch Verwendung einer sauren Lösung, z.B. 0,1 bis 1,0 M Glycin-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 2,0 bis 5,0, oder eines chaotropen Mittels, z.B. 1,0 bis 5,0 M Kaliumthiocyanat bei einem pH-Wert von 4,0 bis 7,5.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können verschiedene Stoffe nachgewiesen werden, zu ihnen zählen exogene, endogene und andere Stoffe.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "exogener Stoff" soll einen beliebigen Stoff, der normalerweise in der Quelle nicht vorliegt, und außerdem natürliche Stoffe umfassen, die künstlich zur Probe zugefügt wurden. Beispiele exogener Stoffe, die normalerweise in der Quelle, aus der die Probe entnommen wird, nicht vorliegen, sind Haptene, Arzneistoffe und Antigene, die von pathogenen Quellen stammen, wie z.B. von Viren, Bakterien und Parasiten. Ein Beispiel natürlicher Substanzen, die künstlich in die Quelle der Probe eingeführt werden, sind Modifikatoren der biologischen Antwort, wie z.B. die Interferone und Interleukine.
"Endogene" Stoffe sind Substanzen, die ursprünglich in der Quelle, aus der die Probe entnommen wird, enthalten sind. Beispiele solcher endogenen Stoffe sind Hormone, Steroide, Lipide, Enzyme und Rezeptoren, wobei die Spiegel dieser Substanzen Aussagen über den Gesamtzustand der Quelle der Probe machen können.
Haptene sind kleine Moleküle, die selbst keine Antikörperproduktion induzieren, die aber an ein Antikörpermolekül gebunden werden können. Es ist jedoch möglich, Antikörper gegen ein Hapten zu erzeugen, wenn das Hapten vor der Immunisierung zuerst an einen Träger gebunden wird.
Für die erfindungsgemäßen Zwecke kann ein Arzneistoff ein beliebiger Stoff sein, für den der Begriff normalerweise benutzt wird, wie z.B. Antibiotika, und außerdem Stoffe, wie Modifikatoren der biologischen Antwort.
Ein Antigen ist eine Substanz, die die Produktion von Antikörpern induzieren kann. Antigene kommen überall in der Natur vor und können aus den verschiedensten Quellen stammen. Eine Antigen-Quelle sind Antigene, die mit Pathogenen assoziiert sind. Ein Pathogen kann z.B. ein beliebiges Virus, Bakterium oder Parasit sein, das/der eine Krankheit auslösen kann.
Weitere Stoffe, die unter Verwendung der Erfindung nachgewiesen werden können, sind Hormone, Steroide, Lipide und Enzyme.
Hormone sind Substanzen, die wirken, indem sie metäbolische Aktivitäten hemmen oder anregen. Beispiele von Hormonen mit beachtlichem Interesse sind Hormone, die mit der Reproduktion assoziiert sind, wie menschliches Choriongonadotropin, luteinisierendes Hormon, Prolactin und Follikel-stimulierendes Hormon, außerdem die mit dem Wachstum zusammenhängenden Hormone, wie menschliches Wachstumshormon, Somatomedin und thyroideastimulierendes Hormon sowie andere Hormone, wie Parathormon, adrenokortikotropes Hormon, Vitamin D und seine Metaboliten, und Calcitonin.
Steroide haben eine chemische Grundstruktur in Form von Cyclopentanoperhydrophenanthren. Bestimmte Steroide spielen bei der gesamtbiologischen Aktivität eine entscheidende Rolle. Zu den wichtigsten Steroiden zählen Cortisol, Aldosteron, Progesteron, Estradiol und Testosteron.
Lipide sind wasserunlösliche organische Substanzen, die durch apolare Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, Ether und Benzol, extrahiert werden können. Zu den Klassen der Lipide mit biologischer Bedeutung zählen die Neutralfette, Phosphoglyceride, Glykolipide und Cholesterinester. Von besonderer Bedeutung sind Cholesterin, Lecithin, Carotin, Sphingomyelin, Cerebrosid und Gangliosid.
Enzyme sind Proteinmoleküle, die biochemische Reaktionen katalysieren. Enzyme sind für die Erhaltung einer homöostatischen Umgebung so wichtig, daß sie innerhalb des Organismus einen intermediären Stoffwechsel darstellen. Veränderungen in der Konzentration von Enzymen, die mit bestimmten biochemischen Stoffwechselwegen assoziiert sind, können ein wertvolles diagnostisches Mittel für die Beurteilung des Krankheitszustands sein. Beispiele wichtiger Enzyme sind Urease, Desoxyribonuclease, Ribonuclease, Kreatininphosphokinase, Lactatdehydrogenase, Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, alkalische Phosphatase, 5'-Nucleotidase, Aspartat Aminotransferase, Alanin-Aminotransaminase und Gamma-Glutamyl-Transpeptidase.
Die Spiegel der Antikörper, die in einer Probe vorliegen, können manchmal einen Hinweis auf Faktoren geben, denen das Immunsystem des Wirtes kürzlich ausgesetzt war. Beim Menschen werden die Antikörper in fünf Klassen eingeteilt, nämlich IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. IgE ist hauptsächlich an der allergischen Reaktion beteiligt. Eine allergische Reaktion wird durch IgE über dessen Wechselwirkung mit bestimmten sensibilisierenden Substanzen, die als Allergene bezeichnet werden, vermittelt. Wenn das Allergen an IgE-Moleküle bindet, die auf Mastzellen liegen, läuft eine Reihe von Ereignissen ab, die sich als Symptome manifestieren, die normalerweise bei Allergien auftreten. Während es möglich ist, den Gesamtspiegel von IgE in einer Probe zu messen und aus dieser Information allgemein zu bestimmen, ob ein Patient eine allergische Reaktion auf ein beliebiges Allergen zeigt, hat jedoch die Fähigkeit, das exakte Allergen bestimmen zu können, das die allergische Reaktion auslöst, einen viel größeren klinischen Wert. Dies kann erreicht werden, indem man bestimmt, ob eine Probe solche IgE- Antikörper, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind und daran binden können, enthält oder ob sie diese Antikörper nicht enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt somit auch ein Verfahren zur Bestimmung von Allergen-spezfischem IgE in einer Probe bereit, umfassend:
