DE1617382A1

DE1617382A1 - Neues Antibiotikum A 28 829

Info

Publication number: DE1617382A1
Application number: DE19661617382
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Bickel; Vladimir Prof Dr Prelog; Hans Prof Dr Zaehner
Original assignee: Ciba Geigy AG; Ciba AG
Current assignee: Novartis AG; BASF Schweiz AG
Priority date: 1965-10-08
Filing date: 1966-09-29
Publication date: 1971-04-01
Also published as: AT268521B; SE328254B; GB1116280A; DK117282B; BE687967A; CH469089A; NL6614165A; FR1503666A; US3769418A

Description

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Case 5787/E
Deutschland

Neues Antibiotikum -A 28 829

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Antibiotikum., das im folgenden als Antibiotikum A 28829 bezeichnet wird.

Das neue Antibiotikum entsteht bei der Kultur eines neuen Stammes der Art Streptomyces antibioticus (Waksman et Woodruff), Waksman et Henrici 19^8j der aus einer Bodenprobe aus der Umgebung von Bourebo (Beoumi), Elfenbeinkuste, isoliert wurde und in unseren Laboratorien sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 28829

1098U/1976

aufbewahrt wird. Der Stamm ist unter der Bezeichnung NRRL 3207 beim Northern Regional Research Lab., US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt.

Der Stamm S.antlbioticus A 28829 bildet ein dünnes, reich verzweigtes Substratmycel aus 0,6 bis 0,8μ dicken Hyphen, aus denen ca, 1μ breite Luftmycelfäden entstehen, die endogene Sporen bilden. Die Sporen sind ellipsoid, 0,6 - 1,4 χ- 0,5 1,2μ gross, mit glatter oder höchstens leicht warziger Ober-

fläche. Die Sporenketten sind monopodial verzweigt, mit geraden oder gewellten Seitenästen. Beim Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden wird eine melanoide Verfärbung beobachtet. Das Substratmycel ist hellgelb, gelbbraun bis hellbraun, braungrau oder dunkelbraun. Das Luftmyeel ist sammetig, anfangs kreldeweiss oder weissgrau,, in ausgereiftem Zustande graubraun bis braungrau oder aschgrau (cinereus). Der Stamm wächst aerob, bei Temperaturen von 18*40°,. insbesondere 27-37°C. Er ist lysQzymempfindlich. . ■ ■

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien Nr. 5, 6, 7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch.Mlkrobiol. 17, 36I (1952), hergestellt; Nr. 3 und 9 nach Pridham et al., Antibiot. Ann. 1956/57, S, 947; Nr. 1 nach Gause et al., "Probleme der Klassifizierung, von Aetinomyceten-Antagonisten" (russisch), Nat. Verlag Medzig-Moskau 1957* S, 22; Nr. 2 nach Tresner und Danger, J.Baot, £6> (1958); Nr. 4 nach dem Manual of Methods of Pure Culture Study of Bacteria, Geneva N.Y. 44-9-10-(1946), 54-14; Nr.

1098U/19T6

nach Ettlinger et. al.,· Arch.Mikrobiol. ^1, 326 (1958); (Chromogen-Agar enthält : 1 g Trypton,\l g Hefeextrakt (Difco), 1 g Fleischextrakt (Lab-Lemco), 8,5 S Natriumchlorid, 17 g Agar-Agar, 1000 ml aq.dest.)·

1. Mineralisches Substrat : Wachstum dünn, schleierartig,

·...*' hell braungrau; Luftmycel ' · · sammetig, weissgrau bis . . - hellgrau; Substrat nicht ge-

2. Pepton-Eisen-Agar

3. ·Hefeextrakt-Agar .Nitratbrühe

5· Glucose-Asparagin-Agar . Wachstum runzelig weissgelb, kein Luftmycel; Substrat nicht gefärbt.

. Wachstum dünn, schleierartig bis runzelig, braungrau bis dunkelbraun, Luftmycel sammetig, braungrau; Substrat nicht gefärbt.

Ringwachstum pustelig, weissgelb bis hellgelb, Luftmycel sehr spärlich, einen staubigen Ueberzug bildend, weissgrau, Substrat sattgelb bis hellbraun gefärbt;·starke Nitratreduktion.

