DE2900546C3 - Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Referenzstandard und Verwendung der standardisierten markierten Bindungskomponente in spezifischen Bindungstest-Verfahren - Google Patents
Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Referenzstandard und Verwendung der standardisierten markierten Bindungskomponente in spezifischen Bindungstest-VerfahrenInfo
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Description
Überempfindliche Menschen sind bei den Kontakt mit den Antigenen aus einem Allergen allergisch und
reagieren unter Bildung von Antikörpern gegen dieselben. Ein darauffolgender Kontakt mit einem jener
Antigene oder einer strukturell ähnlichen Substanz kann bei einem allergisch reagierenden Menschen
eine pathologische Reaktion hervorrufen, was auf die Anwesenheit derartiger Antikörper zurückzuführen
ist. Wenn diese Menschen das in Frage kommende Antigen einatmen oder es durch die Nahrung aufnehmen,
so ergeben sich als auffallende und übliche Manifestationen Heuschnupfen, Asthma oder Nesselausschlag.
Diese Antikörper sensibilisieren das Gewebe und können als Reagin Ig bezeichnet werden. Es gibt
fünf Klassen von Antikörpern: IgE, IgG, IgA, IgM und IgD. IgE bildet die Klasse von Antikörpern, die
besonders für atopische Allergien verantwortlich ist. s In-vivo-diagnostische Tests auf Atopie, d. h. die
Bestimmung der Anwesenheit von IgE, das als Reaktion auf Allergen gebildet wurde, werden im allgemeinen
durch Injizierung kleiner Mengen des vermutlichen Allergens in die Haut des empfindlichen
ίο Menschen durchgeführt; daraufhin wird die Injektionsstelle
untersucht, ob sich auf der Haut derselben ein unregelmäßiges Pustel bzw. Quaddel bildet, welches
von einer Erythämiezone umgeben ist. Neben den in-vivo-Versuchen wurden auch in-vitro-diagnostische
Tests entwickelt. Eine Art der in-vitro-diagnostischen Verfahren umfaßt analytische Verfahren, die
im breiten Sinne als »spezifische Bindungsteste« klassifiziert werden können.
Im Hinblick auf in-vitro-diagnostische Tests auf Atopie umfassen die Verfahren zur Durchführung
spezifischer Bindungstest den Nachweis eines Liganden in einer Körperflüssigkeit. Ein typisches Verfahren
eines spezifischen Bindungstests besteht in der Bestimmung der IgE-Antikörper (Ligand) im Blutserum
eines überempfindlichen Menschen. US-PS 3720760 betrifft einen diagnostischen in-vitro-Test,
der als »RAST« (radioallergosorbent test) bezeichnet wird.
Der Test besteht aus einem ersten Schritt, bei dem ein Test-Allergen (Antigen) an ein unlösliches polymeres
Substrat unter Bildung eines gebundenden Festphasen-Antigens gebunden wird. Der zweite
Schritt umfaßt das Inkontaktbringen des Festphasen-Antigens mit dem Serum eines atopischen Individuums
(bei dem IgE-Antikörper vorliegen). Das IgE haftet bzw. verbindet sich mit dem IgE-Rezeptorzentrum
des Antigens unter Bildung eines Antigen-Liganden-Komplexes. Im dritten Schritt wird der Komplex
mit einem markierten Bestandteil in Kontakt gebracht, wobei dieser markierte Bestandteil ein
Konjugat aus einer Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente (die in der Lage ist, eine Bindung
mit dem Liganden einzugehen), d. h. radiomarkiertes Anti-IgE, ist.
Als Markierungssubstanzen lassen sich verschiedene Stoffe verwenden. Infolge der Gefährlichkeit
und Schwierigkeit bei der Handhabung radioaktiver Materialien wurden zahlreiche neue Testsysteme, die
als Systeme vom »RAST-Typ« bezeichnet werden
so können, entworfen, wobei keine radioaktiven Isotopen als Markierungssubstanz verwendet werden.
Beispiele von Markierungssubstanzen umfassen freie Radikale, fluoreszierende Moleküle (z. B. Fluorescein-Isothiocyanat
und Rhodium-Farbstoffe), lumineszierende Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme
und Enzyminhibitoren.
Antikörper setzen sich in der Regel aus vier Ketten zusammen, und zwar aus zwei sogenannten leichten
und zwei schweren Ketten. In beiden Kettentypen besteht ein konstanter Bereich und ein variabler Bereich,
d. h. die Aminosäuresequenz des Bereiches ist jeweils verhältnismäßig konstant oder variabel. Die Aminosäuresequenz
des variablen Bereichs richtet sich nach der Identität des Antigens, gegen welches derselbe gcrichtet
ist; der variable Bereich des Antikörper-Moleküls, der sich mit dem Antigen verbindet, wird vom
Antikörper-Bindungsfragment (Fab), welches durch Papain-Abbau erhalten wird, umfaßt. Der konstante
Bereich variiert nicht in Abhängigkeit vom Antigen, gegen welches das Antikörper-Molekül gerichtet ist,
sondern ist für eine bestimmte Antikörper-Klasse charakteristisch. Ein Teil des konstanten Bereiches
der schweren Kette bildet das andere Fragment (Fc), das beim Papain Abbau freigesetzt wird.
IgE bindet an das Antigen über dem Antikörper-Fragment-(Fab)-Bereich
des Antigen-Moleküls, wobei der Fc -Bereich freibleibt. Das radiomarkierte
Anti-IgE bindet dann an das IgE über den Fc-Bereich
von IgE.
Das RAST-Reaktionsprodukt stellt ein Substrat dar, an das drei »Schichten« gebunden sind: (1) Festphasenanzeige:
(2) IgE, das sich spezifisch gegen das Antigen richtet, und (3) radiomarkiertes Anti-IgE,
das spezifisch niit IgE reagiert. Die vom radiomarkierten Reaktionsprodukt herrührende radioaktive
Strahlung ist ein Maß für die Menge des vorhandenen antigenspezifischen IgE im Testserum. Die Verwendung
von RAST erlaubt, wie dies oben beschrieben wird, die Bestimung des Vorliegens und - zu einem
begrenzten Maße - die Bestimmung der Menge des im Serum des Patienten vorliegenden IgE, welches in
der Lage ist, mit dem an das Substrat gebundene Antigen zu reagieren. Dieser Test gibt zusammen mit
Hauttests eine Indikation, ob der Patient gegenüber einem Antigen allergisch reagiert oder nicht.