(a) Inkontaktbringen einer Probe, die ein Allergen-spezifisches IgE enthält, mit:
(i) einem ersten immunologischen Bindungspartner, der spezifisch mit dem Allergen-spezifischen IgE reaktiv ist, wobei der erste immunologische Bindungspartner an Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, und
(ii) einem zweiten immunologischen Bindungspartner, der spezifisch mit dem Allergen-spezifischen IgE reaktiv ist, wobei der zweite immunologische Bindungspartner nachweisbar markiert ist;
(b) Inkubation der Komponenten von Schritt (a) für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Immunkomplexes ausreichend sind, der aus dem Allergen-spezifischen IgE, dem ersten immunologischen Bindungspartner und dem zweiten immunologischen Bindungspartner besteht;
(c) Inkontaktbringen der den Immunkomplex von Schritt (b) enthaltenden Probe mit einem Biotin-bindenden Protein oder mit Biotin, das an einen Träger gebunden ist, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die für die Bindung des Komplexes an den Träger ausreichend sind;
(d) Trennung des Trägers von der Probe; und
(e) Bestimmung des nachweisbar markierten zweiten immunologischen Bindungspartners entweder in der Probe oder auf dem Träger;
wobei die Reaktion zwischen dem ersten immunologischen Bindungspartner und dem Träger nach oder im wesentlichen gleichzeitig mit der Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem ersten immunologischen Bindungspartner und dem Stoff stattfindet.
Diese Technik kann eingesetzt werden, um Allergen-spezfisches IgE entweder direkt in der Probe oder nach einer wesentlichen Reinigung des Allergen-spezfischen IgE z.B. durch Affinitäts-Chromatogarphie, nachzuweisen.
Der erste Bindungspartner ist in diesem Fall ein Allergen, an das entweder Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein entsprechend gebunden ist, so daß das Allergen noch mit dem Allergen-spezifischen IgE in der Probe gekoppelt werden kann. Der zweite Bindungspartner ist entweder ein monoclonaler Antikörper oder mehrere monoclonale Antikörper oder ein polyclonaler Antikörper, der für IgE spezifisch ist. Außerdem ist der zweite Bindungspartner nachweisbar markiert. An den Träger ist Biotin gebunden, wenn der erste Bindungspartner mit einem Biotin-bindenden Protein verknüpft ist, oder an ihn ist ein Biotin-bindendes Protein gebunden, wenn der erste Bindungspartner mit Biotin verknüpft ist.
Biotin kann an ein Allergen oder an Allergenextrakte gebunden werden, wobei Techniken verwendet werden, die dem durchschnittlichen Fachmann geläufig sind, z.B. durch:
(a) Mischen eines Antigenextraktes mit N-Hydroxysuccinimid-Biotin (NHS-Biotin);
(b) Inkubation des Gemisches 4 bis 24 Stunden bei 4 bis 37ºC;
(c) Dialyse des Gemisches zur Entfernung von nicht-umgesetztem NHS-Biotin.
Die Bestimmung von Allergen-spezifischem IgE in einer Probe unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach einer der vier vorstehend beschriebenen Ansätze durchgeführt werden.
Beispiele von Allergenen oder ihren Extrakten, die im erfindungsgemäßen Immuntest nachgewiesen werden können, sind Allergene, die von Schimmel, Pilzen, Parasiten, Pollen, Tierhaaren, Speichelproteinen, Arzneistoffen, Toxinen und Tiergiften stammen.
Die Substanzen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Test sind für die Herstellung eines Kits ideal geeignet. Ein solches Kit kann einen Träger umfassen, der so eingeteilt ist, daß er ein oder mehrere Behältnisse, wie z.B. Gläschen, Röhrchen und dergleichen, nebeneinander aufnehmen kann, wobei jedes Behältnis eines der getrennten, im Verfahren zu verwendenden Elemente enthält.
Z.B. kann eines der Behältnisse biotinylierte monoclonale Antikörper oder ein biotinyliertes Antigen umfassen. Ein zweites Behältnis kann einen löslichen, nachweisbar markierten bereichsspezifischen polyclonalen Antikörper in gefriergetrockneter Form oder in Lösung umfassen. Die Träger-Einheit kann außerdem ein drittes Behältnis enthalten, umfassend ein Biotin-bindendes Protein, wie z.B. Avidin oder Streptavidin, gebunden an einen Träger.
Z.B. kann ein Kit ein oder mehrere Behältnisse umfassen, wobei
(a) ein erstes Behältnis einen immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist;
(b) ein zweites Behältnis einen immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an einen nachweisbaren Marker gebunden ist; und
(c) ein drittes Behältnis einen Träger enthält, an den ein Biotin-bindendes Protein oder Biotin gebunden ist;
