DE2916155C2 - Verbindung DC-11, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitung - Google Patents
Verbindung DC-11, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische ZubereitungInfo
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Description
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung DC-Il des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
Micromonospora chalcea NRRL 11289 in einem Nährmedium züchtet und die gebildete Verbindung DC-Il
durch folgende Isolierungs-Maßnahmen aus der KuIturHüssigkeit erhältlich ist: das zellfreie Kulturfiltrat (pH-Wert
6,0) wird über eine mit einem nicht-ionischen porösen Austauscherharz bepackte Süule gegeben, mit
Methanol, Aceton oder Äthylacetat desorbiert, das Eluat zur Trockene eingeengt, der Rückstand in Wasser
gelöst, die Lösung durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule geleitet, mit Äthylacetat eluiert, d<u>
Eluat zur Trockene eingeengt, der Rückstand in Chloroform gelöst, die Lösung durch eine Säule geleitet, die mit in
Chloroform suspendiertem Kieselgel gefüllt ist, mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (98:2
Volumenteile) eluiert und das Eluat zur Trockene eingeengt."
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von
25 bis 40° C während 1 bis 7 Tagen bei einem pH-Wert von 4 bis 10 vornimmt.
4. Pharmazeutische Zuberei.jng, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 und übliche Trägerstoffe
und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.
Die Erfindung betrifft den In den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Es besteht ein ständiger Bedarf nach Verbindungen mit antibakterieller oder antineoplastische? Wirksamkeit.
Von Seiten der Erfinder wurde eine neue Art eines Mikroorganismus aus einer Bodenprobe in Sendal-shl,
Mlyagi-ken, Japan, isoliert. Die aufgefundene neue An bildet bei ihrer Züchtung in einem Nährmedium eine
Verbindung mit antibakterieller Wirksamkeit.
Eine Untersuchung der morphologischen Eigenschaften des Mikroorganismus führt zu der Erkenntnis, daß es
sich bei diesen um einen neuen Stamm der Gattung Mlkromonospora handelt.
4S Eine Untersuchung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Isolierten aktiven
Verbindung führt zu dem Ergebnis, daß es sich dabei um eine neue Verbindung handelt, die als DC-II bezeichnet
wird.
Erfindungsgemäß wird die neue Verbindung DC-Il hergestellt, indem men diesen Mikroorganismus der
Gattung Micromonospora, in einem Nährmedium züchtet. Nach beendeter Züchtung wird die erflndungsge-5n
mäße neue Verbindung DC-Il aus der Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch
Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, isoliert (vgl. hierzu auch die Patentansprüche 2 und 3).
Die Verbindung DC-11 gemäß der Erfindung weist eine antibakteriell Wirksamkeit auf und Ist deshalb unter
anderem auch zur Reinigung und Sterilisation von Laboratoriums-Glasgeräten und chirurgischen Instrumenten
geeignet. Ferner kann sie zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschlösungen für sanitäre Zwecke elnge-5<
set*t werden. Die Verbindung der Erfindung ist aufgrund Ihrer antlbakterleilen Eigenschaften auch zur Behandlung
von bakteriellen Infektionen bei Tieren geeignet. Darüber hinaus eignet sich die erfindungsgemäße Verbindung
DC-Il. wie aus der nachstehenden Beschreibung deutlich wird, auch als antineoplastische Mittel bei
Tieren.
