JPH0354466A - 免疫学的測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗体が担持された不溶性担体の免疫学的特異
反応による凝集の程度を検出することにより試料中の抗
原を測定するための試薬及び測定方法に関し、特に、保
存安定性が良くかつ交差反応の影響を回避し得る試薬及
び測定方法に関する。

〔従来の技術〕

従来より、被測定試料中の抗原に対応する抗体を不溶性
担体に担持させ、免疫反応により生じた不溶性担体の凝
集の程度を検出する免疫学的測定方法が広く用いられて
いる。この種の免疫学的測定方法において測定精度を高
めるには、免疫反応の特異性を高めることが必要であり
、種々の方法が提案されている． 特開昭５７−９７２３号に開示されている方法では、特
異性を高めるために、免疫グロプリンの構或威分が安定
化剤として用いられており、また免疫グロブリンの構或
戒分に加えて牛血清アルフミンも共存させた例が開示さ
れている。

他方、特開昭６０−２５６０５７号には、免疫学的測定
法において、非特異反応を抑制するために、保護コロイ
ドとしての安定化作用を有する物質として血清アルブミ
ンが開示されている。ここでも、血清アルブミンとして
は、牛血清アルブミンを用いることが開示されている。

〔発明が解決しようとする課題） 上述した特開昭５７−９７２３号及び特開昭６０−２５
６０５７号に記載の方法では、何れにおいても非特異反
応を抑制する安定化剤として牛血清アルブミンを使用し
得る旨が示されている．しかしながら、使用する抗体の
産生勅物種に関わらず、牛血清アルプミンを用いた場合
には、試薬の保存安定性が充分なものではなかった．さ
らにまた、使用する抗体に対して対応する抗原ばかりで
なく牛血清アルブミンも反応する、いわゆる交差反応の
可能性も常に存在していた。特に、抗原がヒトアルブミ
ンである場合には、この交差反応を回避することができ
なかった， 本発明の目的は、免疫反応により生じた不溶性担体の凝
集の程度を検出することにより被測定試料中の抗原を測
定するための試薬及び測定方法であって、試薬の保存安
定性において優れ、かつ交差反応の影響を回避すること
ができるものを提供することにある． 〔課題を解決するための手段］ 本願発明者らは、試料中の抗原に対応する抗体を不溶性
担体に担持させ、免疫反応により生じた不溶性担体の凝
集程度を検出する試薬及び方法において、抗体作戒時に
用いた被免疫動物種の血清アルブミンを反応系に含有さ
せれば、保存安定性が良く、かつ交差反応を回避し得る
ことを見出し、本発明を威すに至った． すなわち、本発明は、被測定試料中の抗原に対応する抗
体が担持された不溶性担体と、この抗体作成に用いた被
免疫動物種の血清アルブ旦ンとを含有することを特徴と
する免疫学的測定試薬、並びに被測定試料中の抗原に対
応する抗体を不溶性担体に担持させ、免疫反応により生
じた不溶性担体の凝集の程度を検出することにより被測
定試料中に含有された抗原を検出する方法において、反
応系中に抗体作成時に用いた被免疫動物種の血清アルブ
ミンを含有させることを特徴とする免疫学的♂り定方法
である． 本発明の試薬及び測定方法における測定対象物としては
、ハプテン、ポリベブチド、ステロイド及び多糖類等の
他、ヒトアルブミンやＣＲＰのような種々の抗原となる
蛋白質が挙げられる。そして、本発明はヒトアルブミン
の測定において特に好適に使用される。