Wachstum dünn schleierartig, ■ hellgelb bis hellbraun, Luftmycel spärlich, sammetig, weissgelb bis blasskarmin oder braungrau, Substrat nicht gefärbt.

• 1 Ö 9 8 U / 1 9 7 6

7. ■Stärkeplatte

8. Chromogen-Agar

6. .Gelatinestich (27⁰C) : Oberflächen-Wachstum punkt-. . .-■■·;■ ■·; . förmlg, hellbraun, Luft-'■."■'■ .- '..;■ ·. .^■.·..·. ./ ; ■ · rnycel mehlig bestäubt, weiss-■-"... ; :;·.", .. ; ■ . grau, Substrat dunkelbraun ge-' "' ■.·:··■■.:'.'.,:.■.-■·>-;' ^:·'. "färbt, Verflüssigung 1 era nach ■■ ■ ■'·■'■ -..- '.. ■/-' . 5 Tagen, 5 ^r-m nach 10 Tagen.

.. ..' ' , Wachstum dünn sehleierartig,
-..·' . : hellbraun, Luftmycel i^ehlig

·. bestäubt bis sammetig, braun-. ■·' ^: grau, Substrat nicht gefärbt, Hydrolyse nach 10 Tagen 5 mm.

. Wachstum dünn sehleierartig, ■-.■ ..,· ·■. ' . .-weissgelb, Luftmycel spärlich, "■.-,· . , ■ . einen staubigen Ueb^rcug bil-. - ' . . . dend, .vfeissgr-aUj, Melaninbii-■ dung.

9. .Carvaj.al's Hafermehl-Agar: Wachstum dünn, sohleierar-

l\ ■-.. '-■ ^:. ·' . .■;. ..'.'. · . -tig, weissgrau bis braun-■ ' ·., · ··;■; · - grau; Substrat nicht gefärbt, ■·■-"-. . .Luftmycel samnetig braungrau.

-10. .Lackmusmilch : . ^ Ring-waohstum runzelig, dunkel-■■-·-·' '. ·/ ■ . ₍ braun, Luftmycel spärlich,

.■■··/·;'■. einen staubigen Ueberzug bil-

. . r - . . .- '.. - . . dend, weissgrau; Substrat . ' :···_·.' dunkelbraun; Peptcnisierung,

. · ... . jedoch nur spärliche Koagulation;

pH nach 10 Tagen 7,5.

■ Folgende Kohlenstoffquellen werden verwertet : d-Glucose,' L-Arabinose, Saccharose, d-Xylose, i-Inosltol, d-Mannit, d-Fructose. . ". '. ' }. · ·-

': .. ■ V''.'- BADORfGfNAL

In seinen wesentlichen Merkmalen stiam der Stamm .28829 rait S.antibioticus (Waksman et Woodruff), Waksman et

•Henrici 1948, überein. In der folgenden Tabelle 1 sind charakteristische-Eigenschaften von Stamm 28829 und dem .Typus-Stanra von.S.antibioticus Stamn IMRU 3^35 gegenüber--

·-'.-." Tabelle 1 -

	Stamm 28829	. Stairs IMRU 3^35
Morphologie der Sporen	Sporen glatt, ellipsoid	Sporen glatt, ellipsoid
Luftmycelfarbe ·	cinereus	cinereus
Morphologie des Luftmycels	Spcrenketten monopodial ver zweigt,, gerade oder gewellt	. Sporenketten KOiiopödial ver-/ zweigt, gerade oder gewellt.
Fähigkeit zur Melaninbiidung	vorhanden	vorhanden .
Substratrayceifarbe *	hellgelb,- gelb braun, dunkel braun, braungrau	gelbbraun, hell braun, orangs- gelb, grüngrau

Das. Antibiotikum A 28829 wird bei der Züchtung von S.antibioticus A 28829 oder eines:anderen wesentlich -öle gleichen-Eigenschaften aufweisenden-Stammes gebildet.

