DK166234B - Agglutineringstest til paavisning af antigener - Google Patents

Description

DK 166234 B

Den foreliggende opfindelse angår en agglutineringstest til afsløring af antigener i legemsvæsker som f.eks. serum, urin o.l. der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne. Ved den omhandlede test redu-5 ceres forekomsten af "falske" positive reaktioner ved ag-glutinationsprøverne væsentligt i forhold til de tidligere kendte anvendte agglutinationsmetoder.

Afsløringen af mikrobielle antigener i legemsvæsker er af 10 værdi til hurtig diagnose i et stadigt større tilfælde af infektioner. Imidlertid er hovedproblemet, at de tilgængelige metoder for øjeblikket ikke er tilstrækkelig følsomme (immunodiffusion, CIE), og de er derfor ikke i stand til at påvise tilstedeværelsen af antigener hos en 15 stor del inficerede patienter, eller de er for langsomme til en hurtig diagnose (RIA, ELISA). I nogle tilfælde dannes antigen/antistofkomplekset langsomt, og/eller de dannede partikler er for små til med sikkerhed at kunne observeres. Aflæsningsnøjagtigheden er blevet forbedret 20 ved at anvende agglutinationsprøver, hvor der anvendes partikler som bærestoffer på hvis overflade antigeneller antistofmolekylet adsorberes eller bindes.

Disse agglutinationsprøver kan udføres ved den indirekte 25 metode, ved hvilken den kliniske prøve blandes med antistof i en forud bestemt fortynding, hvorefter der efter en passende inkubationsperiode sættes et indikatorsystem bestående af et kompleks af antigenet bundet til et findelt bærestof til blandingen. Dersom antigen er til stede 30 i den kliniske prøve, vil antistoffet ikke være i stand til at reagere med antigen/bærestofkomplekset;. Og der vil ikke ske nogen agglutination, hvorfor ingen agglutination er en positiv prøve for antigenet. Omvendt, hvis antigenet ikke er til stede i den kliniske prøve, vil antistof-35 fet reagere med antigen/bærestofkomplekset, hvorved der sker agglutination af indikatorprøven. Teorien for disse agglutinationsprøver er velkendt og er f.eks. omtalt i US

DK 166234B

2 patenterne 3 171 783, 3 775 536, 3 873 683, 3 879 262, 4 003 988 og 4 045 384.

Man har længe haft følelsen af, at den eneste metode af 5 værdi til effektiv diagnose af infektionssygdomme er tidlig, hurtig afsløring af antigener i forbindelse med det infektiøse agens, hvorved man vil være i stand til straks at udføre effektiv behandling.

10 Opfindelsen angår således en direkte agglutinationstest til afsløring af antigener omhandlet i krav l's kendetegnende del.

Man har nu udviklet en særdeles følsom agglutinationsprø-15 ve til afsløring af antigener, som f.eks. proteiner og polysacchariderne fra forskellige mikroorganismer blandt andet fra bakterier, protozoer og svampe, der er til stede i lave koncentrationer i legemsvæskerne.

20 Ved undersøgelsesmetoden ifølge opfindelsen kan der rutinemæssigt afsløres så lidt som 0,2 ng pr. ml kapsulært polysaccharid fra patogene bakterier. Dette repræsenterer en følsom følsomhed, der er 25 til 250 gange større end de hidtil anvendte modstrømsimmunoelektrophoresemetoder 25 (CIE), og en følsomhed, der er i det mindste lig med ra-dioimmunoprøven (RIA). Hertil kommer, at selv om CIE er hurtig, kræver metoden trænet laboratoriepersonale og forholdsvis kostbare reagenser og udstyr, og undersøgelsesmetoden har en begrænset følsomhed på 10 til 50 ng pr.

30 ml for de fleste bakteriepolysaccharider. Da lavere koncentrationer af antigen ofte forekommer i legemsvæsker, ser man ofte falske negative CIE-prøver hos patienter, hvor man ved dyrkning kan konstatere bakteriel infektion.

RIA er på den anden side 10 til 100 gange mere følsom end 35 CIE, men den er betydelig mere tidsrøvende og kostbar.

DK 166234B

3

Inden den foreliggende opfindelse forelå, har den udstrakte anvendelse af partikelagglutinationsprøver, skønt de er umådeligt simple og billige, været begrænset på grund af den lave følsomhed af disse test for små kon-5 centrationer af antigen og dårlig specificitet, der viste sig som ikke-specifik agglutination, specielt i serumprøver. Ved at anvende testen ifølge opfindelsen opnår man en følsomhed af størrelsesordenen 0,2 ng/ml og hyppigheden af ikke-specifik agglutination med humant serum er 10 reduceret til 2% eller mindre. Yderligere har en omhyggelig udvælgelse og fremstilling af antiserum frembragt en undersøgelsesmetode, der er karakteriseret ved ensartet følsomhed, god stabilitet og specificitet.

