DE2342404C3

DE2342404C3 - 3-(5,7-Dimethyl-2-hydroxy-4-oxo-6,8-decadienyI)-glutarimid sowie Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2342404C3
Application number: DE2342404A
Authority: DE
Inventors: Nakao Sendai Miyagi Ishida; Akira Kamata; Tsutomu Okada; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1972-08-25
Filing date: 1973-08-22
Publication date: 1979-10-04
Also published as: CA987618A; DE2342404B2; JPS5530838B2; DE2342404A1; SE399908B; US3880858A; CH586201A5; FR2196789B1; FR2196789A1; JPS4947596A; GB1392266A

Description

Die Erfindung betrifft das antibiotisch wirkende in 3-(5,7-Dimethyl-2-hydroxy-4-oxo-6,8-decadienyl)-glutarimid sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben. Dieses Antibiotikum wird vorläufig als »Antibiotikum TS-S85« bezeichnet

Verschiedene Antibiotika und andere Naturstoffe r> konnten bereits durch Kultivierung von Streptomyces-Stämmen hergestellt werden. Aus nachstehenden Literaturstellen sind die Antibiotika Protomycin und Streptimidon bekannt: R. R. Frohardt.H. W. Dion, Z. LJakubowski.A. Ryder, J. C. French und Q. R. B a r t ζ, J. Am. Chem. Soc, 81, 5500 (1959); P. W. R. W ο ο, H. W. D i ο η und Q. R. B a r t ζ, ebenda, 83,3085 (1961); F. F. van Tamelen und V. Haarstad, ebenda, 82, 2974 (1960); Francis Johnson, N. A. Starkovsky und William D. Gurowitz, ebenda, 4"> 87, 3492 (1965); R. Sugawara und A. Matsumae, Journal of Antibiotics, 16A, 111 (1963).

Aufgabe der Erfindung war es, ein Antibiotikum, welches sich zur Unterdrückung bestimmter Virusarten eignet, aufzufinden, sowie ein Verfahren zur Herstellung >o dieses Antibiotikums zu schaffen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung von 3-(5,7-Dimethyl-2-hydroxy-4-oxo-6,8-decadienyl)-glutarimid gelöst, welches vorläufig als »Antibiotikum TS-885« bezeichnet wird. Dieses Anti- ·->■> biotikum eignet sich ausgzeichnet gegen verschiedene Virusarten wie Poliovirus und Influenzavirus vom Typ A. Dieses Antibiotikum wird durch Kultivierung von Streptomyces pruricolorescetis var. yamashitaensis S-885 hergestellt. Dieser Mikroorganismus wurde am ho Fermentation Research Institute of the Japanese Ministry for International Trade and Industry in Tokyo unter der Nr. FERM-1546 hinterlegt. Ferner wurde dieser Mikroorganismus unter der Nr. ATCC Nr. 21 956 am American Type Culture Collection hinterlegt. tn

Die Kultivierung erfolgt in wäßrigem Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen.

Die ursprüngliche Quelle des Organismus isi Streptomyces pluricolorescens var. yamashitaensis und wurde in Watarigun, Miyagi Pref, Japan, gefunden. Im folgenden werden die taxonomischen Kennzeichen dieses Stammes angegeben:

(A) Morphologie

Der Stamm entwickelt sich sowohl auf natürlichem als auch auf synthetischem Nährmedium wohl und bildet ein vegetatives BasismyceL Das Luftmycel auf Glyzerinagar und auf Glucose-asparagin-agar bildet unregelmäßig verzweigte Hauptachsen, geschlossene Spiralen aber keine Wirbel. Der Mikroorganismus bildet am oberen Bereich des Luftmycels ellipsoide Sporen (0,4-0,6 χ 0,9-1,2 μ). Die Oberfläche der Sporen ist bei Betrachtung unter dem Elektronenmikoskop glatt

(B) Kulturcharakteristika

Die Charakteristika der Streptomyces S-835-Bakterien werden unter Verwendung verschiedener Medien, welche gewöhnlich zur Identifikation von Streptomyces-Stämmen dienen, festgestellt Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:

(1) Saccharose-Nitrat-Agarplatte ^Czapeks Lösung) (27° C).

Der Stamm wächst mit farbloser Wuchsform und bildet ein pulvriges Mycel mit einer grauen bis gräulichbraunen Färbung und es wird kein lösliches Pigment gebildet

(2) Glyzerin-Nitrat-Agarplatte (27° C).

Der Stamm wächst mit einer gräulichbraunen Wuchsform mit bräunlichpurpurner rückwärtiger Oberfläche. Es wird ein pulvriges Luftmycel mit Blaßorangefärbung gebildet sowie ein lösliches Pigment mit einer blaß rötlichbraunen Färbung.

(3) GIucose-Nitrat-Agarplatte (27° C).

Der Stamm zeigt eine blaß gelblichorange Wuchsform mit einer leicht rötlichbraunen Färbung auf der Rückseite. Das Luftmycel hat eine gräulichbraune Färbung und es wird ein lösliches blaß gelblichbraunes Pigment gebildet

(4) Glucose-Asparagin-Agarplatte (27°C) (Krainskys Medium).