.Zur Herstellung von Antibiotikum A 28829 wird &* antibioti- CUS A. 28829 oder ein dessen^Eigenschaften aufweisender Mikroorganismus in einer wässrigen« eine Kohlenstoff- und

:Sticketoffquelle aowie anorganische Salze enthaltender

Nährlösung aerob gezüchtet, bis die Nährlösung eine wesentliche antibakterielle Wirkung asigt, und das Antibiotikum .A 28829 hierauf aus dem Mycel isoliert.

·.:. . Zur Prüfung von Mikroorganismen auf dem Antibiotikum A 28829 entsprechende Eigenschaften kann der unten beschriebene Test mit Botrytis cinerea verwendet werden. . Bei der Züchtung sind als Kohlenstoff- und Stick-

stoffquellen beispielsweise zu verwenden : Glucose, Saeeha- ;. . rose, Fructose, Stärke, Mannit, Aminosäuren, z.B. Glycin, P.eptide, Proteine und deren Abbauprodukte-, wie Pep ton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Ge- : · treidekörnern, wie Mais¹ oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Cornsteep-liquor, Hefe, ; -Samen, insbesondere der Raps- und Soya- und Baumwollpflanze, ■Ammoniumsalze und Nitrate/ An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate^ Sulfate, Nitrate, Phosphate von Alkali- und·Erdalkalimetallen, von Magnesium,' Zink, Mangan und Eisen enthalten. '· . Die Züchtung erfolgt aerob, beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttel« - flaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur ·.'·· eignet sich eine solche zwischen 27 und 37°CDie HShrloV sung zeigt im allgemeinen eine wesentliche antibakteriell«

Wirkung nach 2-5 Tagen. Vorzugsweise kultiviert nan in

mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine Vorkultur in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, z.B. im Verhältnis l:'2O, überimpft wird. Die Vorkultur erhält man beispielsweise, indem man ein durch . ca. l4-tägiges Wachstum auf einem festen Nährboden erhal-. tenes Sporenmycel in ein flüssiges Medium überimpft und 48 Stunden wachsen lässt.

Die Isolierung des Antibiotikums aus dem Kulturmedium, und zwar aus dem Mycel, erfolgt nach an sich be-. kannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, · ■ physikalischen und biologischen Eigenschaften des Antibiotikums. Zum Testieren der Antibiotikawirkung in den einzelnen Isolierungsstufen - wie auch im Kulturmedium eignet sich als TestOrganismus besonders gut Botrytis cinerea. Die Hyphen dieses Mikroorganismus werden durch Antibiotikum A 28829 morphologisch verändert (starke Verzweigung von einer bestimmten Stelle an, so dass hexenbesenartige Gebilde entstehen). Der Test wird beispielsweise als Plattendiffusionstest wie folgt durchgeführt :

In der Mitte von Malzagarplatten wird eine kreisförmige Fläche von 5 mm Durchmesser mit Botrytis cinerea beimpft, und die Platten werden 2-3 Tage bei 24°C ittku-' biert. In dieser Zeit wächst das Mycel auf eine GrÖsse von 20-30 mm Durchmesser an» Eine Lösung der zu prüfenden Substanz wird mittels Filterrondellen von 6 mm Durchmesser

1098 U/

in ca. 5 mm Abstand vom Rande des Mycels aufgebracht. Die Platten werden dann 24 - 36 Stunden bei 24° inkubiert. Bei aktiven Lösungen lässt sich eine morphologische Veränderung der Hyphen bis zu einem Abstand von 24 mm von der Filterrondelle feststellen.· Lösungen einer Konzentration von 30 7/ml Antibiotikum A 28829 geben noch deutlich veränderte Hyphen. ·

Das Antibiotikum A 28829 weist folgende chemi- w sehe und physikalische Eigenschaften auf:

Es ist eine lipophile, neutrale, farblose kristalline Substanz, die u.a. in Methanol, Aethanol, Aceton, Aethylacetat, Chloroform, Aether, fetroläther löslich ist." • . Aus Methanol kristallisiert sie in Stäbchen, die bei 223 - 227°C unter Zersetzung schmelzen.