und wobei das erste Behältnis einen oder mehrere monoclonale Antikörper enthält, und das zweite Behältnis einen bereichsspezifischen polyclonalen Antikörper enthält, wobei weiterhin der erste und zweite Bindungspartner mit unterschiedlichen Bereichen auf dem Stoff reagieren, so daß beide Partner an den Stoff binden können.
In einem weiteren Beispiel kann der Kit einen oder mehrere Behältnisse umfassen, wobei
(a) ein erstes Behältnis einen immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an Biotin oder ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist;
(b) ein zweites Behältnis einen immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an einen nachweisbaren Marker gebunden ist; und
(c) ein drittes Behältnis einen Träger enthält, an den ein Biotin-bindendes Protein oder Biotin gebunden ist;
wobei das erste Behältnis ein Antigen und das zweite Behältnis einen bereichsspezifischen polyclonalen Antikörper enthält, der für die nachzuweisende Antikörperklasse spezifisch ist.
Außerdem kann die Träger-Einheit verschiedene Behältnisse umfassen, von denen jedes unterschiedliche, vorher bestimmte Mengen eines bekannten Antigens enthält. Diese letzteren Behältnisse können sodann zur Aufstellung einer Standardkurve verwendet werden, anhand derer die Ergebnisse intrapoliert werden können, die mit der die unbekannte Antigenmenge enthaltenden Probe erhalten wurden.
Bei Verwendung des Kits muß der Benutzer nur in einem Behältnis eine vorher abgemessene Menge einer Probe, die die meßbare, noch unbekannte Menge des nachzuweisenden Stoffes enthält, den Inhalt des im ersten Behältnis enthaltenen biotinylierten ersten Bindungspartners, den Inhalt des im zweiten Behältnis enthaltenen markierten Antikörpers und den Inhalt des dritten Behältnisses, das den Träger umfaßt, an den ein Biotin-bindendes Protein gebunden ist, zum ersten Behältnis zugeben. In einer anderen Ausführungsform kann das Biotin-bindende Protein an das Behältnis gekoppelt bereitgestellt werden, zu dem die Probe und die Inhalte des ersten und zweiten Behältnisses zugegeben werden. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird ein Immunkomplex gebildet und von der Überstandsflüssigkeit abgetrennt, sodann wird der Immunkomplex oder die Überstandsflüssigkeit getestet, z.B. durch Zählung der Radioaktivität oder durch Zusatz eines Enzymsubstrats und Bestimmung der Farbentwicklung.
Als allgemeines Beispiel wurde ein Sandwich-Immuntest für menschliches Wachstumshormon (hGH) durchgeführt, wobei ein biotinylierter monoclonaler Antikörper gegen hGH als erster Bindungspartner und ein ¹²&sup5;I-markierter polyclonaler Antikörper, der mit anderen Bereichen des hGH-Moleküls als der monoclonale Antikörper reagiert, als zweiter Bindungspartner eingesetzt wurden. Das Experiment wurde in zwei Versuchsanordnungen durchgeführt und die Empfindlichkeiten beim Nachweis von hGH in den beiden Versuchsanordnungen miteinander verglichen.
In der ersten Versuchsanordnung wurde der biotinylierte monoclonale Antikörper an ein mit Avidin beschichtetes Kunststoffkügelchen immobilisiert, bevor er (wie in Katz et al., US-Patent 4 496 654) zusammen mit dem ¹²&sup5;I-markierten polyclonalen Antikörper zu der hGH-enthaltenden Probe zugesetzt wurde. Unter diesen Bedingungen liegt bei der Reaktion mit hGH nur der zweite Bindungspartner frei in Lösung vor.
In der zweiten Versuchsanordnung wurde der monoclonale Antikörper gegen hGH vor Zugabe zu der hGH-enthaltenden Probe nicht immobilisiert, stattdessen wurde er zusammen mit dem ¹²&sup5;I-markierten polyclonalen Antikörper frei in Lösung umgesetzt. Unter diesen Bedingungen können beide Bindungspartner frei mit dem in der Probe vorliegenden hGH reagieren. Die zweite Versuchsanordnung war in allen Punkten mit der ersten identisch, bis auf die Ausnahme, daß der biotinylierte monoclonale Antikörper vor Zugabe zu der hGH-enthaltenden Probe nicht an das mit Avidin beschichtete Kügelchen immobilisiert wurde. Der biotinylierte monoclonale Antikörper, der ¹²&sup5;I-markierte polyclonale Antikörper und das mit Avidin beschichteten Kügelchen wurden gleichzeitig zu der hGH-enthaltenden Probe zugegeben.
Erstaunlicherweise zeigte die zweite Versuchsanordnung beim Nachweis des in der Probe enthaltenen hGH eine viel größere Empfindlichkeit. Diese gesteigerte Reaktivität beruht vermutlich auf den optimaleren Molekülkinetiken des Systems, die zustandekommen, wenn bei der Reaktion alle Antikörpermoleküle frei in der Lösung vorliegen, im Gegensatz zur ersten Versuchsanordnung, wobei die Antikörpermoleküle in ihren Kinetiken z.T. dadurch beschränkt sind, daß sie auf das mit Avidin beschichtete Kügelchen der festen Phase immobilisiert sind.
Diese Erfindung wurde vorstehend allgemein beschrieben, im folgenden wird sie anhand von bestimmten spezifischen Beispielen noch deutlicher gemacht, diese Beispiele sind hier eingeschlossen, sie dienen ausschließlich der Erläuterung und sollen den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken, sofern nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1