15 Specielt tilsigter opfindelsen at tilvejebringe en forbedret partikelagglutinationsundersøgelsesmetode til hurtig afsløring af polyribophosphat (PRP), det kapsulære polysaccharid fra Haemophilus Influenzae type b.

20 Den begrænsede følsomhed er som nævnt hovedproblemet ved de tidligere beskrevne metoder til afsløring af mikrobielle antigener. Som følge heraf kan bakterielt antigen ikke afsløres hos alle patienter med dokumenterede infektioner. F.eks. har undersøgelser afsløret, at 7-22% af 25 patienterne med H.i.b. meningitis; 38% med H.i.b. epiglottitis; 20-39% med bakteremisk pneumococpneumoni og 50-90% med ikke-bakteremisk pneumococpneumoni ikke viste tilstedeværelsen af antigen i serum eller cerebrospinal-væsken, dersom man undersøgte med de almindeligt tilgæn-30 gelige modstrømsimmunoelektrophorese- eller partikelag-glutinations-undersøgelsesmetoder. Imidlertid vil en ra-dioimmunoundersøgelse, der er i stand til at afsløre 0,5 ng/ml eller mindre, være i stand til at diagnosticere bogstaveligt alle tilfælde af H.i.b. meningitis, når de 35 første gang dukker op hos lægen. Forsøgsresultaterne angiver også, at koncentrationen af antigen i 37% af patienterne var mindre end 10 ng/ml, og den var derfor under

DK 166234 B

4 følsomheden ved de fleste almindeligt anvendte modstrøms-immunoelektrophoreseundersøgelsesmetoder.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en partikelagglutina-5 tionstest, der har en følsomhed, der er sammenlignelig med radioimmunoforsøgets. Den høje følsomhed opnås ved den omhandlede test ved modifikationer af tidligere kendte partikelagglutinationsforsøg, nemlig ved udvælgelsen af et specifikt H.i.b. antiserum, ved anvendelse af en 10 globul inf rakt ion af antiserummet, ved vaskning af den sensibilerede partikel og ved en forøgelse af inkubationsperioden for partikelagglutinationsundersøgelsesme-toden fra de sædvanlige 5 til ca. 45 minutter eller længere.

15 a. Følsomhed

Udvælgelsen af antiserum påvirker i høj grad undersøgelsesmetodens følsomhed. Seks antisera fremstillet i tre 20 dyrearter frembragte partikler med følsomhed, der lå fra 0,2 ng til mere end 1000 ng PRP pr. ml. Den funktionelle kvalitet af det specifikke antistof såvel som koncentrationen heraf var vigtig. Det antiserum, der frembringer de mest følsomme partikler, har ikke den højeste koncen-25 tration af antistof bestemt ved radioantigenbindingsfor-søget.

Seks antisera over for hele Haemophilus Influenzae type b fremstilledes i fire kaniner, et æsel og en hest ved 30 hjælp af immuniseringsprogrammerne beskrevet af H.E. Alexander et al., Journal of Immunology 54: 207-211, 1946.

Udtrykket "partikler" anvendt i den foreliggende beskri-35 velse med kray betegner partikler, der er inerte og neutrale overfor andre komponenter, og som er i stand til at · adsorbere antisera på irreversibel måde. Disse partikler

DK 166234B

5 kan være glaskugler, polybutadien, polystyren, polybuta-dien-styren, osv., der er i besiddelse af en gennemsnits-partikelstørrelse på fra ca. 0,15 til ca. 0,9 mikron. Fortrinsvis sensibiliseres polystyren latexpartikler med 5 ensartet diameter på fra omtrent 0,81 u som en 10%-vægt/rumfang suspension i destilleret vand med det overfor omtalte antiserum på følgende måde: Æsel- og kanin-fuld-antiserum fortyndedes hver 1/500 og 10 heste-fuld-antiserum 1/200 i standard glycinpufret saltvand (0,1 M glycin, 0,9% natriumchlorid, pH 8,2). Antistof adsorberedes på latexpartiklerne ved at sætte en del 10% latex-suspension til 80 dele fortyndet antiserum og inkuberer ved stuetemperatur i 1 time. Frit antiserum de-15 kanteredes fra efter centrifugering i 10 minutter ved 12000 G. Latex bundfaldet opslemmedes i glycinpufret saltvand med en ringe mængde protein dvs. 0,1% humant serumalbumin eller 0,1% æsel, kanin eller hesteserum afhængig af, hvad man ønskede, for at fremstille en 0,125% la-20 tex-suspension, der atter centrifugeredes og atter op slemmedes i glycinpufret saltvand. Føtalt kalveserum, der havde vist sig ikke at indeholde noget anti-PRP-antistof ved radioimmunoundersøgelser, anvendtes som fortyndingsmiddel til standardopløsningerne af PRP-antigen.

