NL8003542A

NL8003542A - Agglutineringsreagens voor diagnostiseringsproeven.

Info

Publication number: NL8003542A
Application number: NL8003542A
Authority: NL
Original assignee: Siber George
Priority date: 1979-06-19
Filing date: 1980-06-18
Publication date: 1980-12-23
Also published as: DK258080A; DK166234C; GB2052059A; NO153910B; CA1138331A; US4310508A; BE883905A; AU5940280A; NO153910C; SE448577B; AU538062B2; CH646524A5; FR2459480B1; FR2459480A1; IT8067909A0; DE3022681C2; NL191323C; DK166234B; ZA803473B; NO801830L

Description

i IT.0.29.147 \

Agglutineringsreagens voor diagnostiseringsproeven

De uitvinding heeft betrekking op agglutineringsproeven voor de directe agglutinering van deeltjes^die zijn gericht op het vaststellen van het al dan niet aanwezig zijn van antigenen in vloeistoffen van het lichaam zoals serum, urine, cerebrospinale vloei-5 stof en dergelijke als hulpmiddel in de diagnose van bepaalde fysiologische of pathologische afwijkingen bij mens en dier.

De detectie van microbi’éle antigenen in vloeistoffen van het lichaam kan doelmatig zijn bij de snelle diagnose van een toenemend aantal infecties. Een groot probleem is echter dat de bekerde be-10 schikbare methoden onvoldoende sensitief zijn (immunodiffusie, CIE) en derhalve falen bij de indicatie van aanwezige antigenen bij een aanzienlijk gedeelte van geïnfecteerde patiënten of te veel tijd in beslag nemen voor een snelle diagnose (RIA, ELISA). In sommige gevallen wordt het antigeen-antilichaam-complex langzaam gevormd 15 en/of de gevormde deeltjes zijn te klein voor een observatie met zekerheid. De mogelijkheid tot detectie heeft men verbeterd door

S

het invoeren van agglutinatieproeven onder toepassing van deeltjes als dragers met op de oppervlakte daarvan het antigeen of het anti-lichaam-molecuul dat daarop is geadsorbeerd of gebonden.

20 Dergelijke agglutineringsproeven kunnen volgens de indirecte methode worden uitgevoerd, waarbij het klinische monster wordt gemengd met antilichaam in een bepaalde verdunning, waarna na een geschikte incubatietijd een indicatorsysteem bestaande uit een complex van het antigeen gebonden aan een speciale drager aan het 25 mengsel wordt toegevoegd. Indien antigeen in het klinische monster aanwezig is staat geen antilichaam ter beschikking voor een reactie met het antigeen/drager-complex en er treedt geen agglutinatie op, dat wil zeggen dat het niet optreden van agglutinatie een positieve proef betekent voor het antigeen. Indien omgekeerd geen antigeen 30 in het klinische monster aanwezig is reageert het antilichaam met het antigeen/drager-complex waardoor een agglutinatie van het als indicator gebruikte monster wordt veroorzaakt. De theorie met betrekking tot dergelijke agglutineringsproeven is bekend, bijvoorbeeld uit de Amerikaanse octrooischriften 3.171.783> 3*775.536, 35 3.873*683, 3.879.262, 4.003.988 en 4.045'·384·

Reeds enige tijd is men van mening dat de enige doelmatige diagnostisering van een door een infectie aangetast deel een vroege 800 35 42 2 f / snelle detectie is van antigenen in samenhang met het de infectie veroorzakende reagens, dat wil zeggen het direct aangeven van de richting voor een effectieve behandeling.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een directe 5 agglutineringsproef voor de detectie van antigenen.

Yolgens de uitvinding werd een bijzonder sensitieve agglutineringsproef voor de detectie van antigenen zoals proteïnen en de polysacchariden van verscheidene microOrganismen waartoe bacteriën, protozoën en fungi behoren, in kleine concentraties in vloeistoffen 10 van het lichaam gevonden. Een proef volgens de onderhavige uitvinding is onderstaand beschreven, waarbij routinematig de detectie van 0,2 nanogram per milliliter van de gecapsuleerde polysacchariden van pathogene bacteriën mogelijk is. Dit betekent een sensibiliteit die met een factor 25 - 250 groter is dan de sensibiliteit van de op 15 grote, schaal toegepaste tegenstroom-methoden van de immunoëlektro-forese (CIE) en een sensibiliteit die ten minste gelijk is aan de radioimmuno-methode (RIA). Omdat de CIE-methode een snelle methode is vereist deze methode daarnaast* geoefend laboratoriump.ersoneel en bijzonder dure reagentia en apparatuur terwijl de methode een be-20 perkte sensibiliteit van 10-50 nanogram per milliliter voor de meeste bacteriële polysacchariden oplevert. Daar betrekkelijk kleinere antigeenconcentraties in vloeistoffen van het lichaam veelvuldig voorkomen worden vaak negatieve CIE-proefresultaten waargenomen bij patiënten met bacteriële infecties die in een cultuur zijn vast-25 gesteld. De EIA-methode is anderzijds met een factor 10 - 100 sensitiever dan de CIE-methode, maar vereist aanzienlijk meer tijd en is duurder.

Tot dusverre kon men agglutineringsproeven met deeltjes, die bijzonder eenvoudig en goedkoop zijn, slechts beperkt toepassen, 50 daar de sensibiliteit van deze proeven bijzonder klein is ten opzichte van kleine concentraties antigeen en op grond van de onvoldoende specificiteit veroorzaakt door het optreden van een niet specifieke agglutinatie, in het bijzonder bij serum-monsters. Door toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding wordt een sensibili-35 teit in de grootte-orde van 0,2 ng/ml bereikt en de frequentie waarmede niet-specifieke agglutinatie bij menselijk serum optreedt wordt tot 2 % of minder verlaagd. De uitvinding verschaft een methode voor de bereiding van antiserum waarmede proeven mogelijk zijn die uitmunten door een uniforme sensibiliteit, een goede stabiliteit en 40 een goede specificiteit.

800 3 5 42 3 \ $

Aan de uitvinding lag derhalve het probleem ten grondslag een sensitieve agglutineringsproef met deeltjes te verschaffen voor de detectie van microbiële antigenen in vloeistoffen van het lichaam bij concentraties van 0,2 ng per milliliter vloeistof van het lichaam.