Der Stamm wächst mit blaß gelblichbrauner Färbung und mit einer blaß gelblichbraunen Färbung auf der Rückseite und es bildet sich ein pulvriges Luftmycel mit bräunlichweißer Färbung. Ferner wird ein blaß-gelbliches Pigment gebildet.

(5) Ca-Malat-Agarplatte(27°C).

Der Stamm wächst mit einer schwärzlich-braunen Wuchsform mit dunkelbrauner Färbung auf der Rückseite bei 27° C unter Ausbildung eines pulvrigen Luftmycels, welches blaß-gelb oder blaß-orange gefärbt ist. Ferner wird ein lösliches gräulich-orangenes Pigment gebildet.

(6) Stärke-Agarplatte(27°C).

Der Stamm zeigt eine leicht rötlich-gelbe Wuchsform mit rötlich-gelber Färbung auf der rückwärtigen Fläche und mit einem pulvrigen Luftmycel mit bräunlich-weißer Färbung. Ein lösliches orangegefärbtes Pigment wird erzeugt.

(7) Tyrosin-Agarplatte (27° C).

Der Stamm zeigt eine gräulich-braune Wuchsform mit blaß gräulich-orange gefärbter Rückseite und mit einem blaß-orange gefärbtem Luftmycel. Ein lösliches blaß gelblich-braunes Pigment wird gebildet.

(8) Glucose-Czapeks Lösung (27° C).

Der Stamm wächst in Form einer Zimthaut und erzeugt kein Luftmycel. Es bildet sich ein lösliches bräunliches Pigment

(9) Cellulose-Agar(27°C). ■> Der Stamm wächst schwach und bildet weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment

(10) Schräges Meeragarmedium.

Der Stamm zeigt eine farblose bis gräulich-weiße Wuchsform mit blaß gelblich-brauner Färbung auf ' der Rückseite und erzeugt weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment

(11) Pepton-Glucose-Agarplatte (37° C).

Der Stamm zeigt eine dunkel-orange gefärbte Wuchsform mit rötlich-gelb gefärbter Rückseite. Er bildet ein schwaches gräulich-weißes Mycel und kein lösliches Pigment

(12) BIut-Agarplatte(37°C).

Der Stamm wächst mit gräulich-gelber bis gelber Wuchsform and erzeugt weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment

(13) Ei-Agar-Medium(37°C).

Der Stamm wächst schwach zu einer gelben Wuchsform und erzeugt weder ein Luftmyce! noch ein lösliches Pigment

(14) Gelatine-Impfmedium (20°C).

Der Stamm wächst mit einer blaß-bräunlichen Wuchsform und erzeugt kein Luftmycel. Es wird jedoch ein lösliches blaß rötlich-braunes Pigment ^o gebildet

(15) Lackmus-Milch-Medium(37°O

Der Stamm wächst mit einer blaß gelblich-braunen Wuchsform, und zwar in Ringform, und erzeugt ein Luftmycel und die Flüssigkeit zeigt ^3l eine stumpf-rote Färbung mit saurem pH.

(16) Loefflers Serum-Medium(37°C).

Der Stamm wächst mit einer cremefarbenen bis blaß gelblich-braun gefärbten Wuchsform als Kolonie mit einem erhobenen Zentrum. Es wird kein Luftmycel gebildet An der Schnittstelle ändert sich die Färbung zu blaß-gelb hin.

(C) Verwertung von Kohlenstoff quellen

Es werden Tests unter Verwendung von Grundmedium und Pridham und Gottliebs Salzmedium durchgeführt. Arabinose, Glucose, Glyzerin Maltose, Mannit, Mannose und Stärke werden gut verwertet. Fruktose, Lactose und Saccharose werden assimiliert und >n Rhamnose, Xylose und Inosit werden nicht verwertet.

(D) Physiologische Eigenschaften

Der Stamm reagiert positiv auf den Ca-Malat-Löslichkehstest, sowie bei der Nitratreduktion, der Stärkehydrolse, der Gelatineverflüssigung, der Serumverflüssigung, der Milchkoagulation und der Milchverflüssigung. Der Stamm wirkt jedoch negativ bei der Thyrosinasereaktion und bei der Melaninbildung. _b0

(E) Wuchstemperatur und pH-Wert

Die optimale Temperatur für besten Wuchs liegt bei 27°C und bei einem pH-Wert von 6-8,4. Ferner kann der Stamm bei 15 — 37°C und bei einem pH-Wert von _br, 7,0-8,0 gezüchtet werden, oberhalb 60°C wird kein Wachstum beobachtet, unabhängig vom pH-Wert. Der Stamm ist aerob.

