JPS5992353A - 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法 - Google Patents
不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法Info
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- JPS5992353A JPS5992353A JP20216682A JP20216682A JPS5992353A JP S5992353 A JPS5992353 A JP S5992353A JP 20216682 A JP20216682 A JP 20216682A JP 20216682 A JP20216682 A JP 20216682A JP S5992353 A JPS5992353 A JP S5992353A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法に関
する。
する。
近年、臨床検査の分野においては、ある種の疾患を血清
学的に診断することが重要視されている。
学的に診断することが重要視されている。
そして、この診断のためには、抗原及び抗体を正確、簡
便かつ迅速に定量することが、極めて重要な課題となっ
ている。本発明はかかる課題の解決を目的とするもので
ある。
便かつ迅速に定量することが、極めて重要な課題となっ
ている。本発明はかかる課題の解決を目的とするもので
ある。
一般的に、抗原−抗体はそれぞれ一定濃度の範囲内で反
応が起こり、その複合体を形成する。この濃度比が極端
に偏ると抗原−抗体複合体が形成されにくくなる。一定
量の抗体存在下で抗原量を増加していくと、ある一定の
抗原量まで抗原濃度に比例して複合体形成による沈降物
は増加していくが、抗原濃度がある一点を越えると逆に
沈降物の訃は減少していく。この現象は抗原過剰による
複合体の可溶化現象としてよく知られている。
応が起こり、その複合体を形成する。この濃度比が極端
に偏ると抗原−抗体複合体が形成されにくくなる。一定
量の抗体存在下で抗原量を増加していくと、ある一定の
抗原量まで抗原濃度に比例して複合体形成による沈降物
は増加していくが、抗原濃度がある一点を越えると逆に
沈降物の訃は減少していく。この現象は抗原過剰による
複合体の可溶化現象としてよく知られている。
このことは、血清学的ラテックス試薬を用いた抗原の測
定反応においても起こりうる。血清学的ラテックス試薬
は、通常粒径０ 、００５〜１μのラテックス粒子に抗
体又は抗原を感作させ、弱アルカリ性の緩衝液に分散さ
せたものである。しかし、一定置のラテックス粒子に感
作できる抗体又は抗原量は自と限界があるだめ測定でき
る抗原又は抗体量にも限界がある。従って、高濃度抗原
の測定に際しては前記の抗原過剰現象の発現によって、
そのままでは低値に誤って測定されることがある。この
場合、検体（ザンプル）の希釈操作でその誤りを回避し
ようとするが、これは煩雑である。例えば、免疫グロブ
ＩＪ Ｇ （ＩｇＧ）の測定では検体血清を約１，００
０〜Ｉ Ｏ，０００倍希釈するのが通例であり、これは
臨床検査薬の測定操作の簡略化というニーズを考慮する
と大きな欠点となる。
定反応においても起こりうる。血清学的ラテックス試薬
は、通常粒径０ 、００５〜１μのラテックス粒子に抗
体又は抗原を感作させ、弱アルカリ性の緩衝液に分散さ
せたものである。しかし、一定置のラテックス粒子に感
作できる抗体又は抗原量は自と限界があるだめ測定でき
る抗原又は抗体量にも限界がある。従って、高濃度抗原
の測定に際しては前記の抗原過剰現象の発現によって、
そのままでは低値に誤って測定されることがある。この
場合、検体（ザンプル）の希釈操作でその誤りを回避し
ようとするが、これは煩雑である。例えば、免疫グロブ
ＩＪ Ｇ （ＩｇＧ）の測定では検体血清を約１，００
０〜Ｉ Ｏ，０００倍希釈するのが通例であり、これは
臨床検査薬の測定操作の簡略化というニーズを考慮する
と大きな欠点となる。
従来、ラテックスのような不溶性の担体粒子に抗体又は
抗原を感作した試薬を用いて抗原−抗体凝集反応を行な
い、その反応の結果生じた複合体の濁度を光学的に測定
する方法は提案されている〔特開昭５４−１０８６９３
、特開昭５５−１５９１５７、特開昭５７−１９７０及
び沢井・石川、検査と技術；１０（６）、５５５（１９
８２）など〕。しかし、これらにみられる方法において