5 Aan de uitvinding lag voorts het probleem ten grondslag een agglutineringsproef met deeltjes te verschaffen met een niet-specifieke agglutineringsgraad met menselijk serum van 2 % of kleiner.

In het bijzonder lag aan de onderhavige uitvinding het probleem 10 ten grondslag een verbeterde agglutineringsproef met deeltjes te verschaffen voor de snelle detectie van polyribofosfaat (PEE) dat het gecapsuleerde polysaccharide van Haemophilus Influenzae type b . is.

Een beperkte sensibiliteit is het hoofdprobleem van de tot dus-15 verre bekende methoden voor de detectie van microbieel antigeen.

Het gevolg daarvan is dat de detectie van bacterieel antigeen niet bij alle patiënten met vastgestelde infecties mogelijk is. Bijvoorbeeld is gebleken dat volgens de methode van de tegenstroom immuno-elektroforese of volgens agglutineringsproeven met deeltjes bij 20 7 - 22 % patiënten met Hi.b. meningitis, bij 58 % patiënten met H.i.b. epiglottitis, bij 20 - 39 % patiënten met bacteriële pneumococcen-pneumonie en bij 50 - 90 % patiënten met niet-bacteriële pneumococcen-pneumonië antigeen in het betreffende serum of in de cerebrospinale vloeistof niet kan worden aangetoond. Echter kan een 25 geneeskundige volgens de radioimmuno-methode, waarmede de detectie van 0,5 ng/ml of minder mogelijk is, alle gevallen van H.i.b. meningitis bij het eerste optreden daarvan diagnostiseren. ïïit de proefresuitaten blijkt eveneens dat de antigeenconcentratie bij 37 % van de patiënten kleiner was dan 10 ng/ml, dat wil zeggen be-30 neden de sensibibiliteitsgrens van de meest toegepaste technieken volgens de tegenstroom immunoëlektroforese.

Volgens de onderhavige uitvinding werd een agglutineringsproef met deeltjes gevonden met een sensibiliteitsgraad die vergelijkbaar is met die van de radioimmuno-proef. Be grote sensibiliteitsgraad 35 die wordt bereikt met de proef volgens de uitvinding is het resultaat van modificaties van tot dusverre bekende agglutineringsproeven met deeltjes, namelijk de selectie van een specifiek H.i.b. antiserum, het gebruik van een globulinefractie van het antiserum, wassen van het betreffende gesensibiliseerde deeltje en verlenging 40 van de incubatietijd van de agglutineringsproef met deeltjes van 800 3 5 42 t 4 gewoonlijk 5 tot ongeveer 45 minuten of langer, a) Sensibiliteit

De keuze van het antiserum beïnvloedt in aanzienlijke mate de sensibiliteit van de proef. Zes antiserums bereid in drie speciën 5 van dieren produceren deeltjes' met sensibiliteiten variërend van 0,2 namogram tot meer dan 1000 namogram ERE per milliliter.

De functionele kwaliteit van het specifieke antilichaam alsmede de concentratie daarvan zijn belangrijk. Het antiserum dat het meest sensitieve deeltje oplevert heeft niet de grootste concentratie 10 antilichamen, zoals is bepaald door een radio-antigeen-bindproef.

Zes antiserums tegen vol Haemophilus Influenzae type b werden in vier konijnen, een ezel en een paard volgens de immuniserings-schema’s van Η. E. Alexander en medewerkers beschreven in Journal of Immunology 207-211, 1946 bereid.

15 Onder de term "deeltjes" zoals in de onderhavige uitvinding wordt gebruikt worden deeltjes verstaan die inert en neutraal ten opzichte van de andere componenten zijn en die het vermogen hebben antiserums op een irreversibele wijze te adsorberen. Dergelijke deeltjes kunnen glazen bolletjes, polybutadieen, polystyreen, poly-20 butadieen-styreen, enzovoort, zijn met een gemiddelde deeltjesgrootte van ongeveer 0,15 tot ongeveer 0,9 yum. Bij voorkeur worden poly-styreen-latex-deeltjes met een uniforme diameter van ongeveer 0,81 jam in de vorm van een suspensie in gedestilleerd water met 10 gew.% per volume-eenheid met de volgende antiserums op de volgende wijze 25 gevoelig gemaakt :

De volle antiserums van de ezel en de konijnen werden elk met een verdunningsgraad van 1/500 en het volle antiserum van het paard met een verdunningsgraad van 1/200 met een gestandaardiseerde, met glycine gebufferde zoutoplossing (0,1 M glycine, 0,9 gew.% natrium-50 chloride, pH 8,2) verdund. Antilichaam werd aan de latexdeeltjes geadsorbeerd door toevoeging van 1 gew.dl van de 10-gew.procents latex-suspensie aan 80 gew.dln van het verdunde antiserum en bij kamertemperatuur 1 uur geïncubeerd. De vrije hoeveelheid antiserum werd gedecanteerd na 10 minuten centrifugeren met een intensiteit 55 van 12.000 G·. Het uit deeltjes bestaande lates>residu werd gesuspendeerd in een met glycine gebufferde zoutoplossing die een kleine hoeveelheid proteïne bevat , dat wil zeggen 0,1 gew.% menselijk serum-albumine, of 0,1 gew.% ezelserum, konijneserum of paardeserum zoals het geval is ter verkrijging van een 0,125-gew.procents latex- werd 40 suspensie die opnieuw v gecentrifugeerd en opnieuw werd gesuspen- 800 3 5 42 5 “ï deerd in een met glycine gebufferde zoutoplossing. Foetaal kalfs-serum dat volgens de radioimmuno-proef geen anti-PEF-antilichaam bevatte, werd gebruikt als verdunningsmiddel voor standaard oplossingen van PRF-antigeen.

5 De agglutinering werd uitgevoerd door toevoeging van evenmatige hoeveelheden van 0,05 ml antigeen bevattende vloeistof aan 0,01 ml van een gesensibiliseerde latex-oplossing op een monster-glas-plaat je voo rzi enfSerami sche ringen voor serologische proeven, let glasplaatje werd in een vochtige kamer bij normale tempe- 10 ratuur met een toerental van 180 omwentelingen per minuut geroteerd en na 45 minuten werd de agglutinatie onderzocht. De agglutinatie werd met 4+ gewaardeerd in het geval dat het agglutineringsmengsel helder was geworden en grove klonters latexdeeltjes konden worden waargenomen, met 3+ in het geval dat het mengsel troebel bleef ter-15 wijl daarbij grove klonters waarneembaar waren, met 2 in het geval dat het mengsel troebel bleef met een gemakkelijk waarneembare granulatie en met 1+ in het geval dat het mengsel troebel bleef met slechts een minimale granulatie. Een agglutinatie van 2 en groter geldt als positief. De vergelijkbare sensibiliteiten zijn in tabel A 20 vermeld.