また、本発明において用い得る抗体としては、上記各種
の抗原に対して特異的な抗体蛋白質であり、．免疫グロ
プリンやその断片、例えばＦ（ａｂ′）２を例示するこ
とができる． 不溶性担体としては、無機物質粉末、有機高分子粉末、
微生物、血球または細胞膜片等が考えられる。より具体
的には、無機物質粉末としては、シリカ、アルミナまた
は金、チタン、鉄もしくはニソケル等の金属片を例示す
ることができる．有機高分子粉末としては、ラテックス
、不溶性アガロース、セルロースまたは不溶性デキスト
ラン等が例示され、好ましくは、ラテンクスが用いられ
る。ラテックスとしては、ボリスチレン、スチレンース
チレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、ア
クリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエン共重合体
または塩化ビニルーアクリル酸エステル共重合体等を例
示することができる。

ラテックスは、通常、反応媒体に悲濁されたラテックス
懸濁液の状態で用いられる． 上記不溶性担体の平均粒径は、測定対象物質の検出濃度
あるいは使用する測定機器により適宜選択されるもので
あるが、０．０５〜１．０μｍ程度のものが好適に用い
られる． 不溶性担体を分散あるいは懸濁させる反応媒体としては
、水や緩衝液のような水性媒体を例示することができる
．また、場合によっては、尿等の検体をそのまま反応媒
体とすることもできる。

本発明において抗体を上記不溶性担体に担持（感作）さ
せるには、物理的あるいは化学的結合を利用した公知の
方法を用いることができる。

本発明の測定試薬では、上記の抗体が感作された不溶性
担体と、上記抗体を作戒するのに用いた勅物種由来の血
清アルブミンとが含有されている．試薬中の該血清アル
ブミンの含有量は、この試薬の使用される態様によって
決められるので、一律には決められないが、通常０．Ｏ
ｌ〜８重景％、好ましくは０．１〜２重量％程度である
。

また、本発明の測定方法では、反応系中に抗体の作戊時
に用いた被免疫動物種の血清アルブミンを含有させる．
該血清アルブミンを反応系中に含有させる方法は、上記
感作を行った後に、該血清アルブミンを、不溶性担体の
分散または懸濁された反応媒体中に添加する方法、被測
定試料の希釈液中に該血清アルブミンを添加する方法な
ど種々の態様が考えられるが、何れでもよい。。血清ア
ルブミンの添加は、血清アルプミンを含有する溶液を加
えることにより、あるいは粉末状の血清アルプ兆ンを添
加することによってもよい．なお、反応系中の血清アル
ブミンの含有量は、測定対象物質の検出濃度等により適
宜選ばれるものであるが、通常０．０１〜８重量％、好
ましくは０．１〜５．０垂景％程度の濃度とされる。

なお、本発明の免疫学的測定方法において、凝集の程度
を検出する具体的な方法としては、凝集の有無を肉眼で
判定する方法、並びに反応液に光を照射し、散乱光ある
いは透過光を測定する光学的方法の何れをも用い得る。