Zusammenfaßend wird somit festgestellt, daß gemäß obigen taxonomischen Eigenschaften der Stamm eine Ähnlichkeit zu Streptomyces pluricolorescens Okami et Urnezawa besitzt, jedoch im Detail gewisse Unterschiede aufweist Die taxonomischen Eigenschaften von Streptomyces pluricolorescens Okami et Umezawa wurden im Journal of Antibiotics 19 A, 1 —9 (1966) beschrieben.

Im Vergleich zu den Eigenschaften von Streptomyces S-885 wächst der bekannte Streptomyces pluricolorescens nur in linearen Ketten mit büschelförmigen Zweigen. Im Falle von Gelatine-Impfmedium ist die Wuchsform farblos und es wird ein blaß-braun gefärbtes Luftmycel gebildet, jedoch kein lösliches Pigment Diese Eigenschaften sind klar von den entsprechenden Eigenschaften des Streptomyces S-885 unterschieden. Gewisse Unterschiede bestehen auch noch in anderer Hinsicht

Aus diesen Gründen wird Streptomyces S-885 als neue Varietät von Streptomyces pluricolorescens angesehen und erhält die Bezeichnung Streptomyces pluricolorescens van yamashitaensis.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Organismen, welche das Antibiotikum TS-885 erzeugen und zur Gattung Streptomyces gehören (natürliche oder synthetische Varietäten), kultiviert wobei das Antibiotikum TS-885 entsteht Dieses Verfahrens unterliegt jedoch keinen besonderen Beschränkungen und verschiedene bekannte Kultivierungsverfahren für Actinomyceten können angewandt werden. Das Verfahren eignet sich für die industrielle Durchführung. Hierbei wird im Fermentationstank mit einer submersen aeroben flüssigen Kultur gearbeitet. Während des Betriebs wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 6—8 gehalten und die Temperatur liegt im Bereich von vorzugsweise 25—30⁰C und insbesondere 27-28° C.

Das Medium wird aus herkömmlichen Materialien für Actinomycetenkulturen hergestellt und besteht aus verschiedenen Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Antischaummitteln od. dgl. in geeigneter Kombination. Melasse, Glyzerin und Glucose sind als Kohlehydratquellen optimal, obowhl auch Stärke, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextrin, Cellulose und Fructose mit Erfolg angewandt werden können. Die Konzentration der Kohlehydrate liegt im Bereich von 0,5—10 Gewichtsprozent und insbesondere im Bereich von 1 — 5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtmedium. Fleischextrakt, Pepton und CSL sind optimale Stickstoffquellen. Ferner können jedoch auch Sojabohnen, Casaminosäure, Polypepton, Ammoniumsulfat, Kaliumnitrat und Casein eingesetzt werden. Die Konzentration der Stickstoffquelle liegt vorzugsweise im Bereich von 0,3 — 5 Gewichtsprozent und insbesondere vor 0,5-3 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtmedium. Es kommen anorganische Salze in Frage, welche Kalium Magnesium- und Phosphationen liefern können. Die Konzentration der anorganischen Salze liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 — 1 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtmedium. Es ist bevorzugt, Siliconöl oder Sojabohnenöl als Antischaummittel zuzusetzen.

Nach 48 bis 120 Stunden, gerechnet vom Beginn der Kultivierung an, liegt eine maximale Konzentration des Antibiotikums TS-885 vor. Die Menge des sich ansammelnden Antibiotikums TS-885 in der Kulturbrühe kann nach einer der folgenden beiden Methoden gemessen werden:

a) Hemmwirkung auf das Wachstum von Helazellen und

b) Hemmwirkung auf die Poliovirusplattenbildung in Helazellen.

Sodann wird die Kulturbrühe aufgearbeitet wobei die Flüssigkeit von dem das Mycel enthaltenden Festkörper in herkömmlicher Weise durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt wird. Das Antibiotikum TS-885 befindet sich in der Hauptsache im Filtrat obwohl auch ι ο kleine Mengen des Antibiotikums im Filtrierrückstand zurückbleiben. Zur Isolierung des Antibiotikums TS-885 wendet man am besten ein Extrationsverfahren unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie Äthylacetat Amylacetat oder Butanol, an, da das Antibiotikum in Wasser unlöslich ist Das Antibiotikum TS-885 wird mit dem organischen Lösungsmittel exuahiert und wird sodann durch Säulenchromatographie oder Dünnschichtchromatographie in der üblichen Weise gereinigt

Im einzelnen verfährt man in folgender Weise: Die Kulturbrühe wird filtriert um die Feststo'fkomponenten zu entfernen, sodann wird Salzsäure zu dem Filtrat gegeben, um den pH-Wert einzustellen. Das Antibiotikum TS-885 wird mit organischem Lösungsmittel, wie Äthylacetat, aus dem Filtrat extrahiert Sodann wird das