TABEL· A

Sensibiliteit van de LDA-proef met zes antiserums tegen Haemophilus Influenzae type b 1) Ί)

Serum Anti-PRF antilichaam ' Anti-PEE antilichaam ' Gevoelig·»

in vol serum ( /Ug Ab geabsorbeerd aan latex- heid J

25 proteine/ml) ' deeltjes (/ug Ab pro- van de ΙΛΑ- teine/ml M) ) proef (ng PRF/ml) ezel 11.200 3,40 0,2 konijn 1 96,000 7,84 1 ,0 2 68.000 7,20 1,0 30 3 45.000 6,56 5,0 4 10.300 1,95 10,0 paard 3 · 100 1,84 1000 1 ) J Bepaald volgens radioantigeen-bindproef 35 ^ Kleinste concentratie PRE-5 in foetaal kalfsserum die een agglutinatie van 2+ of groter oplevert.

Uit tabel A blijkt dat de kwaliteit van het antiserum dat voor de sensibilisering van de latexdeeltjes wordt gebruikt sterk afhankelijk is van de sensibiliteit van de agglutineringsproef met latex- 800 3 5 42 6 deeltjes met betrekking tot de detectie van PEE-antigeen. Uit de in tabel A vermelde resultaten blijkt duidelijk dat het niet mogeljjk is de sensibiliteit slechts op basis van de concentratie van PEP in het antiserum bepaald volgens de radioantigeen-bindproef te voor-5 spellen. Een ezel-antiserum dat slechts met 12 % evenveel anti-lichaam als het beste konijne-antiserum bevatte leverde een preparaat van latexdeeltjes op met een 5 keren grotere sensibiliteit.

Be verklaring van dit verschil in sensibiliteit kan niet een effectievere bekleding van latexdeeltjes met ezel-antilichaam zijn, daar 10 latexdeeltjes bekleed met konijn-antiserum een antiliohaam-absorptie heeft die 2,3 keren groter is. Be agglutineringsactiviteiten van ezel-antiserum en konijne-antiserum voor rode bloedlichaampjes van schapen bekleed met PRE waren. gelijk ondanks de veel grotere concentratie van PRE-bindactiviteit in het konijne-antiserum.

15 Een meting van de associatiegraden toont aan dat ezel-anti- lichamen veel sneller combineren met PRE-antigeen dan konijne-antilichamen. Be associatie-halveringstijd van ezel-antilichamen is 20 minuten en die van konijhe-antilichamen meer dan 60 minuten.

Be oorzaak van dit verschil in associatiegraden is onbekend.

20 Be dissociatiegraad van antigeen/antilichaam-complexen bij aan wezigheid van een overmaat antigeen is een maat -roer de intensiteit van de binding of affiniteit van het antiliehaam. Het konijne-antilichaam dissocieert langzamer uit polyribose-fosfaat dan het ezel-antilichaam en derhalve heeft het een grotere affiniteit voor 25 antigeen. Bit resultaat versterkt de hypothese dat de graad van de combinatie van antigeen en anitlichaam in agglutinatieprocessen significaaier is dan de sterkte van de wisselwerking tussen het antigeen en het antiliehaam.

b) Gebruik van macroglobulinefractie voor het bekleden van latex-30 deelt.ies.

Be chromatografie met een moleculaire zeef van verscheidene dier-antiserums ten opzichte van bacteriële polysacchariden toont aan dat het merendeel van het anti-polysaccharide-antilichaam in paardachtige dieren (ezel, paard) aanwezig is in de macroglobuline-35 groep die wordt geëlueerd in de lege volume-eenheid van de betreffende kolom. In tegenstelling daarmede is het merendeel van het konijne-antilichaam aanwezig in de IgG-groep die op een later tijdstip wordt geëlueerd. Zoals uit tabel 3 blijkt kan het gebruik van de macroglobuline-fractie van ezel-antiserum of paard-antiserum met 40 een concentratie van 50 /ug proteine/ml voor het sensibiliseren van 800 3 5 42

X

7 latexdeeltjes de sensibiliteit van betrekkelijk zwakke antiserums van paardachtigen aanzienlijk verbeteren. De sensibiliteit van da beste antiserums wordt door deze modificatie niet verder verbeterd, hoewel de helderheid van de agglutinatiereactie met de lege volume-5 fractie aanzienlijk beter is. Het gebruik van de IgG-fractie van konijne-serum levert geen vergelijkbare verbeteringen in de sensibiliteit of helderheid van de agglutinatie op.

(TABEL B

Vergelijking van de sensibiliteiten van latex-deeltjes bekleed met 10 vol serum of de macroglobulinefractie van antiserums van paardachtigen ten opzichte van bacteriële polysacchariden.

Dier Antiserum Sensibiliteit*van Sensibiliteit van gericht op latex-deeltjes be- latex-deeltjes ze- kleed met vol serum kleed met macro-(1/500 verdunning) globulinefractie 15 (50^ug proteine/ml) ezel-E Ξ. influenzae type b 1 ng/ml 0,2 ng/ml ezel-132 Ξ. influenzae type b , 0,2 ng/ml 0-,-2 ng/ml / ezel-W.J. Ξ. influenzae 20 type b 2 ng/ml 0,5 ng/ml ezel-I Neisseria menin- gitidis-groep Y 1 ng/ml 0,2 ng/ml paard-49 N. meningitidi-s groep A 0,5 ng/ml 0,2 ng/ml paard-46 N.meningitidi s 25 groep B >10.000 ng/ml 2 ng/ml * De kleinste concentratie antigeen die een agglutinatie met de -j- waardering 2 of groter oplevert is vermeld.

c) Het wassen van beklede latex-deeitjes.