すなわち、肉眼判定方法により、被測定試料中における
抗原の有無を判定したり、あるいは抗原を半定量的に検
出してもよく、また光学的測定方法により抗原を定量し
てもよい， また、本発明をヒトアルブミンを測定する場合に通用す
ると、保存安定性が良いばかりでな《、被免疫動物種と
異なる動物種の血清アルブミンを使用したときに見られ
る、ヒトアルブミンと該血清アルブミンとの交差が回避
される試薬及び測定方法が得られるので、本発明の効果
が特に発揮される．ヒトアルブミンを含有する被検検体
としては、何れも適用可能であるが、例えば尿及び血清
検体等が例示される． 〔作用及び発明の効果〕 本発明の免疫学的測定試薬には、不溶性担体に担持され
る抗体の作戒時に用いたのと同し動物種の血清アルブミ
ンが含有されているので、異種の勅物種の血清アルプミ
ンを用いた場合に比較し、試薬の保存安定性が効果的に
高められる．この理由は、抗体と血清アルブミンとの非
特異的相互作用が、抗体の作戒時に用いたのと同じ勅物
種の血清アルプミンを使用した場合には、生じ難いため
と准定される。さらに、本発明の免疫学的測定試薬にお
いては、使用する血清アルブミンと抗原との間に起こり
得る交差が、抗体作成時に用いたのと同し動物種の血清
アルブミンを使用するので回避される。同様に、本発明
の免疫学的測定方法においても、反応系中に被免疫動物
種の血清アルブミンが含有されるので、抗体と血清アル
ブミンとの非特異的相互作用及び交差反応を回避するこ
とができる．従って、本発明の試薬及び測定方法によれ
ば、免疫学的特異性を効果的に高め得るため、被測定試
料中の抗原を正確に測定することが可能となる． また、本発明の免疫学的測定試薬及び測定方法をヒトア
ルプミンの測定に適用する場合には、保存安定性が良い
だけでなく、被免疫動物種と異なる動物種の血清アルブ
ミンを使用した時に見られる、ヒトアルブミンと該血清
アルブミンとの交差が回避された試薬及び測定方法が得
られるので、ヒトアルブ１ンを常に正確に測定すること
が可能となる． 〔実施例の説明〕 尖脂班上 抗ヒトアルブミン抗体（ウサギ由来）をｌｍｇ／　ｍ　
１２のＩｇｃｌ度で含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（
ｐＨ＝９．０）を調製する。この抗ヒトアルブミン抗体
含有グリシン緩衝液１　０ｍｆに千均粒径が０．１３μ
ｍのポリスチレンラテックス（積水化学工業株式会社製
、固形分１０％）ｌｍ２を加え、３７゜Ｃで６０分間撹
拌し、しかる後、４゜Ｃの温度で６０分間遠心分Ｘｆｆ
ｌ（１８００Ｏｒｐｍ）を行う。

遠心後、上清を捨て去った沈澱物に、濃度ｌ．２重量％
のウサギ血清アルブミン含有０．１Ｍグリノン緩衝液（
ｐＨ＝９．０）ｌｏｍｆを加え、ラテノクスを悲濁させ
て、測定試薬を得る．上記測定試薬を４”Ｃの温度で保
存し、試薬１００μ乏に、希釈液として上記ウサギ血清
アルブビン含有グリシンｌ１衝液９００μｌを混合し、
セル長５ｍｍのガラスセルにより７００ｎｍの吸光度を
測定した。

止鮫史上 抗ヒトアルブミン抗体（ウサギ由来）をｌｍｇ／　ｍ　
ｌのＩｇ（４度となるように０．１Ｍグリシン緩衝ｆｉ
（ｐＨ＝９．０）に含有させた抗ヒトアルブミン抗体含
有グリシン緩衝液１０ｍｌに、平均粒径が０．１３μｍ
のポリスチレンラテックス（積水化学工業株式会社製、
固形分１０％）ｌｍｌを加え、３７゜Ｃで６０分撹拌し
、次に４　’Ｃの温度で６０分間遠心分離（１８０００
ｒｐｍ）する．遠心後、上清を捨て去った沈澱物に、１
．２重量％の牛血清アルプミン含有０．１Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ＝９．０）ｌｏｒ＋／！を加え、ラテックス
をｇ濁させて試薬を得る。この測定試薬を４゜Ｃの温度
で保存し、試薬１００μｅに、希釈液として上記生血清
アルブミン含有グリシン緩衝液９００μｌを混合し、セ
ル長５圓のガラスセルにより７００ｎｍの吸光度を測定
した． 上記実施例ｌ及び比較例ｌにおける試薬保存期間と７０
０ｎｍにおける濁度の変化の関係を下記の第１表に示す
。

第　　Ｉ　　表 第１表より、従来法すなわち比較例１では、測定試薬自
身の自己凝集が生し、保存期間の長期化に連れて濁度が
急速に上昇していくことがわかる．これに対して、実施
例１の測定拭薬では、自己凝集を起こさないため、濁度
の上界がほとんどなく、保存安定性に優れていることが
わかる。