CHj CHj

C H CH Lösungsmittel unterhalb 40°C im Vakuum abgedampft, um das Antibiotikum TS-885 zu erhalten. Das so erhaltene dunkelbraune ölige Produkt wird durch Säulenchromatographie über Silicagel gereinigt. Hierzu wird mit Benzol, Äthylacetat und Äthanol entwickelt, wobei ein gelbes, ein gelblich-rotes und ein braunes Band gebildet wird. Das gelbe Band wird mit Benzol eluiert Es ist inaktiv. Wenn das Äthylacetat vermehrt wird, so wird das Band unklar und der gröBte Teil des Antibiotikums TS-885 wird mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (Gewichtsverhältnis 1:1) eluiert Das so erhaltene gelbe Gemisch, welches das Antibiotikum TS-885 enthält, wird weiter durch Säulenchromatographie über Silicagel gereinigt. Bei dieser Reinigung wird das so erhaltene Gemisch mit Benzol entwickelt um Verunreinigungen abzutrennen, worauf die aktive Substanz mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (4 :1) eluiert wird. Aus dem so erhaltenen gelblichen Sirup wird schließlich das Antibiotikum TS-885 durch Dünnschichtchromatographie abgetrennt und gereinig;.· -(Entwickler : Äthylacetat). Hierzu wird die Fraktion mit cem Rf-Wert von 0,5 abgetrennt. Das Antibiotikum TS-885 wird als blaßgelbliches viskoses Material erhalten. Es besitzt die Bezeichnung 3-(5,7-Dimethyl-2-hydroxy-4-oxo-6,8-decudienyl)-glutarimid und weist die Formel

HC
C

C H H,
CHC O

/H₂\|/ \ f

HjC HC C C C

OH H,C NH

auf.

Das so erhaltene Gelbprodukt wird durch Dünnschichtchromatographie (Entwickler: Äthylacetat) weiter aufgearbeitet, wobei eine Fraktion mit dem Rf-Wert von 0,5 abgetrennt wird. Hierbei wird das blaß-gelbe ölige Antibiotikum TS-885 erhalten.

Diese Verbindung hat die nachstehenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Form

Schwach saures, blaß-gelbliches, öliges Material

(2) Elementaranalyse C17H25O4N

	Berechnet	Oefunden	CHCI3)
	C % 66,42	65,88
	H % 8,20	8,60
	N% 4,56	4,38
	0% 20,82	21,14
(3)	Summenformel
	C₁₇H₂₅O₄N
(4)	Molekulargewicht
	307 (Masrenspectrographie) [M +
(5)	Spezifische Drehung
	(α]?=, + 105" (C:0,1

m/e = 307)

b0

65

(6) Siedepunkt
135-140⁰C(I mm/Hg)

(7) Farbreaktionen

Positiv bei Ehrlich-Reaktion, m-Phenylendiamin-Reaktion (aktives Methylen) und Schwefelkohlenstoffreaktion (primäres und sekundäres Amin).
Negativ bei Tollens und Ninhydrin-Reaktionen.

(8) Löslichkeit

Löslich: Aceton,Chloroform, Benzol,

Äthylacetat, Äthanol, Methanol;
1% Natronlauge und Pyridin.

Schwach löslich: Äther.

Unlöslich: Wasser und 5%ige Sahsäure.

(9) Rf-Wert der Dünnschichtchromatographie bei verschiedenen Lösungsmitteln:

0,8 (Chloroform: Äthanol= 10 :3)

0,65 (Äthanol)

0,5 (Äthylacetat)

0,25 (Benzol :Äthylace.tat=1 :1)

0 (Benzol)

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antibiotikums TS-885, des Streptimidons und des Protomycins sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengestellt:

Tabelle I

Plnsikalisch-ehemische Hiycnschaften des Antibiotikums TS-SK5. des Streptimidons und des Protomvcins

Eigenschaften	Antibiotikum TS-885	Streptimidon	Protomycin
lorm	blaßgelbliehes OI	farblose Nadeln	weiße Kristalle
Ip. (KpI	135 140 Cl min Hg	72 73 C	5S 61 C
IxI	+ 105 (( 0.1. CHCI₁)	t 23« (('0.5.CHCI,!	t 126 (C 1.0. CHCI.,1
Löslichkeit	Löslich in Bcn/ol. AtInI- acetai. Aceton. Äthanol I"c. NaOH: schwach löslich in Äther: unlöslich in Wasser. 5"<> HCI	Löslich in Ben/ol. AtInI- acelal. Aceton. Äthanol: unlöslich in Wasser	Löslich in Ben/ol. AtInI acetat. Aceton. Äthanol: unlöslich in CCI₄. Petroläther
Suniiiienloriiiel	C₁-IL₅O₄N	C₁JL₁O₄N	C₁₁₁IL₁₁(KN
Molekular gewicht	307	293	351
I. V.	231.5115. 3501	232(23. 100)	232.5 (24. (HK))
/ ma\	2X3.0(1. 259)	29I( 7901	2X7 I 1.3301
um I.· I	291.0(1. 23Oi
IR:cm '	3475. 3225 1725 1710 1690	1710. 1700 16Sl)	Ws 3tS() 1725. 1690
N. M. R.	1.151 CH CU, I	1.071 CH-CH₁)
Spektrum	1.S(C- CH CH,)	l.S3(CC CH.,\|
	I.S5IC -C CH₁)
Masseiispektrum	M ' m e 307
	LLC H

