DE2444110A1

DE2444110A1 - Neues antibiotikum

Info

Publication number: DE2444110A1
Application number: DE2444110A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Fukase; Toru Hasegawa; Kazunori Hatano; Hidesuke Iwasaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1973-09-18
Filing date: 1974-09-14
Publication date: 1975-03-20
Also published as: CA1030885A; US4017485A; JPS5053594A; GB1480082A; FR2243699B1; NL7412369A; FR2243699A1; JPS5611440B2

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SC HON WALD

DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES Dl PL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS 2444110

Köln, den IJ. Sept. Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomach.1,2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Neues Antibiotikum

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum C-2801-X (nachstehend auch kurz als "C-2801-X" bezeichnet) und seine Herstellung. Es wurde gefunden, daß durch einen zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus ein neues Antibiotikum gebildet und im Kulturmedium angehäuft wird, daß das neue Antibiotikum eine chemische Struktur von der Art der Cephalosporine hat und wertvoli ist beispielsweise für die Behandlung von Infektionen der Harnwege, Infektionen der Atmungswege, Colitis, Sepsis, eitrigen Entzündungen usw. bei Warmblütern einschließlich des Menschen. Das neue Antibiotikum wurde als "Antibiotikum C-2801-X" bezeichnet.

Gegenstand der Erfindung sind das neue Antibiotikum C-2801-X und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze sowie ein großtechnisch vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums. Die Erfindung umfaßt ferner die Abscheidung des Antibiotikums C-2801-X von den Kulturmedien.

Gemäß der Erfindung wird das Antibiotikum C-2801-X hergestellt, indem ein C-2801-X bildender Mikroorganismus

509812/1138

der Gattung Streptomyces in einem geeigneten Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, gezüchtet wird, bis das Antibiotikum im Kulturmedium stark angehäuft ist, und das Antibiotikum G 2801-X vom Kulturmedium abgetrennt wird.

Die für die Zwecke der Erfindung zu verwendenden Mikroorganismen können von natürlichen Hilfsquellen isoliert und auch von den Typkultur-Sammelstellen bezogen werden.

Zu diesen Mikroorganismen gehören beispielsweise Streptomyces heteromorphus C-2801, der von einer Bodenprobe in Cabanatuan City, Republik der Philippinen, erhalten wurde, und Streptomyces panayensis C-2878 und Streptomycei panayensis C-2879, die von Bodenproben, die in Panay Island der Republik der Philippinen genommen wurden,

isoliert worden sind. J

Streptomyces heteromorphus C-2801, Streptomyces panayensis C-2878 und Streptomyces panayensis C-2879 werden nachstehend kurz als Stamm C-2801, Stamm C-2878 und Stamm C-2879 bezeichnet.

j Der Stamm C-2801, der von der Aninelderin'durch Screening isoliert wurde, hat die nachstehend genannten mikrobiologischen Charakteristiken und Kulturmerkmale. Falla ■ nicht anders angegeben, handelt es sich um die Kultur-25 merkmale, die routinemäßig nach 14-tägiger Kultivierung ; bei 28⁰C festgestellt wurden.

> 1) Morphologie (auf Glucose-Asparaginagar) ; ' Ein Luftmycel von etwa 1 u Tagt weit von dem gut ver- : zweigten vegetativen Mycel mit kurzen monopodial verlaufenden Zweigen. Die Spitze des Luftmycels trägt Ketten von Sporen von unterschiedlicher Gestalt, z.B. schleifenförmig, hakenförmig, wellenförmig, unvollständige Spiralen, offene Spiralen und geschlossene Spiralen, Wahre Wirtel, die für Verticillatkulturen repräsentativ

509812/1138

2U4110

sind, werden nicht beobachtet. Die Zahl der Sporen pro Kette variiert von einigen wenigen bis mehr als 10. Jede Spore ist ellipsoid, oval oder zylindrisch (0,6 bis 0,7 χ 0,8 bis 1,2 a) mit stacheliger Oberfläche. Keine anderen speziellen Organe werden festgestellt.

2) Kulturmerkmale

1) Saccharose-Nitratagar

Wachstum: mäßig, hell-lohfarben bis gräulichbraun Luftmycel: weiß bis cremefai-ben Rückseite: dunkellohfarben bis dunkelbraun Lösliches Pigment: hell-lohfarben bis hellpurpurartig-

braun (light purplish brown)

2) Glucose-Asparaginagar

Wachstum: mäßig, blaßbraun bis hellpurpurartig-braun Luftmycel: weiß bis gräulichb¹au

Rückseite: hellbraun bis purpurartig-braun Lösliches Pigment:hell-lohfarben bis hellpurpurartigbraun

3) Glycerin-Asparaginagar

Wachstum: mäßig, blaßbraun bis gräulichbraun Luftmycel: weiß bis gräulichblau Rückseite: hellbraun bis dunkelbraun

Lösliches Pigment: hell-lohfarben bis blaß-purpurartigbraun

4) Stärkeanar

Wachstum: gut, lohfarben bis hellbraun Luftmycel: reichlich, weiß bis hellgräulichblau Rückseite: hellbraun bis purpurartig-braun Lösliches Pigment: farblos bis hellpurpurartig-braun

5) Tyrosinagar

Wachstum: mäßig, braun

Luftraycel: spärlich, weiß bis grau Rückseite: braun

Lösliches Pigment: schwärzlich-braun

509812/1 138

24U110

6) Nähragar

Wachstum: mäßig, blaßbraun Luftmycel: spärlich, weiß "bis gräulichweiß Rückseite: lohfarben Lösliches Pigment: lohfarben bis blaßbraun

7) Hefe-Malζagar
Wachstum: gut, lohfarben

Luftmycel: reichlich, cremefarben bis grau bis hellgräulichblau Rückseite: lohfarben bis orangebraun Lösliches Pigment: hellorangegelb bis lohfarben

8) Hafermehlagar

Wachstum: gut, blaßbraun bis gräulichbraun Luftmycel: weiß bis cremefarben bis hellgräulichblau Rückseite: hellbraun bis purpurartig-braun Lösliches Pigment: hellbraun bis purpurartig-braun

j 3) Physiologische Charakteristiken

a) Wachstumstemperaturbereich (Hefe-Malzagar, 2 Wochen) - : kein Wachstum;
+ : mäßiges Wachstum;