25

Agglutination udførtes ved at tilsætte 0,05 ml af anti-genholdig væske til 0,01 ml sensibiliseret latex opløsning på en serologisk plade med keramikringe. Pladen roterede (180 omdr. pr. minut) inden i et fugtighedskammer 30 ved stuetemperatur og undersøgtes for agglutination efter 45 minutters forløb. Agglutinationen bedømtes som 4 , af· dersom agglutinationsblandingen kunne ses, 3 dersom blandingen forblev uklar, men man kunne observere grove klumper, 2 dersom blandingen forblev uklar, og man let 35 kunne se små partikler, og 1+ dersom blandingen forblev uklar, og man kun kunne se en minimal mængde små partik- 4.

ler. Agglutination på 2 eller mere betragtes som posi-

DK 166234 B

6 tiv. De sammenlignede følsomheder er angivet i tabel I.

Tabel I

5 Følsomhed af LPA-undersøgelsesmetoden med seks antisera over for Haemophilus Influenzae type b.

Anti-PRP antistof1 1 2 Anti-PRP antistof absorberet på Latex- Følsomhed

10 i hel serum partikler (ag Ab af LPA

Senam (ug Ab protein/ml) protein/ml (LP) (ng PRP/ml) Æsel 11.200 3,40 0,2

Kanin 1 96.000 7,84 1,0 15 2 68.000 7,20 1,0 3 45.000 6,56 5,0 4 10.300 1,95 10,0

Hest 3.100 1,84 1000,0 20 1 Målt ved radioantigenbindingsforsøg 2

Laveste koncentration af PRP-5 i føtalt kalveserum giver agglutination på 2+ eller mere.

Tabel I viser klart, at kvaliteten af det antiserum, der 25 er anvendt til at sensibilisere latexpartiklerne er kritisk for følsomheden af latexpartikelagglutinationsforsø-get til afsløring af PRP antigen. Ved at undersøge resultaterne i tabel I ses det let, at følsomheden ikke kan forudsiges udelukkende på basis af koncentrationen af PRP 30 i antiserummet, der er målt ved radioantigenbindingsforsøget. Et æselantiserum, der kun indeholder 12% så meget antistof som det bedste kaninantiserum frembragte et fem-fold mere følsomt latexpartikelpræparat. Denne forskel i følsomhed kan ikke forklares ved mere effektiv overtræk 35 af latexpartiklerne med æselantistof, da latexpartikler overtrukket med kaninantiserum udviser 2,3 gange mere absorberet antistof. Agglutinationsaktiviteten af æsel- og

DK 166234B

7 kaninantiserum overfor røde blodlegemer fra får overtrukket med PRP var af samme størrelse, på trods af den betydeligt større koncentration af PRP bindingsaktivitet i kaninantiserum.

5 Måling af associationsgraderne viser, at æselantistof forbinder sig betydeligt hurtigere med PRP-antigen end kaninantistof. Associationshalveringstiden er 20 minutter for æselantistof og mere end 60 minutter for kaninanti-10 stof. Forklaringen på denne forskel i associationshastigheden er ukendt.

Dissociationsgraden af antigen-antistofkomplekser i nærværelse af overskud af antigen er et mål for bindingstæt-15 heden eller affiniteten af antistoffet. Kanin-antistof dissocierer langsommere fra polyribose-phosphat end æselantistof, og det har derfor større affinitet over for antigen. Dette resultat fører til den hypotese, at kombinationshastigheden af antigen og antistof er af større be-20 tydning ved agglutinationsprocesser end styrken af den gensidige påvirkning af antigen-antistof.

Molekylarsichromatografi af forskellige dyre-antisera over for bakterielle polysaccharider afslører, at stør-25 stedelen af anti-polysaccharid antistoffet hos dyr af hesteslægten (æsler, heste) findes i den makroglobulin-klasse, der elueres i det frie rum i denne søjle. I modsætning hertil findes hoveddelen af kaninantistoffet i IgG-klassen, der eluerer senere. Som angivet i tabel 2 30 kan anvendelsen af makroglobulinfraktionen af æsel- eller hesteantiserum i en koncentration på 50 ug protein/ml til sensibilisering af latexpartikler i betydelig grad forøge følsomheden af forholdsvis svage antisera fra hesteslægten. Følsomheden af de bedste antisera forbedres ikke 35 yderligere ved denne modifikation, skønt agglutinations-reaktionens tydelighed sædvanligvis forbedres med fraktionen fra det frie rum. Anvendelsen af IgG-fraktionen

DK 166234B

8 fra kaninserum giver ikke tilsvarende forbedringer i følsomheden eller agglutinationens klarhed.

