DE69021631T2 - Diagnostische Zusammenstellung zum Nachweis von rheumatischer Arthritis. - Google Patents
Diagnostische Zusammenstellung zum Nachweis von rheumatischer Arthritis.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Arzneimittel für die rheumatoide Arthritis, das Protein A oder G und ein markiertes Lectin als wesentliche Bestandteile umfasst und in medizinischen Gebieten zur Diagnostik der rheumatoiden Arthritis verwendbar ist.
- Es ist bekannt, dass ein Autoantikörper, der "Rheumafaktor" genannt wird, im Serum eines Patienten mit rheumatoider Arthritis (im folgenden abgekürzt mit "RA-Patient") existiert, der das Antigen, das in der Fc-Region des menschlichen Immunoglobulins G (im folgenden abgekürzt mit "IgG") vorliegt, erkennt (Ref. 1). Vor kurzem wurden die Kohlehydratketten der Fc-Region des Serum-IgG eines RA-Patienten im Detail analysiert. Einige der Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden bereits, dass der Galactosegehalt der Kohlehydratketten der Fc-Region des Serum-IgG bei einem RA-Patienten wesentlich niedriger ist als bei einem gesunden Menschen (Ref. 2). Das heisst, es wurde gefunden, dass die Kohlehydratketten der Fc-Region des Serum-IgG eines gesunden Menschen aus verschiedenen Arten von Kohlehydrateinheiten mit Mikroheterogenität ohne jeden individuellen Unterschied in ihren Anteilen zusammengesetzt sind (Ref. 3). Andererseits hat die Kohlehydratkette der Fc-Region des Serum-IgG eines RA-Patienten einen bemerkenswert herabgesetzten Gesamtgalactosegehalt, obwohl sie aus verschiedenen Arten von Kohlehydratketten mit Mikroheterogenität ohne jeden individuellen Unterschied in ihren Anteilen besteht und dies mit gesunden Freiwilligen gemeinsam hat. Insbesondere wurde gefunden, dass drei Kettentypen, die jeweils mit zwei, einem oder keinem Galactosemolekül in Kontakt stehen, in der Fc-Region des Serum-IgG von gesunden Freiwilligen in einem Verhältnis von 2:2:1 auftreten, während der Gehalt der Kohlehydratketten, die zwei Galactoseeinheiten von Serum-IgG aus Patienten mit RA enthalten, deutlich verringert ist und der Gesamtgehalt der Galactose-defizienten Kohlehydratketten stark erhöht ist (Ref. 2). Diese Ergebnisse legen es nahe, dass die Kohlehydratketten des Serum-IgG aus Patienten mit RA strukturell eine Anomalie verursachen, so dass das IgG als Marker für RA dienen wird, wenn die strukturelle Anomalie geklärt werden kann (Ref. 4).
- Die folgenden Referenzen 1bis 4 offenbaren den obigen Befund im Detail und werden in der vorliegenden Erfindung herangezogen.
- (1) Kunkel, H.G. und Tan, E.M. (1964): Autoantibodies and disease. Adv. Immunol., 4:351
- (2) Mizuochi T., Taniguchi, T., Matsuta, K., et al (1985): Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature, 316, 452-457
- (3) Mizuochi, T., et al (1982): K. Immunol. 129, 2016-2020
- (4) Mizuochi, T. (1985): Reactant to rheumatoid factor: abnormality in the sugar chains of IgG in patients with rheumatoid arthritis, Clin. Immunol. 17, 977-984.
- Wie oben beschrieben wurde, ist bereits bekannt, dass die Diagnose von RA möglich sein wird, wenn der Galactosemangel in den Kohlehydratketten der Fc-Region des Serum-IgG bestimmt werden kann. Jedoch wurde bisher noch kein praktisches diagnostisches Arzneimittel zur Bestimmung des Galactosemangels gefunden.
- Die PCT-Anmeldung WO 89/04490 offenbart ein Verfahren des Nachweises und/oder der Messung der terminalen Glycosylierung eines Proteins durch Abschätzung der relativen Anteile verschiedener terminaler Zucker, die in dem Protein vorliegen können. Es wird offenbart, dass Proteine stark an bestimmte feste Substrate, insbesondere Nitrocellulose, binden. Die gebundenen Proben werden mit markiertem Lectin behandelt.