++: gutes Wachstum;
+++: starkes Wachstum

15⁰C -<%.+ 20 +

24 ++

28

50 +++

32 +++

37 +++

40 ++,v

45 ++

55

509812 71138

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß der Wachstumstemperaturbereich dieses Stammes bei 15 bis 45 C liegt.

b) Verflüssigung von Gelatine: negativ (24°C, 3 Wochen)

c) Hydrolyse von Stärke: positiv (schwach)

: 5 d) Koagulierung von entrahmter Milch: negativ ι Peptonisierung von entrahmter Milch: positiv

e) Bildung von Melanoidpigmenten

■ Tyrosinagar: positiv

, Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar: positiv (schwach)

j 10 4) Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gottlieb-Medium) (+ Wachstum, - kein Wanhstum)

ι a) L-Arabinose +

b) D-Xylose +

c) D-Glucose +
d) D-Fructose +

e) Saccharose +

' f) i-Inosit +

g) L-Rharanose +

h) Raffinose - +

i) D-Mannit +
3) Kontrolle (kein Zusatz)

Die vorstehend genannten beobachteten Eigenschaften des Stamms C-28Ö1 lassen deutlich erkennen, daß dieser Stamm zur Gattung Streptomyces gehört. Von den bekannten Spezies von Streptomyces sind die folgenden diesem Stamm mehr oder weniger ähnlich: Streptomyces afghaniensis Shimo et al, Streptomyces lanatus Frommer, Actinomyces coeruleorubidus Preobrazhenskaya, Actinomyces coerulatus Krassilnikov et al und Actinomyces coeliatus Krassilnikov et al. Die Eigenschaften des Stamms C-2801 wurden mit den ursprünglichen Beschreibungen der vorstehend genannten ähnlichen Mikroorganismen und mit den Beschreibungen in International Streptomyces Project 509812/1138

(nachstehend kurz als ISP bezeichnet) verglichen. Eine Vergleichszüchtung von ISP-Stämmen und dem Stamm C-2801 wurde ebenfalls unter gleichen Bedingungen durchgeführt. Zwischen dem Stamiu C-2801 und den oben genannten verschiedenen Mikroorganismen bestehen die folgenden offensichtlichen Unterschiede:

Streptomyces afghaniensis

Die Rückseite seiner Kolonie auf Hefe-Malzagar, Stärkeagar oder Glycerin-Asparaginagar ist orangefarben oder rötlichbraun. Das lösliche Pigment ist ebenfalls orangefarben oder rötlichbraun.

Streptomyces lanatus

Die Sporenketten sind geschlossene Spiralen. Die Rückseite seiner Kolonie auf Hefe-Malζ-Agar, Stärke-Agar, Hafermehl-Agar oder Glycerin-Asparagin-Agar ist farblos. Auf Stärke-Agar und Hafermehl-Agar werden hellgelblichbraune lösliche Pigmente gebildet.

Actinomyces ρoeruleorubidus

Die Rückseite seiner Kolonie.auf Stärkeagar oder Hafermehlagar ist gelb bis gelblichgrün. Auf Hefe-Malz agar, Stärkeagar und Glycerin-Aspara^inagar werden rötliche lösliche Pigmente gebildet.

Actinomyces coerulatus

Die ausgereiften Sporenketten sind lang und haben mehr als 50 Sporen pro Kette. Auf Hefe-Malz-Agar, Stärkeagar, Glycerin-Asparaginagar, Hafermehl-Agar usw. werden keine löslichen Pigmente gebildet.

ActinoiEyces coeriatus

Die Sporenketten sind geschlossene Spiralen. In Hefe-Malz-Agar, Hafermehl-Agar, Stärkeagar und Glycerin-Asparaginagar werden glänzend blaue bis violette lösliche Pigmente gebildet.

509&12/1138

2U4110

Von den Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, von denen bekannt ist, daß sie Antibiotika der Cephalosporingruppe "bilden, sind die. Spezies Streptomyces chartreusis und Streptomyces viridochromogenes (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2, 122-131 (1972)) dem Stamm C-2801 verhältnismäßig ähnlich. Aus den ursprünglichen Beschreibungen der beiden Spezies, den ISP-Beschreibungen und der Vergleichszüchtung von ISP-Stämmen und dem Stamm C-2801 unter den gleichen Bedingungen ergaben sich die folgenden offensichtlichen Unterschiede: ;

Streptomyces chartreusis j

Ein cremefarbenes Luftmycel wird auf Saccharose-Nitratagär gebildet. Die Rückseite ist gelb und das lösliche Pigment ebenfalls gelb. Auf Hafermehl-Agar wird ein gelblichbraunes Pigment gebildet, und die Rückseite seiner Kolonie auf Stärke-Agar ist grünlichgelb. Ein Luftmycel in Form von offenen Spiralen wird gebildet.

Streptomyces viridochrcmogenes

Das Luftmycel hat die Form von offenen Spiralen.' Ein charakteristisches lösliches Pigment wird auf Saccharose-Nitratagar, Stärkeagar, Hafermehl-Agar usw. nicht gebildet. Die Rückseite der Kolonie auf Hafermehl-Agar, Hefe-Malzagar oder Stärkeagar ist gräulichgrün bis grünlichbraun. ι

Auf Grund der vorstehenden Tatsachen ist es schwierig, den Stamm C-2801 mit einer der bekannten Spezies der Gattung Streptomyces zu identifizieren, so oaß der Stamm als neue Spezies angesehen wurde. Nach der Morphologie seines Luftmycels wurde dieser Mikroorganismus als "Streptomyces heteromorphus" bezeichnet.

Nachstehend sind die verschiedenen Merkmale des Stamms C-2878 und des Stamms C-2879 genannt. Die Kulturmerkmale wurden routinemäßig nach 14-tägiger Bebrütung bei 28⁰C ermittelt, falls nicht anders angegeben.

509812/1138

1) Morphologische Eigenschaften (auf Glucose-Asparagin-

Ag ar) ^

a) Stamm 0-2876

Das luftmycel mit offenen oder geschlossenen Sporen ragt monopodisch vom gut verzweigten vegetativen Mycel nach oben. Die Sporen liegen im allgemeinen in Ketten mit 10 oder mehr Sporen pro Kette vor. Die Form der Sporen ist oval oder ellipsoid (0,6 bis 0,8 χ 0,9 bis 1,3 ju) mit stacheliger Oberfläche. Keine anderen speziellen Organe sind festzustellen.

b) Stamm C-2879

Die Merkmale dieses Stamms stimmen mit den vorstehend beschriebenen Merkmalen des Stamms C-2878 überein.