Herstellung von bereichsspezifischen polvyclonalen Antikörpern

1 g BrCN-aktivierte Sepharose-4B wurde gewaschen und mit einem Gesamtvolumen von 200 ml 1 mM HCl in mehreren Aliquots 15 Minuten gequollen. Das gequollene Gel wurde sodann mit 20 ml 0,1 M Carbonatpuffer, pH 8,3, gewaschen, der sofort wieder abgesaugt wurde. Anschließend wurde das Gel in eine vorher hergestellte Proteinlösung überführt, die 2 mg Affinitäts-isoliertes Kaninchen-Anti-Maus-IgG in 0,1 M Carbonatpuffer enthielt. Dieses Gemisch aus Proteinlösung und Gel wurde über Nacht bei Raumtemperatur gründlich gemischt. Anschließend wurde die Proteinlösung aus dem Gel abgesaugt und das Gel in eine Blockierungslösung von 0,1 M Ethanolamin, pH 8,0, übertragen und drei Stunden bei Raumtemperatur gründlich gemischt. Diese Lösung wurde sodann vom Gel abgesaugt und das Gel fünfmal abwechselnd mit 20 ml Aliquots von 0,1 M Carbonatpuffer und 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,3, gewaschen. Das gewaschene Gel wurde sodann in einer Lösung von 1 mg monoclonalem Maus-Antikörper gegen menschliches Wachstumshormon in 0,01 M PBS/BSA- Puffer, pH 7,4, suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gründlich gemischt. Anschließend wurde die Lösung vom Gel abgesaugt und das Gel mit 50 ml 0,01 M PBS/BSA-Puffer gewaschen und sodann in einer Lösung von 0,01 M PBS/BSA-Puffer, enthaltend 350 mg gereinigtes menschliches Wachstumshormon, resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gründlich gemischt. Danach wurde die Lösung vom Gel abgesaugt und das Gel mit 50 ml 0,01 M PO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, und sodann mit 20 ml 0,2 M Triethanolamin, pH 8,3, gewaschen. Anschließend wurde das Gel in 15 ml 500 mg% Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid in 0,2 M Triethanolamin, pH 8,3, resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gründlich gemischt. Die Lösung wurde vom Gel abgesaugt und das Gel zehnmal abwechselnd mit 20-ml-Aliquots von 0,01 M PO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, und 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,3, gewaschen. Die Lösung wurde vom Gel abgesaugt und das Gel mit verdünnter HCl, pH 1,85, gewaschen und anschließend mit 0,01 M PO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, äquilibriert. Die Affinitätsgel-Matrix kann nun zur Reinigung von bereichsspezifischen polyclonalen Antikörpern gegen menschliches Wachstumshormon verwendet werden.
Zur Reinigung von bereichsspezifischen polyclonalen Antikörpern unter Verwendung der Affinitätsgel-Matrix wird das Gel in eine Säule für die Flüssigkeitschromatographie gepackt und mit 0,01 M PBS/BSA-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 äquilibriert. Sodann werden Antiseren gegen menschliches Wachstumshormon durch die Säule gegeben, so daß die Bindung an das menschliche Wachstumshormon erfolgen kann. Anschließend wird das Gel mit 0,01 M PBS/BSA-Puffer und danach mit destilliertem Wasser solange gewaschen, bis alles ungebundene Protein entfernt ist. Die an die Säule gebundenen Antikörper werden sodann mit 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,3, eluiert. Diese Antikörperlösung wird unmittelbar darauf gegen 0,01 M PO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, dialysiert und auf etwa 100 µg/ml eingeengt. Die Antikörper, die auf diese Weise durch Affinitätschromatographie gereinigt wurden, sind für die Teile des menschlichen Wachstumshormon-Moleküls bereichsspezifisch, die nicht den monoclonalen Maus-Antikörper binden.

BEISPIEL 2

Bestimmung von hGH in Proben unter Verwendung des erfindungsgemäßen DESP und herkömmlicher Sandwich-Immuntests