Die neue Verbindung DC-H gemäß der Erfindung weist somit antibakterielle und antineoplastische Elgen-
«i schäften auf und ist durch die nachstehenden physlkochemlschen Eigenschaften gekennzeichnet:
(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228° C (unter Zersetzung),
(2) Elementaranalyse: H = 6,9«, C = 59,0, N = 2,0%;
(3) IR-Spektrum (KBr-Pressllng gemäß nachstehender Flg. 1),
(Λ (4) UV-Absorptionsspektrum In Methanol gemüß nachstehender Fig. 2,
(5) PMR-Spektrum In CDCIi (Internes TMS):
9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, 1,13, 0,63 (ppm),
(6) CMR-Soektrum In CDCK (Internes TMS):
T) 16 ISS
14,0, 14,2, 15,1, 16,1, 16,9, 17,0-21,0 (ca. 5 Peaks) 22,1, 25,3 26,8-28,0 (ca. 2 Peaks), 29,7, 31,2, 34,0-37,0,
(ca. 3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2 44,9 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca. 4 Peaks), 69,3, 70,0-78,0 (ca. 5
Peaks), 83,9, 84,3, 91,4, 91,5-100,0 (ca. 5 Peaks), 100,8, lld,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,0, 136,3, 141,3,
149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 192,6, 201,4; 206,4 (ppm) und
(7) Spezifischer Drehv/ert: [a]y = -86,3° (c= 1,0, Aceton
(8) Löslichkeit:
Die Verbindung DC-II ist löslich in Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton, Äthyiacetat und Chloroform;
geringfügig löslich in Benzol und Wasser und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther und n-Hexan.
Das Massenspektrum zeigt kein ausgeprägtes Molekülion.
Aus der Elementaranalyse und dem CMR-Spektrum wird der Verbindung DC-11 die empirische Formel C64^72
H90-102 N2 O26_M zugeordnet, sowie ein Molekulargewicht von 1204 bis 1476.
Wie aus der nachstehenden Experimentalanalyse hervorgeht, wurde festgestellt, daß die Struktur der Verbindung
DC-i 1 L-Digitoxose sowie L-Amicetose als Bestandteile enthält. !5
Gemäß der vorstehend genannten Experimentalanalyse wird 1,5 g der Verbindung DC-II in einem Lösungsmittelgemisch
aus 75 ml 0,2 N HCl und 150 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird 17 Stunden unter Rückfluß
erhitzt. Anschließend wird Aceton unter vermindertem Druck abdestilliert. Das entstandene Gemisch wird viermal
mit jeweils 50 ml Chloroform extrahiert.
Die entstandene wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt, und
das entstandene Konzentrat wird durch eine mit einem Kationenaustauscherharz, Dowex 1 ^ 4 (OH-), gefüllte
Säule, geleitet. Anschließend wird das Au:iauscherharz gründlich mit Wasser gewaschen.
Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und der entstandene Rückstand wird säulenchromatographisch,
unter Verwendung von Kieselgei, behandelt. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Chloroform und
Methanol (9: 1 Volumenteile) entwickelt. Man erhält Fraktionen, die L-Amicetose enthalten, sowie Fraktionen,
die L-Digitoxose enthalten.
Die ersteren Fraktionen werden eingeengt, bis ein Rückstand von 218 mg einer öiartigen Substanz verbleibt.
Die letzteren Fraktionen werden zur Trockene eingeengt, um 196 mg eines Feststoffes zu ergeben.
Die ölartige Verbindung wird bei einem Druck von 0,1 Torr destilliert, wobei ein gereinigtes Öl entsteht. Die
feste Substanz wird aus einem Gemisch von η-Hexan und Aceton umkristallisiert. Man erhält farblose Prismen.
Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften des gereinigten Öls zusammengestellt:
(1) Erscheinungsform: farbloses Öl;
(2) Siedepunkt: 75° C/0,1 Torr,
(3) spezifische Drehung: UIk =-50,9° (C= 1.08, Aceton);
(4) die physikochemischen Eigenschaften des 2,4-DinitrophenyIhydrazons, das durch Umsetzung der öiartigen
Substanz mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin erhalten wird, sind nachstehend zusammengestellt:
Schmelzpunkt: 160 bis 16TC,
PM'.'.-Spektrum des 2,4-Dinitrophenylhydrazons in ds-Pyridin und internem TMS (<5, ppm):
l,56(d, 6,1. 3H), 2,20(m, 2H), 2,85(m, 2H), 3,94(m, IHi 4,14(dq, 6,1, 6,1, IH), 7,91(d, 9,5, IH), 7,96(t, 5,3,
IH), 8,29(dd, 9.5. 2,7, IH), 9,04(d, 2.7, IH).