Tabel 2 5

Sammenligning af følsomheden af latexpatikler overtrukket med fuldserum eller makroglubolinfraktionen af hesteslægts-antiserum over for bakterielle polysaccharider.

10 Følsomhed af Følsomhed af LP LP beklædt med overtrukket makroglubolin- med fuldserum fraktion

Dyr Antiserum mod (1/500 fortynding) (50 ug protein/ml) 15 - Æsel-F H. influenzae type b 1 ng/ml 0,2 ng/ml Æsel-132 H. influenzae type b 0,2 ng/ml 0,2 ng/ml 20 Ssel-W.J. H. influenzae type b 2 ng/ml 0,5 ng/ml Æsel-Y Neisseria meningitisgruppe Y 1 ng/ml 0,2 ng/ml 25 Hest-49 N-meningitis gruppe A 0,5 ng/ml 0,2 ng/ml

Hest-46 N-meningitis gruppe B >10 000 ng/ml 2 ng/ml * + 30 Den laveste koncentration af antigen, der frembringer 2 agglutination eller større er angivet.

For at opnå yderligere forbedring i følsomheden af æsel-antisera sammenlignedes antistofbeklædte latexpartikler, 35 der var beklædt med forskellige fortyndinger af æsel- antiserum i glycin-pufret saltvand, uvasket og efter 1,2 og 3 vaske, med glycinpufret saltvand indeholdende 1/1000

DK 166234B

9 dele føtalt kalveserum, og resultaterne er angivet i tabel 3.

Tabel 3 5

Virkning af fortynding af antiserum og vask af latexpartikler på sensibiliteten af latexpartikelagglutinationsprøven for polyribose-phosphat.

10 Fortynding af

æselantiserum Minimumkoncentration af afsløret PRP

anvendt til (ng/ml) sensibilisering ...................— -------------------—..............— af latexpartikler Uvasket vasket x 1 vasket x 2 vasket x 3 15 - 1/10 200 > 1000 > 1000 > 1000 1/100 50 0,5 0,5 0,5 1/500 2 0,2 0,2 0,2 1/1000 0,5 0,2 0,2 0,2 20 1/2000 0,2 0,2 0,2 0,5 1/5000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 k + 2 agglutination eller større antoges som positivt resultat.

25 Det fremgår af resultaterne i tabel 3, at lave fortyndinger af antiserum er ikke-følsomme. Med fortyndinger på 1/500 og større opnås maksimal følsomhed, forudsat at la-texpartiklerne er vasket. Uvaskede latexpartikler opnåede kun maksimal følsomhed med et snævert område af fortyn-30 dinger. To vaske gav maksimal følsomhed, medens tre vaske kan resultere i formindsket følsomhed.

Sensibiliserede latexpartikler fra vaskeexperimentet lagredes ved 4 °C og afprøvedes efter 12 og 24 måneders for-35 løb. Latexpartiklerne sensibiliseret med 1/500 og 1/1000 fortynding af æselantiserum og vasket to gange bibeholdt deres oprindelige følsomhed, mens uvaskede latexpartikler

DK 166234B

10 var to til fire gange mindre følsomme efter 24 måneders forløb.

Fig. 1 viser forholdet mellem testfølsomhed og inkuba-. 5 tionsperiode. Store koncentrationer af antigen agglutine-rede latexpartiklerne i løbet af 5 minutter. Følsomheden forøgedes hurtigt under de første 45-60 minutter, hvorefter de langsomt nåede et maksimum på 0,05 ng/ml med de mest følsomme præparater på 10 timer. Det omhandlede se-10 rum fra hesteslægten var mere følsomt end kaninserum ved alle inkubationstiderne. Under sammenligningsforsøgene blandedes 50 nl prøveopløsning og 10 μΐ belagte latexpar-tikler, som beskrevet i det følgende, på en serologisk plade, og den roteredes ved 180 omdr./min, ved stuetempe-15 ratur. Pladen blev overdækket, og fugtigheden blev opretholdt ved hjælp af en svamp, der var mættet med varmt vand. Man undersøgte pladerne til de angivne tider.