50 Voor het verder verbeteren van de sensibiliteit van de ezel- antiserums werden de met antilichaam beklede latex-deeltjes die bekleed waren met verscheidene verdunningen van ezel-antiserum in een met glycine gebufferde zoutoplossing ongewassen en na 1, 2 en 5 keren wassen met een met glycine gebufferde zoutoplossing die 1/1000 te 35 gew.dln foetaal kalf-serum bevat/met elkaar vergeleken en de resultaten zijn in tabel C vermeld.

800 3 5 42 i 8

TABEL· C

Het effect van de verdunning van antiserum en het wassen van latex-deeltjes op de sensibiliteit bij de agglutineringsproef met latex-deeltjes onder toepassing van polyribosefosfaat.

Verdunning van Vastgestelde minimale concentratie van PRE®) ezel-antiserum, (ng/ml) het^ensibili nie-i: ge” 1 x Sewassen 2 x Sewas“ 3 x gewas-, ” wassen sen sen seren van latex- deeltjes 1/10 200 >1000 >1000 >1000 1/100 50 0,5 0,5 0,5 1/500 2 0,2 0,2 0,2 1/1000 0,5 0,2 0,2 0,2 1/2000 0,2 0,2 0,2 0,5 1/5000 >1000 >1000 >1000 >1000 *^een agglutinatie van 2+ of groter werd als een positief resultaat beschouwd.

Zoals uit de resultaten van tabel C blijkt hebben lage anti-serum-verdunningen geen sensibiliteit. Met verdunningen van 1/500 5 en groter worden maximale s'ensibiliteiten bereikt indien de latex-deeltjes zijn gewassen. Met ongewassen latex-deeltjes wordt een maximale sensibiliteit bereikt bij slechts een smal verdunnings-gebied. Twee keren wassen levert een maximale sensibiliteit op terwijl het resultaat van drie keren wassen een verlies aan sensi-10 biliteit kan zijn.

Gesensibiliseerde latex-deeltjes afkomstig van de wasproef werden bij 4°C opgeslagei ai na 12 en 24 maanden opnieuw aan de betreffende proef onderworpen. Latex-deeltjes, gesensibiliseerd met verdunningen van ezel-antiserum van 1/500 en 1/1000 en twee keren 1 5 gewassen kregen weer de oorspronkelijke sensibiliteit terwijl niet gewassen latex-deeltjes na 24 maanden een sensibiliteit hadden die met een factor 2-4 kleiner was.

d) Duur van de incubatietijd.

Be grafieken van fig. 1 tonen het verband tussen de proef-20 sensibiliteit en de incubatietijd. Grote concentraties antigeen agglutineerden de latex-deeltjes binnen 5 minuten. De sensibiliteit nam tijdens de eerste 45 - 60 minuten snel toe en daarna langzaam, waarbij met de preparaten . met de grootste sensibiliteiten na 10 uren een maximum van 0,05 ng/ml werd bereikt. Het serum vol- 30 0 3 5 42 * 9 gens de uitvinding van een paardachtig dier had hij alle incubatietijden een grotere sensibiliteit dan konijneserum. Als vergelijkende proef werden 50^ul van de als monster gebruikte oplossing en 10^ul beklede latex-deeltjes, die in het volgende zijn beschreven, op een 5 monsterglasplaatje voor serologische proeven gemengd en bij kamertemperatuur met 180 omwentelingen per minuut geroteerd. De glasplaatjes werden bedekt en het vochtigheidsgehalte werd gehandhaafd met sponzen die met warm water waren verzadigd. De glasplaatjes werden na de vermelde tijden beoordeeld.

10 Door de incubatietijd van vijf minuten tot 45 minuten of langer te verlengen wordt als resultaat een vergroting van de sensibiliteit met een factor 10-20 bereikt. Yoor praktische klinische doeleinden werd een incubatietijd van 45 minuten gekozen waarbij gewoonlijk met tussenpozen van 5-15 minuten werd afgelezen in gevallen waarbij 15 latexdeeltjes werden gebruikt die zijn bekleed met een antiserum van een paardachtig dier. De latexdeeltjes hadden een antigeen-sensibiliteit van 0,2 ng/ml vloeistof.

Er werd verwacht dat door vergroten van de sensibiliteit van de agglutineringsproeven met deeltjes ook de niet specifieke agglu-20 tinering wordt versterkt en het is gebleken dat in het geval van serum-monsters 69 % van de serums van kinderen die in een ziekenhuis war ai opgenomen deze latex-deeltjes agglutineerden. Dit belangrijk nadeel heeft eerst de uitgebreide toepassing van deze proefmethode beperkt. Als factoren die in verband staan met de agglutinering 25 van latex-deeltjes die zijn bekleed met gamma-globulinen worden serumcomponenten die tegen temperatuurverhoging niet bestand zijn (waarschijnlijk complementair) en anti-globulinen die tegen temperatuurverhoging bestand zijn beschouwd, die in het algemeen in lage concentraties zijn te vinden in menselijke serums in het bij-50 zonder van patiënten met chronische ontstekingsziekten.

Een niet specifieke agglutinering werd vastgesteld door agglutinering van controle-latex-deeltjes die waren gesensibiliseerd met vol niet-immuun dierlijk serum. Indien met macroglobuline beklede latex-deeltjes worden gebruikt worden de controle-latex-55 'deeltjes bekleed met de macroglobulinefractie van niet immuun serum.

Yolgens de uitvinding werd de frequentie van het voorkomen van een niet specifieke agglutinering met menselijk serum tot 2 % en kleiner verminderd door i) het toevoegen van niet immuun dierlijk serum aan de gesensibiliseerde latex-deeltjes; ii) door het direct 40 toevoegen van een als buffer dienend serum dat een polyanion en/of öiiu u j 42 10 een reducerend reagens bevat aan bet ineubatiemengsel en/of iii) door het inactiveren door temperatuurverhoging van de serums.

Het voorkomen van een niet specifieke agglutinering werd bepaald met serums die waren genomen van in een ziekenhuis opgenomen pediatrische en volwassen patiënten die niet onder de ziekte Haemophilus Influenzae type b leden. Alle serums werden met latex-deeltjes beproefd die waren gesensibiliseerd met ezel-antiserum (anti-PBE-latexdeeltjes) en met latexdeeltjes gesensibiliseerd met niet-immuun ezel-serum (controle-latexdeeltjes).