CH,

H₁C mc 109

O OH

mc 198

NH

Die obige Formel des Antibiotikums TS-885 ergibt sich aus den obigen Daten, wobei das Infrarotspektrum die Gegenwart von —OH, -NH-, einem Keton und einer konjugierten Doppelbindung anzeigt, und wobei das Ultraviolettspektrum die Gegenwart einer kunjugierten Doppelbindung und eines Glutarimidrings anzeigt, und wobei das N.M.R.-Spektrum die Gegenwart von drei Methylgruppen anzeigt

Im folgenden wird die biologische Aktivität des Antibiotikums TS-885 erläutert Die biologischen Eigenschaften werden folgendermaßen festgestellt:

100 mg des Antibiotikums TS-885 werden in einem Gemisch aus 0,6 m! Dimethylsulfoxid und 0,02 m! Polyoxyäthylensorbitanhydrid-monoiaurat (EO: 20) aufgelöst, worauf 1,0 ml Salzlösung (pH-Wert 7,2; mit 0,01 M Phosphat gepuffert) unter Rühren zu der

Mischung gegeben werden, wobei sich eine gleichförmige Lösung bildet Darauf werden 48 ml Salzlösung zu Ϊ5 der Lösung gegeben, wobei man die Stammlösung des Antibiotikums TS-885 mit einer Konzentration von 2 mg/ml erhält. Die Stammlösung wird für die folgenden Anwendungen mit Pufferlösung verdünnt

1) Antimikrobiell Aktivität

Das Antibiotikum TS-885 zeigt keine antibakteriellen und antimycoplasmischen Aktivitäten. Es zeigt jedoch Hemmwirkungen gegenüber einigen Hefen. Die antimikrobiellen Spektren wurden mittels der Agarstrichmethode und der Diffusionsmethode festgestellt Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 zusammengestellt

Tabelle 2

Testorganismus

Medium*

Minimale

llemm-

konzentration

(mcg/ml)

Staphylococcus aureus N
209,,

Streptococcus hemolyticus N

Diplococcus pneumoniac N

Sarcina lutea 1001 N

Bacillus suhtilis N

Kscherichia coli NIIIJ N

Shigella liexneri 2a N

Proteus mirabilis N

i'"se udomonas acruginosa N

Salmonella typhi N

Candida alibicane E

Trychophyton rubrum E

Mycoplasma pneumoniae PPLO-Agar

>1000

>1000 >1000

> 1000 >IOOO >1000 >IOOO >IOOO

> i 000

> 1000 >1000

1000 >1000 >1000 >1000 >1000

> 1000

PPLO-Agar > 1000

Mycoplasma hominis PPLO-Agar

Mycoplasma orale PPLO-Agar

Mycoplasma salivarium PPLO-Agar

Mycoplasma PPLO-Agar gnllisepticum

Mycoplasma laidlawii

*' Medium.

N: Nähragarmedium.

K: llefeexiraktmedium.

I'l'I.O-Sair: Vollständiges Medium aus Heu PPLO (Uilco)

+ 0,5 % lleleextrakt und 20 % Pferdeserum

Globulin.

Tabelle 3

2) Cytotoxizität

Die Cytotoxizität des Antibiotikums TS-885 gegen verschiedene Gewebszellkulturen wird nach zwei -> Methoden festgestellt:

(1) Zylindermethode (auf dünner Keimplatte),

(2) Röhrenverdünnungsmethode.

(1)10 ml Zellsuspension (3 χ 10⁵ Zellen/ml) werden in

in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 90 mm geimpft und danach werden die Platten unter CO2 in einem Inkubator bei 37°C inkubiert. Nach 24 Stunden wird das Medium entfernt und die Platten werden mit 5 ml Agarmedium belegt, worauf ein Zylinder auf das

ι ί Medium gestellt wird. 0,25 ml der Testprobe werden in den Zylinder gefüllt. Die Platten werden 2 Stunden bei Zimmertemperatur belassen, wobei das Antibiotikum TS-885 in das Agar diffundiert. Die Platte wird unter CO₂ irr, Inkubator bei 37°C inkubicrt. Nach 48 Stunden

_>(i wird der cytotoxische Effekt des Antibiotikums TS-885 gemessen. Hierzu wird die Größe des Durchmessers der Wachstumshemmzone um den Zylinder herum gemessen.
(2) Bei der Röhrchenverdünnungsmethode werden

_'-> 2 χ 10¹⁵ Zellen in ein kleines Teströhrchen geimpft und die Zellen werden während 24 Stunden bei 37° C inkubiert.

Verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums TS-885 werden in die Röhrchen mit den Zellen gegeben

!ti und diese werden wiederum bei 70⁰C inkubiert. Nach 48 Stunden werden die Entartungsfiguren der Zellen mikroskopisch untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

,-, Tabelle 4

Testzellen

Testorganismus

Medium Minimale llemmkonzentration

(mcg/ml)

Candida alibicans S.A. >100

Candida utilis IFO 0396 S.A. 100

Candida tropicalis M.A. 100

Candida parapsilosis M.A. > 100

IFO 0708

Hansenula anomalaIFOOl 18 M.A. 20

Cryptococcus albidus M.A. 4

IFO 0378

Brettanomyces anomalus M.A. >I00

IFO 0648

Phodotorula glutinis M.A. 100

IFO 0754

R. rubra IFO 0001 M.A. 20

Torula rubra var alpa M.A. 4

Saccharomyces sakeHUT7U9 M.A. 4

Saccharomyces fragil is M.A. 20 IAM 7160

Saccharomyces rosei AHU 3174 M.A. 100

Medium: S.A. Sabouraud's Agar
M.A. Malt's Agar.

Medium Minimum-Ilemmkonzentration

/.ylin- Röhrchenderverdünnungs

methode methode

HeLa (HeIa S,Zellen)

L (L-Zellen)
CEC(Hühnerembryofibroblasten-
zellen)

MK (AfTennierenzellen)

P₁IIR-I (8u.-k.itt-

!ymphomzeüen

YLE

0,2

YLE 0,25

MEM 0,5

MEM 0,2

MEM -

0,4

0,5
1,0

0,4 0,1

3) Antivirusaktivität

(1) Hemmwirkung gegenüber der Vermehrung von
Poliovirus in HeLa-Zellkultur.

1 Röhrchenverdünnungsmethode
400 000/ml HeLa-Zellen werden in ein kleines Teströhrchen gegeben und während 48 Stunden bei 27° C kultiviert. Etwa 100 TCID 50/ml Polioviren werden in die HeLa-Zellkultur gegeben. Nach Inkubation während 90 Minuten bei 37° C zur Absorption der Viren an den Zellen werden die Zellen mit Hanks-Lösung gewaschen und verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums TS-885 werden hinzu gegeben. Nach der

Inkubation während 48 Stunden bei 37°C wird der cytopathische Effekt der Zellen mikroskopisch untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Konzentration

(mcg/ml)

Cytotoxizität

Cytopatischer
Effekt

AntiviruselTekt

10
I

0,5
0,25
0,125
0,0625
0

toxisch
toxisch
toxisch

2 Plattenmethode

Zehn ml HeLa-Zellen (6 χ 10⁵ Zellen/ml) werden in eine Petrischale gegeben (90 mm Durchmesser) und die Platten werden bei 37°C im Inkubator unter CO₂ inkubiert. Nach 24 Stunden werden die Platten mit Polioviren infiziert (1000 P Fu/ml).

Nach der Inkubation bei 37°C während 120 Minuten zur Absorption der Viren werden die Platten mit 2 Teilen Hanks Salzlösung gewaschen, um nicht absorbierte Viren zu entfernen und die Platten werden mit 5 ml Agarmedium und mit einer Pulpescheibe, welche verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums TS-885 enthält, belegt. Die Antivirusaktivität wird anhand des Durchmessers der freien Zone gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.

Tabelle 6

Konzentration

(mcg/ml)

Cytotoxizität

Durchmesser
der freien
Zone

Antivirusaktivität

25

12,5
6,25
5,0
1,0
0,5
0

tnvisrh

toxisch

28,4
25,0
19,4
15,0
0

(2) Antiviruseffekt bei vesikulären Stomatitisviren
In Teströhrchen werden Hühnerembryofibroplasten-

— ~11r,.~ .«·* ..An!l..ilnmH Ctn(Hn4itinrii.nn «r,fi^"o # tnrl ritt* ^C]IUl llflt V\.31ftUfai LtI OtUIIiaUlt««ll\.tl lllllcivt ι UlIU UtV.

PlattsnfTiethode wird angewandt, um den Antiviruseffeki zu ieäien. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengestellt

Tabelle 7

Konzentration Cyto- Durchmesser Antivims-

toxizität der plättchen- effekt
freien Zone

(mcg/ml)

(mm)

	250
I	125
	100

42,0	toxisch
33,2	toxisch
31,7	toxisch

Konzentration

(mcg/ml)

Lytotoxizitiit

Durchmesser
der pliittchen-Ireien /one

(mm)

AntiviruselTekt

62,5
20
10
5

2,5

1,25

0,6

0,3

28,8
26,2
22,9
19,6
18,9
18,1
17,4
15.4
<8,0

toxisch
toxisch

(3) Antiviruseffekt gegenüber Influenzaviren
bei Mäusen.

Das Antibiotikum TS-885 wird 24 Stunden, 6 Stunden bzw. 3 Stunden vor der Virusinfektion und 3 Stunden bzw. 6 Stunden und einmal täglich an sieben aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal an Mäuse mit einer Dosis von 7 bzw. 22 mg/kg verabreicht. Die Virusinfektion (Influenzavirus-Aj/Kumamoto, I0LD50) geschieht durch Inhalation. Der Antiviruseffekt wird durch Feststellung der Lebensdauer im Vergleich zu nicht behandelten Mäusen und/oder im Vergleich zu mit Amantadin (1-Adamantylamin) behandelten Mäusen festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8

»"» Überlebenszeit
-Tage-

Überlebende Mäuse/behandelte Mäuse x 100% Antibiotikum TS-885 Amantadin Blindprobe 22 mg/kg 7 mg/kg 20 mg/kg

100%
80%
^n °/.