も、検体が高濃度の場合では例外なく大幅な希釈操作を
必要とするだめ、希釈による大きな誤差、測定範囲が狭
いことに起因する抗原過剰現象による誤った測定値を出
す危険もはらんでいる。
抗原を感作した試薬を用いて抗原−抗体凝集反応を行な
い、その反応の結果生じた複合体の濁度を光学的に測定
する方法は提案されている〔特開昭５４−１０８６９３
、特開昭５５−１５９１５７、特開昭５７−１９７０及
び沢井・石川、検査と技術；１０（６）、５５５（１９
８２）など〕。しかし、これらにみられる方法において
も、検体が高濃度の場合では例外なく大幅な希釈操作を
必要とするだめ、希釈による大きな誤差、測定範囲が狭
いことに起因する抗原過剰現象による誤った測定値を出
す危険もはらんでいる。
本廃明′者は上記につき検討した結果、免疫グロブリン
のよう、な検体血清中に存在する高濃度抗原を測定する
場合、フリーの抗体を不溶性担体粒子に感作した抗体と
ともに反応系へ添加することにより、測定範囲を拡大し
て抗原過剰現象の発現頻度を避け、以って検体血清の希
釈操作も極力少なくし、正確で簡単な高濃度抗原を測定
する方法を見出し、本発明全完成するに至った。
のよう、な検体血清中に存在する高濃度抗原を測定する
場合、フリーの抗体を不溶性担体粒子に感作した抗体と
ともに反応系へ添加することにより、測定範囲を拡大し
て抗原過剰現象の発現頻度を避け、以って検体血清の希
釈操作も極力少なくし、正確で簡単な高濃度抗原を測定
する方法を見出し、本発明全完成するに至った。
即ち、本発明は不溶性担体粒子に抗体を感作させ、これ
と検体とを反応させて、この反応混合物の凝集を光学的
に測定する方法において、不溶性担体粒子に感作した抗
体とは別に、フリーの抗体を反応系に加えて抗原−抗体
反応を行うことを特徴とする凝集反応測定方法である。
と検体とを反応させて、この反応混合物の凝集を光学的
に測定する方法において、不溶性担体粒子に感作した抗
体とは別に、フリーの抗体を反応系に加えて抗原−抗体
反応を行うことを特徴とする凝集反応測定方法である。
本発明の方法によれば、凝集反応は■不溶性担体粒子に
感作した抗体■検体血清中の抗原と反応シ得るフリーの
モノスペシフィクな抗体■抗体作製動物の正常面清■検
体血清とを順次、液体媒体中で数分間振とう混合によっ
て反応させ、希釈液で一定容暗に希釈後、抗原−抗体反
応に基づく凝集に光を照射し、その際の吸光度の変化に
より定量的に測定できる。もちろん、上記のピペット操
作の順序は任意であり、上記番号順に拘る必要はないが
、検体血清だけは最後に反応させた方が望ましい。
感作した抗体■検体血清中の抗原と反応シ得るフリーの
モノスペシフィクな抗体■抗体作製動物の正常面清■検
体血清とを順次、液体媒体中で数分間振とう混合によっ
て反応させ、希釈液で一定容暗に希釈後、抗原−抗体反
応に基づく凝集に光を照射し、その際の吸光度の変化に
より定量的に測定できる。もちろん、上記のピペット操
作の順序は任意であり、上記番号順に拘る必要はないが
、検体血清だけは最後に反応させた方が望ましい。
本発明で使用する不溶性担体粒子は、有機高分子物質の
微粒子のもの、例えばポリスチレン、カルボキシ変性、
スルフォン酸変性、スチレンアクリロニ） ＩＪル共重
合体の如き乳化重合により得られるラテックス、個々に
分散されたブドウ球菌、連鎖球菌の如き球菌型の細菌又
はシリカ、ソリカーアルミナ、アルミナの如き無機酸化
物、その他鉱物粉末、金属等が用いられる。そして、こ
のような不溶性担体粒子に抗体を感作させる方法は公知
の方法が多くあり、これに従って良い。また、希釈液に
は生理食塩水、リン酸、トリス−塩酸等の緩衝液を用い
る。
微粒子のもの、例えばポリスチレン、カルボキシ変性、
スルフォン酸変性、スチレンアクリロニ） ＩＪル共重
合体の如き乳化重合により得られるラテックス、個々に
分散されたブドウ球菌、連鎖球菌の如き球菌型の細菌又
はシリカ、ソリカーアルミナ、アルミナの如き無機酸化
物、その他鉱物粉末、金属等が用いられる。そして、こ
のような不溶性担体粒子に抗体を感作させる方法は公知
の方法が多くあり、これに従って良い。また、希釈液に
は生理食塩水、リン酸、トリス−塩酸等の緩衝液を用い
る。
本発明の方法で測定できる対象は、血清中のデ
ＩｇＧ、ＩｇＡ、 ＩｇＭ等の如き免疫グロブリン、ア
ルグミノ、セルロプラスミン、トランスフェリン、アン
チトリプンン等が挙げられるか、特に免疫グロブリンの
ような検体血清中に高濃度に存在する物質の測定に有効