Die Elementaranalyse ergibt: C = 60,53 %* 60,79 & 60,97 & H = 8,52 %i 8,76 %; 8,52 %i N - 1,89 %} B = 1,35 %S 1*18 Jö.p (ber.) = 27,49 %. .."...

Das Molekulmrgewicht (thermoelektrische Methode, Lösungsmittel Methylenchlorid) beträgt ca. 868.

Das IR»-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u.a. Banden %el 54So^ 'S^Si S88o, 1735* 163*0, 1515 -(Schulter), 1465, 13T0, 1328, ißt,' 1^3,3.222, 1202, II78, 1127, 1100, 1070, * . -995* 923* 890 (Schulterh 846, 795, 780, 757, 719 ^iÄ

Ö 8-81AV

- _ / . -Das NMR-Spektrum ist in Fig.· 2 dargestellt. - Das UV.-Absorptionsspektrum weist zwischen 210 und 400 «τιμ kein Maximum auf. · . '..'· · · ... ·

• ". Im Dünnschichtehromatogramm anSilicagel, Fliessmittel Aethylacetat, entsteht ein einziger Fleck, R- = 0,75; Nachweis durch Besprühen mit konz. Schwefelsäure und Erhitzen auf l40° oder bioautographiseh mit Spicaria.

-Beim-Erhitzen des Antibiotikums mit verdünnter I ' Salzsäure auf 100°C während 30 Minuten wird kein durch ammoniakalisches Silbernitrat oder Anilinhydrogenphthalat nachweisbarer reduzierender Zucker gebildet. ^

.Das Antibiotikum. A 28829 besitzt eine gute antibiotische·Wirkung gegenüber gram-positiven Mikroorganismen, z.B. Bac. subtilis, und gegenüber Fungi, z.B. Candida vul- garis, Paecilomyces varioti, Spicaria. In der folgenden Tabelle 2 ist.die Hemmwirkung verschiedener■Antibiotikumkonzentrationen gegenüber diesen Mikroorganismen im Plattenöiffusionstest (Durchmesser der mit einer.•Antibiotikumlösung getränkten Filterrondellen 6'mm) dargestellt..Es ist der Durchmesser der·Hemmzone, für die jeweilige Antibiotikunikonzentration angegeben. !.'·;·.··. ...Γ;',

• V-Ä^-ί

Tabelle 2

Mikroorganismus	Zonendurchmesser bei· Antibiotikum konzentration	0*1 mg/ml	0,01 mg/ml
	1 mg/ml	l6 mm	11 mm
Bac.subtilis (auf natürl. Medium)	22 mm	l8 mm	10 mm
Bac.subtilis (auf synth..Medium)	33 mm	*
Candida vulgaris	10 mm
Sacharomyces cerevi- siae	10 mm	-15 mm	9 mm
Paecilomyces varioti	28 mm	Io nun	11 mm
Spicaria sp.	.21 mm

Vor allem aber zeichnet sich das neue Antibiotikum durch seine chemotherapeutische'Wirkung gegen parasitische Protozoen, speziell Plasmodien und Piroplasmen, wie Babesien, Babesiellen und Theilerien, aus. Es ist auch gegen solche Plasmodien wirksam, die gegenüber bekannten Antimalariaraitteln resistent sind..Das neue Antibiotikum kann daher pharmakologisch am Tier oder als Medikament, z.B. bei Malaria, Babesiosis, Theileriosis, Anaplasmosis und anderen'Infektionen, Verwendung finden.-Es kann auch' als Zusatz zu.Tierfutter verwendet werden..Weiter kann es als Desinfektionsmittel oder als Konservierungsmittel oder zur Bekämpfung von Pflanzenpilzen gebraucht werden· , ' '

Die chemotherapeutische Wirkung gegenüber Protozoen der Gattungen Plasmodium und Babesia kann wie folgt

nachgewiesen werden :-. ..'..·.- ■ la) Gegen Plasmodium berghel. . "