Elementaranalyse des 2,4-Dinitrophenylhydrazons:
CjH16N4O6: CHN
Elementaranalyse des 2,4-Dinitrophenylhydrazons:
CjH16N4O6: CHN
ber.: 46.15 5.16 17,94
gel: 46.13 :.14 17,94.
Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß die ölartie Substanz als L-Amicetose identifiziert wird.
Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften der vorstehend erwähnten unkristalllsierten farblosen
Prismen zusammengeheilt: so
(!) Erscheinungsform: farblose Prismen,
(2) Schmelzpunkt: 110-1120C.
(3) Spezifische Drehung:
[*]}';·= -37.3 (c =1.11. Methanol).
(4) PMR-Spekirum in CD1OD und mit internem TMS (<5, ppm): 5s
1.23(d. 6.1. 3H). 1.61(ddd. 13,7, 9,5, 2,8, IH), 2,02(ddd, 13,7, 3,7, 2,8, IH), 3,14(dd, 9,5, 3,2, IH;, 3,77(dq,
9.5. 6.1. IH), 4.00(ddd, 3,7. 3,2, 2,8. IH), 5,06(dd, 9,5, 2,4, IH).
(5) Elementaranalyse
CHuO1: C H
ber.: 48,64 8.16 M
gef.: 48,47 8,34.
Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß die farblosen Prismen als L-Digitoxose identifiziert
werden können.
In der nachsiehenden Tabelle 1 sind die /? ,-Werte der Verbindung DC-Il <*ei Kleselgel-Dünnschichtchromatographle
(DC) unter Verwendung verschiedener Entwickler zusammengestellt:
Träger *) II
Entwickler (V/V)
/{/-Werte
III
Benzol | Aceton | 0,55 |
(35 | 65) | |
Tuluol | Aceton | 0,48 |
(4 | 6) | |
Chloroform | Methanol | 0,60 |
(9 | 1) | |
Chloroform | Dioxan | 0,70 |
(92,5 | 7,5) | |
Chloroform | Tetrahydrofuran | 0,67 |
(85 | 15) | |
Chloroform | Aceton | 0,50 |
(9 | 1) | |
Aceton : Dioxan | 10% Ammoniumacetat | 0,35 |
(5 : 5 | 1) |
I: Kieselgcl für DC, Nr. 5715, hergestellt von der Firma Merck & Co., Inc.
II: Kieselgel für „reversed phase" DC, Nr. 5747, hergestellt von Merck & Co., Inc.
III: Aluminiumoxid RIr DC, Nr. 5727, hergestellt von Merck & Co., Inc.
Die Verbindung DC-Il der Erfindung wird durch Züchtung vor; Micromonospora chalcea KY 11 091 hergestellt.
Der vorstehende Stamm wurde bei der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development
Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (ehemals Northern Regional
Research Agriculture), Peoria, Illinois 61604 unter der Hlnterlegungs-Nr. NRRL 11289 hinterlegt und Ist
öffentlich zugänglich.
Der genannte Stamm KY 11 091 Ist durch die nachstehenden Eigenschaften gekennzeichnet:
I. Morphologische Eigenschaften:
Gut entwickeltes, verzweigtes, nicht septlertes Substratmyzel mit einem Durchmesser von etwa 0,5 um,
jedoch wird kein echtes Luftmyzel gebildet. Sporen werden sehr gut ausgebildet und einzelne Sporen werden an
den Enden von einfachen Sporophoren (Länge etwa 0,3 bis 1,0 um), die sich aus dem Substratmyzel abzweigen,
gebildet. Viele Sporen werden am Ende des Substratmyzels gebildet. Gerelfte Sporen weisen einen Durchmesser
von etwa 1,0 μπι auf und sind kugelförmig.
Wenn der Stamm im flüssigem Medium gezüchtet wird, 1st das Wachstum anfänglich hellorange und wechselt
in den späteren Stadien in ein Dunkelbraun. Es werden viele Sporen gebildet.