1d Θ V8f"b "b ©23

In vooraf gedane proeven werden serums^ die agglutinenvdie tegen temperatuurverhoging bestand zijn^beproefd onder toevoeging van 10^ul van een reducerend reagens zoals 1 .4-clithiotreitol (lïl) of 2-mercaptoëthanol (ME), toegevoegd aan het ineubatiemengsel aan het begin van de incubatie. De optimale concentraties voor DTT was 0,018M en voor ME 0,35M (de uiteindelijke concentraties in het incubatie-mengsel voor DT!E was 0,0026M en voor ME 0,05M).

In tabel I) zijn de resultaten vermeld die zijn verkregen met 104 pediatrische serums die *ten minste 24 uren op 4°C werden gehouden voordat de betreffende "proeven werden uitgevoerd.

800 3 5 42 11

TABEL D

Het voorkomen van een niet specifieke agglutinering met bewaarde 1) serums ' van in een ziekenhuis opgenomen kinderen die niet leden aan de door Haemophilus influenzae type b veroorzaakte ziekte.

agglutinering met anti-PZF latex- deeltjes negatief positief negatief positief agglutinering met controle-latex- deeltjes negatief positief positief negatief serum niet behandeld (h=104) 32 (31%) 65 (63%) 3 (3%) 4 (4%) serum door tempera-tuurverhoging geïnactiveerd (n=104) 49 (47%) 47 (45%) 1 0%) 7 (7%) toevoeging van normaal ezel-serum (2,5%) aan latex- deeltjes (n=104) 72 (69%) 23 (22%) 7 (7%) 2 (2%) serum door temperatuurverlaging ge-inactiveerd en toevoeging van normaal ezel-serum (2,5%) aan latex-deeltjes (n=104) 75 (72%) 23 (22%) 5 (5%) 1 (1%) toevoeging van normaal ezel-serum (2,5%) aan latex-deeltjes en toevoeging van LTï2) aan serum (n=53) 3) 52 (98%) 1 (2%) 0 0 ^ten minste 24 uren bij 4°G bewaard v<S<5r het uitvoeren van.de proef 2) 'dithiotreitol, uiteindelijke concentratie 0,0026M in het incubatie-mengsel 3) 'slechts 53 van de 104 monsters bevatten voldoende serum voor deze proef.

Met 69 % van de serums werd met anti-PRP niet-specifieke agglutinering verkregen en slechts 4 % werden door controle-latexdeeltjes geïdentificeerd.

Boor inactiveren door temperatuurverhoging (15 minuten bij éO°C) werd de niet specifieke agglutinering slechts zwak verminderd, tot 53 %> en het toevoegen van niet-immuun ezel-serum aan anti-PRP en ook 800 3 5 42 * 12 aan controle-latexdeeltjes werd de niet specifieke agglutinering tot 31 % verminderd; en door toevoegen van van een reducerend reagens, dat wil zeggen dithiotreitol, werd bet voorkomen van een niet specifieke reactie tot 2 % verlaagd. Met 52 aan een bewaring 5 onderworpen serums van volwassenen werden soortgelijke resultaten verkregen. Met slechts een serum werd een niet-specifieke agglutinering verkregen (positief met anti-PRE latexdeeltjes en controle-latexdeeltjes) door toevoegen van 2,5 normaal ezel-serum aan de latexdeeltjes en door toevoegen van DTT aan het incuhatiemengsel.

10 Onderzocht werd of met verse serums een hogere graad van een niet specifieke agglutinering werd bereikt. Daartoe werden 100 serums van volwassenen genomen en direct met ijs gekoeld en op dezelfde dag werden met de serums proeven genomen. Elk serum werd met en zonder reductiemiddel (ME) beproefd en met en zonder een 15 inactivering door temperatuurverhoging (5 minuten bij 60°C).

De agglutinering werd met anti-PRP latexdeeltjes en controle-latex-deeltjes onderzocht die telkens 2,5 gew.% normaal ezel-serum bevatten en die in alle gevallen met elkaar overeenkwamen. De patronen van de agglutinering zijn in tabel E samengevat.

TABEL· E

Miet-specifieke agglutinering met verse serums van 100 volwassenen die niet leden aan door Haemophilus influenzae type b veroorzaakte ziekte"!)

Zonder inactivering Met inactivering door temperatuur- door temperatuur-verhoging 2) verhoging 2) Aantal Opmer-

Patroon zonder ME met ME1^ zonder ME met Mr' serums kingen 1 (-) (-) (-) (-) 43 geen anti- globulinen geen complementaire component 2 (+) (-) (+) (-) 28 slechts anti- globulinen 3 (+) (+) (-) (-) 4 slechts complementaire component 1 800 3 5 42 (-) (+) (-) (-) 14 slechts complementaire component ("heracti-veerd' door ME) * 13

Vervolg van TABEL E.

5 (+) (+) (+) (-) 10 antiglobu- linen en complementaire component 6 (-) (-) (-) (+) 1 aantal serums die een niet-specifie-ke agglu-tinering veroorzaken 42 38 38 1 1) 'Alle proeven werden met anti-PRE en controle-latexdeeltjes uitgevoerd die 2,5 % normaal ezel-serum bevatten. Er was volledige overeenstemming tussen 'anti-PRE en controle-latexdeeltjes.

2) '2-mercapto'ëthanol, de uiteindelijke concentratie in het incubatie-mengsel van 0,05M.

Met 42 % onbehandelde serums (niet onderworpen aan een behandeling door temperatuurverhoging, geen reductiemiddel) werd een niet-specifieke agglutinering verkregen. Boor toevoeging van een reductiemiddel (ME) werden 28 van de serums negatief (patroon 2), 5 hetgeen de aanwezigheid van antiglobulinen aantoonde. 14 Serums^die aanvankelijk negatief waren?werden positief (patroon 4) hetgeen betekende dat een agglutinine dat tegen temperatuurverhoging niet bestand was door mercaptoëthanol was heractiveerd. Het netto effect ME afzonderlijk was een vermindering van de niet-specifieke agglu-10 tinering tot 38 %. Een soortgelijke graad van de niet-specifieke agglutinering wordt bereikt met slechts het inactiveren door temperatuurverhoging. Be combinatie van een inactivering van de serums door temperatuurverhoging met het toevoegen van een reductiemiddel aan het incubatiemengsel vermindert het voorkomen van de niet-15 specifieke agglutinering tot ongeveer 2 % en kleiner.