2) Kulturmerkmale auf verschiedenen Medien

Medium

Stamm C-2878

Stamm C-2879

1) Saccharose- W* spärlich, farbniiratagar los bis cremefarben

spärlich bis mäßig, hell lohfarben bis hell gräulichbraun

L nicht gebildet

spärlich (weiß) oder nicht gebildet

farblos bis hell lohfarben

hell lohfarben bis hell rräulichbraun

LP farblos

2) Glucose-Asparagin- Ag ar

farblos bis helleerb

W mäßig, farblos bis blaßbraun

mäßig, blaß hellbraun

L grau bis bläulichgrau

weiß bis gräulichweiß bis bläulich· grau

R dunkel lohfarben

hell lohfarben bis hellbraun

LP farblos bis hell lohfarben

farblos bis hellgelb

509812/1138

— Q _

Medium

Stamm C-2878

Stamm C-2879

3) Glycerin-Asparagin-
Ag ar

W mäßig» gräulichbraun, bis dunkelbraun

mäßig, lohfarben

L weiß bis gräulichweiß

spärlich, weiß bis bläulichweiß

R dunkelbraun bis dunkelgrünlichbraun

lohfarben

LP hell lohfarben bis hell gelblichbraun mit grünlichem Stich gelb bis goldfarben

4)Stärkeagar

¥ mäßig, hell lohfarben bis blaß hellbraun

gut, farblos bis cremefarben

L grau bis bläulichgrau

weiß bis bläulichgrau

R hell lohfarben bis blaß hellbraun farblos bis hell lohfarben

IP farblos

farblos

5) Tyrosin-Agar

W mäßig, dunkelbraun bis schwärzlichbraun

mäßig, dunkelbraun

L spärlich, weiß spärlich, weiß

R dunkelbraun bis schwärzlichbraun schwärzlichbraun

LP dunkelbraun schwärzlichbraun

6) Nähragar W

spärlich, farblos spärlich, farblos bis hell lchfarben bis lohfarben

L nicht gebildet nicht gebildet

R hell lohfarben blaß braun

LP farblos bis lohfarben

lohfarben

509812/1138

Medium	Stamm C-2878	2444110 Stamm C-2879
7) Hefe-Malz- W agar	mäßig, farblos bis hell	gut, blaß hell braun
L	reichlich, weiß bis bläulich weiß	weiß bis bläulich grau
R	lohfarben	hellbraun
LP	farblos bis lohfarben	orange-lohfarben bis gelblich-hell braun
8) Hafermehl- W Agar	gut, farblos bis blaß hell braun	gut, blaß hell braun bis blaß- braun
L	weiß bis gräulich blau	gräulichweiß bis bläulichgrau
R	hellbraun bis grünlichbraun	dunkel lohfarfcen bis hellbraun
LP	farblos bis blaß hellbraun	blaß hellbraun

*W = Wachstum;; L = Luftmycel; R = Rückseite; LP = lösliches Pigment. Allen Werten liegt Bebrütung für 14 lage bei 28⁰C zu Grunde.

3) Physiologische Eigenschaften

a) Wachstumstemperaturbereich (2 Wochen auf Glucose-Asparagin-Agar) (- = kein Wachtum; + = Wachstum; ++ = gutes Wachstum; +++ = starkes Wachstum)

Temperatur,	~C	Stamm C-2878	Stamm C-2879
15		-«-„ +
20		+	+
24		++	++
28		+++	+++
30		+++	++-r
32		+++	+++
37		+++	+++
40			++

509012/1138

	⁰C	Stamm C-2878	2444110
Temperatur,		++	Stamm C-2879
45		—	++
55		-

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß der Stamm über den Temperaturbereich von 15 bis 45°C wächst.

	Verflüssigung Gelatine	von	stamm C-2878	Stamm C-2879
a)	Hydrolyse von	Stärke	positiv	positiv
b)	Koagulierung rahmter Milch	von ent	positiv (schwach)	positiv (schwach)
c)		negativ	negativ

Peptonisierung von positiv positiv ; entrahmter Milch

d) Bildung von Melanoid- !

pigmenten !

ι Tyrosin-Agar positiv positiv

Pepton-Hefeextrakt- positiv positiv Eisen-Agar

4) Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham und Gottlieb-Medium) (+ = Wachstum; + = vermutetes Wachstum; - = kein Wachstum)

Stamm C-2878 Stamm C-2879

i-Inosit + +

D-Mannit + ₊

D-Xylose + ₊

1-Arabinose -v+ - λ, +

D-Glucose + ₊ B-Pructose

L-Rhamnose + ₊

Saccharose + ₊

Raffinose + ₊ Kontrolle

509812/1138

Die vorstehenden Merkmale zeigen, daß sowohl der Stamm . C-2878 als auch der Stamm C-2879 zur Gattung Streptomyces gehören. Was ihre Verwandtschaft anbelangt, so kann mit gutem Grund geschlossen werden, daß sie zur gleichen Spezies gehören, denn mit Ausnahme ihrer offensichtlichen Unterschiede in den Rückseitenfarben des Wachstums auf Glucose-Asparagin-Agar und auf Glycerin-Asparagin-Agar sowie in der Farbe des löslichen Pigments stimmen diese Stämme in den morphologischen Eigenschaften, Kultureigenschaften und physiologischen Eigenschaften gut überein. Diese Feststellung in Verbindung mit den beobachteten Mengen des gebildeten Luftmycels deuten darauf hin, daß der Stamm C-2879 ein spontaner Mutant des Stamms C-2878 ist.

Es wurde versucht, den Stamm C-2878 mit bekannten Spezies der Gattung Streptomyces, insbesondere denen, die bläuliches Luftmycel bilden, zu vergleichen.

Es wurde gefunden, daß der beschriebene Charakter auf Glucose-Asparagin-Agar bei Streptomyces viridochromogenes, einer typischen Spezies, die ein bläuliches Luftmycel bildet (S.A. Waksman, The Actinomycetes II, 287), der entsprechenden Eigenschaften der erfindunsgemäß verwendeten Stämme stark ähnelt. Daher wurde ein Vergleichszüchtungsversuch mit dem Stamm C-2878 und Streptomyces viridochromogenes unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Dieser Versuch warf Licht auf einige hervorstechende Unterschiede zwischen den beiden Mikroorganismen, d.h. in ihren Charakteristiken auf Saccharose-Nitrat-Agar, Hefe-Malζ-Agar, Hafermehl-Agar und anderen Medien, ihren verschiedenen Fähigkeiten, Melanoidpigmente zu bilden, ihren verschiedenen Fähigkeiten, Kohlenstoffquellen zu assimilieren und in anderer Hinsicht.