Forlænget inkubation fra 5 til 45 minutter eller længere 20 gav en 10 til 20 fold forøgelse af følsomheden. Til praktiske kliniske formål valgtes en inkubationsperiode på 45 minutter, idet man normalt aflæste med 5-15 minutters mellemrum, når der anvendtes latexpartikler belagt med et hesteslægts-antiserum. Disse latexpartikler havde en føl-25 somhed på 0,2 ng antigen pr. ml væske.

Man gik ud fra, at den forøgede følsomhed af partikelag-glutinationsforsøget også ville forøge tilfældene af ikke-specifik agglutination, og i serumprøver fra hospi-30 taliserede børn agglutinerede 69% af disse sera latexpartiklerne. Denne ulempe har tidligere begrænset en vidstrakt anvendelse af denne prøvemetode. Faktorer, der deltager i agglutinationen af latexpartikler belagt med gammaglobuliner, er varmelabile serumkomponenter (sand-35 synligvis komplementer) og varmestabile antiglobuliner, hvoraf der sædvanligvis i humane sera findes lave niveauer specielt fra patienter med kroniske inflammatoriske

DK 166234 B

11 sygdomme.

Ikke-specifik agglutination sås ved agglutination af kon-trollatexpartikler sensibiliseret med hel ikke-immun dy-5 reserum. Dersom man anvendte makroglobulin-overtrukne latexpartikler, var kontrollatexpartiklerne overtrukne med makroglobulinfraktionen af ikke-immun serum.

Ved anvendelse af testen ifølge opfindelsen reduceredes 10 hyppigheden af ikke-specifik agglutination med humant serum til 2% eller lavere ved 1) tilsætningen af ikke-im-munt dyreserum til sensibiliserede latexpartikler; og 2) ved tilsætningen af en serumpuffer indeholdende en poly-anion og/eller et reducerende middel direkte til inkuba-15 tionsblandingen og/eller 3) ved varmeinaktivering af serummet .

Tilfældene af ikke-specifik agglutination bestemtes ved hjælp af sera opsamlet fra hospitalsindlagte børn- og 20 voksne patienter, som ikke havde H.i.b. syge. Alle sera undersøgtes med latexpartikler sensibiliseret med æsel-antiserum (anti-PRP LP) og med latexpartikler sensibiliseret med ikke-immunt æselserum (kontrol LP).

25 Ved tidligere forsøg var sera indeholdende varmestabile agglutiner undersøgt ved tilsætning af 10 nl af et reducerende middel som f.eks. 1,4-dithiothreitol (DTT) eller mercaptoethanol (ME) til inkubationsblandingen ved begyndelsen af inkubationen. Optimale koncentrationer var 30 0,018 M for DTT og 0,35 M for ME (slutkoncentrationerne i inkubationsblandingen var 0,0026 M for DTT og 0,05 M for ME).

Den efterfølgende tabel 4 opsummerer resultaterne opnået 35 med 104 pediatriske sera, der var lagret mindst 24 timer ved 4 °C, inden de undersøgtes.

DK 166234 B

Tabel 4 12 i

Tilfælde af ikke-specifik agglutination med lagrede sera fra hospitaliserede børn uden Haemophilus Influenzae type b syge 5

Agglutination med anti-PRP LP Negativ Positiv Negativ Positiv

Agglutination 10 med kontrol LP Negativ Positiv Positiv Negativ

Ingen behandling af serum (n=104) 32 (31%) 65 ( 63%) 3 (3%) 4 (4%) 15 Varmeinaktivering af serum (n=104) 49 ( 47%) 47 (45%) 1 (1%) 7 (7%)

Tilsætning af normalt æselserum 20 (2,5%) til LP

(n=104) 72 (69%) 23 (22%) 7 (7%) 2 (2%)

Varmeinaktivering af serum og tilsæt-25 ning af normalt æselserum (2,5%) til LP (n=104) 75 (72%) 23 (22%) 5 (5%) 1 (1%)

Tilsætning af nor-30 malt æselserum (2,5%) til LP og 2

tilsætning af DTT

til serum (n=53)3 52 ( 98%) 1 (2%) 0 0 35 ^ Lagret mindst .24 timer ved 4 °C inden undersøgelsen 2

Dithiothreitol, slutkoncentration på 0,0026 M i inkubationsbian- · dingen

Kun 53 af 104 prøver indeholdt tilstrækkeligt serum til denne undersøgelse.

3

DK 166234 B

13 69% af sera frembragte ikke-specifik agglutination med anti-PRP og alle bortset fra 4% identificeredes med kontrol LP.