. Das Antibiotikum wurde an Albinomäusen getestet, die mit je einem Stamm von P-. berghei infiziert wurden, nämlich mit einem normal arzneimittelempfindlichen Stamm und einem gegen 7-Chlor-4-(4,-diäthylamino-l-methyl--butylamino)-chinolin-diphosphat resistent gemachten Stamm. Die Mäuse erhielten am Tag der Infektion und an jedem der drei folgenden Tage einmal täglich oral eine gelöste Dosis (vgl. Tabelle 3) des Antibiotikums..Einen Tag nach dem Ende der Behandlung wurden die Parasiten in einem- dünnen Blut film, gezählt. Die Dichte der Parasiten in den behandelten Mäusen und in den nicht behandelten Mäusen (Kontrolle) ist in Tabelle 3 angegeben.-ED₅₀ ist diejenige Dosis, die die Zahl der Parasiten in den behandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen auf 50$ herabsetzt.

_ *^: '.--'-■■-■■". . - Tabelle' 5

Dosis(rag/kg) _s	2ahl der behandelten Mäuse	-Parasitendichte in % der Kontrollen
'6\* (Käntifottei	;, -30. - ··_ - ■ m,.: ;· .: so - - 20	' 100 - ,75+ 16 " 42 +.17 , 0,03 + 0,03

go^ergibt sich durch graphische Interpolation zu 2,2 jfvlvö ing/kg. "· '
-Die entsprechende ED₅₀ für einea gegen das oben genannte

Chitnolinderlvat resistenten Stamm ist 2 + 0,6 mg/kg.

Ib) Gegen Plasmodium gallinaceum.

Ein analoger Test wurde an Kücken (50 g Gewicht), die mit dem Erreger der Hühnermalaria, P. gallinaöeum, infiziert wurden, -durchgeführt. In diesem Test wurde das Antibiotikum zweimal täglich oral in Form einer Suspension angewendet. Blutfilme wurden einen Tag nach Abschluss der Behandlung ausgezählt. Tabelle 4 zeigt das Ergebnis.

Tabelle 4

Dosis (mg/kg)	Zahl der behandelten	Parasitendichte in
-	Kücken	# der Kontrollen
0 (Kontrolle)	15	100
'2	10	. 64
6	20	86
20	21	0,4
60	10	0

Die ED-Q wird durch Interpolation zu ca. 7 +, 4 mg/kg bestimmt.

2) Gegen Babesia rodhaini.

' Älbinomäuse wurden mit B. rodhaini infiziert und das Antibiotikum oral getestet, wie für P. berghei beschrieben. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 5.

1-09

V9T6

Tabelle 5

Dosis (mg/kg)	Zahl der behandelten	Parasitendichte in
	Mäuse	% der Kontrollen
0 (Kontrolle)	30	100
1	""· 15 ·	89 :
3 ^: "	■ " 15 "" . '^] ■'■':■:.
•10	.15	0

Durch Interpolation ergibt sich ED,_₀ zu 2,4 + 1,7 mg/kg.

•Die Toxizität des·Antibiotikums wurde bestimmt

durch Messen der LD™, d.h. der Dosis, die 50$ der Tiere

tötet..Die LDc₀ einer oral applizierten Lösung des Antibiotikums an 4 aufeinanderfolgenden Tagen ist 15 mg/kg.·Der ' therapeutische Index ist günstiger als bei vergleichbaren i. Chemotherapeutika. · .

•Auf Grund obiger Tests ergibt sich für die Behandlungvon Malaria' am Menschen eine tägliche Dosis von.2-5 mg .oder einem Bruchteil davon.

■ . .Das Antibiotikum.A 28829 kann als Heilmittel, z.B. in-Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. .Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit -einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen •Trägermaterial.-Für dasselbe kommen-solche Stoffe in Betracht, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, •wie z.B..Gelatine/-Milchzucker,■Stärke,■Magnesiumstearat,

'•pflanzliche OeIe,- BenzylalkolipleV""oder andere Bekannte • · ·'■'·'· · '"·. ;# '■· - ■ - . 10 98.U /.19 7.6, ' " . '

Arzneimittelträger.. Die pharmazeutischen Präparate können z.B.·als Tabletten, Dragees,■Pulver, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungsmittel,

. Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel..Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

•Weiter kann das Antibiotikum als Desinfektions- und Konservierungsmittel sowie zur Bekämpfung von Pflanzenpilzen verwendet werden. ...

.Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispie-" len beschrieben. -Die .Temperaturen sind in Celsiusgraden ' angegeben. _: ' .

■ ' ". .:: " ■ ^Beispiel 1 : - · ·

a) Der Stamm Streptomyces anti'bioticus A 28829 .wird auf Hefeagar (Zusammensetzung: 4 g Hefeextrakt Difeo, 10 g Malzextrakt Difeo, 4 g Dextrose,. 20 g Bactoagar Difeo, aq.dest. ad 1000 ml) bei 28° gezüchtet.. Hach l4 Tagen hat sich ein gut versportes Mycel gebildet. Dieses wird in physiologischer Katriumchlbridlosung suspendiert. Mit dieser Sporenmyeelsuspension (0,5 Vol-.jS) beimpft man 500 ml Nährlösung, die sich in einem 2 Liter-Erlenineyerkolben befindet und pro-Liter Leitungswasser 20 g vollfettes Sojamehl und 20 g Mannit enthält.. Man inlcubiert die ·Suspension 48 Stunden bei- 28° unter Schütteln auf einer PwUndschüttelmaschine mit 120 upm.

b) Mit 1,5 Liter einer,-wie beschrieben, erhaltenen Torkultur beimpft man 30 Liter Nährlösung der für die Vorkultur angegebenen ZusammensetZung, die sich'in einem 50 Liter-Fermenter befinden und dereii pH vor der ' · •Sterilisation (20 Min. bei 125°) auf 7,8 eingestellt ist.

.Man inkubiert die mit 700-900 upm gerührte Kultur während 72 Stunden bei-28° und 1 Atmosphäre TJeberdruck unter Belüftung anit 30 Liter Luft pro Hinute. Dann trennt man das Mycel mittels Vakuumfiltration von der liährlösung _;ab und .isoliert daraus das Antibiotikum.A.28829 nach dem unten besßhrieJaeisen Verfahren· . ^: . .

■ c) Eine nach dem unter b) beschriebenen Verfahren, aber nur 36 Stunden inkubierte Kultur kann zur Beimpfung eines grösseren Fermenters (300 Liter Nährlösung) ' im Volumenverhältnis 1:20 und die so erhältliche Kultur zur Beimpfung eines Fermenters mit 3000 Liter Nährlösung, ebenfalls im Volumenverhältnis 1:20, verwendet werden. · d) 3200 Liter Kulturmedium vom pH 6,3 werden mit 64 kg Hyflo-Supercel vermischt und filtriert.-Das klare FiItrat wird verworfen. Das feuchte Gemisch von Mycel und Hyflo-Supercel wird zweimal mit je 640 Liter 80^igem wässrigem .Aceton während 30 Minuten gerührt und anschliessend zentrifugiert. Das Zentrifugar (156O Liter) wird unter . schonenden ,Bedingungen vom Aceton befreit, der Rückstand .(550 Liter) mit 82,5 kg Natriumchlorid versetzt und bei pH 5,9 mit' Essigester im Volumenverhältnis 3:1 in einem Gegenstromextraktor extrahiert.· Der wässrige Rückstand .wird nochmals mit 82,5 kg Natriumchlorid versetzt und in, gleicher Weise extrahiert .· Die vereinigten.Extrakte (57Ö Liter) werden schonend auf 10 Liter konzentriert.. Man. löst den öligen Rückstand in 50 Liter Petroläther (Kp. •50-70°) und extrahiert die PetrolätherlÖsung 8mal mit je 6 .Liter 85#igem Methanol. Die methanol lachen Extrakte enthalten die gesamte antibiotisch aktive Substanz..Beim ^Eindampfen zur Trockne erhält man 640 g rohes Antibiotikufis