Nach Diagnose einer Atopie wird üblicherweise zur Behandlung der allergischen Störung eine Immunisierung
(»Desensibilisierung«) des Individuums mit Hilfe einer Reihe von Injektionen von langsam zunehmenden
Mengen an Allergenextrakten durchgeführt. Infolge der Gefahr des Auslösens eines anaphylaktischen
Schocks müssen die verabreichten Mengen an Allergenextrakt sorgfältig kontrolliert werden.
Da Schwankungen in der Wirksamkeit des verabreichten Allergenextraktes, wie dies bei Messungen
der Reaktivität auf der Haut der empfindlichen Menschen induziert wird, auftreten können, ist es wünschenswert,
eine Verbesserung des Standardisierens von Allergenextrakten zu erreichen. Es wird angenommen,
daß Schwierigkeiten beim Standardisieren von Allergenextrakten dadurch entstehen, daß Allergenextrakte
(z. B. Blütenstaub) im allgemeinen komplexe Gemische darstellen und es ist schwierig zu bestimmen,
welche Bestandteile für das Auslösen einer allergenen Reaktion oder eines therapeutischen Effektes
während der Therapie verantwortlich sind. Die Verfahren, um die Wirksamkeit derselben auszudrükken,
sind weitgehend indirekt und basieren entweder auf dem einfachen Verhältnis des rohen Ausgangsmaterials
zum Volumen an Extraktionsflüssigkeit oder sie basieren auf dem Proteinstickstoffgehalt des Extraktes.
Da offensichtlich die meisten Allergene proteinartiger Natur sind, wurde eine Bestimmung der
Wirksamkeit durch Proteinstickstoff-Einheiten (PNU), definiert als 0,01 μg Phosphorwolframsäurepräzipitierbarem
Stickstoff, weitgehend akzeptiert. Der PNU-Gehalt ist jedoch nicht notwendigerweise
mit der biologischen Aktivität vergleichbar, da Allergenextrakte Proteine enthalten können, die nicht als
Allergen wirksam sind. Außerdem können spezifische Proteinallergene während der Extraktion oder während
der Lagerung denaturiert werden, wodurch sich ein Verlust ihrer biologischen Aktivität ergibt, wohingegen
sie bei der chemischen Bestimmung als Protein vorliegen und mitgerechnet werden.
Eine zweite Anwendung von Bi ι idungstest-Verfahren,
wie sie RAST darsttllt, besteht in der Bestimmung der Wirksamkeit von Allergenen in dem Versuch,
Allergene, die bei diagnostischen Hauttesten und in der in-vivo-Desensibilisierung Verwendung
finden, zu standardisieren. Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem die zweiten und dritten Schichten
(nämlich IgE und markiertes Anti-IgE) konstant gehalten werden und im ersten Schritt zunehmende
Mengen an löslichem Antigen zugegeben werden. Das
ιυ Prinzip dieser Methode basiert auf einer Kompetition
zwischen Antigen der festen und flüssigen Phase an IgE-Rezeptorzentren im ersten Schritt von RAST.
Mit der Zunahme der Menge an löslichen Antigen komplexiert eine kleinere Menge IgE mit dem Festphasen-Antigen,
was auf eine zunehmende Komplexbildung zwischen dem Antigen der flüssigen Phase und
IgE zurückzuführen ist. Dies wiederum läßt die prozentuale Bindung des radiomarkierten Anti-IgE an
das Festphasen-Antigen im dritten Schritt von RAST abnehmen. Diese Abnahme in Prozent Bindung von
Anti-IgE an Festphasen-Antigen führt zu einer Abnahme der von der Festphase emittierten Strahlung.
Ausgehend von 100% Bindung kann durch sorgfältige Titration die Menge an löslichem Antigen bestimmt
werden, die erforderlich ist, um 50% Inhibierung der Bindung zu erreichen. Durch Auftragen der
Menge an erforderlichem, löslichen Antigen gegen die gebildete Inhibitierung (auf halblogarithmischem Papier)
kann eine annähernd lineare Beziehung aufgestellt werden. Insbesondere im Bereich von 30 bis
70% Inhibierung ist der halblogarithmische Kurvenverlauf weitgehend linear. Der Endpunkt dieser Titrationen
kann willkürlich bestimmt werden als die Menge an Allergenextrakt, die für 50% Inhibierung
erforderlich ist. Theoretisch würde der Vergleich einer Reihe von Allergenextrakten ausreichende Vergleichsdaten
bringen, um eine Standardisierung der Extrakte durchzuführen (J. Allergy din. Immunol.
63 [1974], Seiten 158-169). Wie nachfolgend beschrieben wird, zeigt dieses Verfahren eine Reihe von
Nachteilen.
Ein Nachteil liegt im Anti-IgE selbst. Das beim RAST schließlich verwendete Reagenz, das radiomarkierte
Anti-IgE, wird durch Radiomarkierung mit einem radioaktiven Jodsalz hergestellt. Auf diese Weise
wird ein radiomarkiertes Anti-IgE mit einer Halbwertszeit gebildet, die kurz genug ist, um die notwendige
Empfindlichkeit für eine Messung bei niedrigen Konzentrationen von IgE zu gewährleisten. Diese
kurze Halbwertszeit bedeutet jedoch, daß sich das radiomarkierte Anti-IgE schnell verändert, wodurch
dessen Verwendung als ein Standardreferenzreagenz über einen längeren Zeitraum hinweg nicht möglich
ist. Darüber hinaus entstehen durch harte Jodierungsbedingungen und darauffolgende Strahlungsschäden
während dem Radiomarkierungsverfahren Variationen in dem radiomarkierten Anti-IgE. Aufgrund dieser
Variationen ist es nicht möglich, zwei Bestimmungen, die zu verschiedenen Zeiten durchgeführt
wurden, direkt zu vergleichen, indem die gleiche Charge des radiomarkierten Anti-IgE verwendet wird
oder indem zum gleichen Zeitpunkt verschiedene Chargen von radiomarkiertem Anti-IgE verwendet
werden. Durch Standardisierung des radiomarkierten Anti-IgE gemäß der Erfindung werden diese Nachteile
verhindert.