5 Varmeinaktivering (60 °C i 15 minutter) reducerede kun i ringe grad ikke-specifik agglutination til 53%, og tilsætning af ikke-immun æselserum til både anti-PRP og kontrol LP reducerede ikke-specifik agglutination til 31%; og tilsætning af 10 ul af et reducerende middel, dvs.

10 dithiothreitol sænkede tilfældene af ikke-specifikke reaktioner til 2%. De opnåede resultater med 52 lagrede voksne sera var tilsvarende. Kun ét serum gav ikke-specifik agglutination (positiv med anti-PRP LP og kontrol LP), når 2,5% normalt æselserum sattes til latexpartik-15 lerne, og DTT sattes til inkubationsblandingen.

For at bestemme om friske sera gav en højere grad af ikke-specifik agglutination, indsamlede man 100 sera fra voksne patienter, hvorefter man umiddelbart efter anbrag-20 te prøverne på is og undersøgte dem samme dag. Hvert serum undersøgtes med og uden reducerende middel (ME) og med og uden varmeinaktivering (60 °C i 5 minutter). Agglutination undersøgtes med anti-PRP LP og kontrol LP, der hver indeholdt 2,5% normalt æselserum, og der var 25 overensstemmelse i alle tilfælde. Agglutinationsmønsteret er angivet i tabel 5.

30 35

DK 166234 B

Tabel 5 14

Ikke-specifik agglutination med friske sera fra 100 voksne patienter uden Haemophilus Influenzae type b sygex

Ingen varme Varme- 5 inaktivering^ aktivering 2 Antal

Monster Ingen ME ME^ Ingen ME MEZ sera Aflæsninger 1. (-) (-) (-) (-) 43 Ingen antiglo- buliner Ingen komplement 10 2. (+) (-) (+) (-) 28 Kun antiglo- buliner 3. (+) (+) (-) (-) 4 Kun komplement 4. (-) (+) (-) (-) 14 Kun komplement ("reakt!veret" 15 med ME) 5. (+) (+) (+) (-) 10 Antiglobuliner og komplement 6. _(-) (-) (~) (+) 1_

Antal sera, 20 der frembringer ikke-specifik agglutination 42 38 38 1

Alle undersøgelser udførtes med anti-PRP og kontrol LP, der inde-25 holdt 2,5% normal æselserum. Der var fuldstændig overensstemmelse af resultaterne mellem anti-PRP og kontrol LP.

2 2-Mercaptoethanol, slutkoncentration 0,05 M i inkubationsblandingen.

30 35 15

DK 166234B

42% af de ubehandlede sera (ingen opvarmning og intet reducerende middel) frembragte ikke-specifik agglutination.

Dersom et reducerende middel (ME) tilsættes, bliver 28 af sera'er negative (mønster 2), hvilket indicerer tilstede-5 værelsen af antiglobuliner. 14 sera, der oprindeligt havde været negative, blev positive (mønster 4), hvilket indicerede, at et varmelabilt agglutinin var reaktiveret med mercaptoethanol. Nettovirkningen af ME alene var at reducere ikke-specifik agglutination til 38%. En lignende 10 størrelse af ikke-specifik agglutination opnås med varme-inaktivering alene. Imidlertid reducerer kombinationen af varmeinaktivering af sera og tilsætning af et reducerende middel til inkubationsblandingen tilfældene af ikke-specifik agglutination til en størrelse på 2% eller lavere.

15

Fordi varmeinaktiveringen er tidsrøvende, er der udviklet en alternativ metode til at fjerne ikke-specifik agglutination af varmelabile serumfaktorer. En hel række polyan-ioner, herunder natriumpolyanetolsulfonat (SPS), dextran-20 sulfat, carrageenin og heparin, forhindrer ikke-specifik agglutination af globulin-overtrukne latexpartikler med varmelabile serumfaktorer.

100 friske sera fra voksne undersøgtes med en serumpuffer 25 indeholdende både ME (som ovenfor) og SPS ved en koncentration på 0,05%. Kun én af de 100 sera frembragte ikke-specifik agglutination med anti-PRP og kontrol LP. Ikke-specifik agglutination med dette serum fjernedes ved opvarmning.

30

Fortrinsvis tilsættes en serumpuffer indeholdende både reducerende middel og en polyanion til inkubationsblandingen af en stabiliseret, sensibiliseret latexpartikel og en serumprøve.

Denne serumpuffer fremstilles på følgende måde: 35

DK 166234 B

16

Man fortynder 14 molær 2-mercaptoethanol (standard fuldstyrke opløsning) 1/40 i glycinpufret saltvand (GBS) (0,1 M glycin, 0,9% natriumchlorid, pH 8,2). Man fortynder 5% vandig opløsning af polyanetholsulfonat 1/100 i samme 5 GBS.