Baar het inactiveren door temperatuurverhoging tijdrovend is heeft men een alternatieve methode ontwikkeld voor het elimineren van het niet-specifiek agglutineren door serum-factoren die tegen een temperatuurverhoging niet bestand zijn. Verscheidene poly-20 anionen waartoe natrium-polyanethol-sulfonaat (ïïES), dextraansulfaat, 800 35 42 , 14 i carragenine e^ieparine behoren verhinderen het niet-specifiek agglutineren van met globuline beklede latexdeeltjes door serumfactoren die tegen temperatuurverhoging niet bestand zijn.

Honderd verse serums van volwassenen werden beproefd met een 5 serum-buffer die zowel ME (zie boven) als UPS in een concentratie van 0,05 gew.?6 bevatte. Met slechts één van de 100 serums werd een niet-specifieke agglutinering met anti-PRE en controle-latexdeeltjes verkregen. Het niet-specifieke agglutineren met dit serum werd verhinderd door verwarmen.

10 Desgewenst wordt een serum-buffer, die zowel een reductiemiddel als een polyanion bevat? toegevoegd aan het incubatiemengsel.,dat gestabiliseerde gesensibiliseerde latexdeeltjes en een serum-monster bevat.

Een dergelijke serum-buffer wordt als volgt bereid : 15 Een 14 molaire oplossing van 2-mercaptoëthanol (een gestan

daardiseerde oplossing met de volle sterkte) wordt in een verhouding van 1/40 met een met glycine gebufferde zoutoplossing (GGZ), 0,1M

glycine, 0,9 gew.% natriumchloride, pH 8,2) verdund. Een 5-gew.pro- in water cents oplossing van polyanetho 1-sulfonaat^wo'rdt in een verhouding 20 van 1/100 met een hoeveelheid van de vermelde GGZ-oplossing verdund.

De serum-buffer kan andere reductiemiddelen zoals dithiotre-itol, glutathion, cysteine en dergelijke, in plaats van 2-mercapto-ethanol bevatten. Daarnaast kunnen andere polyanionen zoals dextraan-sulfaat, heparine en carragsrine en dergelijke worden gebruikt, voor 25 zover zij de antigeen/antilichaam-reactie niet nadelig beinvloeden.

In tabel P zijn de optimale concentraties van de reagentia in de serum-buffer vermeld. Hogere concentraties reductiemiddelen of polyanionen verminderen de sensibiliteit van de proef en met lagere concentraties wordt geen onderdrukking van de niet-specifieke agglu-30 tinering in alle serums bereikt.

800 3 5 42 15

TABEL E

Optimale concentraties van de reagentia in "serum-buffer”.

DTT 2-ME IPS

(uiteindelijke concentraties in het proefmengsel) verlaagde sensibiliteit 12,8 mM 40° mM 0,07 gew.% goede sensibiliteit + onderdrukking van de niet-specifieke agglu- tinering 2,6 mM 50 mM 0,007 gew.^ geen onderdrukking van de niet-specifieke agglutinering 0,65 mM 10 mM 0,0007 gew.% ITT - dithiotreitol 2-ME 2-mercaptoëthanol IPS - natrium-polyanetholsulfonaat

De effectieve concentratie van het niet-immune dierlijke serum 5 in de latex-suspensie werd opnieuw in het beproevingssysteem onder toepassing van de tevoren .beschreven serumbuffer onderzocht.

Concentraties van niet-immuun dierlijk serum kleiner dan 0,25 gew.% in de deeltjes bevattende suspensie (kleiner dan 0,055 gew.% in het uiteindelijke proefmengsel) leverden in sommige gevallen een 10 niet-specifieke agglutinering op ondanks de toepassing van serumbuffer .

Concentraties van niet-immuun dierlijk serum tot ongeveer 25 gew.% in de latex-suspensie (3,5 gew.% in het uiteindelijke proefmengsel) zijn in de vermindering van het voorkomen van een 15 niet-specifieke agglutinering doelmatig, echter wordt de sensibiliteit van de proef door polyribofosfaat met een factor 2 verminderd door de grootste concentratie, dat wil zeggen 25 gew.%.

De niet specifieke agglutinering in andere vloeistoffen van het lichaam.

20 De meeste urine-monsters veroorzaken met anti-PEP en controle- latexdeeltjes geen specifieke agglutinering. Dit kan worden tegengegaan door verwarmen (5 minuten op 100°c) of door filtreren van de urine. Volgens de uitvoeringsvorm die de voorkeur verdient wordt een filter van 0,45yum gebruikt.

25 Monsters "ran. .cerebrospinale vloeistoffen veroorzaken zeer zelden een niet-specifieke agglutinering, hetgeen wordt tegengegaan door verwarmen (5 minuten op 100°C). Het PRE-antigeen is bestand tegen de 800 3 5 42 * 16 vermelde verwarming en filtrering.

Het volgende specifieke voorbeeld illustreert een uitvoeringsvorm volgens de uitvinding die de voorkeur verdient.

a) Bekleding van latex-deeltjes.

5 Ter verkrijging van anti-ERE latex-deeltjes werd vol ezel-anti- serum tegen Ξ. influenzae type b in een verhouding van 1/500 verdund met de met glycine gebufferde zoutoplossing (GGZ) en 30 minuten verwarmd op 5^°C. Een gedeelte van de latex-suspensie ( een 10-gew. procents suspensie van deeltjes met een diameter van 0,81^um in 10 gedestilleerd water) werd aan 80 gew.dln verdund antiserum toegevoegd ter verkrijging van een uiteindelijke concentratie van latexdeeltjes van 0,125 gew.%. Het mengsel werd 1 uur bij kamertemperatuur ge-incubeerd, 10 minuten met een intensiteit van 12.000 G gecentrifugeerd en de bovenliggende vloeistof werd gedecanteerd. Be deeltjes 15 werden opnieuw gesuspendeerd in een gelijke volumehoeveelheid GGZ-oplossing die 0,1 gew.% niet-immuun ezel-serum bevatte en zoals is vermeld opnieuw gecentrifugeerd en daarna opnieuw gesuspendeerd in een gelijke volumehoeveelheid van de GGZ-oplossing die 2,5 gew.% -niet-immuun ezel-serum bevarfcte.