50%
50%

100%
60%
35 "/·
35%
35%

100%
60%
in»/»

0%
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Wenn das Antibiotikum TS-885 mit einer Dosis von 22 mg/kg verabreicht wird, so überleben 50% der Mäuse, woraus sich ein deutlicher Antiinfluenzaeffekt in ergibt.

(4) Antitumoreffekt

1000 000 .Mäuseaseites-Turnorzeüeri (Sarcom 180) werden intrapsritoneal iransplantiert. Nach 24 Stunden

bt> iiäch Transplantation Werden u€ii ι ϋΠΐοΓπΐαϋ5£π verschiedene Dosen des Antibiotikums einmal täglich während 6 Tagen durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Das Antibiotikum TS-885 führt bei einer Dosis von 2,5 mg/Maus je Tag zu einer Hemmung des

bo Wachstums des Ascitestumors, woraus sich klar eine Verlängerung der Lebensdauer der Mäuse ergibt, deren Tumor mit dem Antibiotikum behandelt wurde.

(5) Invivo- und Invitrountersuchungen

Das Antibiotikum TS-885 wird mit einer Dosis von 25 mg/kg bzw. 25 mg/kg Mäusen intravenös eingespritzt Nach 10 und 30 Minuten nach Injektion werden

die Mäuse getötet und das Serum wird entnommen Die Konzentration des Antibiotikums im Serum wird anhand des Hemmeffekts der Bildung von Scheibchen von Poliovirus in HeLa-Zellen bestimmt. Man stellt fest, daß bei der Gruppe von Mäusen, welchen 25 mg/kg des Antibiotikums verabreicht wurden, nach 10 Minuten eine Antibiotikumkonzentration im Blut von 2,9 mcg/ml vorhanden ist und nach 30 Minuten eine Konzentration von 2,4 mcg/ml. Bei der Gruppe von Mäusen, welchen 2,5 mg/kg verabreicht wurden, beträgt die Konzentration nach 10 Minuten 1,8 mcg/ml und nach 30 Minuten 0,58 mcg/ml.

(6) Toxizität

Das Antibiotikum TS-885 wird einmal täglich während 10 Tagen in einer Dosis von 20 mg/kg pro Tag durch intravenöse Injektion an Mäusen mit einem Gewicht von 20 g verabreicht (Gesamtdosis 200 mg/kg). Irgendwelche toxische Anzeichen werden nicht beobachtet.

Somi kann das Antibiotikum TS-885 verabreicht werden, um Infektionen durch Poliovirus, Influenzavirus vom Typ A od. dgl. zu verhindern oder zu inhibieren. Wenn die Verabreichung vor der Infektion erfolgt, so tritt eine prophylaktische Wirkung ein. In diesem Fall ist es bevorzugt, daß die Verabreichung 0 — 24 Stunden vor der Infektion des Tieres oder des Menschen mit pathogenen Viren liegt. Die Verabreichung kann topisch, oral oder parenteral an Säugetiere, wie z. B. Hunde, Affen, Katzen, Meerschweinchen, welche mit den genannten Viren infiziert sind, erfolgen. Die optimale Dosis variiert je nach Verabreichung und je nach zu behandelndem Virus sowie je nach Tierart, Alter, Gesundheit, Gewicht, Ausmaß der Infektion und Häufigkeit der Behandlung sowie je nach der Natur des gewünschten Effekts. Normalerweise wird eine Dosis von 0,5 bis 20 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Unter den Darreichungsformen für orale und parenteral Verabreichung seien z. B. Tabletten, Kapseln, Injektionsflüssigkeiten genannt. Lösungen oder Suspensionen können mit jedwedem nicht toxischen pharmazeutischen Träger verabreicht werden. Der Träger muß sich tür die orale Verabreichung eignen oder tür die topische Anwendung oder für die parenteraie oder buccale Verabreichung eignen.