である。
ルグミノ、セルロプラスミン、トランスフェリン、アン
チトリプンン等が挙げられるか、特に免疫グロブリンの
ような検体血清中に高濃度に存在する物質の測定に有効
である。
本発明法において、不溶性担体に感作した抗体にフリー
の抗体を加えると、抗体のロットにより非特異凝集が起
こることがある。このような場合反応系に抗体作製に使
用した動物の正常血清を加えて、この非特異凝集を回避
する。
の抗体を加えると、抗体のロットにより非特異凝集が起
こることがある。このような場合反応系に抗体作製に使
用した動物の正常血清を加えて、この非特異凝集を回避
する。
本発明によれば、測定できる抗原量が増加できるし、正
確性も期待できる。これに伴い、検体血清の希釈倍数を
大幅に軽減でき、測定範囲を大幅に拡大することが可能
になる。
確性も期待できる。これに伴い、検体血清の希釈倍数を
大幅に軽減でき、測定範囲を大幅に拡大することが可能
になる。
以下、本発明を実施例により、さらに説明するが、本発
明はこれにより何ら限定されるものではない。
明はこれにより何ら限定されるものではない。
実施例１
（＋） 抗ヒトＩｇＧ抗体の調製
家兎の産生じたヒ） ＩｇＧモノスペアフィック抗体を
用いる。（抗原ヒ） ＩｇＧ＆鎖を固定したセファロー
ズ４Ｂのカラムに通液シてアフィニティクロマトグラフ
ィーによって精製。）（２）抗ヒ）Ｉｇ（Ｊ抗体感作ラ
テックス試薬の調製ラテックス（日本合成ゴム社製、カ
ルポキン変性タイプ、粒径０．３０５μ）をｐ１１８の
グリシン緩衝液に浮遊（０，５％）させ、この浮遊液１
容と、リン酸緩衝液で５００７’ｇ／−に調製した抗ヒ
）ＩｇＧ抗体溶液１容とを混合し、室温で３０分保った
後、１０．ｏｏｏｘＧで２０分遠心分離して、ラテック
ス粒子に未吸着のウサギｒ−グロブリン分子を除去し、
次に沈降したラテックス粒子を再び１ ％ ｆ３ｓＡを
含むグリシン緩衝液に０．５チになるよう分散させて感
作ラテツクスを調製する。
用いる。（抗原ヒ） ＩｇＧ＆鎖を固定したセファロー
ズ４Ｂのカラムに通液シてアフィニティクロマトグラフ
ィーによって精製。）（２）抗ヒ）Ｉｇ（Ｊ抗体感作ラ
テックス試薬の調製ラテックス（日本合成ゴム社製、カ
ルポキン変性タイプ、粒径０．３０５μ）をｐ１１８の
グリシン緩衝液に浮遊（０，５％）させ、この浮遊液１
容と、リン酸緩衝液で５００７’ｇ／−に調製した抗ヒ
）ＩｇＧ抗体溶液１容とを混合し、室温で３０分保った
後、１０．ｏｏｏｘＧで２０分遠心分離して、ラテック
ス粒子に未吸着のウサギｒ−グロブリン分子を除去し、
次に沈降したラテックス粒子を再び１ ％ ｆ３ｓＡを
含むグリシン緩衝液に０．５チになるよう分散させて感
作ラテツクスを調製する。
（３） ラテックス凝集反応の測定
上記抗Ｉｇｃ）ラテックス試薬２０ ｐｉ 、抗１ｇＧ
抗体液２０μｔ、リン酸緩衝液で３倍希釈の正常家兎血
清２０μを及び検体血清又は標準品２０ ｐｉを小試験
管にとり、１０分分間上う混合したのち、希釈液４ｄを
加え３４０闘における吸光度を日立製作所２００−１０
型分光光度計を用いて測定し、ブランクに対する吸光度
の変化（−△Ａ３４０）により凝集活性を求める。（濃
度の算出は標準品の一△Ａ３４０を検量として行なう） 比較例１ （１）実施例１の（３）でのラテックス凝集反応の測定
において、フリーの抗体による非特異凝集防止効果につ
いて正常家兎血清を除いて測定する代わりに、リン酸緩
衝液（１００＋ｎＭ、 ｐＬ（７，５）を用いて測定す
る。所定の方法により凝集反応を行なったのち、肉眼で
凝集の有無を判定した。その結果を表１に示す。
抗体液２０μｔ、リン酸緩衝液で３倍希釈の正常家兎血
清２０μを及び検体血清又は標準品２０ ｐｉを小試験
管にとり、１０分分間上う混合したのち、希釈液４ｄを
加え３４０闘における吸光度を日立製作所２００−１０
型分光光度計を用いて測定し、ブランクに対する吸光度
の変化（−△Ａ３４０）により凝集活性を求める。（濃
度の算出は標準品の一△Ａ３４０を検量として行なう） 比較例１ （１）実施例１の（３）でのラテックス凝集反応の測定
において、フリーの抗体による非特異凝集防止効果につ
いて正常家兎血清を除いて測定する代わりに、リン酸緩
衝液（１００＋ｎＭ、 ｐＬ（７，５）を用いて測定す
る。所定の方法により凝集反応を行なったのち、肉眼で
凝集の有無を判定した。その結果を表１に示す。
表 １
（１１） ヒト血清成分による非特異凝集防止効果に
ついて、正常家兎血清を除いて測定する代わりにリン酸