20 Controle-latexdeeltjes werden zoals is vermeld verkregen, met dien verstande dat niet-immuun ezel-serum werd gebruikt dat met de GGZ-oplossing in een verhouding van 1/500 was verdund voor het vooraf bekleden van de latexdeeltjes. Het niet-immune ezel-serum dat voor alle proeven werd gebruikt dient serum te zijn dat voor de 25 immunisering is genomen van hetzelfde dier dat werd geïmmuniseerd.

Indien de macroglobuline-fractie dient te worden gebruikt worden de totale hoeveelheid vö<3r-immuun en immuun ezel-serum ge-chromatografeerd door een met Sephacryl G-200 gel gevulde filtratie-kolom en de fracties die uit het lege volume van de 30 kolom worden geëlueerd worden in een vat opgevangen. Be in een vat opgevangen vloeistoffracties, die tot een protelne-concentratie in de GGZ-oplossing van 50yug proteine per milliliter zijn verdund worden vervolgens vervangen door onverdund vol-serum ter uitvoering van de tevoren vermelde werkwijze.

55 b) Bereiding van de serum-buffer.

Een 14-niolaire 2-mercaptoëthanol-oplossing (een gestandaardiseerde oplossing met de volle sterkte) wordt in een verhouding van 1/40 in GGZ-oplossing verdund. Baaraan wordt natrium-poly-'ane tho 1-sulfonaat toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 gew.%.

800 3 5 42 'i 17 c) Uitvoering van de proef.

De proef wordt volgens de uitvinding als volgt uitgevoerd:

Telkens 50yul positief controle-serum, negatief controle-serum en-ran elk serum, oerebrospinale vloeistof en urine die dienen te wor-5 den onderzocht worden in elk van de twee kuiltjes van een gereinigde droge plaat voor serologisohe proeven volgens het volgende schema gebracht. Het positieve controle-serum bevatte 2 ng PEP antigeen/ml. Het negatieve controle-serum bevatte antiglobulinen die zowel anti-EEP latexdeeltjes als controle-latexdeeltjes agglu-10 tineren tenzij serum-buffer is toegevoegd, hetgeen een controle betekent van de activiteit van de serum-buffer. Urinemonsters werden vooraf gefiltreerd met behulp van een filter van 0,45^um.

Positief Negatief Proef- CSV-.. Urinecontrole controle serum monster monster serum serum 15 rij A: anti-PEF __ deeltjes (^SB^) (^) (^J) / rij B: controle deeltjes (sB^) (sB^) (s3^) (^) (^J) SB = serum buffer toegevoegd CS7 = cerebrospinale vloeistof 25 Aan elk van de kuiltjes die positief controle-serum, negatief controle-serum en serum-monsters bevatten werden 10yul serum-buffer toegevoegd.

De latex-suspensies werden zwak geroerd zonder schuimen en aan ieder kuiltje van elk paar daarvan (rij A) werden 10yul anti-PEP 30 latexdeeltjes toegevoegd en de mengsels werden goed gemengd.

Aan elk tweede kuiltje van elk paar daarvan werden. 10^ul controle latexdeeltjes toegevoegd en de mengsels werden goed gemengd.

De plaat met daarop de met de monsters gevulde kuiltjes werd in een- schudinrichting voor serologisohe proeven gebracht en ongeveer 55 45 minuten geroteerd. De kamer diende vochtig te worden gehouden door sponzen die met warm water waren verzadigd, waarbij gedurende de proef condensatie zichtbaar was. De plaat werd uit de kamer genomen, hoeveelheden condensaat werden door afvegen verwijderd en de agglutinering werd beoordeeld door de houders in schuin invallend 800 3 5 42 18 licht voor een zwart achtergrond heen en weer te bewegen : 4+ grote klonters - heldere achtergrond 3+ grote klonters - melkachtige achtergrond 2+ kleine klonters 5 1+ fijn grannlair 0 melkachtig

De waarderingen van monsters met 3+ en 4+ dienen zodanig te worden bereikt dat de monsters op een afstand van een armlengte gehouden gemakkelijk visueel zijn te beoordelen. Yoor de waardering 10 2+ dienen de monsters op een kortere afstand te worden beoordeeld.

De resultaten waren als volgt :

Haemophilus latex deeltjes Controle Opmerkingen latexdeeltjes (+) (-) positief met betrekking tot Ξ. influenzae type b 15 antigeen (-) (-) negatief met betrekking tot Ξ. influenzae type b antigeen * (+) (+) niet specifieke aggluti- ' nering. Ξ. influenzae type b antigeen kan al 20 dan niet aanwezig zijn

Een positieve agglutinering met de waardering 2+ dient te worden beschouwd als "zwak positief".

In de onderhavige aanvrage zijn de voor de warmtebehandeling en de incubatie toegepaste tijden en temperaturen optimaal genomen, 25 waarbij wordt opgemerkt dat dezelfde resultaten kunnen worden verkregen door toepassing van hogere temperaturen met kortere tijden of omgekeerd met lagere temperaturen en langere tijden. Yoorts zijn in de onderhavige aanvrage reagentia, andere middelen en technieken toegepast waarmede de werkwijze volgens de uitvinding bijzonder 30 doelmatig wordt uitgevoerd. Onder deskundigen ligt het voor de hand de dat variaties in‘'technieken, de tijden, de volumina en de soorten materialen, andere middelen en apparatuur binnen het raam van de uitvinding mogelijk zijn.

800 3 5 42

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van een reagens dat agglutineert bij een contact met vloeistoffen van het lichaam die antigenen bevatten, met het kenmerk, dat men een hoeveelheid 5 antigeen in een dierlijke species injecteert en de dierlijke species gelegenheid geeft antiserum ten opzichte van het antigeen te produceren; dat men het op deze wijze geproduceerde antiserum wint; dat men het verkregen antiserum verdunt met een fysiologisch buffer-systeem met compatibiliteit voor warmbloedigen; dat men de op deze 10 wijze verkregen antiserum-oplossing mengt met een suspensie van deeltjes; dat men de suspensie incubeert; dat men de verkregen suspensie centrifugeert en het-niet geadsorbeerde antiserum decanteert; dat men de verkregen deeltjes opnieuw suspendeert in een fysiologisch buffersysteem met compatibiliteit voor warmbloedigen en dat men de 15 verkregen deeltjes opnieuw centrifugeert en opnieuw suspendeert in het vermelde buffersysteem dat niet immuun dierlijk serum van dezelfde species bevat die het antiserum heeft geproduceerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat men als dierlijke species een paardachtige species gebruikt. 20 3· Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men als paardachtige species de species ezel gebruikt.