Eine Standardisierung durch RAST-Inhibierung
ergibt andere Nachteile. RAST selbst stellt keine standardisierte Methode dar. In typischer Weise werden
Radioimmunobestimmungen durch Schaffung festgesetzten, gut definierten Referenzreagenzes, entweder
eines Antigens oder eines Antikörpers standardisiert. Allergene stellen jedoch komplexe Mischungen
dar, die sich nicht gut definieren lassen; außerdem ist ihre Stabilität nicht eindeutig bekannt. Auf diese
Weise kann jedoch durch dieses Verfahren RAST nur teilweise standardisiert werden. Es wurde jedoch vorgeschlagen
(J. Allergy Clin. Immunol. 63 [1974], Seiten
158-169), daß Serum von atopischen Individuen als Referenzreagenz für die häufiger auftretenden Allergien
verwendet werden könnte. Aber auch dies würde nur eine teilweise Standardisierung von RAST
ergeben, da Serum ein komplexes Gemisch mit schlecht definierten Antikörperspezifitäten darstellt.
Trotz der inhärenten Schwierigkeiten wurde eine bevorzugte Verwendung atopischer Seren beim direkten
RAST-Verfahren vorgeschlagen (Advances in Diagnosis of Allergy: RAST, Seiten 85-99, Symposium
specialists [1975]).
Theoretisch könnte das im dritten Schritt von RAST verwendete radiomarkierte Anti-IgE dadurch
standardisiert werden, indem die ersten und zweiten Schichten konstant gehalten werden und man das radiomarkierte
Anti-IgE in der dritten Schicht vergleicht. Das standardisierte radiomarkierte Anti-IgE
könnte dann dazu verwendet werden, das RAST-Verfahren selbst zu standardisieren. Eine Standardisierung
von Anti-IgE-RAST mit standardisiertem radiomarkierten Anti-IgE wäre nützlich, indem ein
Standardreagenz verwendet werden könnte, ungeachtet des in der ersten Schicht vorliegenden Allergenextraktes.
Da jedoch die Reagentien, die in den ersten zwei RAST-Schritten verwendet werden, komplexe
Gemische von schlecht definierter Stabilität darstellen, ist es schwierig, diese Schritte von einem
Experiment zum nächsten präzise zu reproduzieren. Da es auch Schwierigkeiten bereitet, die Aktivität von
radiomarkierten Anti-IgE-Proben präzise zu definieren, kennte dieses Reagenz nicht ohne weiteres als
Referenzstandard verwendet werden.
Wie bereits im vorhergehenden ausgeführt, stellt die Radioimmunobestimmung ein wichtiges Beispiel
eines Bindungstestes unter Verwendung einer markierten Verbindung dar, wie z. B. die Radioallergosorbent-(RAST)-Verfahren.
Alternative markierte Materialien, die ebenfalls vorgeschlagen wurden, sind
freie Radikale, fluoreszierende Moleküle, lumineszierende Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme
oder Enzyminhibitoren. Es bestehen ähnliche Schwierigkeiten zur Definition der Aktivität eines
jeglichen markierten Materials, ungeachtet des Materials, gegen das es gerichtet ist, oder des Typs der verwendeten
markierten Verbindung.
Ceska undLundvkist beschreiben in »Immunochemistry«,
2 (1972), Seiten 1021-1030 einen dreischichtigen Festphasen-Test für nicht-spezifisches
IgE. Die erste Schicht besteht aus nichtmarkiertem Anti-IgE; die zweite Schicht ist das untersuchte IgE
und die dritte Schicht besteht aus markiertem Anti-IgE. Dieses Verfahren kann nicht dazu verwendet
werden, markierte Bestandteile zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest zu standardisieren,
da das Festphasen-Anti-IgE der ersten Schicht teilweise sterisch die darauffolgende Bindung des markierten
Anti-IgE der dritten Schicht hindert. Eine stetische Hinderung tritt dann ein, wenn das Festphasen-Anti-IgE
der ersten Schicht einige Moleküle IgE auf eine solche Weise bindet, daß diese zur Bindung
des markierten Anti-IgE der dritten Schicht nicht verfügbar sind. Eine sterische Hinderung ist bei spezifischen
Bindungstest-Verfahren unerwünscht.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente,
welche in einem spezifischen Bindungs-Testverfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen
Liganden-Referenzstandard zur Verfügung zu stellen. Verbunden mit dieser Aufgabe ist die Verwendung
der standardisierten markierten Bindungskomponente zur Bestimmung der Allergenwirksamkeit und
zur Bestimmung der Menge des in Körperflüssigkeiten vorliegenden Liganden.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst.
In den Patentansprüchen 2 und 3 sind vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens und in den Patentansprüchen
4 und 5 bevorzugte Verwendungen einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren standardisierten
markierten Bindungskomponente beschrieben.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert.
Fig. 1 stellt eine Standardkurve (aufgetragen auf logit gegen log-Achsen) zur Bestimmung der IgE-Menge,
ausgedrückt in World Health Organization-(WHO)-Einheiten;
Fig. 2 ist eine Kalibrierungskurve der Bindung von 125I-markiertem Anti-IgE an IgE auf Anti-L-Ketten-Scheiben;
Fig. 3 stellt grafisch eine Titration von atopischen
Seren auf Allergen-Scheiben zur Bestimmung der für den Versuch erforderlichen Verdünnung des Serums
dar; die Kapazität der Scheibe (Δ) beträgt 170 X ΙΟ'3 U IgE;
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung eine Titration
von zwei verschiedenen Allergenextrakten durch spezifische Bindungstest-Inhibierung, unter Verwendung
eines atopischen Serums; (AE) = 170 X 10~3 U IgE;
und
Fig. 5 stellt eine schematische Darstellung der Bestimmung der Allergenwirksamkeit gemäß der Erfindung
dar.