Als Spezies, die ein Antibiotikum der Cephalosporingruppe oder ein anderes Antibiotikum zu bilden vermögen

5 0 9 812/1138

! -¹³-

ί und ein bläuliches Luftmycel bilden; sind Streptomyces ! chartreusis und Streptomyces heteromorphus bekannt,

der eine neue Spezies im Rahmen der vorliegenden Anmeldung ist, jedoch gleicht keiner dieser Mikroorganismen j 5 dem Stamm C-2878.

Aus den vorstehend genannten Beobachtungen wurde gefolgert, daß sowohl der Stamm C-2878 als auch der Stamm j C-2879 zu einer neuen Spezies gehören, die keiner bej kannten Spezies der Gattung Streptomyces zugeordnet j 10 werden kann, so daß ihnen nach der Panay-Insel der 'Republik der Philippinen, wo die Bodenproben gesammelt worden waren, der spezielle Name "Streptomyces panayensis" gegeben wurde.

Es ist natürlich bekannt, daß die Merkmale von Actinomyceten, insbesondere von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, nicht konstant sind, sondern Veränderungen sowohl durch spontane als auch induzierte Mutation _: unterliegen. Die zur Gattung Streptomyces gehörenden , Stämme, die das Antibiotikum C-2301-X bilden, sind keine Ausnahme. Beispielsweise können sie leicht eine Mutation durch künstliche mutagene Behandlungen, z.B. durch Bestrahlung mit UV-Licht, Röntgenstrahlen oder andere Strahlung, oder durch Behandlung mit Chemikalien (z.B. Natriumnitrit und N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) erfahren, und auch diese Mutanten können sämtlich für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, so lange sie das Antibiotikum C-2801-X zu bilden vermögen.

Die vorstehend als Beispiele genannten Stämme sind unter den nachstehend genannten Hinterlegungsnummern deponieft: j

Streptomyces heteromorphus C-2801 (IPO-13575, PERM P-Nr.

2271, ATCC- j Streptomyces panayensis C-2878 (lPO-13576, PERM P-Nr.

2272, ATCC

509812/1138

-H-

Streptomyces panayensis C-2879 (IFO-13577, FERM P-Nr.

2273, ATCC-

Die Zahlen in Klammern, denen die Abkürzungen "IFO", "FERM" und "ATCC" vorausgehen, sind die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), The Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Japan (FERM), bzw. bei der American Type Culture Collection, USA (ATCC).

Gemäß der Erfindung werden die das Antibiotikum C-2801-X bildenden Stämme in einem Nährmedium kultiviert. Das Medium kann flüssig oder fest sein, jedoch ist ein flüssiges Medium vorteilhafter. Die Nährmedien enthalten die Nährstoffe, die üblicherweise für die Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces verwendet werden, z.B. Kohlenstoff- und Stickstoffquellen usw. Als Kohlenstoffquellen eignen sich u.a. Glucose, Stärke, Glycerin, Dextrin, Saccharose, Hirsegallerte, Melasse, Lactose und Maltose. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Weizenkleie, Baumwollsaatmehl, Fleischextrakt, Reiskleie, Harnstoff, Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat) und andere anorganische und organische Stickstoffverbindungen. Als anorganische Salze können beispielsweise Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Calciumchlorid und Calciumphosphat zugesetzt werden. Ferner können andere organische und/oder anorganische Verbindungen, die das Wachstum des Mikroorganismus und die Bildung des Antibiotikums C-2801-X durch den Mikroorga-.30 nismus fördern und beschleunigen, zugesetzt werden.

Von den in Frage kommenden Kultivierungsmethoden wird die Flüssigkultur, insbesondere die Submerskultur, bevorzugt. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums kann im Bereich von 5 bis 9 liegen und beträgt vorzugsweise

509B12/1 138

6 "bis 8. Die Kultivierungstemperat ur kann 20° bis 40 C betragen und liegt vorzugsweise im Bereich von 24 bis 37⁰C. Die Kultivierungsdauer liegt zwischen 20 und 240 Stunden und beträgt vorzugsweise 24 bis 120 Stunden.

Das im Kulturmedium gebildete Antibiotikum C-2801-X kann vorteilhaft nach an sich bekannten Verfahren, die routinemäßig angewendet, werden, gewonnen werden. Das zu den sog. Cephalosporin-Antibiotika gehörende Antibiotikum C-2801-X ist eine wasserlösliche amphotere Substanz, die unter stark sauren und unter alkalischen Bedingungen instabil ist und nach verschiedenen Verfahren unter Ausnutzung des Vorteils der ausgeprägten sauren und alkalischen Funktionalitäten ihrer Seitenketten abgetrennt und gewonnen werden kann. Beispielsweise können entweder allein, in Kombination oder wiederholt die folgenden Verfahren angewendet werden: Das Verfahren, bei dem der Vorteil der ausgeprägten adsorbtiven Affinität des Antibiotikums zu nichtionischjen Adsorptionsharzen, z.3. nichtionischen Adsorptionsharzen vom Polystyroltyp (z.B. Amberlite XAIi-2, Hersteller Rohm and Haas Co., USA, und "Diaion HP-10", Hersteller Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) ausgenutzt wird; das Verfahren, bei dem die Basizität der basischen funktioneilen Gruppe ausgenutzt wird und Kationenaustauschharze (z.B. Dowex 5OW, Hersteller Dow Chemicals, USA) verwendet werden, und das Verfahren, bei dem die Acidität der sauren funktionellen Gruppe ausgenutzt wird und Anionenaustauscherharze (z.B. Amberlite IRA-68, Hersteller Rohm and Haas Co., USA) oder Anionenaustauschcellulose (z.B. DEAE (Diäthylaminoäthylcellulose, Hersteller Seikagaku Kogyo, Ltd., Japan) verwendet werden.