緩衝液（１ｏ ｏｍＭ、 ｐＨ７，ｓ ）を用いて測定
する。凝集の判定は（１）に準じた。その結果を表２に
示す。尚、ラテックス試薬は抗α−フェトプロティン抗
体（家兎）感作したものを使用した。調製法は実施例１
の（２）に準する。
ついて、正常家兎血清を除いて測定する代わりにリン酸
緩衝液（１ｏ ｏｍＭ、 ｐＨ７，ｓ ）を用いて測定
する。凝集の判定は（１）に準じた。その結果を表２に
示す。尚、ラテックス試薬は抗α−フェトプロティン抗
体（家兎）感作したものを使用した。調製法は実施例１
の（２）に準する。
表２
一：肉眼で凝集を認めないもの
＋：肉眼で明らかに凝集を認めるもの
第１図はラテックス試薬に抗原を添加し凝集させた時の
吸収スペクトルを対照（抗原無添加）のものと比較した
図である。 ３ ６１２２４４８９５１９０３Ｅ！０７５０１５００
ＩｇＧ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （、＊７／Ｊ手
続補正書（方式） 昭和５８年３月７日 特許庁長官 若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第２０２１６６号 Ｚ発明の名称 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法３、補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 住 所 神奈川県相模原市大野台２−２９−１４昭和５
８年２月２２日（発送日） ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 明細書中の表の枠（別紙の通り） 別紙 表 １ 表 ２ − 肉眼で凝集を認めないもの ＋、肉眼で明らかに凝集を認めるもの
吸収スペクトルを対照（抗原無添加）のものと比較した
図である。 ３ ６１２２４４８９５１９０３Ｅ！０７５０１５００
ＩｇＧ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （、＊７／Ｊ手
続補正書（方式） 昭和５８年３月７日 特許庁長官 若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第２０２１６６号 Ｚ発明の名称 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法３、補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 住 所 神奈川県相模原市大野台２−２９−１４昭和５
８年２月２２日（発送日） ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 明細書中の表の枠（別紙の通り） 別紙 表 １ 表 ２ − 肉眼で凝集を認めないもの ＋、肉眼で明らかに凝集を認めるもの
Claims (1)
- 不溶性担体粒子に抗体を感作させ、これと検体とを反応
させて、この反応混合物の凝集を光学的に測定する方法
において、不溶性担体粒子に感作した抗体とは別に、フ
リーの抗体を反応系に加えて抗原−抗体反応を行うこと
を特徴とする不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20216682A JPS5992353A (ja) | 1982-11-19 | 1982-11-19 | 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20216682A JPS5992353A (ja) | 1982-11-19 | 1982-11-19 | 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5992353A true JPS5992353A (ja) | 1984-05-28 |
| JPH0331227B2 JPH0331227B2 (ja) | 1991-05-02 |
Family
ID=16453050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20216682A Granted JPS5992353A (ja) | 1982-11-19 | 1982-11-19 | 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5992353A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62168051A (ja) * | 1986-01-17 | 1987-07-24 | Green Cross Corp:The | 凝集反応試験用水性溶媒 |