Wie im vorangehenden erläutert, besitzen Antikörper-Moleküle
am Ende des Moleküls ein Antigen-Bindungsverrnögen, das als Antigen-Bindungsfragment
(Fab) bezeichnet wird; diese Eigenschaft ist spezifisch in bezug auf die Bindung spezifischer Antigene.
Am anderen Ende des Moleküls, das als Fc bezeichnet wird, werden keine Antigene gebunden.
Bei spezifischen Bindungs-Testverfahren, welche Radioisotope einschließen, binden die IgE-Antikörper
an das Antigen über den Fab -Bereich, wobei der Fc-Bereich frei bleibt. Während der zweiten Inkubation
mit dem radiomarkierten Anti-IgE bindet das Anti-IgE an den freigebliebenen Fc-Bereich des
IgE-Moleküls. Um in diesen Tests eine richtige Funktion
zu gewährleisten, muß das markierte Anti-IgE auf eine Weise standardisiert werden, die weitgehend
die Aktivität des markierten Anti-IgE im Test simuliert. Dieses »Simulierungs«-Erfordemis bedeutet,
daß aufgrund der Tatsache, daß die spezifische Bindungs-Testmethode, z. B. RAST, oder Methoden, die
andere Markierungssubstanzen, wie Enzyme, verwenden, sterisch verhältnismäßig ungehindert sind,
die Verfahren zum Standardisieren von markiertem Anti-IgE sterisch ebenfalls relativ ungehindert sein
sollten. Das vorliegende Standardisierungsverfahren unter Verwendung von Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern,
die an ein Festphasen-Substrat gebunden sind, erfüllt dieses Simulierungserfordernis.
Bei der erfindunsgemäßen Methode können verschiedene markierte Substanzen in spezifischen Bindungs-Testverfahren
verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen Radioisotope und Enzyme.
Der markierte Bestandteil kann in sämtlichen dreischichtigen, spezifischen Bindungs-Testverfahren
verwendet werden. Bevorzugte Ausführungen hinsichtlich der Verwendung umfassen die Standardisierung
von Allergenextrakten und die Bestimmung oder den Nachweis eines Liganden in einer Körperflüssigkeit.
Diese Liganden umfassen Antikörper, z. B. Ig, und Proteine. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt
der Nachweis oder die Bestimmung von IgE in atopischem Serum dar.
Beim Standardisierungsverfahren gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird radiomarkiertes
Anti-IgE gegen IgE standardisiert. IgE wird wiederum gegen einen IgE-Referenzstandard standardisiert,
wie z. B. ein Standard-IgE-Referenzserum, welches von der World Health Organization (WHO)
erhältlich ist und das als IgE (69/341) bezeichnet wird und 10000 WHO-Einheiten pro ml enthält.
Verfahren zur Standardisierung von
radiomarkiertem Anti-IgE
radiomarkiertem Anti-IgE
Wie nachfolgend unter (A) beschrieben, wurde IgE mit Na131I radiomarkiert. Die emittierte Strahlung
wurde gemessen. Die Beziehung zwischen der von 131I
radiomarkiertem IgE emittierten Strahlung und der Menge an vorliegendem IgE-Protein in dem radiomarkierten
IgE wurde, wie nachfolgend beschrieben, durch eine Doppel-Antikörper-Methode nach
Gleich et al (J. Lab. din. Invest., 77 [1971], Seiten 690-698) beschrieben unter Bezugnahme auf eine
aufgestellte Standardkurve unter Verwendung des WHO-IgE-Referenzserums bestimmt, wobei die
Konzentration des radiomarkierten IgE-Proteins in WHO-Einheiten ausgedrückt ist.
Die Standardkurve wurde nach der Doppel-Antikörper-Methode aufgestellt, wobei eine kompetitive
Flüssigphase-Inhibierung einer Reaktion zwischen !25I-radiomarkiertem IgE und nicht-markiertem Kaninchen-Anti-IgE
mit zunehmenden Konzentrationen an WHO-IgE-Referenzserum genutzt wurde. Das
131I-radiomarkierte IgE ersetzte in dem Inhibitionstest
das WHQ-Referenzserum. Die Fähigkeit von 131I-Tadiomarkiertem
IgE die Bindung von 125I-radiomarkiertem IgE an nicht-markiertes Kaninchen-Anti-IgE
zu inhibieren, wurde, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve, mit der Inhibitionsfähigkeit des
WHO-IgE-Referenzserums in dem gleichen Test verglichen und die Konzentration von IgE in 1MI-radiomarkiertem
IgE-Präparation aufgestellt.
Jod-125-radiomarkiertes IgE, das im Handel von
Pharmacia, London, erhältlich ist, wurde mit nichtmarkiertem Anti-IgE, das im Handel von Behring
Werke AG, erhältlich ist., in Gegenwart zunehmender Mengen an WHO-IgE-Referenzserum umgesetzt unier
Bildung einer Reihe von 125I-radiomarkierten
IgE-Anti-IgE-Komplexen. Da es erforderlich ist,
diese Komplexe von dem löslichen, nicht-umgesetzten i:5I-radiomarkierten IgE abzutrennen, wurden sie
durch Zugabe von Esel-Anti-Kaninchen-Immunoglobulin-Serum,
das im Handel von Wellcome Laboratories erhältlich ist, präzipiticit.
Die von 125I-radiomarkiertem IgE emittierte Strahlung, welches in der Reihe von Komplexen vorlag, wurde bestimmt und eine Standardkurve aufgestellt. Die Konzentration des in der '"I-IgE-Präparation enthaltenen IgE-Proteins wurde aus der Standardkurve direkt in WHO-Einheiten bestimmt, wobei die 125I-Werte um die Impulse korrigiert wurden, die von dem 131I-Isotop überlappen. Eine Standardkurve (aufgetragen in logit gegen log-Achsen) zur Bestimmung der Menge an IgE in WHO-Einheiten, wird in
Die von 125I-radiomarkiertem IgE emittierte Strahlung, welches in der Reihe von Komplexen vorlag, wurde bestimmt und eine Standardkurve aufgestellt. Die Konzentration des in der '"I-IgE-Präparation enthaltenen IgE-Proteins wurde aus der Standardkurve direkt in WHO-Einheiten bestimmt, wobei die 125I-Werte um die Impulse korrigiert wurden, die von dem 131I-Isotop überlappen. Eine Standardkurve (aufgetragen in logit gegen log-Achsen) zur Bestimmung der Menge an IgE in WHO-Einheiten, wird in
is Fig. 1 dargestellt. Vor der Zugabe des WHO-IgE-Referenzserums
kann die Bindungsreaktion zwischen 1 "l-radiomarkieriern-IgE-Kaninchen-Anti-IgE als
100% angenommen werden.
