DE2615092A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von antigenen substanzen und testpackung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung von antigenen substanzen und testpackung zur durchfuehrung des verfahrens

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DE2615092A1 DE19762615092 DE2615092A DE2615092A1 DE 2615092 A1 DE2615092 A1 DE 2615092A1 DE 19762615092 DE19762615092 DE 19762615092 DE 2615092 A DE2615092 A DE 2615092A DE 2615092 A1 DE2615092 A1 DE 2615092A1
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Description

"Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen und Testpackung zur Durchführung des Verfahrens"
Priorität: 10. April 1975, Japan, Hr. 42803/75
Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Die Bestimmung von antigenen Substanzen, wie Imtnunoglobulin, Albumin, Ot1-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobin und Komplementkomponenten, spielt bei der Diagnose und Behandlung von verschiedenen Krankheiten eine wichtige Rolle.
Zur quantitativen Bestimmung dieser Substanzen sind Verfahren bekannt, die sich der einfachen Diffusion in Platten oder Röhrchen bedienen. Die einfache Diffusion in Platten wird im allgemeinen
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durchgeführt, indem man eine Trägerplatte aus Agargel herstellt, die einen für eine zu bestimmende antigene Substanz (Antigen) spezifischen Antikörper enthält, die antigene Substanz
in ein kleines Loch in der Gelplatte bringt, die Platte bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit stehenläßt, um eine Diffusion der antigenen Substanz durch die Gelplatte und eine Reaktion mit dem Antikörper zu ermöglichen, und die Größe des iings um das Loch gebildeten weißen Präzipitatrings (Reaktionsprodukt) mißt.
Die einfache Diffusion in einem Röhrchen wird durchgeführt, indem man eine antigene Substanz auf ein in einem Glasröhrchen befindliches Agargel, das einen Antikörper enthält, bringt. Innerhalb dieses Röhrchens reagiert dann das Antigen mit dem Antikörper. Bei diesem Verfahren diffundiert das Antigen in das Gel von oben nach unten und bildet eine scharfe Präzipitatbande (Reaktionsprodukt). Die Bewegung der Bande kommt an der Stelle zum Stillstand, wo das System seinen Gleichgewichtszustand erreicht. Die Antigenmenge wird bestimmt, indem man den Abstand zwischen dem oberen Ende des Gels und der endgültig gebildeten Bande mißt.
Diese Verfahren haben jedoch den Fachteil, daß für die Diffusion und die Beendigung der Reaktion eine lange Zeit erforderlich ist, im allgemeinen 1 bis 2 Tage. Ferner ist eine weitere Zeitspanne" von 1 bis 2 Tagen abzuwarten, wenn die Probe das Antigen in einer
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Menge enthält, die über dem einwandfrei meßbaren Bereich liegt. Außerdem ist es bei Anwendung dieser Verfahren nicht einfach, genaue Werte zu erhalten, da die Bestimmung durch visuelle Beobachtung mit Hilfe eines Vergrößerungsglases durchgeführt wird.