Ein Experiment wurde durchgeführt, wobei die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen DESP und die der herkömmlichen Sandwich-Immuntests beim Nachweis des Vorliegens von hGH in verschiedenen Konzentrationen verglichen wurden. Standardverdünnungen von hGH wurden unter Verwendung eines WHO-Referenzpräparates in 0,01 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2,0 % Rinderserumalbumin (BSA) in Konzentrationen von 0, 0,5, 1,5, 5,0, 15,0 und 35,0 mg/ml hergestellt.
Zur Bestimmung der Empfindlichkeit des herkömmlichen Sandwich-Immuntests beim Nachweis von verschiedenen hGH-Spiegeln in den Proben wurde ein im Handel verfügbarer monoclonaler Antikörper, der biotinyliert worden war, zuerst an ein mit Avidin beschichtetes Kunststoffkügelchen immobilisiert, das sodann zusammen mit dem ¹²&sup5;I-markierten polyclonalen Antikörper (hergestellt wird in Beispiel 1 beschrieben) zu den hGH- enthaltenden Proben in doppelter Ausführung zugegeben. Die Probenröhrchen wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur bei 170 UpM in einem Klinik-Kreiselmischer gehalten. Danach wurden die Kügelchen zweimal mit 0,1 % Tween 80 in PBS-Lösung gewaschen.
Beim DESP-Test wurden das mit Avidin beschichtete Kügelchen, der biotinylierte, im Handel erhältliche monoclonale Antikörper und der ¹²&sup5;I-markierte bereichsspezifische polyclonale Antikörper gleichzeitig zu den doppelten Proben zugegeben, die die verschiedenen Konzentrationen von hGH enthielten. Die Inkubation und die Waschschritte wurden genauso durchgeführt, wie im herkömmlichen Sandwich-Immuntest.
Nach dem Waschen wurden die in doppelter Ausführung vorliegenden Kügelchen dieser beiden Tests in einen Gamma-Szintillationszähler gestellt und ihre relative Radioaktivität bestimmt. Die erhaltenen Werte werden in Tabelle I gezeigt und in Figur 1 erläutert. Tabelle 1
a Konzentration in ng/ml
b Mittelwert der doppelten Proben in cpm
Diese Ergebnisse zeigen, daß der erfindungsgemäße DESP- Immuntest insgesamt eine größere Empfindlichkeit beim Nachweis von hGH bereitstellt als der herkömmliche Sandwich-Immuntest, wobei die gleichen Reagenzien verwendet wurden.

Beispiel 3

Bestimmung von hGH in Proben unter Verwendung von drei verschiedenen DESP-Immuntests

Ein Experiment wurde durchgeführt, in dem die relative Empfindlichkeit von drei verschiedenen DESP-Immuntests beim Nachweis von hGH in verschiedenen Konzentrationen bestimmt wurde. Die Standardverdünnungen von hGH wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Außerdem wurden die Inkubationen, die Waschschritte und die Behandlung der Proben in diesen DESP-Immuntests durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Tabelle 2 zeigt die verschiedenen immunologischen Bindungspartner, die bei den drei ausgewerteten DESP-Immuntests jeweils verwendet wurden. Tabelle 2
a Der monoclonale Antikörper-1 und der monoclonale Antikörper-2 reagieren mit unterschiedlichen Epitopen von hGH.
b Hergestellt wie in Beispiel 1.
Die unter Verwendung dieser drei verschiedenen DESP-Immuntests erhaltenen Daten werden in Tabelle 3 dargestellt und in Figur 2 graphisch erläutert. Tabelle 3
a Konzentration in ng/ml
b Mittelwert der doppelten Proben in cpm
Der DESP-Test, wobei biotinylierter monoclonaler Antikörper und radioaktiv-markierter bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper (Test C) verwendet wurden, war beim Nachweis von hGH empfindlicher als die anderen beiden untersuchten DESP-Tests. Die Hypothese, worauf dieser Unterschied in der Empfindlichkeit beruhen könnte, wird deutlich, wenn man sich die Komponenten der anderen Tests genauer ansieht.
Ein Hauptnachteil von Test A besteht darin, daß sowohl der biotinylierte als auch der radioaktiv-markierte polyclonale Antikörper um dieselben Epitopstellen auf dem hGH-Molekül konkurrieren. Während eine größere Zahl von markierten Antikörpern mit unterschiedlichen Spezifitäten für eine Bindung potentiell verfügbar sind, wird jedoch nur dann eine Bindung zustande kommen, wenn ein bestimmtes Epitop nicht zuvor schon durch einen biotinylierten Antikörper blockiert wurde, der für dieselbe Bindungsstelle spezifisch ist.
Andererseits bedeutet die Tatsache, daß die in Test B verwendeten monoclonalen Antikörper gegen unterschiedliche Epitop-Determinanten auf hGH gerichtet sind, daß in diesem Test die biotinylierten und die radioaktiv-markierten Antikörperpopulationen nicht konkurrieren. Jedoch können aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit, daß das für den radioaktiv-markierten Antikörper spezifische Epitop in großer Zahl auf jedem hGH-Molekül vorliegt, nur wenige radioaktiv-markierte monoclonale Antikörper an ein bestimmtes hGH-Molekül binden.
Es ist sehr wahrscheinlich, daß Test C die größte Empfindlichkeit erreicht, da hier durch die Fähigkeit, viele radioaktiv-markierte Antikörper pro hGH-Molekül zu binden, das Signal verstärkt wird, während die biotinylierten und die radioaktiv-markierten Antikörper nicht um dieselben Bindungs stellen der Epitope auf hGH konkurrieren müssen, indem bereichsspezifische radioaktiv-markierte Antikörper eingesetzt werden, die für die Bindungsstelle des biotinylierten monoclonalen Antikörpers nicht-kompetitiv sind.