Da das in der beschriebenen Weise hergestellte Antibiotikum unter stark sauren Bedingungen sowie unter alkalischen Bedingungen instabil ist, werden vorzugsweise neutrale Lösungsmittel oder Puffer verwendet, die auf

509812/1 138

einen pH-Bereich eingestellt sind, der sich für die Stabilisierung der Antibiotika während der Abtrennung und Gewinnung eignet. Damit die Komponenten mit einer gewissen Trennschärfe fietrennt werden können, ist es bei der Durchführung von Elutionen von Adsorptionsmitteln oder Ionenaustauschern zweckmäßig, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, z.B. ein niederes Keton (z.B. Aceton und Methyläthylketon) oder einen niederen aliphatischen Alkohol (z.B. Methanol, Äthanol oder Propanol) mit Wasser oder einer Pufferlösung zu mischen und die Konzentration der Lösungsmittel oder die Salzkonzentration des Puffers kontinuierlich oder stufenweise zu verändern.

Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Mononatriumsalz von Antibiotikum C-2801-X hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

2) Elomentaranalyse:

20 H

N S

3) Bruttoformel: C₂₅H₂gN,O.

4) Optische Drehung: /α_7^⁵° (C=O,5 in Wasser)+124,4° 5) UV-Absorption (Fig.1):

Maxima λ"|° ^Y°_cm) i 235 mu (208), 318 m/j (274) Schulter; 295 m/a (E]*_cm 255)

6) IR-Spektrum (KBr): (Fig.2)

Das Mononatriumsalz von Antibiotikum C-2801-X hat die folgenden charakteristischen Wellenzahlen (cm**¹) der IR-Absorption:

eiße Pulver	Berechnet
Gefunden	46,62
48,46	4,57
4,85	6,79
6,98	5,19
5,13

509812/1138

; 3400 (S), 3200 (S), 3000 (M), 2920 (M)", 1760 (S),

ί . 1690 (M), 1630 (S), 1600 (S), 1510 (E), 1440 (M),

1400 (M), 1350 (M), 1300 (M), 1275 (H), 1240 (S),

1165 (W), 1140 (W), 1110 (W), 1095 (M), IOIO (W). 5 S= stark; M = mittel; W = achwach.

7) Löslichkeit: löslich in Wasser, Methanol und Äthanol Unlöslich in Äthylacetat, Chloroform und Äther.

8) Farbreaktionen: Ninhydrinreaktion: +

Bartonsche Reaktion (unter Verwendung eines aus glei 10 chen Raumteilen 1$igem wässrigem Eisen(lll)-chlorid

und 1$igem wässrigem Kaliumferricyanid -) bestehenden Reagenz: +

9) Acidität-Alkalität: amphoter

J 10) Papierchromatographie (Whatnian-Filterpapier Nr.1, j 15 Hersteller Baiston Ltd., Großbritannien)

Rf-Werte:

I ' n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5) 0,12 j n-Butanol-Essigsäure-Vasser (2:1:1) 0,42

70%iges Isopropanol 0,33

20 Auf der Grundlage der vorstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie der Ergebnisse anderer Analysen wurde die folgende chemische Struktur dieses neuen Antibiotikums C-2801-X bestimmt:

HOOC-CH-I. ... . . _Ί

J-C=CH-fV-OH

COOH ⁰⁰V ^0H

11) Antimikrobielles Spektrum:

Medium: Tripticase Soy Agar (BBL) (Hersteller Becton

._ I

509812/1138

Dickenson Co., USA), pH 6,5» hemmende Mindestkonzentrationen in ug/ml, Temperatur 37°C:

Test-Mikroorganismen

Staphylococcus aureus 209 P 50

(resistent gegen Chloramphenicol,
Streptomycin. Tetracyclin und
Erythromyei η)

Staphylococcus aureus Nr.87 50

Bacillus subtilis PCI 219 12,5

Bacillus pumilus IFO-3813 50

Escherichia coli NIHJ 50

Escherichia coli 25

(klinisches Isolat, gegen Antibiotika
empfindlicher Stamm)

Escherichia coli 25

(klinisches Isolat*)

Escherichia coli

(klinisches Isolat**) 25

Proteus vulgaris IFO-3988 12,5

Proteus uiirabilis IF0-3849 3,13

Proteus morganii IFO-3848 25

Klebsiella pneumoniae IFO-3512 6,25

Pseudomonas aeruginosa IFO-3080 > 100

Pseudomonas aeruginosa NCTC-10490 >100

Salmonella typhimurium IFO-12529 6,25 Salmonella enteritidis IFO-3313 6,25

Aerobacter cloacae IFO-12009 25

Alcaligenes faecalis IFO-13111 12,5

*Der Stamm ist resistent gegen Tetracyclin, Streptomycin, Kanamycin, Lividomycin, Aminobenzylpenicillin und Sulbenicillin.
**Der Stamm ist resistent gegen Sulfonamid, Streptomycin und Sulbenicillin.

(Die vorstehend genannten IFO-Nummern sind die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan.)

509812/1138

ι - 19 -

! 12) Akute Toxizität

, Bei dem an Mäusen durchgeführten Test zur Ermittlung ! der akuten Toxizität trat kein Todesfall ein, wenn

400 mg Antibiotikum C^eoi-X-Mononatriumaalz/kg Körper- ! 5 gewicht intravenös verabreicht wurden.

Das gemäß der Erfindung herstellbare Antibiotikum C-2801-X kann auch in Form von Salzen, z.B. Alkalisalzen

(z.B. Mono- und Diηatriumsalζ und Mono- und Dikaiiumsalz), Monoammoniumsalz und in Form verschiedener Salze j 10 mit anorganischen und organischen Säuren (z.B. als Hydrochlorid, Sulfat und Alkylsulfonat) gewonnen werden.

Die freie Verbindung kann nach an sich bekannten Verfahren in das Salz und das Salz in die freie Verbindung umgewandelt werden.