| JPS63115061A (ja) * | 1986-10-31 | 1988-05-19 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫測定法 |
| JPH06324043A (ja) * | 1993-03-23 | 1994-11-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | 粒子状キャリヤー物質での免疫試験におけるフック作用 の低減 |
| CN103293299A (zh) * | 2012-02-24 | 2013-09-11 | 上海新波生物技术有限公司 | 拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5631648A (en) * | 1979-06-19 | 1981-03-31 | Siber George | Test in which cohesion is caused by contact with body fluid containing antigen and method of preparing reagent for said test |
| JPS579723A (en) * | 1980-06-20 | 1982-01-19 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
| JPS57111446A (en) * | 1980-12-29 | 1982-07-10 | Sekisui Chem Co Ltd | Determing method of latex agglutination |
-
1982
- 1982-11-19 JP JP20216682A patent/JPS5992353A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5631648A (en) * | 1979-06-19 | 1981-03-31 | Siber George | Test in which cohesion is caused by contact with body fluid containing antigen and method of preparing reagent for said test |
| JPS579723A (en) * | 1980-06-20 | 1982-01-19 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
| JPS57111446A (en) * | 1980-12-29 | 1982-07-10 | Sekisui Chem Co Ltd | Determing method of latex agglutination |
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| JPS62168051A (ja) * | 1986-01-17 | 1987-07-24 | Green Cross Corp:The | 凝集反応試験用水性溶媒 |
| JPS63115061A (ja) * | 1986-10-31 | 1988-05-19 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫測定法 |
| JPH06324043A (ja) * | 1993-03-23 | 1994-11-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | 粒子状キャリヤー物質での免疫試験におけるフック作用 の低減 |
| CN103293299A (zh) * | 2012-02-24 | 2013-09-11 | 上海新波生物技术有限公司 | 拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0331227B2 (ja) | 1991-05-02 |
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