Ferner ist zusätzlich zu den vorgenannten Verfahren auch ein turbidimetrisches Verfahren bekannt. Bei diesem Verfahren wird die Beziehung zwischen den Mengen an Antigen und Präzipitat ausgenützt. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, daß man bei der Präzipitationsreaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper bei konstanter Antigenmenge eine in Fig. 1 gezeigte Kurve erhalten kann. Obgleich die Antigenmenge gemäß diesem Verfahren durch Trübungsmessung des Reaktionsgemisches bestimmt werden kann,' ist eine Bestätigung der tatsächlichen Menge notwendig (X im Antigen-Mangelbereich und Y im Antigen-ÜberSchußbereich), da der Trübungswert für das Antigen zwei Werte liefert, nämlich X und Y. Dieser Test wird hier als "Bestätigungstest" bezeichnet. Aufgrund dieser Tatsache ist dieses Verfahren nicht dazu geeignet, eine große Anzahl von Proben innerhalb einer beschränkten Zeit zu untersuchen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von äntigenen Substanzen zur Verfügung zu stellen, bei dem die vorgenannten Nachteile vermieden werden und das für eine einfache und genaue Bestimmung der Menge an antigener Substanz geeignet ist, ohne daß ein Bestätigungstest erforder-
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man eine zu untersuchende Probe mit einer getrennt hergestellten, exogenen, antigenen Substanz, die mit der zu bestimmenden antigenen Substanz identisch ist, in einer zur Erzielung der maximalen Präzipitation bei der Umsetzung mit dem verwendeten Antikörper ausreichenden Menge oder in einer im Verhältnis dazu leicht überschüssigen Menge versetzt, das erhaltene Gemisch zur Auslösung der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem für die zu bestimmende antigene Substanz spezifischen Antikörper versetzt und die Menge des gebildeten Präzipitats turbidimetrisch bestimmt.
Erfindungsgemäß wird die Menge an antigener Substanz unter ausschließlicher Verwendung der Kurve im Überschußbereich an antigener Substanz verwendet, d.h. die letzte Hälfte der in Fig. 1 gezeigten Standardkurve ausgehend vom Punkt Z. Somit ist es nicht notwendig, einen "Bestätigungstest" durchzuführen.
In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchgeführt: Sin Antikörper und eine Probe mit einem Gehalt an antigener Substanz werden getrennt mit einem Puffer, beispielsweise Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer oder Veronalpuffer, die jeweils Kochsalz enthalten, auf Konzentrationen verdünnt, die jeweils für die Antigen-Antikörper-Reaktion und für die anschließende turbidimetrische Messung der Probe geeignet sind. Die getrennt hergestellte, exogene, antigene Substanz ' wird ebenfalls mit dem gleichen Puffer auf eine Konzentration
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verdünnt, bei der eine Messung leicht durchführbar und eine maximale Präzipitation erzielbar ist. Die verdünnte antigene Substanz wird mit verdünnter exogener, antigener Substanz versetzt. Das erhaltene Gemisch wird mit verdünntem Antikörper vermischt, worauf die Antigen-Antikörper-Reaktion bei Temperaturen von 10 bis 40 C, vorzugsweise 20 bis 37°C, eine vorbestimmte Zeit stattfindet. Die Menge an antigener Substanz kann turbidimetrisch bestimmt werden, indem man die Menge an Präzipitat mißt und mit einer vorher erhaltenen Standardkurve vergleicht. Bei der Aufstellung der Standardkurve werden die gleichen Antikörper- und Standardantigenlösungen von verschiedenen bekannten Konzentrationen verwendet.
Dieses Verfahren läßt sich auf alle Arten von antigenen Substanzen anwenden, beispielsweise auf Immunoglobuline, wie IgG-, IgA und IgM, Albumin, tf-i -Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobin und Komplementkomponenten, wie die Komplementkomponente C-,.
Das Diagramm von Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen den Mengen an der zu bestimmenden antigenen Substanz und dem gebildeten Präzipitat unter Verwendung eines herkömmlichen turbidimetrischen Verfahrens. Dabei ist die Konzentration des Antikörpers, der mit der antigenen Substanz reagiert, konstant.
Die Diagramme der Fig. 2 bis 8 zeigen Standardkurven zur Bestimmung von IgG, IgA, IgM, den Komplementkomponenten C,,Haptoglobin, Transferrin bzw. α^-Antitrypsin.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren gelingt eine einfache und genaue quantitative Bestimmung von antigenen Substanzen in kurzer Zeit.