Gemäß Fig. 1 waren bei 50% Inhibierung der Bin-
2" dung etwas mehr als 10' WHO-Einheiten IgE pro ml
zu den Komplexen zugegeben worden.
Der oben beschriebene Doppel-Antikörper-Test ergab die folgenden Ergebnisse. Es wurde festgestellt,
daß eine l-radiomarkierte IgE-Präparation 224
WHO-Einheiten IgE/ml (22,4 μ IgE 0,01 ml"1) enthielt.
Die von einer 131I-IgE-Probe emittierte Strahlungwaräquivalent
450000 cpm. Die Strahlung jeder in der radiomarkierten Präparation enthaltenen IgE-Einheit
wurde zu 20000 cpm errechnet.
3d Es gibt alternative Methoden zur Doppel-Antikörper-Methode
nach Gleich zur Bestimmung der IgE-Menge in WHO-Einheiten, wie z. B. die Methode
von Ceska und Lundvkist (Immunochemistry, 2 [1972], Seiten 1021-1300).
Wie nachfolgend unter (B) beschrieben, wurde Anti-IgE mit '"I radiomarkiert. Die von dem Anti-IgE
emittierte Strahlung unterschied sich von der von '■'I-radiomarkiertem IgE emittierten Strahlung. Die
Identität der radioaktiven Isotope ist nicht wesentlich,
4« solange die Radioaktivität unterscheidbar ist.
Aktivierte Substrate in Form von Scheiben bzw. Platten wurden in Kontakt mit Anti-Human-L(leicht)-Ketten-Antikörper,
wie unter (D) beschrieben, gebracht. Diese Scheiben wurden dann mit un-
terschiedlichen Konzentrationen an 131I-radiomarkiertem
IgE etwa 3 Stunden lang bei 20° C inkubiert. Die überschüssigen Reagentien wurden entfernt und
die Scheiben 4mal mit l%igem Detergenz, z. B. »TWEEN«, im Handel erhältlich von Sigma Chemical,
St. Louis, Missouri, in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Scheiben wurden dann 17
Stunden lang mit i:5I-radiomarkiertem Anti-IgE inkubiert,
wobei ein Substrat gebildet wurde, welches ein dreischichtiges Festphasen-Produkt gebunden
hatte.
Nach dem Waschen wurde die Radioaktivität von 131I-IgE und 125I-Anti-IgE gleichzeitig in einem Gammazähler
bestimmt. Die Menge an IgE-Protein in dem 13lI-radiomarkiertem IgE, direkt ausgedrückt in
WHO-IgE-Einheiten, im Verhältnis zur 131I-Radioaktivität
wurde zuvor bestimmt. Die 125I-Anti-IgE-Impulse,
korrigiert um ein Überlappen von 131I-Impulsen,
wurden die IgE-Einheiten, die an den Scheiben gebunden waren, wie aus den 131I-Impulsen
bestimmt, aufgetragen. Dies ergab die in Fig. 2 gezeigte Kalibrierungskurve, durch die das an die aktivierte
Scheibe gebundene IgE in Beziehung zur anschließenden Bindung von radiomarkiertem Anti-IgE
gebracht werden kann. Somit ist das Verhältnis zwischen der durch radiomarkiertes Anti-IgE emittierten
Strahlungsmenge, der an das radiomarkierte Anti-IgE gebundene IgE-Proteinmenge und der Menge an
IgE-Protein in WHO-Einheiten bekannt. Das radiomarkierte
Anti-IgE wird in WHO-Einheiten standardisiert, da das wirkliche Gewicht eines Liganden (z. B.
IgE) aus der Menge des an diesen gebundenen markierten Bestandteils bestimmt werden kann.
Das standardisierte, radiomarkierte Anti-IgE kann in den verschiedenen Modifikationen von spezifischen
Bindungstest-Verfahren, wie sie eingangs beschrieben wurden, verwendet werden, um die Menge an IgE, die
an ein aktiviertes Substrat gebunden ist, zu bestimmen, ungeachtet der verwendeten markierten Substanz.
Herstellung von Materialien zum Standardisieren
von radiomarkiertem Anti-IgE
von radiomarkiertem Anti-IgE
(A) Radiomarkiertes IgE
Gereinigtes IgE (welches weniger als 0,6% IgG enthielt) wurde mittels Ionenaustausch- und Gelchromatografie
aus IgE-Myloma-Serum hergestellt. Das IgE wurde mit Na111I radiomarkiert.
Die Radiomarkierung wurde durchgeführt, indem etwa 0,025 ml 0,5M Phosphatpuffer (pH = 7,5) zu
10 μΐ Na131I in einem Glasfläschchen zugegeben wurden.
Unmittelbar darauf wurden 5 μg IgE in 0,025 ml 0,05M Phosphatpuffer und 100 μg frisches Natriump-toluolsulfochloramin,
welches als Chloramin-T erhältlich ist, in 0,025 ml 0,05 M Phosphatpuffer zugegeben.
Nach jeder Zugabe wurde der Inhalt des Glasfläschchens vermischt. Sofort nach Zugabe
von Toluolsulfochloramin wurde 0,1 ml Natriummetabisulfit-Lösung (2,4 g/m!) in 0,05 M Phosphatpuffer
zugegeben, um eine spätere Jodierung zu vermeiden. Die nicht-umgesetzten Reagentien wurden
durch Leiten über Ionenaustauschharz entfernt. Der markierte IgE-Peak wurde gesammelt und mit
5%igem Humanserumalbumin in Phosphatpufferphys.-Kochsalz-Lösung
(PBS) auf 5 ml eingestellt und bei 20° C gelagert (Biochem. J. 89 [1963], Seiten
114-123).