Im Rahmen dieser Beschreibung umfaßt der Ausdruck j

"Antibiotikum C-2801-X" sowohl die freie Form als auch : die Salze von Antibiotikum C-2801-X, falls nicht anders

: angegeben. ,

Das gewonnene Antibiotikum C-280-1-X und seine Salze ^; 20 hemmen das Wachstum von Staphylococcus aureus, Bacillus

subtilis, Escherichia coli_; Proteus vulgaris, Salmonella S typhimurium, aeroben Bakterien usw. Sie werden daher

als Mittel zur Behandlung von Warmblütern einschließlich des Menschen verwendet, die an Infektionen der Harnwege (z.B. Zystitis und Nephropyelitis), Infektionen der Atmungswege (z.B. Bronchitis und Pneumonie), Colitis, Septikämie, eitrigen Entzündungen usw. leiden. Zur Behandlung dieser Krankheiten beim Menschen kann das Antibiotikum C-2801-X oder eines seiner Salze in regelmäßigen Tagesdosen von 1 bis 2 g für den Erwachsenen in Mischung mit einem pharmakologisch unbedenklichen inerten Hilfsstoff in Form von Zubereitungen wie parenteralen Injektionslösungen usw. verabreicht werden. Die Dosierung von C-2801-X bei Verabreichung an andere Empfänger

509812/1138

kann auf der Grundlage ihres Körpergewichts im Verhältnis zum Menschen bestimmt werden. Typische Zubereitungen werden nachstehend genannt. ' ;

Injektionslösung (für eine Verabreichung) I

In 2 ml destilliertem Wasser wird ein 500 mg-A'quivalent des Antibiotikums C-2801-X-Mononatriumsalz. gelöst. Nach aseptischer Filtration wird die Lösung in sterilisierte Ampullenflaschen gefüllt und gefriergetrocknet. Zur Injektion wird das Pulver in 2 ml destilliertem Wasser für Injektion gelöst und die Lösung intramuskulär injiziert. Für den Erwachsenen werden die Injektionen alle 6 bis 8 Stunden vorgenommen.

Kapseln

Kapseln werden so hergestellt, daß sie 550 mg Granulat der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Antibiotikum C-2801-X-Mononatriumsalz 500 mg

Lactose 20 mg

Stärke 20 mg

Magnesiumstearat 10 mg

550 rug

Für den Erwachsenen wird eine Kapsel alle 6 Stunden verabreicht.

Da das Antibiotikum C-2801-X ein breites antibiotiscb.es Spektrum hat, kann es als Desinfektionsmittel sowie als Konservierungsmittel verwendet werden. Seine keimtötende Wirkung kann beispielsweise für die Sterilisation der Luft und von Geräten u.dgl. beispielsweise in Krankenhausräumen ausgenutzt werden, indem eine wirksame Menge beispielsweise einer Lösung des Antibiotir kums in Äthanol in die Luft oder auf die Geräte gesprüht wird.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile

509812/1138

als Gewichsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1

In einen Fermenter, der ein Passungsvermögen von 2000 Raumteilen hat, werden 500 Raumteile eines Mediums gegeben, das 2?6 Glucose, 3$ lösliche Stärke, 1$Maisquellwasser, 1$ Sojabohnenmehl, 0,5$ Pepton, 0,3$ Natriumchlorid und 0,5$ CaCO₅ enthält (pH 7,0), und 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert.

Der Fermenter wird mit Strepto'myces heteromorphus C-2801 (IFO-13575, FERM P-Nr.2271) beimpft, worauf 4-0 Stunden bei 28⁰C inkubiert wird. Die erhaltene Impfkultur wird in einen Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 50000 Raumteilen hat und 30000 Raumteile eines Mediums der vorstehend genannten Zusammensetzung enthält, worauf 24 Stunden bei 28⁰C unter Belüftung und unter Rühren kultiviert wird (Belüftung 100$, Geschwindigkeit des Rührers 280 UpM).

Von der erhaltenen Kultur werden 10000 Raumteile in einen Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 200000 Raumteilen hat und 100000 Raumteile eines Mediums enthält, das 3$ Saccharose, 2$ entfettetes und· gekochtes Baumwollsaatmehl ("Proflo", Hersteller Traders Oil Mill Company, USA), 1$ Maisquellwasser, 0,05$ PeSO., 0,05$ K₂HPO., 0,3$ Natriumchlorid und 0,5$ CaCO, enthält (pH 7,0), worauf 66 Stunden bei 28°C unter Belüften (100$) und Rühren (200 UpM) bebrütet wird.

Das erhaltene Kulturmedium in einer Menge von 93000 Raum-

- teilen wird mit 10$iger Phosphorsäure auf pH 5 einge- | stellt und mit dem Filterhilfsmittel "Hyflo-Supercel" j (Hersteller Johns Manville Products, USA) gerührt. ·

Das Gemisch wird in einer Filterpresse filtriert, wobei

509812/1138

80000 Raumteile Filtrat erhalten werden. Dieses Filtrat wird in einer Menge von 16000 Raumteilen/Std. durch eine Säule geleitet, die 8000 Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" enthält. Das Harz, das die aktive Substanz adsorbiert hat, wird mit 16000 Raumteilen eines 1/15-molaren Phosphatpuffers (pH 6,5)-Methanol (9s1) gewaschen, worauf das Antibiotikum mit 16000 Raumteilen von 1/15 Mol Phosphatpuffer (pH 6,5)-Methanol (4s1) eluiert wird. Das Eluat wird in Teile von je 4000 Raumteilen fraktioniert. Die 2. bis 4.Fraktion enthält das Antibiotikum C-2801-X. Die Säule wird weiter mit 16000 Raumteilen 1/15 Mol Phosphatpuffer (pH 6,5)-Methanol (1:1) eluiert. Das Eluat wird erneut in Teile von je 4000 Raumteilen fraktioniert. Die erste Fraktion und die zweite Fraktion enthalten das Antibiotikum C-2801-X.

Die in dieser Weise erhaltenen Fraktionen, die das Antibiotikum C-2801-X enthalten und insgesamt 20000 Raumteile ausmachen, werden zusammengegossen und mit 60000 Raumteilen 1/15 Mol Phosphatpuffer (pH 5,6) verdünnt.

Die verdünnte Lösung wird in einer Menge von 4000 Raumteilen/Std. durch eine Säule von 2000 Raumteilen des Harzes "Amberlite XAD-2" geleitet. Das Harz, das d.ie aktive Substanz adsorbiert hat, wird mit 1000 Raumteilen 1/15 Mol Phosphatpuffer (pH 5,6) gewaschen und dann mit 2000 RauEteilen Wasser und 4000 Raumteilen 10bigem wässrigem Äthanol in der genannten Reihenfolge gespült. Der Ablauf wird in Portionen von je 500 Raumteilen fraktioniert, wobei die Fraktionen Nr.1 bis Nr.12 erhalten werden.

Jede dieser Fraktionen wird durch aufsteigende Papierchromatographie (Whatman Nr.1) mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Sutanol, Essigsäure und Wasser (2:1:1) als Entwickler analysiert. Das Chromatogramm wird dem Bioautographie-Test gegen Bacillus subtilis und Proteus

509812/ 113 8

I - 23 -

vulgaria als Test-Mikroorganismus unterworfen. Der Hemm-Ϊ hof zeigt, daß das Antibiotikum C-2801-X in den Fraktionen Nr.6 Ms Nr. 10 enthalten ist.