_;A> 28829, ■ . ^: ■'·.-■'■■

' . . 109814/1^76

·- 17 -

"'■' ' - "·' ;"■■"·■" Beispiel 2 : .' ..· . ·

Das nach Beispiel 1 b) erhaltene Myeel' itfird 3mal ir;it Je 1000 ml-Essigester extrahiert, die vereinigten Extrakte werden auf 500 ml konzentriert und das Konzentrat 3mal mit verdünnter Essigsäure, Wasser, verdünnter Natriumbicarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt. Man dampft die über Natriumsulfat getrocknete Essigesterlösung im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand enthält gemäss Testierung mit Botrytis cinerea fast die gesamte Aktivität des Kulturmediums. 7*09 g des Rückstandes werden einer Craig-Vertei- .. -lung über 100 Stufen unterworfen..Das hierfür verwendete-Lösungsmittelsystem enthält auf 3 Liter Tetrachlorkohlenstoff- 2,55 Liter Methanol und 0,45.Liter Wasser..Man.füllt die·Substanz mit-150 ml Lösungsmittelgemisch in die ersten 3. Gläser der vollautomatischen Apparatur. Da.s Antibiotikum' reichert sich in den·Stufen 10-22 an..Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. .Man erhält 2,39 g eines festen bräunlichen Schaumes, der nach dem.Aufnehmen in Aether weitgehend kristallisiert.

1098 U/197 0.

Beispiel 3 : ■

Man löst 20 g rohes Antibiotikum in absolutem Chloroform und chromatographiert es an einer Säule aus 500 g Kieselgel. Das Antibiotikum wird mit ca. 2000 ml Essigester eluiert. Beim Einengen auf 200 ml scheiden sich 1^*75 g farblose Kristalle ab. Weitere 1,95 g werden aus k den Mutterlaugen gewonnen.

Aus Methanol umkristallisiert schmilzt das Antibiotikum bei 223 - 227° (Zersetzung).

Die Elementaranalyse ergibt: C = 60,53 %l 60,79 %l 60,97 & H = 8,52 %; 8,76 & 8,52 %; N = 1,89 & B = 1,35 %; 1,18 %i 0 (ber.) = 27,49 %.

Das Molekulargewischt (thermoelektrische Methode, Lösungsmittel Methylenchlorid) beträgt ca. 868.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel, Pliess-' mittel Aethylacetat, entsteht ein einziger Fleck, Rf = 0,75; Nachweis durch Besprühen mit konz. Schwefelsäure und Erhitzen auf l40° oder bioautographisch mit Spicaria wie folgt:

Auf eine Agarplatte, die mit Spicaria-Keimen beimpft ist,legt man ein Filterpapier und darüber die ent- i wickelte Dünnschichtplatte. Nach 15 Minuten ist genügend ' ! Antibiotikum in den Agar diffundiert, um eine Wachstumshemmung zu bewix^ken. Man entfer.nt die Dünnschichtplatte und das Filterpapier und inkubiert die Agarplatte 20 Stunden

,6° ioMU/mi-

'■'¹⁹

20 mg Antibiotikum A 28 829 werden in 2 ml Dioxan gelöst lind mit 2 ml η. Salzsäure 30 Minuten im siedenden Wasserbad erwärmt. Die Lösung wird durch Zufügen von festem Bariumcarbonat neutralisiert, zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit dem Fliessmittel n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:1) papierchroniatographisch untersucht. Es lassen sich weder mit ammoniakalisehem Silbernitrat noch mit Anilinhydrogenphthalat reduzierende f Zucker nachweisen.

109814/1916

Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces antibioticus A 28829 oder eine Mutante davon in einer wässerigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung züchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung aufweist, und das Antibiotikum A 28829 hierauf aus dem Mycel isoliert.

2. Das Antibiotikum A 28829, eine neutrale, lipophile, farblose Verbindung, die aus Methanol nadeiförmig kristallisiert und bei 223 - 224°C schmilzt, folgende Elementarzusammensetzung aufweist: C = 60,76$; H = 8,53$ * N = 1,89$; B = 1,27$ und 0 = 27,47$ (ber.), und die inKaliumbromid das in Fig. 1 dargestellte IR-Spektrum zeigt.

..erlagen (An. / * l Ab«. 2 Nr, l Sau 3 des Ändwunfleo^a. v. 4.9.1962}

1 Π fl ft 1 U I 1 Q 7 ß"

Leerseite