(B) Radiomarkiertes Anti-IgE
Schaf-Anti-Human-IgE wurde durch Isolierung
Schaf-Anti-Human-IgE wurde durch Isolierung
des 7S-Peaks über eine G200-Chromatografiesäule gereinigt. Das spezifische Anti-IgE wurde mit Glyzerin/HCl-Puffer
(pH = 2,6) eluiert.
Ein Anteil von 10 με, dieser Anti-IgE-Präparation
wurde mit 1 mCi Na'-5I radiomarkiert.
Die Markierung erfolgte nach folgender Methode.
Das Markierungsverfahren wurde bei 4" C durchgeführt,
wobei in einem Eisbad vorgeküh'ue Reagentien verwendet wurden. Ein Anteil von 100 μg gereinigtem
Schaf-Anti-IgE in 100 ul 0,1M Phosphatpuffer (pH = 7,0) wurde in Glasfläschchen gegeben und
dazu 1 mCi Na125I zugegeben, worauf unmittelbar
50 μg Chloramin-T in 50 μΐ C, Wi Phosphatpuffer
(pH = 7,0) zugefügt wurden. Der Inhalt des Glasfläschchens wurde vermischt und die Reaktion 30 Minuten
lang bei 4° C fortgesetzt, wobei zwischendurch wieder vermischt wurde. Das Jodierungsgemisch
wurde durch Zugabe von 20 ug Natriummetabisulfit in 5 μΐ 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) neutralisiert.
Der Inhalt des Glasfläschchens wurde vermischt und das Reaktionsgemisch weitere 5 Minuten bei 4° C
stehen gelassen. 5 μΐ einer 5%igen Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung wurde zugegeben und der Inhalt
des Glasfläschchens auf eine Ionenaustauschharz-Säule aufgetragen, wodurch die nicht-umgesetzten
Reagentien abgetrennt wurden. Der radiomarkierte Protein-Peak wurde gesammelt und mit 5%
(BSA) in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (PBS) auf 5 ml eingestellt und bei
- 20° C gelagert.
Vor der jeweiligen Verwendung wurde die Anti-IgE-Präparation in PBS, das 20% normales Schaf-
Ki serum, 0,2% Rinderserumalbumin und 1 % Detergenz enthielt, verdünnt, um eine Arbeitslösung zu erhalten,
die 10h Impulse pro Minute/ml ergab.
(C) Aktiviertes Substral
Papierscheiben (5 mm Durchmesser) wurden aus
is Filterpapier ausgestanzt und mit Cyanogenbromid wie
folgt aktiviert.
Geeignetes Filterpapier ist z. B. Whatman Nr. 54. Die Substrate, die hier als »Scheiben« bezeichnet
werden, wurden etwa 30 Minuten lang in destilliertes
2u Wasser eingetaucht und eine wäßrige 5%ige BrCN-Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde in ein Wasserbad
mit einer Temperatur von etwa 20° C gegeben und ca. 5 Min. lang gerührt. Während des Rührens
wurde der pH im Bereich von 10,5 bis 11,0 gehalten, indem tropfenweise 2M NaOH zugegeben wurde. Das
Gemisch wurde dann in etwa 2 1 0,005M NaHCO3-Lösungvon4°
C gegossen und weiter vermischt. Der Überstand wurde dekantiert und die Scheiben wiederholt
mit 0,005M NaHCO3 von 4° C und dann mit 500-ml-Anteilen Aceton (4° C) gewaschen, an der
Luft getrocknet und bei — 20° C gelagert.
(D) Anti-Human-L(leicht)-Ketten- Antikörper, die an ein aktiviertes Substrat gekoppelt sind.
Antikörper bestehen aus Pcptidketten, die als L(leicht)-Ketten und H(schwer)-KeUen bezeichnet
werden. Die leichten Ketten besitzen ein Molekulargewicht von etwa 20000; die schweren Ketten haben
ein Molekulargewicht von etwa 50000. Obwohl die leichteren Ketten von gereinigten Antikörpern weit-
4(i gehend heterogen sind, sind die leichten Ketten der
Myelomaproteine (lymphoider Tumor im menschlichen Knochenmark) homogen. Patienten, die an
Myeloma leiden, scheiden ein einheitliches, homogenes Protein, das als Bence-Jones-Protein bezeichnet
wird und welches aus homogenen leichten Ketten besteht, aus.
Anti-Human-L-Ketten-Antikörper werden hergestellt und, wie nachfolgend beschrieben, an die aktivierten
Substrate gemäß (C) gekoppelt. Antikörper,
5(i die spezifisch auf das Bence-Jones-Protein sind, sind
als eine Immunoglobulinfraktion von Kaninchen-Antiseren erhältlich. Anti-Human-L-Ketten-Antikörper
wurden au die gemäß (C) aktivierten Substrate ge koppelt, indem die Antikörper mit den Substraten
etwa 1 Stunde lang bei etwa 5° C inkubiert wurden. Die nicht-umgesetzten Gruppen wurden mit /S-Äthanolamin-Lösung
blockiert, indem etwa 1 ml ß-Äthanolamin-Lösung (0,05M in 0,1 M NaHCO3) zugegeben
wurde. Das Gemisch wurde in einem mechanischen Schüttler (100 Upm) 3 Stunden lang
geschüttelt. Die Lösung wurde entfernt und die Scheiben nacheinander mit einer 2,5 ml-Portion 0,1 M
NaHCO3, drei 2,5-ml-Portionen 0,1 M Acetatpuffer
(pH 4,0) und drei 7,5-ml-Portionen PBS gewaschen.
es Die Anti-L-Ketten-Scheiben wurden unmittelbar
nach ihrer Herstellung verwendet.
(E) WHO-IgE-Referenzserum
Das Serum ist von der World Health Organization
erhältlich. Das hier verwendete Referenzserum wurde
als IgE (69/341) bezeichnet und enthielt 10000 WHO-Einheiten (LI) pro ml.