Sofern der Stamm in einem A°ar-Medium gezüchtet wird, entsteht auf dem Medium, in dem die Sporen
leicht gebildet werden, eine ziegelrote, glanzende, wachsartige Sporenschicht.
Il.Wuchsformen:
Wachstumsgrad, Farbe des Substratmyzels sowie das eventuelle Auftreten löslicher Pigmente bei der Züchtung
des Stammes KY 11 091 in verschiedenen Nährböden sind In nachstehender Tabelle II zusammengefaßt.
Die englischen Farbangaben richten sich nach der Klassifizierung in dem Color Harmony Manual (Container
Corporation of America). Die Bestimmung der Eigenschaften erfolgt nach einer Züchtung bei 30° C während 2
Wochen.
Nährboden | Wachstum | Farbe | PO), | Lösliche Pigmente |
Saccharose-Nitrat-Agar | gut, flach. | Black-olive (I schwarz-oliv |
keine | |
GIucose-Asparagin-Agar | spärlich, flach | White (a), weiß |
keine | |
Giycerin-Asparagin-Agar | spärlich, flach | White (a), weiß |
po), | keine |
Stärke-anorganische Salze-Agar |
gut, flach | Black-olive (1 schwarz-oliv |
keine | |
29 16 ibt)
Fortsetzung
Nährboden
Wachstum
Farbe
Lösliche
Pigmente
Pigmente
Tyrosin-Agar | mäßig | Black-olive (1 po), schwarz-oliv |
keine |
Nähragrar | mäßig, flach | Apricot (4 ca), aprikosenfarben |
keine |
Hafermehl-Agar | mäßig, flach | Apricot (4 ca), aprikosenfarben |
keine |
Hefe-Ma!z-Agar | gut, erhaben | Black-olive (1 po), schwarz-oliv |
keine |
Pepton-Hefe-Agar | mäßig, flach | Orange (4 la), | keine |
orange |
III. Physiologische Eigenschaften:
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes KY 11 091 gehen aus der nachstehenden Tabelle 111 hervor,
In der die optimale Wachstumstemperatur nach 5tilglger Züchtung festgestellt wird und die Eigenschaften
gegenüber Milch sowie im Hinblick auf die Zersetzung von Cellulose nach lmonatiger Züchtung festgestellt
werden. Die sonstigen Eigenschaften werden nach Züchtung bei 27° C wahrend 2 Wochen festgestellt.
(1) Verwertung von Kohlenstoffquellen
Kohlenstoflquelle
Verwertung
D-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Fructose
Saccharose inosit
L-Rhamnose D-Raffinose D-Mannitol Ribose
SaIi ei η
L-Arabinose Glycerin Melibiose
(2) Sonstige Eigenschaften Verflüssigung von Gelatine
Verflüssigung von Milch Peptonisierung von Milch Zersetzung von Cellulose Hydrolyse von Stärke
optimaler pH-Wert des Wachstums optimale Temperatur des Wachstums Bildung von Tyrosinase
Bildung von mclanoiden Pigmenten
negativ
positiv
negativ
schwach
positiv
6,6 bis 7,5
28 bis 38° C
keine
keine
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, bildet der Stamm KY 11091 kein echtes Luftmyzel in
einem Agar-Nührboden und bildet Einzelsporen an dem Substratmyzel. Durch Analyse der Zellwand kann
festgestellt werden, daß der Stamm Mesodiaminopimelinsäure enthält.
Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse und der Auswertung von »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«,
8. Aufl. (1974), S. 846-849 und »International Journal of Systematic Bacteriology«, Bd. 21, Nr. 3,
S. 248-253, wurde der Stamm KY 11091 der Art Mlcromonospora chaSr.ea zugeordnet. Dieser Stamm KY
11 091 erzeugt In einer biologisch reinen Kultur bei der Züchtung die erfindungsgemäße Verbindung DC-H In
■ H verwertbarer Ausbeute.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können herkömmliche Verfahren zur Züchtung von
S Actlnomyzeten verwendet werden. Im Züchtungsmedium können verschiedene Nührstoffquellen eingesetzt
werden. Beispiele für geeignete Kohlenstoffqueiien sind Glucose, Starke, Mannose, Dextrin, Fructose, Saccharose
und/odff Melassen. Beispiele für anorganische oder organische Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid,
Ammonlumsviifat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat. Diese können allein oder zusammen mit
natürlichen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Malsquellwasser, Soyaboh-
i" nenpulver, Kasamlnsüure und löslichen Pflanzenproteine^ verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische
Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Kaliumdihydrogenphosphat,
Dlkallumhydrogenphosphat, Elsensulfat, Calciumchlorid, Mangansulfat, Zinksulfat, oder Kupfersuirat, dem
Medium zugesetzt werden. Außerdem können organische und anorganische Produkte, beispielsweise Vitamin
Β,, Biotin und dergleichen, die das Wachstum des speziellen Stammes und die Bildung der Verbindung DC-Il
fördern, dem Medium zugegeben werden.
Vorzugsweise wird die Züchtung In einem flüssigen Medium, insbesondere unter Rühren im Submersverfahren,
durchgeführt. Die Züchtungstemperaturen betragen nach Möglichkeit 25 bis 4O0C, vorzugsweise 28 bis
38° C. Die Züchtung wird bevorzugt bei einem pH-Wert von 4 bis 10, Insbesondere 6 bis 8, durchgeführt, wobei
der gewünschte pH-Wert mittels einer wäßrigen Ammoniaklösung oder einer Ammonlumcarbonatlösung elnge-
» stellt wird.
Im allgemeinen hat sich nach 1 bis 7täglger Züchtung im flüssigen Medium die Verbindung DC-Il In der
Kulturflüssigkeit gebildet und angereichert. Wenn die Ausbeute der Verbindung DC-Il in der Kuiturflüssigkelt
ein Maximum erreicht, wird die Züchtung abgebrochen. Das gewünschte Produkt wird nach dem Entfernen der
Mlkroorganismenzcllen aus der Kulturfiüssigkeit, beispielsweise durch Abflltrteren, Isoliert und gereinigt.
Die Isolierung und Reinigung der Verbindung DC-U wird nach an sich üblichen Verfahren zur Isolierung
und Reinigung von Mikroorganismen-Stoffwechselprodukten auf KulturflUsslgkelten durchgeführt. Beispielsweise
wird das zellfreie Kulturflltrat (pH-Wert 6,0) über einen mit einem nlcht-lonlschen porösen Austauschharz,
wie HP-20 (Warenzeichen der Firma Mitsubishi Chemical Industries) bepackte Säule gegeben, damit die
aktiven Bestandteile adsorbiert werden. Die Desorption der aktiven Bestandteile erfolgt unter Verwendung von
-in Methanol, Aceton, Äthylacetat oder dergleichen. Das entstandene Eluat wird zur Trockene eingeengt und der
Rückstand wird In Wasser gelöst. Anschließend wird die Lösung durch eine mit Aktivkohle gefüllte Süule geleitet
und die Elutlon erfolgt mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat. Das Eluat wird zur Trockene
eingeengt und der Rückstand wird In Chloroform gelöst. Die entstandene Lösung wird sodann durch eine Säule
geleitet, die mit In Chloroform suspendiertem Kieselgel gefüllt Ist, wobei gelbliche Verunreinigungen entfernt
werden. Die Elution erfolgt mit einem Lösungsmittelgemlsch aus Chloroform und Methanol (98:2 Volumlelle)
und das Eluat wird zur Trockene eingeengt. Man erhalt die aktive Verbindung. Das gleiche, vorstehend
beschriebene Chromaiograpnievcrfahren oder ein Chrornaiogrupuierverfanren unter Verwendung einss vernetzten
Polysaccharld-Dextrans, wie Sephadex LH-20, kann zur weiteren Reinigung des erwünschten Produktes
wiederholt werden. Die auf diese Welse erhaltene erfindungsgemaße Verbindung DC-11 weist die vorstehend
*) geschilderten physlkochemlschen Eigenschaften auf.