! Die in dieser V/eise erhaltenen Fraktionen, die 2500 Raum- ! 5 teile ausmachen und das Antibiotikum C-2801-X enthalten, werden durch eine Säule, die 250 Raumteile des Harzes " :

j "Dowex 50 Wx4" (74-119 μ) enthält, das vorher mit 0,1 Mol : ι / / ■ ■ ■ I

Natriumacetatpuffer (pH 4,4) ins Gleichgewicht gebracht

■ worden ist, in einer Menge von 250 Räumteilen/Std. ge- ^: : 10 leitet, wodurch die aktive Substanz adsorbiert wird. ' ! Das Harz wird dann mit 10bigem wässrigem Äthanol ge- j waschen. Die Säule wird anschließend mit einem Lösungsmittelgemisch aus Ο,Ί Mol Essigsäure-Natriumacetatpuffer

(pH 4,4)-Äthanol (9:1) eluiert. Die aktiven Fraktionen ! 15 werden aufgefangen. Diese Fraktionen werden dann auf eine

■ Säule aufgegeben, die mit 200 Raumteilen des Harzes ; "Amberlite XAD-2" gefüllt ist, wobei die aktive Substanz adsorbiert wird. Dann werden 1/15 Mol Phosphatpuffer von pH 5,6 durchgeleitet, bis der Ablauf einen pH-Wert von

20 5,6 hat. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und mit

10bigem wässrigem Äthanol eluiert. Das Eluat in einer : ¹ Menge von 100 Raumteilen, das antibiotische Aktivität I aufweist, wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 15°C eingeengt, um das Äthanol 25 zu entfernen.·Die erhaltene wässrige Lösung wird gefrier-I getrocknet. Hierbei werden 2,5 Teile von Antibiotikum j C-2801-X-Mononatriumsalz als rohes Pulver (Reinheit 75$) ! erhalten.

1 Teil des so erhaltenen rohen Pulvers des Antibiotikums 30 C-2801-X (Mononatriumsalz) wird in 10 Raumteilen einer

wässrigen Lösung gelöst, die durch Auflösen von Natriumchlorid in 1/10 Mol Natriumacetatpuffer von pH 4,4 in einer Konzentration von 0,1 Mol hergestellt worden ist. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule geleitet, die 35 DEAE-Cellulose (Chloridform) enthält. Die Säule wird

50S812/1138 -■--■-

mit der vorstehend genannten Lösung entwickelt. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen. Diese Fraktionen werden weiter durch eine Säule geleitet, die mit dem Harz "Amberlite XAD-2" gefüllt ist, wo "bei die aktive Substanz adsorbiert wird. Die Säule wird mit 1/15 Mol Phosphatpuffer von pH 5,6 gewaschen, bis der Ablauf einen pH-Wert von 5,6 hat, worauf mit 500 Raumteilen Wasser gewaschen wird. Die Elution wird mit 5$igem wässrigem Äthanol durchgeführt. Die Fraktionen, die positive Ninhydrin- und Bartonsche Reaktionen zeigen, werden zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei werden 0,550 Teile Antibiotikum C-2801-X (Mononatriumsalz) als reines Präparat erhalten. ;

Zu 1 Teil des in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen rohen pulverförmiger Antibiotikums C-2801-X werden 10 Teile Cellulosepulver (Hersteller Toyo Roshi Ltd., Japan) gegeben. Das Gemisch wird gerührt und dann oben auf eine Säule von Cellulosepulver gelegt, die vorher mit einer oberen Schicht von Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5) gepackt worden ist (previously packed with the upper layer of butanol-acetic acid-water (4:1:5))· Eine geringe Menge des Lösungsmittels wird zugesetzt, und nach vorsichtigem Rühren zur Vermeidung einer Störung des oberen Endes der Säule wird die Säule mit dem vorstehend genannten Lösungsmittel entwickelt.

Die Fraktionen, die positive Ninhydrin- und Bartonsche Reaktionen ergeben, werden mit Wasser verdünnt und unter vermindertem Druck eingeengt.

Nach Entfernung des Butanols durch Destillation wird die als Rückstand verbleibende restliche Lösung durch eine Säule geleitet, die mit dem Harz "Amberlite XAD-2" gefüllt ist, worauf 1/15 Mol Phosphatpuffer von pH 5,6 durchgeleitet wird, bis der Ablauf einen pH-Wert von 5,6

Pepton, O,55ö Natriumchlorid und 0,5$ CaCO, enthält, worauf 66 Stunden unter Belüften und Rühren bei 28⁰C bebrütet wird (Belüftung 100$, 280 UpM). Die Bildung des Antibiotikums ist in 54 bis 66 Stunden maximal.

Aus 28000 Raumteilen dea in dieser Weise erhaltenen Kulturmediums werden auf die in Beispiel 1 beschriebene . Weise 25 Raumteile filtriertes Kulturmedium erhalten.

Das Filtrat wird zur Adsorption der aktiven Substanz durch eine Säule von 2500 Raumteilen des Harzes "Amberlite XAD-2" geleitet, worauf mit 5000 Raumteilen Wasser

- 25 - !

hat. Die Säule wird dann mit 500 Raumteilen Wasser gewaschen.

Die Elution wird mit 5$igem Äthanol durchgeführt. Die Fraktionen, die positive Ninhydrin- und Bartonsche Reaktionen ergeben, werden unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. In der beschriebenen Weise werden 0,400 Teile reines Antibiotikum C-2801-X·(Mononatriumsalz) erhalten. i

Beispiel 2

In einen Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 2000

Raumteilen werden 500 Raumteile 'eines Kulturmediums ' (pH 7»0) gegeben, das 2.⁰Jo Glucose, 3$ lösliche Stärke,

1$ Maisquellwasser, 1$ Sojabonnenmehl, 0,5$ Pepton, j

0,3$ Natriumchlorid· und 0,5$ CaCO, enthält, worauf j

30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert wird. j

Der Fermenter wird dann mit Streptomyces panayensis \ C-2878 (lFO-13576, FERM P-Nr.2272) beimpft, worauf ! 40 Stunden tei 28⁰C bebrütet wird. Die erhaltene Impfkultur wird in einen Fermenter überführt, der ein Fas-

sungsvermögen von 50000 Raumteilen hat und 30000 Raumteile eines Fermentationsmediums (pH 7) enthält, das 1$ Glycerin, 2$ Glucose, 2$ lösliche Stärke, 1$ Sojabohnenmehl, I5& Baumwollsaatmehl, 1$ Maisquellwasser, 0,5%