Spezifisches Bindungstest verfahren
Herstellung von Materialien:
(F) Ätiiigei]-(Ai!ergen)-Exu akie
Allergenextrakte aus zwei Chargen Dactylis glo-
Allergenextrakte aus zwei Chargen Dactylis glo-
merata-Pollen (Cocksfoot/Orchard) (F/75 und M/76) wurden als gefriergetrocknete Präparationen bei
-20° C gelagert.
(G) Substrat-Antigen
Der Blutenstaub- bzw. Pollen-Extrakt M'76 nach
(F) wurde wie folgt in das in (C) aktivierte Substrat gekoppelt.
4 ggefriergetrockneter Blütenstaub-Extrakt wurde in i 1 pliosphaigepuffeüc physiüiügische Kochsalzlösung
(pH 7,2) eingebracht. Der Allergenextrakt wurde wie folgt an die aktivierten Papierscheiben gebunden.
Etwa 100 g aktivierte Papierscheiben (etwa 50000 Scheiben) wurden mit 4 g rekonstituienem
Pollen-Extrakt unter 20stündigem mechanischen Rühren inkubiert. Die nicht-umgeseizte Pollen-Fxtrakt-Lösung
wurde durch Dekantieren entfernt. Die nicht-umgesetzten Gruppen wurden mit ! 1 0.05M
/3-Äthanolamin innerhalb von 3 Stunden blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Scheiben sukzessive
mit 1 1 0,1M NaHCO,. drei 1-1-Poitionen von 0.1M
Acetatpuffer (pH 4,2) und vier 1-1-Portionen PBS gewaschen.
Die gewaschenen Scheiben wurden in 0,5-g-Anteile aufgeteilt und vor dem Lagern bei — 2')c C
gefriergetrocknet.
(H) Atopische Seren
Es wurde eine Arbeitslösung de^ verwendeten Serums,
das als IgE-Quelle dien;, gewühlt, welche die
gewünschte IgE-Bindungbei der Bestimmung der Allergen-Wirksamkeit
gewährleistet Die Arbeitslösung wurde wie folgt bereitet
Reihenveidünnungen von atopischen Seren wurden
mit einer Reihe von aktivierten Substraten, an die ein Antigen gebunden war [hergestellt wie unter
(G) beschrieben] inkubiert. Nach dem Waschen mit einer 1 %igen Detergenziösung in physiologischer
Kochsalzlösung wurden die Scheiben mit verdünntem radiomarkierten Anti-IgE, welches wie im Standardisierungsverfahren
beschrieben hergestellt wurde, inkubiert. Das gebildete Produkt stellte ein aktiviertes
Substrat mit einem Antigen dar; IgE und radiomarkiertes Anti-IgE waren gebunden.
Es wurde eine parallele Inkubation mit Anti-L-Ketten-aktivierten Scheiben angesetzt. Es wurde nach
dem beschriebenen früheren Verfahren, auf welches im fogenden eingegangen wird, gearbeitet, um eine
Kalibrierungskurve zu erhalten, in welcher die radioaktiven Impulse des radiomarkierten Anti-IgE gegen
die an die Scheiben gebundenen IgE-Einheiten aufgetragen wurden, wie dies aus den radioaktiven Impulsen
des radiomarkierten IgE bestimmt worden war. Die Anti-L-Ketten-aktivierten Scheiben, welche radiomarkienes
'11I-IgE gebunden hatten [wie unter
(D) beschrieben hergestellt] wurden mit radiomarkiertem Anti-IgE inkubiert. Nach dem Waschen
wurde die von diesen Scheiben emittierte Strahlung in einem Gammazähler gemessen. Wie nachfolgend
erläutert, wurde eine Dosis-Impuls-Kurve aufgestellt, um die Arbeitsverdünnung eines jeden Serums, das
die gewünschte IgE-Bindung gewährleistete, zu ermitteln.
Es wurde eine Titration von drei Seren durchgeführt. Ein Serum bestand aus einem Pool von Seren
von 30 bestimmten atopischen Patienten, die alle gegenüber Graspollen empfindlich waren. Das zweite
und dritte Serum wurde von individuellen Patienten erhalten und mit M.D. und C.W., die beide gegen
Graspollen empfindlich waren, bezeichnet.
Um in bezug auf die Inhi'uierung genaue Ergebnisse
zu erhalten, muß die Konzentration des Patientense-
Hi rums (IgE-Quelle) unterhalb der Konzentration liegen,
die eine Sättigung des aktivierten Substrates bewirken würde. Um die Konzentration des zu verwendenden
Serums zu bestimmen, wurden verschiedene atopische Seren mit aktivierten Substraten titriert. Es
wurde eine Kurvenfamilie für die IgE-Bindung erhalten, wie dies in Fig. 3 aufgezeigt wird. Die erforderliche
Verdünnung wurde dadurch erhalten, daß die Konzentration bestimmt wurde, welche ein willkürlich
bestimmtes Standardniveau der IgE-Bindung ergibt,
:» welche als Kapazität des aktivierten Substrates bezeichnet
wird (Δ). Der Wert Δ liegt im allgemeinen in der Größenordnung von 50 bis 70% der maximalen
Bindung des Substrates; in der vorliegenden Erfindung wird .Α als 170 x 10-' U (WHO-Einheiten) IgE
definiert, da festgestellt wurde, daß dies das optimale Niveau zur Durchführung der Versuche darstellte.
Verfahren zur Bestimmung der Allergen-Wirksamkeit (Fig. 5)
i>i Die Bestimmung der Wirksamkeit des Dactylisglomerata-Allergens
wurde, wie nachfolgend beschrieben, durchgeführt. Die Allergenextrakte von (F) wurden in 1 ir.l Inkubationspuffer (1% BSA) 1%
Detergenz in PBS rekonstituiert und in diesem Puffer eine Reihe von Verdünnungen hergestellt. Ein
100 μΐ-Anteil des verdünnten Extraktes wurde mit
0,1 ml atopischem Serum 2 Stunden lang bei 20° C in flachen Schalen inkubiert. Die atopischen Seren
wurden wie im vorangehenden beschriebenen verdünnt, so daß die Serumkonzentration unterhalb der
für die Sättigung der aktivierten Scheiben erforderlichen Konzentration lag. Ein Substrat-Antigen
(Scheibe) wie dieb in (G) hergeblein worden war, wurde zu dem Serum-Allergen-Reaktionsgemisch gegeben
und mit dem Gemisch weitere 3 Stunden lang inkubiert. Die flüssigen Reagentien wurden abgesaugt
und das Substrat-Antigen-IgE-Produkt mit vier 1-ml-Portionen
einer 1 %igen Detergenz-Salin-Lösung gewaschen. Das standardisierte radiomarkierte
5(i Anti-IgE wurde dann zu dem Substrat-Antigen-IgE-Produkt
unter Bildung eines dreischichtigen Festphasen-Produktes zugegeben. Die von dem radiomarkierten
Anti-IgE emittierte Strahlung wurde bestimmt und die entsprechenden Impulse auf das Gewicht der
IgE-Bindung an das Anti-IgE unter Bezugnahme auf die Kalibrierungskurve in Fig. 2 umgerechnet.