Die biologischen Eigenschaften der Verbindung DC-11 werden nachstehend geschildert.
In der nachstehenden Tabelle IV ist das in vitro gemessene antibakterielle Wirkungsspektrum der Verbindung DC-II, nach der Blättchen-Methode (Hemmhoftest-Methode) gemessen (pH 8,0) angegeben.
In der nachstehenden Tabelle IV ist das in vitro gemessene antibakterielle Wirkungsspektrum der Verbindung DC-II, nach der Blättchen-Methode (Hemmhoftest-Methode) gemessen (pH 8,0) angegeben.
Tabelle IV
Mindesthemmkonzentration
Mindesthemmkonzentration
Mikroorganismen MIC
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 100
Bacillus subtilus Nr. 10707 1,6
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 >100
Escherichia coli ATCC 26 >100
Shigella sonnei ATCC 9290 >100
Salmonella typhosa ATCC 9992 >100
Die akute Toxizität (LDso)-Wert) für die Verbindung DC-Il beträgt bei intraperitonealer Verabfolgung für
Mäuse 54 mg/kg.
Die antineoplastische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung DC-11 ergibt sich aus den nachstehenden
Untersuchungen:
Π) Wirkung bei Sarkom 180 Ascttestunioren
Sechs männliche ddY-Stamm-Mäuse mit einem jeweiligen Gewicht von 20 g werden für jede Grr.ppe als
Testtiere eingesetzt. Es werden jeweils 5xlO6 Sarkom 180 Ascitestumorzellen den Tieren implantiert. 24 Stun-
den nach erfolgter Implantation wird den Tieren jeweils Intraperltoneal 0,2 ml Phosphat-gepuffertc Kochsulzlösung
(PBS), die jeweils unterschiedliche Konzentrationen der erflndungsgemüßen Verbindung DC-Il enthalten,
vcrabfolgu Die vorstehend genasinte PBS besteht aus 0,8 g/dl Kochsalz, 0,02 g/dl KCl, 1,15 g/dl Na2HPO4 und
0,02 g/dl KHiPO1 (pH 7,2).
Zum Vergleich werden 0,2 ml PBS-Lösungcn, die als Testverbindung Mitomycin C enthalten, einer Gruppe
von Tieren während der gleichen Zelt, bei der den anderen Versuchsgruppen die erfindungsgemäße Verbindung
verabfolgt wird, gegeben.
7 Tage nach erfolgter Implantation wird bei den Versuchstieren das durchschnittliche Tumorvolumen T
(mm1) und der Wert TIC (T= durchschnittliches Tumorvolumen nach Verabfolgung der erfindungsgemäßen
Testverbindung; C = durchschnittliches Tumorvolumen ohne Verabfolgung einer Testverbindung) bestimmt. Die
Ergebnisse sind In der nachstehenden Tabelle V zusammengefaßt.
Tabelle V | Dosis (mg/kg) | 7(mm3) | TlC |
Testverbindung | 0 | 1405 | |
Kontrolle | "IC ■CJ |
1096 | Q,73 |
DC-H | 50 | 730 | 0,52 |
DC-Il | 70 | 590 | 0,42 |
DC-Il | 4,2 | 450 | 0,32 |
Mitomycin | |||
(2) Wirkung auf den Lymphozytenleukämie P-388 Tumor zs
|: Als Testtiere werden für jede Versuchsgruppe fünf mannliche CDF,-Mäuse mit einem jeweiligen Gewicht von
etwa 22 g verwendet. Den Testtieren werden jeweils 1 χ 106-Zellen Lymphozytenleukämie P-388 Tumor-Zellen
\: Intraperltoneal Implantiert. ?<Λ Stunden nach erfolgter Implantation erfolgt die Intraperitoneale Zugabe von
0,2-ml-PBS-Lösung, die die Verbindung DC-11 In jeweils verschiedenen Konzentrationen enthalt. 3"
* Zum Vergleich mit einer Gruppe der Testtiere wird gleichzeitig eine Lösung von 0,2 ml PBS, die als Testverbindung
Mitomycin C enthalt, intraperitoneal verabreicht.