Beispiel 4

Bestimmung von Allergen-spezifischem IgE in Proben unter Verwendung von drei verschiedenen Radioimmuntests

Eine Studie wurde durchgeführt, in der die Empfindlichkeiten von drei verschiedenen Radioimmuntests verglichen wurden. In diesen Tests wurden mit Avidin beschichtete Polystyrol-Kügelchen, biotinylieter Allergenextrakt (Kentucky Blue Grass) und Allergen-spezifisches menschliches IgE verwendet.
Die Biotinylierung des Allergenextraktes wurde durchgeführt, indem 1 ml des Kentucky Blue Grass-Extraktes (1,0 mg/ml, Poa Pratensis, Hollister-Stier, Chargen-Nr. K61798M) in 0,01 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, mit 0,22 ml einer 6,4 mM Lösung von N-Hydroxysuccinimidbiotin (Sigma Mg 341,4) in N,N-Dimethylformamid (Sigma Mg 73,09) versetzt wurde. Dieses Gemisch wurde über Nacht (12 bis 14 Stunden) bei Raumtemperatur inkubiert und sodann gegen zweimal 4 Liter 0,15 M NaCl bei Raumtemperatur über eine Zeitspanne von 8 Stunden dialysiert. Dieser dialysierte biotinylierte Extrakt wurde bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
Mit Avidin beschichtete Polystyrol-Kügelchen wurden hergestellt, indem zuerst die Kügelchen (5/16 Inch, Precision Plastic Ball, spiegelnde Ausführung) mit einer 1 % Glutaraldehydlösung mindestens 8 Stunden unter leichter rotierender Bewegung auf einem Kreiselmischer (70 UpM) behandelt wurden. Danach wurde das Glutaraldehyd entfernt und die Kügelchen zehnmal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die mit Glutaraldehyd aktivierten Perlen wurden sodann mit einer biotinylierten Rinderserumalbumin-Lösung (Rinderserumalbumin, Fraktion V, Sigma) in einer Konzentration von 10 µg biotinyliertes BSA pro Kügelchen in 0,01 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, unter Einsatz von 0,3 ml/Kügelchen 8 Stunden unter leichter rotierender Bewegung beschichtet. Anschließend wurden die Kügelchen zehnmal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Als nächstes wur den die mit biotinyliertem BSA beschichteten Kügelchen mit Avidin (10 µg/0,03 ml/Kügelchen) in 0,01 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, 8 Stunden unter rotierender Bewegung umgesetzt, sodann folgten 10 Waschschritte mit entionisiertem Wasser. Die mit Avidin beschichteten Kügelchen wurden mit 0,1 % Rinderserumalbumin in 0,01 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, unter Einsatz von 0,3 ml/Kügelchen mindestens 2,5 Stunden unter leichter rotierender Bewegung gespült. Die Kügelchen wurden zehnmal mit entionisiertem Wasser gewaschen und anschließend 30 bis 60 Minuten einer letzten Behandlung mit 2,5 % Saccharose in 0,15 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, unter Einsatz von 0,3 ml/Kügelchen unterworfen. Die Saccharoselösung ließ man ablaufen und die Kügelchen bei Raumtemperatur trocknen, sodann wurden sie bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
Ziegen-Anti-Mensch-IgE (ATAB Atlantic Antibodies) wurde unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens iodiert. Für die drei Radioimmuntests wurden die folgenden Vorschriften verwendet:

(1) Test mit verzögerter Bindung an die feste Phase (Delayed Solid Phase) (Ausführung mit aufeinanderfolgenden Schritten)

Biotinylierter Allergenextrakt (100 µl) in einer Konzentration von 2,0 µg/ml in 0,1 % BSA, 0,01 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN&sub3;, wurde mit 100 µl menschlichem Serum, enthaltend erhöhte Mengen des menschlichen Allergen-spezifischen IgE (D. Dunn, Inc.) in verschiedenen RAST-Einheiten (RAST = Radioallergosorbent-Test), oder 100 µl Pferdeserum (optisch klar, Irvine Scientific) versetzt. Diese Lösungen wurden in 12x75 mm- Kunststoff-Röhrchen aus Polystyrol zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Kreiselmischer (170 UpM) gemischt. Danach wurde in jedes Röhrchen ein mit Avidin beschichtetes Kügelchen zugegeben und die Umsetzung weitere zwei Stunden mit rotierender Bewegung fortgesetzt. Anschließend wurden die Röhrchen, die die Avidin-Kügelchen enthielten, dreimal mit 2 ml 0,01 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,1 % NaN&sub3;, pH 7,4, gewaschen. Das Vorliegen von gebundenem Allergen-spezifischem menschlichem IgE wurde nachgewiesen, indem 200 µl ¹²&sup5;I-markiertes Ziegen-Anti-Mensch-IgE (1500 cpm/µl, 0,814 µCi/µg) zugegeben und sodann zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Kreiselmischer (170 UpM) inkubiert wurden. Die jeweils doppelt vorliegenden Kügelchen-enthaltenden Röhrchen wurden dreimal gewaschen, wie vorstehend beschrieben, und sodann eine Minute in einem Gammazähler gezählt.