509812/1138

gewaschen wird. Die Elution wird mit 50$igem wässrigen Methanol vorgenommen und das Eluat unter vermindertem Druck eingeengt, wobei etwa 2000 Raumteile einer Lösung, die C-2801-X enthält, erhalten werden. 1000 Raumteile dieser Lösung werden auf eine Säule von 300 Raumteilen des Harzes "Amberlite XAD-2" aufgegeben, wobei 1/15 Mol Phosphatpuffer von pH 6,5 durch die Säule geleitet werden, bis der Ablauf einen pH-V/ert von 6,5 hat. Zur Desorption von C-2801-X wird als Entwickler ein Lösungsmittelsystem aus einem Gemisch von Methanol und 1/15 Mol Phosphatpuffer von pH 6,5 verwendet, in dem die Methanolkonzentration stetig von 10$ auf 50$ erhöht wird. Hierbei exscheint das Antibiotikum C-2801-X in den Fraktionen, die 28-35$ Methanol enthalten. Zu 300 Raumteilen der in dieser Weise erhaltenen Fraktionen, die reich an C-2801-X sind, werden 900 Raumteile von 1/15 Mol Phosphatpuffer von pH 5,6 gegeben. Das Geraisch wird durch eine Säule von 100 Raumteilen des Harzes "Amberlite XAD-2" geleitet, wobei die aktive Substanz am Harz adsorbiert wird. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 10$igem wässrigem Äthanol eluiert. Die aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. In der beschriebenen V/eise wird 1 Teil rohes Pulver von Antibiotikum C-2801-X als Natriumsalz (Reinheit 35$) .25 erhalten.

1000 Raumteile, der in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Lösung, die C-2801-X enthält, wird durch eine Säule von 200 Raumteilen DEAE-Cellulose (Chloridform) geleitet. Die Cellulose wird mit 0,3$iger wässriger Essigsäure gewaschen, worauf mit 0,1-molarem wässrigem Natriumchlorid, das 0,3$ Essigsäure enthält, eluiert wird. Hierbei wird C-2801-X desorbiert. Die C-2801-X-Fraktionen werden zusammengegossen und durch eine Säule von 100 Raumteilen des Harzes "Amberlite XAD-2" geleitet, wobei die aktive Substanz adsorbiert wird. Die Säule wird mit

O / 11 O Q ■

Wasser gewaschen, worauf mit 5O$igem wässrigem Methanol eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wird 1 Teil rohes Pulver von Ö-2801-X (Mononatriumsalz) in einer Reinheit von 35$ erhalten. Zwei Teile des in dieser Weise erhaltenen rohen Pulvers von C-2801-X werden auf die in Beispiel 1 "beschriebene Weise weiter gereinigt, wobei 0,363 Teile C-2801-X (Mononatriumsalz) als reines Präparat erhalten werden.

' Beispiel 3 j

In einen Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hat, werden 500 Raumteile eines Nährmediums (pH 7,0) gefüllt, das 2$ Glucose, 3$ lösliche Stärke, 1$ Maisquellwasser, 1$ Sojabohnenraehl, 0,5$ Pepton,

0,3$· Natriumchlorid und 0,5$ OaCO, enthält und dann ^: 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert wird. Der Fermenter wird dann mit Streptomyces panayensis C-2879 (IFO-13577, FERM P-Nr.2273) beimpft, worauf 40 Stunden bei 28⁰C be- ' brütet wird. Die eihaltene Impfkultur wird in einen Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 50000 Raumteilen hat und 30000 Raumteile eines Mediums der gleichen Zusammensetzung, wie vorstehend angegeben, enthält, worauf 24 Stunden bei 28⁰C unter Belüften und Rühren (100$ Belüftung, 280 UpM) bebrütet wird. Dann werden 10000 Raumteile dieser Kultur weiter in einen Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 200000 Raumteilcn hat und 100000 Raumteile eines Fermentationsmediums (pH 7,0) enthält, das 3$ Saccharose, 2$ entfettetes und gekochtes Baumwollsaatmehl "Proflo", 1$ Maisquellwasser, 0,05$ FeSO₄, 0,05$ K₂HPO., 0,3$ Natriumchlorid und 0,5$ CaCO, enthält, worauf 66 Stunden bei 28⁰C unter Belüften und Rühren (100$ Belüftung, 200 UpM) bebrUtet wird. 95«000 Raumteile des erhaltenen Kulturmediums werden der gleichen Abscheidungs- und Reinigungsbehandlung wie in Beispiel 1 unterworfen, wobei

509812/1138

ί - 28 -

2,25 Teile Antibiotikum C-2801-X (Mononatriumsalz) als

j robes Pulver erhalten werden. Dieses Produkt wird der

j gleichen Abscheidungs- und Reinigungsbehandlung wie in

! Beispiel 1 unterworfen, wobei 1,45 Teile Antibiotikum

j 5 C-2801-X (Mononatriumsalz) als reines Präparat erbalten

^: werden.

5 0 9 8 12/1138

Claims

Pat e η ta η Sprüche

1, Antibiotikum C-2801-X mit der Formel

j\ OCH₃

CH₂00-C-=CH-/~\-0H ^000H OCH₅ ^0H I

und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze. j
2.' Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum C-28O1-X, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus, der das Antibiotikum zu bilden vermag, in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und verwertbare Stickstoff quellen enthält, kultiviert, bis das Antibiotikum darin stark angehäuft ist, und das Antibiotikum aus dem Kulturmedium abtrennt. '
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum C-28O1-X in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces heteromorphus verwendet.
5. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces panayensis verwendet.
6. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces heteromorphus C-28OI (IFO-I3575) verwendet.
7· Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces panayensis C-2878 (IFO-I3576) verwendet.

■-■50 -
8. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces panayensis C-2879 (IFO-I3577) verwendet.
9. Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium bei pH 5 bis 9 hält.
10. Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einer Temperatur : von 20 bis 40°C durchführt.

!
11. Arzneimittelzubereitungen, enthaltend Antibiotikum C-280I-X und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger.

509812/7 135

Leerseite