4. Werkwijze volgens conclusies 1 - 3, m e t het kenmerk, dat men als antigeen eenjantigeen gebruikt behorend tot de groep van polysacchariden. 25 5· Werkwijze volgens conclusies 1-4» met het ken merk, dat men als deeltjes polystyreendeeltjes gebruikt met een gemiddelde deeltjesgrootte van ongeveer 0,15 tot ongeveer 0,9 ^um.

6. Werkwijze voor de bereiding van een reagens dat agglutineert bij een contact met vloeistoffen van het lichaam die.polysacchariden 30 bevatten, met het kenmerk, dat men een hoeveelheid van een polysaccharide in een paardachtige species injecteert ter verkrijging van antiserum ten opzichte van het vermelde antigeen; dat men het geproduceerde antiserum wint; dat men macroglobuline-fracties van het gewonnen antiserum met een hoge titer selecteert; 35 dat men de vermelde fractie verdunt met een fysiologisch buffersysteem met een compatibiliteit voor warmbloedigen; dat men het verdunde antiserum samenvoegt met een water bevattende suspensie van deeltjes; dat men de suspensie incubeert; dat men de vermelde suspensie centrifugeert en het niet geadsorbeerde antiserum decan-40 teert, dat men de verkregen deeltjes opnieuw suspendeert in een fy- 800 35 42 siologisch buffersysteem met compatibiliteit voor warmbloedigen en dat men de deeltjes opnieuw centrifugeert en opnieuw suspendeert in het vermelde buffersysteem dat niet immuun paardachtig serum bevat. 5 7· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men als polysaccharide polyribofosfaat gebruikt, het gecapsu-leerde polysaccharide van Haemophilus influenzae type b.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men als paardachtige species de species ezel gebruikt. 10 9· Een vloeibaar reagens met de eigenschap van agglutineren bij een contact met vloeistoffen die antigenen bevatten, gekenmerkt door een drager bekleed met dierlijk antiserum ten opzichte van de vermelde antigenen, gesuspendeerd in een fysiologisch buffersysteem met compatibiliteit voor warmbloedigen en niet immuun 15 dierlijk serum van dezelfde dierlijke species waarmede de antiserums zijn verkregen.

10. Vloeibaar reagens volgens conclusie 9, gekenmerkt door een polysaccharide als antigeen. •e /

11. Vloeibaar reagens volgens conclusie 9» gekenmerkt 20 door vol paardachtig antiserum als antiserum.

12 Vloeibaar reagens volgens conclusie 11, gekenmerkt doordat het paardachtige antiserum de macroglobuline-fractie van het paardachtige antiserum is. 1J. Een werk^voor de directe agglutinering voor de detectie van 25 antigenen in vloeistoffen van het lichaam waarvan wordt aangenomen dat de vloeistoffen dergelijke antigenen bevatten, met het kenmerk, dat men een monster van de vloeistof van het lichaam dat een serum of een plasma is mengt met het vloeibare reagens volgens conclusie 9 en een buffersysteem bestaande uit een polyanion 30 met het vermogen het effect van de sensibiliteit voor temperatuurverlaging van de bestanddelen van het monster te onderdrukken en een reductiemiddel met het vermogen antiglobuline-antilichaam in het monster te-verminderen, dat men het mengsel incubeert en daarna de graad van de agglutinering visueel beoordeelt. 35 14· Werkwijze voLgens conclusie 13, m e t het kenmerk, dat men een incubatietijd van 45 minuten of langer toepast. 15.Weckvijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 13» met het kenmerk, dat men als polyanion een polyanion toepast behorend tot de groep natriumpolyanethol-sulfonaat, dextraan-40 sulfaat, carragenine, heparine en dergelijke. 800 3 5 42 Λ

16. Werkwijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 13» met het kenmerk, dat men als reductiemiddel een reduc-tiemiddel toepast behorend tot de groep 2-mercaptoëthanol, dithio--r treitol, glutathion, cysteine en dergelijke. 5 17· Werkwijze voor de directe agglutinering voor de detectie van antigenen in vloeistoffen van het.lichaam waartoe serum en plasma behoren, waarvan wordt aangenomen dat zij de vermelde antigenen bevatten, met het kenmerk, dat men de vermelde vloeistof van het lichaam verwarmt, dat men de verwarmde vloeistof van het 10 lichaam mengt met een reductiemiddel, met het vermogen antiglobuline-antilichaam in de vloeistof van het lichaam te reduceren, en het vloeibare reagens volgens conclusie 9» dat men het mengsel incubeert en daarna de graad van de agglutinering visueel beoordeelt. 18.Werkwijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 17» 15. e t het kenmerk, dat men als reductiemiddel 2-mercap-toethanol, dithiotreitol, glutathion of cysteine gebruikt.

19· Werkwijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat men een incubatietijd van 45 minuten of langer toepast.ƒ

20. Werkwijze voor de directe agglutinering voor de detectie van antilichamen in vloeistoffen van het lichaam waartoe cerebrospi-nale vloeistoffen behoren.waarvan wordt aangenomen dat zij de vermelde antigenen bevatten, met het kenmerk, dat men de vermelde vloeistof van het lichaam mengt met het vloeibare reagens 25 volgens conclusie 9» dat men het mengsel incubeert en daarna de graad van de agglutinering visueel beoordeelt.

21. Werkwijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 20,met het kenmerk, dat men een incubatietijd van 45 minuten of langer toepast.

22. Werkwijze voor de directe agglutinering voor de detectie van antigenen in urinemonsters, met het kenmerk, dat men een gefiltreerd urinemonster mengt met het vloeibare reagens volgens conclusie 9» dat men het mengsel incubeert en daarna de graad van de agglutinering beoordeelt.

23. Werkwijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat men het urinemonster filtreert door een filter van 0,45 yum.

24. Werkwijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat men het urinemonster ver-4q warmt voordat men het monster incubeert. 800 35 42

25. Werkwijze voor de directe agglutinering volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat men een incubatietijd van 45 minuten of langer toepast. > / 800 3 5 42