Für praktische Zwecke ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Testpackung anzuwenden. Die Erfindung betrifft somit auch eine Testpackung, die aus folgenden Bestandteilen besteht:
(a) Eine Pufferlösung zur Verdünnung der zu bestimmenden Probe,
(b) eine getrennt hergestellte exogene, antigene Substanz in einer ausreichenden Menge, um bei der Reaktion mit dem Antikörper die maximale Fällung zu ergeben,
(c) eine Antikörperlösung, die auf eine zur Antigen-AntikörperReaktion geeignete Konsentration verdünnt ist und
(d) eine Reihe von Standardlösungen der antigenen Substanz, die jeweils verschiedene, bekannte Mengen an antigener Substanz enthalten.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
In Reagenzgläschen werden jev^eils 0,95 ml Serum, das 11 Wg IgG-
^ gegeben
(exogene, antigene Substanz) enthalt,/. Diese Menge an IgG- ergibt bei der Reaktion mit dem Antikörper die maximale Präzipitatinenge. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an IgG und .jeweils mit 1 ,0 ml
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verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 60-fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches in den einzelnen Röhrchen beträgt jeweils 2 ml. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz IgG und dem gebildeten Präzipitat ist in Fig. 2 zu sehen.
Beispiel 2
30 Proben von jeweils 0,1 ml Humanserum, das mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 80-fache verdünnt ist, werden jeweils mit 0,9 ml (entsprechend 110 ^ug) IgG (exogene, antigene Substanz) versetzt und gründlich vermischt. Aus den Röhrchen werden jeweils 0,1 ml Gemisch entnommen und mit 1,0 ml auf das 60-fache mit dem gleichen Puffer verdünntem Antikörper und 0,9 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7j4 versetzt. Man läßt die Antigen-Antikörper-Reaktion bei 260C eintreten. Nach 30 Minuten wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Beim Vergleich der Ergebnisse mit dem Diagramm von Beispiel 1 ergibt sich als Durchschnittswert der 30 Proben ein Wert von 1307 mg/dl, was dem Normalwert von gesunden Personen entspricht.
Zur Ausbeutebestimmung wird eine Probe aus dem 30 Humanserumproben verwendet und mit bekannten Mengen an IgG versetzt. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt.
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IgG zugesetzt (mg/dl)
O 525
1 050
2 100
Tabelle
berechnet (mg/dl)
2 685
3 210
4 260
gefunden Ausbeute*
mg/dl (*)
2 160 _
2 800 104
3 280 102
4 200 99
* Ausbeute
gefundener Wert berechneter Wert
χ 100
Beispiel 3
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml "verdünntes Serum mit einem Gehalt an 1 7 ,ug IgA (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt die maximale Präzipitatmenge bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an IgA und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20-fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37 0 stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz IgA und dem gebildeten Präzipitat ist in Fig. 3 gezeigt.
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Bei der Ausbeutebestimmung gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse»
Beispiel 4
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 25 p-g IgM (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an IgM und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Veronalpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 30-fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37°G stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz IgM und dem Präzipitat ist in Fig. 4 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 5
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 18^g Komplementkomponente C^ (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben,
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Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen,, bekannten Mengen an der Komplementkomponente C, und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20-fache verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der antigenen Substanz Komplernen tkomponente C, und dem gebildeten Präzipitat ist in Fig. 5 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 6
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 15 Pg Haptoglobin (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die mariraale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standard!- sierte antigene Substanz) mit einem Gehalt an unterschiedlichen, bekannten Mengen an Haptoglobin und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20-fache Yolumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37°C
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stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz Haptoglobin und dem gebildeten Präzipitat ist in Pig. 6 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 7
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 14· ,Ug Trans f err in (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an Transferrin und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7»4 auf das 60-fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz Transferrin und dem gebildeten Präzipitat ist in Fig. 7 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
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Beispiel 8
30 Proben von jeweils 0,1 ml mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20-fache verdünntem Humanserum werden in Teströhrchen mit 1,0 ml (entsprechend 14 /ig) Transferrin (exogene, antigene Substanz) versetzt und gründlich vermischt. Sodann wird" das Gemisch mit 1,0 ml mit der gleichen Pufferlösung auf das 60-fache verdünntem Antikörper versetzt und die Antigen-Antikörper-Reaktion bei 37°C hervorgerufen. Nach 60 Minuten wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse werden mit dem gemäß Beispiel 7 erhaltenen Diagramm verglichen. Als Mittelwert der 30 Proben ergibt sich ein Wert von 291 mg/dl, was dem Normalwert für gesunde Personen entspricht
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 wird eine willkürlich gewählte. Probe aus den 30 Humanserumproben verwendet. Man erhält gute Ergebnisse.