Im folgenden wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel

a) 100 ml eines flüssigen Mediums mit einem pH-Wert von 7,2, welches 2% Sojabohnen, 0,5% Natriumchlorid, 0,2% Calciumkarbonat, 2% Stärke, 0,005% Mangansulfat, 0,005% Zinksulfat und 0,005% Kupfer(ll)-sulfat enthält, werden in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben, und das Medium wird mit Streptomyces S-885

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Stunden unter Schütteln kultiviert Andererseits werden 2501 eines Mediums mit einem pH-Wert 7,4 mit 1% Pepton, 0,5% Bouillon, 03% Natriumchlorid, 0,2% Calciumkarbonat, 1% Glyzerin und 3% Stärke in 200 Anteilen von je 500 ml in den Schüttelkolben gegeben, und die Kultur wird sodann aerob bei 27° C kultiviert

und zu diesem Zweck werden je 3 ml in ein Flaschen gegeben. Nach etwa 96 Stunden erreicht die Konzentration des Antibiotikums TS-885 in der Kulturbrühe ein Maximum. Der Titer beträgt etwa 100 mcg/ml und der pH-Wert der Brühe beträgt etwa 8,2. Die Kultivierung wird zu dieser Zeit unterbrochen untl der Festkörper wird über Filterpapier oder einem Filtermittel filtriert, wobei man etwa 220 1 eines gelblich-braunen Filtrats erhält. Das Filtrat wird auf einen pH-Wert von 5,¹^ mit Salzsäure eingestellt und mit Äthylacetat zweimal extrahiert (halbe Menge des Filtrats), so daß der größte Teil des aktiven Bestandteils in die Äthylacetatschicht übergeht. Die so erhaltene Äthylacetatschicht wird bei weniger als 40°C in Vakuum eingeengt, um das Äthylacetat zu entfernen. Man erhält 2,4 g eines rohen dunkelbraunen öligen Materials, welches das Antibiotikum TS-885 enthält.

Das rohe ölige Material hemmt das Wachstum von HeLa-Zellen bei einer Konzentration von 1,2 mcg/ml und der Titer des Produkts beträgt 350 mcg/mg.

b) 2,4 g des dunkelbraunen öligen Materials werden in eine Säule mit einem Durchmesser von 3 cm und einer Länge von 50 cm, welche mit 60 g Silicagel gepackt ist, gegeben, und die Chromatographie wird nach einer Trockenmethode durchgeführt. Die Säule wird mit 1000 ml Benzol entwickelt, um die Verunreinigungen zu eluieren, worauf die Entwicklung mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (1:1) fortgesetzt wird. Hierbei werden 900 mg einer gelblich-braunen Fraktion von Syrupkonsistenz erhalten. Diese Fraktion enthält das Antibiotikum TS-885, welches gegenüber HeLa-Zellen aktiv ist. Der Titer des Produkts beträgt 700 mcg/ml.

c) Das gelblich-braune Rohantibiotikum TS-885 wird durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule weiter gereinigt. 900 mg des Rohmaterials werden in 2 ml Benzol aufgelöst und die Lösung wird auf eine Säule (3 cm Durchmesser und 60 cm Länge), welche mit 70 g Silicagel gepackt ist, gegeben. Die Säule wird mit 1200 ml Benzol entwickelt. Nachfolgend wird Äthylacetat zum Benzol gegeben und das Gemisch wird dazu verwendet, den größten Teil der Verunreinigungen zu eluieren. Die Säule wird ferner mit 1500 ml eines uemisches aus benzoi und Aihyiaceiat (4 : i) eniwikkelt, wobei das gesamte Antibiotikum Tr-885 eluiert wird. Das Eluat wird in Vakuum eingeengt und das Lösungsmittel verdampft, wobei 385 mg des gelben Antibiotikums TS-885 erhalten werden. Der Titer des Produkts beträgt 900 mcg/mg.

d) Das nach c) erhaltene Antibiotikum TS-885 von gelber Farbe wird schließlich durch Dünnschichtchi
matographie in hochreinen Zustand gebracht. Etwa 10 g Silicagel werden auf eine Platte gestrichen (20 χ 20 cm), getrocknet und aktiviert. Etwa 30 mg des Antibiotikums TS-885 werden in Aceton aufgelöst und

Äthylacetat entwickelt Das Antibiotikum TS-885 wird an der Position des Rf-Wertes von 0,5 entwickelt. Der Fleck des Rf-Wertes von 0,5 wird aufgenommen und in eine Säule (2 χ 30 cm) gegeben und mit Aceton eluiert, wobei 308 mg des reinen Antibiotikums TS-885 erhalten werden. Der Titer des Produkts beträgt 1000 mcg/mg.

Claims

Patentansprüche:

1. 3-(5,7-Dimethyl-2-hydroxy-4-oxo-6,8-decadienylj-glutarimid.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 3-(5,7-DimethyI-2-hydroxy-4-oxo-6,8-decadienyl)-glutarimid, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise Streptomyces pluricolorescens var. yamashitaensis (S-885), ATCC Nr. 21 956 in einem wäßrigen Nährmedium, welches Kohlehydrate und eine Quelle für organischen Stickstoff enthält, solange unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert werden, bis das Nährmedium eine wesentliche Antivirusaktivität aufweist, worauf das ι ί Antibiotikum aus der Kulturbrühe isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium auf einer Temperatur von etwa 15 bis etwa 37°C und bei einem pH-Wert von etwa 6 bis etwa 8 während etwa 48 Stunden bis etwa 120 Stunden gehalten wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die nitrierte Kulturbrühe anschließend mit Äthylacetat, Amylacetat oder Butanol extrahiert wird. 2 >