Aktivierte Substrate wurden mit Anti-L-Ketten-Antikörpern,
wie in (D) beschrieben, inkubiert. Die Scheiben wurden dann mit variierenden Konzentra-
Wi tionen an radiomarkiertem IgE 3 Stunden lang bei
20° C inkubiert. Die überschüssigen Reagentien wurden entfernt und die Scheiben 4 Stunden lang mit einer
l%igen Detergenziösung in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Scheiben wurden dann
etwa 17 Stunden lang mit radiomarkiertem Anti-IgE [hergestellt wie in (B) beschrieben], inkubiert.
Wie im vorangehenden beschrieben, wurde aus der Bestimmune des radiomarkierten IeE, in Korrelation
mit dem WHO-IgE-Referenzserum, eine Standardkurve konstruiert (Fig. 1). Diese Kurve dient dazu,
die Konzentration des in dem radiomarkierten IgE vorliegenden IgE zu berechnen. Ausgehend von einer
bekannten Konzentration an radiomarkiertem IgE wurde dann die exakte Menge der IgE-Bindung an
Anti-L-Ketten-Scheiben aus der emittierten Strahlung berechnet. Da die Menge an gebundenem IgE
bekannt ist, können die ' ""!-Impulse des radiomarkierten
Anti-IgE, welches durch nachfolgende Inkubation mit radiomarkiertem Anti-IgE gebunden
wurde, mit der exakten Menge an vorliegendem radiomarkiertem IgE korreliert werden und es
kann eine Kalibrierungskurve aufgestellt werden (Fig. 2).
Wie im vorhergehenden zum RAST-Verfahren beschrieben
und erläutert, bedeutet in den spezifischen Bindungstest-Inhibierungstest-Verfahren, daß, wenn
die Menge an löslichem Antigen, das zu einem Festphasen-aktivierten Substrat-Antigen-IgE-Komplex
zugegeben wird, zunimmt, das Gewicht der IgE-Moleküle, welche an das Festphasen-Antigen gebunden
sind, abnimmt, und die prozentuale Bindung von Anti-IgE an Festphasen-Antigen (über das IgE) abnimmt.
Allergenextrakte können dann hinsichtlich ihrer relativen Wirksamkeit verglichen werden, indem
man die Menge des für eine 50%ige Inhibierung erforderlichen Extraktes ermittelt und miteinander vergleicht.
In der beschriebenen Methode wird die Scheiben kapazität für die IgE-Bindung mit Δ bezeichnet, dii
gebundenen IgE-Moleküle werden mit b bezeichne
bei einer beliebigen gegebenen Allergenkonzentration, das Gewicht des IgE, das keine Bindung einge
hen konnte, wird daher mit dem Ausdruck Δ -b angegeben. Bei bestimmten Allergenkonzentrationen is
die IgE-Bindung an die Scheibe in Gegenwart des A lergenextraktes vollständig inhibiert. Fig. 4 zeigt, daß
mit zunehmender Menge an zugegebenem Allergenextraki
die IgE-Menge, die keine Bindung eingeh {Λ-b) ebenfalls zunimmt.
Fig. 4 zeigt, daß die maximale Antikörper-Menge die von einer Bindung ausgeschlossen ist, durch zunehmende
Mengen an zugegebenem Allergenextrakt in der Nähe von 170 X 1(T3 U IgE liegt. Die Titratioi
eines bestimmten Serums unter Verwendung de: standardisierten markierten Anti-IgE erlaubt es daher,
die Allergen-Wirksamkeit in Form einer Bindungsinhibierung als IgE-Standardeinheiten, z. B. a
U IgE, auszudrücken.
Hierzu 5 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem
spezifischen Bindungstest-Verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Referenzstandard,
gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
a) Inkubieren von Festphasen-Substraten, an welche Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörper
gebunden sind, mit variierenden Konzentrationen eines markierten Liganden, dessen
Markierung von derjenigen der zu standardisierenden markierten Bindungskomponente
verschieden ist, wobei die Menge des im markierten Liganden vorliegenden Ligandenproteins
einer bekannten Menge des Liganden-Referenzstandards äquivalent ist;
b) Inkubieren der im Schritt a) gebildeten Festphasen-Produkte mit der markierten Bindungskomponente,
wodurch die markierte Bindungskomponente an den markierten Liganden gebunden wird;
c) Messen der im Schritt b) gebildeten Produkte und Bestimmung der Menge des markierten
Liganden und der markierten Bindungskomponente.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Markierungssubstanzen
Radioisotope, freie Radikale, fluoreszierende Moleküle, lumineszierende Moleküle,
Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme und/ oder Enzyminhibitoren darstellen.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß markiertes Anti-Ig gegen
Ig-Referenzserum standardisiert wird.
4. Verwendung einer gemäß Anspruch 1 standardisierten markierten Bindungskomponente in
einem spezifischen Bindungstest-Verfahren, welches die Bindung einer markierten Bindungskomponente
an einen Liganden umfaßt, welcher seinerseits an ein Festphasen-Substrat gebunden
wird.
5. Verwendung einer gemäß Ansprüchen 1 bis 3 standardisierten markierten Bindungskomponente
in einem spezifischen Bindungstest-Inhibitions-Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit
eines Allergenextraktes, welches die Bindung von IgE und einem markierten Bestandteil umfaßt.
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