(2) Test mit verzögerter Bindung an die feste Phase (Delayed Solid Phase) (Simultan-Ausführung)

Dieser Test wurde durchgeführt, wie in der Ausführung mit aufeinanderfolgenden Schritten vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, daß der biotinylierte Allergenextrakt, die das Allergen-spezifische menschliche IgE enthaltende Probe und das mit Avidin beschichtete Kügelchen gleichzeitig zusammengebracht und zwei Stunden bei Raumtemperatur unter rotierender Bewegung (170 UpM) inkubiert wurden. Alle anderen Schritte wurden durchgeführt, wie in der Ausführung mit aufeinanderfolgenden Schritten vorstehend beschrieben.

(3) Immobilisiertes Antigen

Jedes in doppelter Ausführung vorliegende Röhrchen, das verschiedene Konzentrationen des biotinylierten Allergenextraktes enthielt (100 µl mit 2,0 µg/ml), wurde mit 100 µl Pferdeserum und einem Avidin-Kügelchen versetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur unter rotierender Bewegung (170 UpM) inkubiert. Nach dem Waschen der Röhrchen und Kügelchen, wie vorstehend beschrieben, wurden 100 µl menschliches Serum, enthaltend Allergen-spezfisches IgE in verschiedenen Konzentrationen, oder 100 µl Pferdeserum zugegeben und anschließend das Ganze mit 100 µl 0,1 % Rinderserumalbumin in 0,01 M NaPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 1 % NaN&sub3;, pH 7,41 versetzt. Die Röhrchen wurden nochmals zwei Stunden bei Raumtemperatur unter rotierender Bewegung (170 UpM) inkubiert und gewaschen, wie vorstehend beschrieben. Danach wurden 200 µl ¹²&sup5;I-markiertes Ziegen-Anti- Mensch-IgE zugegeben, um das gebundene Allergen-spezifische IgE nachzuweisen, und das Ganze unter rotierender Bewegung (170 UpM) zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die mit diesen drei Tests erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt und in Figur 3 graphisch erläutert. Tabelle 4
a Konzentration in RAST-Einheiten/ml
b Mittelwert der doppelten Proben in cpm
c Pferdeserum-Kontrolle
Sowohl der DESP-Test mit aufeinanderfolgenden Schritten als auch der Simultan-DESP-Test, wobei das biotinylierte Allergen frei vorlag und mit Allergen-spezifischem IgE in Lösung reagieren konnte, bevor dieser Komplex mit Hilfe des mit Avidin beschichteten Kügelchens entfernt wurde, zeigten unerwartet eine insgesamt größere Empfindlichkeit als der herkömmliche Test, in dem das Allergen zuerst an das Kügelchen immobilisiert und sodann mit der IgE-enthaltenden Probe in Kontakt gebracht wurde. Die gesteigerte Empfindlichkeit des Tests mit verzögerter Bindung an die feste Phase (DESP-Tests) beruht vermutlich auf einer geringeren sterischen Behinderung und auf gesteigerten Molekülkinetiken, dies kann nicht erreicht werden, wenn das Allergen anfangs in diesen Punkten beschränkt wird, indem es an die feste Phase gebunden wird, wie das beim herkömmlichen Test mit immobilisiertem Allergen der Fall ist. Eine zu Beginn erfolgende Immobilisierung des Allergenextraktes macht die Wanderung des Allergen-spezifischen IgE zur Oberfläche der festen Phase, an welche es gebunden wird, erforderlich, und sie kann außerdem die Verfügbarkeit von Epitop-Stellen, die durch das Allergen-spezifische IgE-Molekül gebunden werden können, behindern.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines in einer Probe vorhandenen Stoffes, umfassend:

(a) Inkontaktbringen der den Stoff enthaltenden Probe mit:

(i) einem ersten immunologischen Bindungspartner für den Stoff, wobei der erste immunologische Bindungspartner an Biotin oder ein Biotin bindendes Protein gebunden ist,

(ii) einem zweiten immunologischen Bindungspartner für den Stoff, wobei der zweite immunologische Bindungspartner nachweisbar markiert ist, und

(iii) einem Biotin bindenden Protein oder Biotin, an einen Träger gebunden;

(b) gleichzeitige oder getrennte Inkubation der Komponenten von Schritt (a) für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Stoff, dem ersten immunologischen Bindungspartner, dem zweiten immunologischen Bindungspartner und dem Träger ausreichend sind;

(c) Trennung des Trägers von der Probe; und

(d) Bestimmung des nachweisbar markierten zweiten immunologischen Bindungspartners entweder in der Probe oder auf dem Träger;

wobei der erste immunologische Bindungspartner einen oder mehrere monoclonale Antikörper darstellt und der zweite immunologische Bindungspartner ein bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper ist, wobei weiterhin der erste und der zweite Bindungspartner mit unterschiedlichen Bereichen des Stoffes reagieren, so daß beide Partner an die Substanz binden können, und wobei die Reaktion zwischen dem ersten immunologischen Bindungspartner und dem Träger nach oder im wesentlichen gleichzeitig mit der Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem ersten immunologischen Bindungspartner und dem Stoff geschieht.