Serumpufferen kan indeholde andre reducerende midler, som f.eks. dithiothreitol, glutathion, cystein og lignende i stedet for 2-mercaptoethanol. Herudover kan andre polyan-10 ioner, som f.eks. dextransulfat, heparin og carrageenin og lignende anvendes, sålænge de ikke griber ind i antigen-antistof reaktionen .

Tabel 6 nedenfor viser den optimale koncentration af rea-15 genser i serumpufferen. Højere koncentrationer af reduce rende midler eller polyanioner formindsker følsomheden af forsøget, og lavere koncentrationer er ikke i stand til at fjerne ikke-specifik agglutination i alle sera.

20 25 30 35

Tabel 6

DK 166234 B

17

Optimale koncentrationer af reagenser i "serumpuffer"

5 DTT 2-ME SPS

(Slutkoncentrationer i forsøgsblandingen)

Nedsat følsomhed 12,8 mM 400 mM 0,07% 10 God følsomhed + fjer nelse af ikke-specifik agglutination 2,6 mM 50 mM 0,007%

Ikke i stand til at 15 fjerne ikke-specifik agglutination 0,65 mM 10 mM 0,0007% DTT - dithiothreitol 2-ME - 2-mercaptoethanol 20 SPS - natriumpolyanethosulfonat

Den effektive koncentration af ikke-immunt dyreserum i latexsuspensionen undersøgtes i forsøgssystemet, idet man anvendte den ovenfor beskrevne serumpuffer.

25

Koncentrationer af ikke-immunt dyreserum på mindre end 0,25% i partikelsuspensionen (mindre end 0,035% i slut-forsøgsblandingen) gav af og til ikke-specifik agglutination, skønt man anvendte serumpuffer.

30

Koncentrationer af ikke-immunt dyreserum på indtil 25% i latexsuspensionen (3,5% i slutforsøgsblandingen) er i stand til at reducere tilfældene af ikke-specifik agglutination, imidlertid formindskede den højeste koncentra-35 tion, dvs. 25%, følsomheden af testen over for polyribo-phosphat to gange.

DK 166234B

18

Ikke-specifik agglutination i andre legemsvæsker

De fleste urinprøver frembringer ikke-specifik agglutination med anti-PRP og kontrol LP. Dette kan forhindres en-5 ten ved opvarmning (100 °C i 5 minutter) eller ved filtrering af urinen. I en foretrukken udførelsesform anvendes et 0,45 mikron filter.

Cerebrospinalvæskeprøver producerer meget sjældent ikke-10 specifik agglutination, der fjernes ved opvarmning (100 °C i 5 minutter). PRP-antigenet er stabilt over for den ovennævnte opvarmning og overfor filtrering.

Følgende specifikke eksempler demonstrerer opfindelsen i 15 en foretrukken udførelsesform.

a. Overtrækning af latexpartikler

For at fremstille anti-PRP latexpartikler fortyndes hel 20 æselantiserum over for H. Influenzae type b 1/500 i gly-cinpufret saltvand (GBS), og der opvarmes til 56 °C i 30 minutter. Én del latexsuspension (en 10% suspension af 0,81 u diameter partikler i destilleret vand) sættes til 80 dele fortyndet antiserum, hvorved man opnår en slutla-25 texpartikelkoncentration på 0,125%. Blandingen inkuberes 1 time ved stuetemperatur, der centrifugeres ved 12000 G i 10 minutter, og den supernatante væske bortkastes. Centrifugebundfaldet genopslemmes i samme rumfang GBS indeholdende 0,1% ikke-immunt æselserum, centrifugeres atter 30 som ovenfor, hvorefter man genopslemmer i samme rumfang GBS indeholdende 2,5% ikke-immun æselserum. iControllatex-partiklerne fremstilles som beskrevet ovenfor bortset fra ikke-immunt æselserum fortyndet 1/500 i GBS anvendes til først at overtrække latexpartiklerne. Det ikke-immune 35 æselserum, der anvendes under hele proceduren, skal være serum udtaget inden immunisering fra samme dyr, der. er blevet immuniseret.

DK 166234 B

19 Når den makroglobuline fraktion skal anvendes, chromato-graferes hele den præ-immune og immune æselserum på en "Sephacryl" G-200 gel filtreringssøjle, og de fraktioner, der eluerer i det tomme rumfang af søjlen, slås sammen.

5 De sammenslåede tomme rumfang fortyndes til en proteinkoncentration på 50 ag protein pr. ml i GBS, og erstatter herefter fortyndet hel serum i den ovenfor beskrevne metode.