犬友池１ 抗ヒトＣＲＰ抗体（ヤギ由来）のＩｇＧｉｆｉ度が１　
ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｅとなるように０．１Ｍグリシン１Ｍ
　ｆＩｉ１　（ｐ　Ｈ＝９．０）　に含有させ７或る抗
！＝｝ＣＲＰ抗体含有グリシン緩衝液１０ｍ乏に、平均
粒径が０．２４μｍのラテックス（積水化学工業株式会
社製、固形分１０％）ｌｍｆｆｉを加え、３７゛Ｃの温
度で６０分間撹拌し、次に、４゜Ｃの温度で６０分間遠
心分Ｍ（１８０００ｒｐｍ）する。遠心後、上清を捨て
去った沈澱物に、０．７重量％の濃度でヤギ血清アルブ
ミンを含有する０．１Ｍグリシ７Ｍ街液（ｐＨ＝９．０
）１０ｍｆを加え、ラテックスを懸濁させて測定試薬を
得る。この測定試薬を４　’Ｃの塩度で保存し、該測定
試薬１００μｌに、希釈液として上記ヤギ血清アルブミ
ン含有グリシン緩衝液９００μｌを混合し、セル長５鄭
のガラスセルにより７　０　０　ｎｍの吸光度を測定し
た．比較例２ 抗ヒトＣＲＰ抗体（ヤギ由来）のＩｇＧ４度が１　ｍ　
Ｂ　／　１　ｍ　ｌとなるように、該抗ヒトＣＲＰ抗体
をＯ．ＩＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）に混合し、こ
の抗ヒ｝ＣＲＰ抗体含有グリシン媛衝液１０ｒｒ＋ｊ！
に、平均粒径が０．２４μｍのラテノクス（積水化学工
業株式会社製、固形分１０％）１ｍｌを加え、３７゜Ｃ
で６０分間撹拌し、次に４℃の温度で６０分間遠心分離
（１８０００ｒｐｍ）する．遠心後、上・清を捨て去っ
た沈澱物に、０．７重量％の牛血清アルブミンを含有す
るＯ．ｔＭグリシン緩衝液（ｐＨ＝９．０）１０ｒｒ＋
ｊ！を加え、ラテックスを懸濁させて測定試薬を得る。

この測定試薬を４゜Ｃで保存し、該測定試薬ｌ００μｉ
に、希釈液として上記生血清アルブミン含有グリシン緩
衝液９００μｌを混合し、セル長５ＩＩＩＩｍのガラス
セルを用いて、７００ｎｍの吸光度を測定した。

上記実施例２及び比較例２における試薬の保存期間と７
００ｎｍにおける渇度の変化を下記の第２表に示す。

第 ２ 表 第２表から、従来法（比較例２）の測定試薬では、測定
試薬自身において自己凝集が起こっており、それによっ
て保存期間の長期化に伴って濁度が急激に上昇すること
がわかる。これに対して、本発明（実施例２）の測定試
薬では、自己凝集が生しないため、濁度の上昇がほとん
どなく、保存安定性に優れていることがわかる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）被測定試料中の抗原に対応する抗体が担持された
   不溶性担体と、前記抗体の作成に用いた被免疫動物種の
   血清アルブミンとを含有することを特徴とする免疫学的
   測定試薬。
2. （２）前記被測定試料中の抗原がヒトアルブミンである
   請求項１に記載の免疫学的測定試薬。
3. （３）被測定試料中の抗原に対応する抗体を不溶性担体
   に担持させ、免疫反応により生じた不溶性担体の凝集の
   程度を検出することにより、被測定試料中に含有された
   抗原を検出する方法において、反応系中に抗体の作成時
   に用いた被免疫動物種の血清アルブミンを含有させるこ
   とを特徴とする免疫学的測定方法。
4. （４）前記被測定試料中の抗原がヒトアルブミンである
   請求項３に記載の免疫学的測定方法。