s Die nach der Implantation erhaltenen Versuchsergebnisse sind In der nachstehenden Tabelle VI zusammenge-
faßt. In der Tabelle bedeuteten die Ausdrücke ASP die durchschnittliche Überlebensdauer nach der Verabfol-
gung, ausgedrückt in Tagen. Der Quotient ASPIC stellt das Verhältnis der durchschnittlichen Überlebensdauer
(In Tagen) aus der Gruppe der Versuchstiere, denen die erflndungsgemäße Testverbindung verabfolgt wurde
und der durchEchp.U'Hchen Überlebensdauer (in Tagen) C von Versuchstieren, denen keine Testverbindung
verabfolgt wurde, dar.
Tabelle VI | Dosis (mg/kg) | ASP (Tage) | ASPlC |
Testverbindung | 0 | 9,4 | |
Kontrolle | 6,25 | 11,2 | 1,20 |
DC-Il | 12,5 | 13,4 | 1,43 |
DC-Il | 25,0 | 13,0 | 1,33 |
DC-Il | 4,2 | 14,2 | 1,51 |
Mitomycin C | |||
Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, ist die erfindungsgemäße Verbindung DC-11 sowohl als antineoplastlsches
als auch als antibakterielles Mittel wirksam.
Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutische Präparate kann enteral, parenteral
oder lokal erfolgen.
Die erflndungsgamäßen pharmazeutischen Zubereitungen enthalten übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel
und/oder Hilfsstoffe.
Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen kann in an sich bekannter Weise
in Form von Tabletten, Kapseln oder als Flüssigkeiten, z. B. in Form von Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen,
erfolgen.
Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen zur Verwendung als antineoplastische
Mittel erfolgt vorzugsweise in Form von Injektionspräparaten.
Die jeweils geeignete Dosierung hängt von der erwünschten therapeutischen Wirkung der Verabfolgungsweise
und der geplanten Behandlungsdauer ab. Im allgemeinen sind tägliche Dosierungen von etwa 0,1 bis 0,5 mg/kg
Körpergewicht zum Erzielen einer antineoplastlschen Wirksamkeit ausreichend.
Das Beispiel erläutert die Erfindung. Hierbei wird die Anwesenheit der Verbindung DC-Il durch ein bioxssav-Verfahren
unter Verwendung von Bacillus subtilus Nr. 10 707 als Test-Mikroorganismus nachgewiesen.
Der Stamm Micromonospora chalcea NRRL 11 289 wird in einen 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft,
der 300 ml eines Kulturmediums enthält, das wie folgt zusammengesetzt ist: 4 g KCI/Liter, 0,5 g
MgSO4 - 7H2O/LLer, 1,5 g KH2PO4, 5,0 g (NH4)2SO4/Liter, 20 g Saccharose/Liter, 10 g Fructose/Liter, 10 g
Glucose/Liter, 5,0 g Maiquellwasser/Liter und 20 g CaCO3/Liter (pH 7,0). Die Züchtung wird 48 Stunden unter
Rühren (220 Uprn) bei 30° C durchgeführt. Sodann werden 0,75 Liter der auf diese Welse erhaltenen Vorkullur
in einen 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dort enthaltenen Ku'turmediums
ist wie folgt:
») 40 g lösliche Stärke/Liter, 8 g Hefeextrakt/Liter, 0,09 g MgSO4 ■ 7H2O/Liter, 0,15 g KH2PO4/Liter, 0,21 g
K2HPO4/Liter, 10 mg Vitamin B, ■ HCl/Liter, 30 ug Biotln/Liter, 10 mg FeSO4 ■ 7H2O/Liter, 30 mg !