Beispiel 9
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt ah 28 ;ug oc-i-Antitrypsin (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit einem Gehalt an unterschiedlichen, bekannten Mengen an cCj-Antitrypsin und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Veronalpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20-fache Volumen verdünnt
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ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz Ou-Antitrypsin und dem gebildeten Präzipitat ist in Fig. 8 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 10 -Herstellung einer Testpackung zur quantitativen Bestimmung von
Die Testpackung wird folgendermaßen hergestellt:
(a) Röhrchen mit Pufferlösung: 0,99 ml 0,001 m VeronalpufferKochsalzlösung vom pH-Wert 7,4.
(b) Röhrchen mit exogenem IgG: 0,98 ml Antiserum mit einem Gehalt an 11 ^g IgG. Diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge
(c) Flasche mit Antikörper: Antiserum, das mit 0,001 m Veronalpuff er vom pH-Wert 7,4 auf eine für die Antigen-Antikörper-
Reaktion geeignete Konzentration verdünnt ist.
(d) Eine Reihe von Standard-IgG-Lösungen: Seren, die IgG in Mengen von 2, 4, 6, 8 bzw. 10yUg/0,02 ml enthalten.
Diese Testpackung kann folgendermaßen verwendet werden: 0,01 ml Probe wird in das Röhrchen mit der Pufferlösung (a)
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Gemisches gegeben und gründlich -vermischt. Anschließend werden 0,02 ml des / in das Röhrchen mit dem exogenen IgG (b) gegeben. Sodann wird 1 ml aus dem Fläschchen mit Antikörper (c) entnommen und in das das Gemisch enthaltende Röhrchen gegeben. Man läßt die Antigen-Antikörper-Reaktion 60 Minuten bei 37°C ablaufen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt.
Das gleiche Verfahren wird unter Verwendung des Standardpuffers anstelle der Probe durchgeführt. Mit Hilfe der so gewonnenen Eichkurve wird die Menge an IgG bestimmt.
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Claims (3)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen, dadurch gekennzeichnet} daß man eine Probe mit einer getrennt hergestellten, exogenen, antigenen Substanz, die mit der zu bestimmenden antigenen Substanz identisch ist, in einer solchen Menge versetzt, daß bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper eine maximale Präzipitation erreicht wird, das erhaltene Gemisch zur Auslösung der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem für die zu bestimmende antigene Substanz spezifischen Antikörper versetzt .und die gebildete Präzipitatmenge turbidimetrisch bestimmt.
  2. 2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Immunoglobulin G- (IgG), Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin M (IgM), Albumin, o(^-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobin oder Komplementkomponenten bestimmt.
  3. 3. Testpackung,g ekennzeichnet durch
    (a) eine Pufferlösung zur Verdünnung der zu bestimmenden Probe,
    (b) eine getrennt hergestellte, exogene, antigene Substanz in einer solchen Menge, daß bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge erzielt wird,
    (c) eine Antikörperlösung, die auf eine für die Antigen-Antikörper-Reaktion geeignete Konzentration verdünnt ist, und
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    (d) eine Reihe von Standardlösungen mit antigener Substanz,
    die jeweils unterschiedliche, bekannte Mengen an antigener Substanz enthalten.
    4-. Testpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie als antigene Substanz Immunoglobulin G- (IgG-), Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin M (IgM), Albumin, tf-j-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobin und Komplementkomponenten enthalten.
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