2. Verfahren zur Bestimmung eines in einer Probe vorhandenen Stoffes, umfassend:

(a) Inkontaktbringen der den Stoff enthaltenden Probe mit:

(i) einem ersten immunologischen Bindungspartner für den Stoff, wobei der erste immunologische Bindungspartner an Biotin oder an Biotin bindendes Protein gebunden ist,

(iii) einem Biotin bindenden Protein oder Biotin, an einen Träger gebunden;

(c) Trennung des Trägers von der Probe; und

wobei der erste immunologische Bindungspartner ein Antigen ist und der zweite immunologische Bindungspartner ein bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper ist, der spezifisch für die nachzuweisende Antikörperklasse ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Stoff im Bezug auf die Quelle der Probe exogen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Stoff im Bezug auf die Quelle der Probe endogen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der endogene Stoff ein Hormon, ein Steroid, ein Lipid oder ein Enzym ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der endogene Stoff ein Immunglobulin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Antigen ein Allergen und das Immunglobulin IgE ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der nachweisbar markierte zweite immunologische Bindungspartner mit einem Enzym, einem radioaktiven Isotop, einer Fluoreszenzverbindung, einer Chemilumineszenzverbindung oder einer Biolumineszenzverbindung markiert ist.

9. Für den Nachweis eines Stoffes in einer Probe wertvoller Kit, umfassend einen Träger, der so eingeteilt ist, daß er ein oder mehrere Behältnisse nebeneinander aufnehmen kann, wobei

(a) ein erstes Behältnis einen immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an Biotin oder ein Biotin bindendes Protein gebunden ist;

(b) ein zweites Behältnis einen immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an einen nachweisbaren Marker gebunden ist; und

(c) ein drittes Behältnis einen Träger enthält, an den ein Biotin bindendes Protein oder Biotin gebunden ist,

und wobei das erste Behältnis einen oder mehrere monoclonale Antikörper und das zweite Behältnis einen bereichsspezifischen polyclonalen Antikörper enthält, wobei weiterhin der erste und zweite Bindungspartner mit unterschiedlichen Bereichen des Stoffes reagieren, so daß beide Partner an den Stoff binden können.

10. Für den Nachweis eines Stoffes in einer Probe wertvoller Kit, umfassend einen Träger, der so eingeteilt ist, daß er ein oder mehrere Behältnisse nebeneinander aufnehmen kann, wobei

wobei das erste Behältnis ein Antigen und das zweite Behältnis einen bereichsspezifischen polyclonalen Antikörper enthält, der für die nachzuweisende Antikörperklasse spezifisch ist.

11. Kit nach Anspruch 10, wobei der Stoff ein Immunglobulin ist.

12. Kit nach Anspruch 11, wobei das Antigen ein Allergen und das Immunglobulin IgE ist.

13. Für den Nachweis eines Stoffes in einer Probe wertvoller Kit, umfassend einen Träger, der so eingeteilt ist, daß er ein oder mehrere Behältnisse nebeneinander aufnehmen kann, wobei

(a) ein erstes Behältnis

(i) einen ersten immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an Biotin oder ein Biotin bindendes Protein gebunden ist, und

(ii) einen zweiten immunologischen Bindungspartner für den Stoff enthält, wobei der Partner an einen nachweisbaren Marker gebunden ist; und

(b) ein zweites Behältnis einen Träger enthält, an den ein Biotin bindendes Protein oder Biotin gebunden ist; und

wobei der erste immunologische Bindungspartner einen oder mehrere monoclonale Antikörper darstellt und der zweite immunologische Bindungspartner ein bereichsspezifischer polyclonaler Antikörper ist, wobei weiterhin der erste und der zweite Bindungspartner mit unterschiedlichen Bereichen des Stoffes reagieren, so daß beide Partner an den Stoff binden können.

14. Zum Nachweis eines Stoffes in einer Probe wertvoller Kit, umfassend einen Träger, der so eingeteilt ist, daß er ein oder mehrere Behältnisse nebeneinander aufnehmen kann, wobei

(a) ein erstes Behältnis

wobei das erste Behältnis ein Antigen und einen bereichsspezifischen polyclonalen Antikörper enthält, der für die nachzuweisende Antikörperklasse spezifisch ist.

15. Kit nach Anspruch 14, wobei der Stoff ein Immunglobulin ist.

16. Kit nach Anspruch 15, wobei das Antigen ein Allergen und das Immunglobulin IgE ist.

17. Zusammensetzung, umfassend einen ersten immunologischen Bindungspartner für einen Stoff, wobei der Partner an Biotin oder ein Biotin bindendes Protein gebunden ist, und einen zweiten immunologischen Bindungspartner für den Stoff, wobei der Partner an einen nachweisbaren Marker gebunden ist, wobei der erste immunologische Bindungspartner und der zweite immunologische Bindungspartner den Bindungspartnern nach Anspruch 1 entsprechen, und wobei der erste und zweite immunologische Bindungspartner in nicht-wäßriger Form vorliegen.

18. Zum Nachweis von hGH in einer Probe wertvoller Kit, umfassend einen Träger, der so eingeteilt ist, daß er ein oder mehrere Behältnisse nebeneinander aufnehmen kann, wobei

(a) ein erstes Behältnis Avidin-beschichtete Polystyrolkügelchen enthält;

(b) ein zweites Behältnis einen ersten an Biotin gebundenen monoclonalen Maus-Antikörper und einen zweiten bereichspezifischen polyclonalen Maus-Antikörper, der nachweisbar mit ¹²&sup5;I markiert ist, enthält, wobei die Antikörper mit unterschiedlichen Epitopen von hGH reagieren; und

(c) jedes Behältnis in einer Reihe von Behältnissen steigende Mengen von hGH enthält.