CaClj/Liter, 4 mg MnSO4/Liter, 30 mg ZnSO4 · 7H2O/Liter und 2 mg CuSO4 ■ 5H2O/Liter. :
Vor der Sterilisation wird das Nährmedium mit NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Züchtung in
dem Fermenter wird 72 Stunden unter Belüftung und Rühren (15 Liter/min, Belüftung; 150 Upm) bei 30° C
>' durchgeführt. Der pH-Wert des Nährmediums wird während der Züchtung nicht kontrolliert.
Die erfiandene Kulturflüssigkeit wird danach filtriert. Man erhält 13 Liter Filtrat. Das Filtrat wird auf eine
mit 1 Liter eines nicht-ionischen, porösen Austauscherharzes HP-10 gegeben, um die aktiven Bestandteile zu
adsorbieren. Anschließend wird das Austauscherharz zur Entfernung der Verunreinigungen mit einem Gemisch ^
aus Wasser und 30« (V/V) Aceton gewaschen. Die Elution erfolgt mit Aceton. Die vereinigten Acetonfraktio- |
:r> ne-n werden zur Trockene eingeengt. Man erhält einen Rückstand» der In einer 30¥!gen Aretonlosung gelöst f
wird. I
Die entstandene Lösung wird auf eine mit 5£ ml Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Anschließend wird die |
Säule mit einer 30%Igen Acetonlösung gewaschen. Die Elution erfolgt mit Aceton, wobei der größte Teil der in |
der Lösung als Verunreinigungen anwesenden Pigmente entfernt wird. -F
-7^ Die aktiven Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird In etwa 10 ml ChIo-
reform gelöst. Die Chloroformlösung wird auf eine mit 500 ml Kieselgel (SlIIc AR CC-4), das In Chloroform j
suspendiert ist, gefüllte Säule gegeben und mit etwa 2 Liter Chloroform gewaschen. {
Die Elution erfolgt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (98: 2 Volumteile). Man 1
erhält DC-11 enthaltende Fraktionen. Die Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Man erhält |
31' 55 mg eines Rohproduktes. Das Rohprodukt wird wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Kieselgel, i
Chromatographien. Man erhält 32 mg eines gereinigten Pulvers, dessen physikochemische Eigenschaften und 1
dessen antibakterielle und antineoplastische Wirksamkeit mii den vorstehend geschilderten Eigenschaften über- t
einstimmen. j>
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
. '·■*
Claims (5)
1. Verbindung DC-Il mit antibakterielier Wirksamkeit, gekennzeichnet durch folgende Kenndaten:
(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228° C (unter Zersetzung),
(2) Elementaranalyse: H = 6,9s, C = 59,0, N = 2,0»,
(3) IR-Spektrum (KBr-PressÜng) gemäß nachstehender Fig. 1, die Bestandteil dieses Anspruchs ist,
(4) UV-Absorptionsspektrum in Methanol gemäß nachstehender Fig. 2, die Bestandteil dieses Ansprurhs
ist,
(5) PMR-Spektrum in CDCl3 (internes TMS):
9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, i,13, 0,63
(ppm),
(6) CMR-Spektrum in CDCI3 (internes TMS):
14 0 14 2 15 1 16,1, 16,9, 17,0-21,0 (ca. 5 Peaks\ 22,1, 25,3, 26,8-28,0 (ca.
2 Peaks), 29,7, 31,2,
34,0-37,0 (ca.
3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2, 44,9, 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca.
4 Peaks), 69,3,
70,0-78,0 (ca. 5 Peaks), 83,9, 84,3, 91,4, 91,5-100,0 (ca.
5 Peaks), 100,8, 118,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,0,
136,3, 141,3, 149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 192.6, 201,4, 206,4 (ppm) und
(7) Spezifischer Drehwert:
[cr]?i =-26,3° (C= 1,0, Aceton).
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---|---|---|---|
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DE2916155C2 true DE2916155C2 (de) | 1985-10-31 |
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FR (1) | FR2423539A1 (de) |
GB (1) | GB2019388B (de) |
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- 1979-04-20 DE DE2916155A patent/DE2916155C2/de not_active Expired
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