10 b. Fremstilling af serumpuffer

Man fortynder 14 molær 2-mercaptoethanol (standard fuldstyrke opløsning) 1/40 i GBS. Man tilsætter natriumpoly-anetholsulfonat til en slutkoncentration på 0,05%.

15 c. Testmetode

Den omhandlede test udføres på følgende måde: 20 50 μ1 positiv kontrolserum, negativ kontrolserum og hvert serum, cerebrospinalvæske og urinprøve, der skal undersøges, sættes til hver af to brønde på en ren, tør serologisk plade efter nedenstående diagram. Den positive kontrolserum indeholder 2 ng PRP antigen/ml. Den negative 25 kontrolserum indeholder antiglobuliner, der agglutinerer både anti-PRP LP og kontrol LP, medmindre SB er tilsat, hvilket giver en kontrol for aktiviteten af SB. Urinprøverne er forfiltreret på et 0,45 mikron filter.

30 35

DK 166234 B

20

Positiv Negativ . kontrol kontrol Test Test Test serum serum serum CSF urin 5 Række A: Anti-PRP LP (sb) (S) (sb) (^) Række B: Kontrol LP (sb) (s?) (sb) (^) (^) SB - tilsæt serumpuffer« 10

Man tilsætter 10 al serumpuffer til hver brønd indeholdende positiv kontrolserum, negativ kontrolserum eller en serumprøve.

15 Latexsuspensionerne blandes forsigtigt uden skumning og 10 al anti-PRP latexpartikler sættes til den ene brønd af hvert par (række A), og reagenserne blandes grundigt.

10 ul kontrollatexpartikler sættes til den anden brønd af 20 hvert par, og reagenserne blandes grundigt.

Pladen anbringes på et serologisk rysteapparat og bearbejdes ca. 45 minutter. Kammeret bør være befugtet med en svamp neddyppet i varmt vand med synlig kondensation un-25 der hele forsøget. Pladen fjernes fra kammeret, tørres fri for kondensat, og agglutinationen aflæses, idet man vipper frem og tilbage i skråt indfaldende lys over sort baggrund: 30 4+ store klumper - klar baggrund 3+ store klumper - mælket baggrund 2+ små klumper 1+ fint granulært 0 mælket 35 3+ og 4+ reaktionerne er let skelnelige fra kontrollerne, når man ser på pladen i en arms afstand. 2+ reaktionerne kræver nærmere inspektion.

DK 166234 B

21

Bedømmelse af resultaterne

Hemophilus LP Kontrol LP Bedømmelse (+) (-) Positiv for H. influenzae 5 type b antigen (-) (-) Negativ for H. influenzae type b antigen 10 ( + ) (+) Ikke-specifik agglutina tion. H. influenzae type b antigen kan eller kan ikke være til stede.

15 Positiv agglutination på 2+ bør angives som "svagt positiv".

I beskrivelsen med krav er tiden og de anvendte temperaturer under varmebehandlingen og inkubationen optimale, 20 hvilket skal forstås på den måde, at samme resultater kan opnås ved højere temperaturer gennem kortere tid eller omvendt ved lavere temperaturer i længere tid. Yderligere er de omtalte reagenser, medier og teknikker, der er anvendt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, sådan, at 25 det let for fagmanden vil være muligt at foretage variationer i"metoderne, tiderne, rumfangene og typerne af materialer, substrater og udstyr.

30 35

Claims (3)

1. Direkte agglutineringstest til påvisning af antigener 5 i legemsvæsker, der antages at indeholde sådanne antigener, kendetegnet ved, at man kombinerer en prøve af en legemsvæske, der er serum eller plasma, med et flydende reagens, der agglutineres ved kontakt med væsker der indeholder antigener, hvilket reagens omfatter 10 en bærer belagt med animalsk antiserum mod nævnte antigener opslemmet i et fysiologisk passende puffersystem og ikke-immunt animalsk serum fra samme dyreart, der dannede antiserumet, hvilket antiserum er et fuld-hesteslægtsan-tiserum, specielt makroglobulinfraktionen heraf, med et 15 puffersystem indeholdende en polyanion, der kan formindske virkningen på prøvens varmelabile bestanddele, hvilken polyanion er natriumpolyanetolsulfonat, dextransulfo-nat, carragen, heparin eller tilsvarende, og et reduktionsmiddel for prøvens antiglobulinantidele, der består 20 af 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, glutation, cystein eller lignende, blandingen inkuberes og herefter bestemmes agglutineringsgraden visuelt.

2. Agglutineringstest ifølge krav 1, kendeteg-25 net ved, at legemsvæsken opvarmes.

3. Agglutineringstest ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den til inkuberingen anvendte tid er mindst 45 minutter. 30 35