- Die europäische Anmeldung EP-A-0 189 388 offenbart diagnostische Methoden für Krankheiten mit einer arthritischen Komponente. Unter anderem wird die Bestimmung des Prozentsatzes von Ig-N-gebundenen Oligosaccharidstrukturen, die eine Galactose am äusseren Arm tragen, offenbart. Dies kann beispielsweise mit den Lectin-Assays für Galactose ausgeführt werden.
- Die europäische Anmeldung EP-A-0 958 780 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern. Diese Referenz offenbart die Verwendung von Protein A zur Bindung von Immunoglobulin.
- Unter diesen Umständen dachten die Erfinder dieser Erfindung, dass das Problem, das durch die Erfindung gelöst werden soll, darin liegt, ein diagnostisches Arzneimittel zur Bestimmung des Galactosemangels in den Kohlehydratketten des im menschlichen Serum vorliegenden IgG zur Verfügung zu stellen.
- Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ausgedehnte Untersuchungen unternommen, um das obige Problem zu lösen, und gefunden, dass das Ziel erreicht wird, indem man Protein A oder G dem Serum zusetzt und anschliessend ein markiertes Lectin zugibt. Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage dieser Entdeckung erreicht. Das heisst, die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Arzneimittel für die rheumatoide Arthritis, das Protein A und G und ein markiertes Lectin als essentielle Bestandteile umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft einen Set aus den zwei Mitteln, Protein A oder G, und einem markierten Lectin, mit dem ein Galactosemangel bestimmt werden kann.
- Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung des Galactosemangels unter Verwendung des oben definierten diagnostischen Arzneimittels zur Verfügung, das die Schritte der Umsetzung von Protein A oder Protein G mit Serum, Reaktion der resultierenden Substanz mit einem markierten Lectin und Ausführung einer Farbentwicklung umfasst.
- Die vorliegende Erfindung wird nun in grösserer Ausführlichkeit beschrieben.
- Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff "rheumatoide Arthritis" bezeichnet Autoimmunkrankheiten und ein spezielles Symptom davon erscheint als Steifheit am Morgen.
- Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff "Protein A" bezeichnet ein Protein, das aus der Zellmembran von Staphylococcus aureus isoliert wird und aus einem einzigen Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 42.000 besteht und aus einigen Teilen, die einander ähnlich sind, in der inneren Struktur zusammengesetzt ist.
- Protein A hat die Eigenschaft der Bindung mit der Fc-Region von IgG, so dass es zur Reinigung des IgG aufgrund dieser Eigenschaft verwendbar ist, was selbst bereits bekannt ist.
- Wie Protein A ist Protein G ein Protein, das aus Staphylococcus aureus isoliert wird und die Eigenschaft der Bindung mit dem Fc-Teil des IgG hat, so dass es zur Reinigung des IgG aufgrund dieser Eigenschaft verwendbar ist, was ebenfalls bekannt ist.
- Der Begriff "Lectin" ist ein allgemeiner Begriff für kohlehydratbindende Proteine. Obwohl ein Lectin zunächst aus Rhizinus-Samen zur Verfügung stand, sind Lectine in Tieren, einschliesslich Bakterien, weitverbreitet, so dass verschiedene Arten von Lectinen, die aus verschiedenen Quellen herrühren, nun erhältlich sind. Beliebige Lectine aus beliebigen Quellen können mit verschiedenen Arten von Zuckerketten, die voneinander in der Struktur verschieden sind, reagieren und sie so erkennen. Beispielsweise können viele Lectine, die aus verschiedenen Quellen stammen, eine Galactose-defiziente Mannosekette erkennen. Demgemäss ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete Lectin nicht besonders von seinem Ursprung her beschränkt, sondern kann von einer beliebigen Quelle stammen. Besonders bevorzugte Beispiele dafür schliessen Concanavalin A und Linsen-Culinaris-Agglutinin ein.
- Das Markieren des Lectins als Sonde zum Nachweis von Kohlehydraten kann durch herkömmliche Verfahren durchgeführt werden. Das heisst, es kann durch ein Verfahren ausgeführt werden, das geeignet aus solchen für die Markierung eines Enzyms, für Radioisotopen usw. ausgewählt wird. Somit ist die vorliegende Erfindung in der Markierungsmethode nicht beschränkt. Bei der Enzymmarkierung kann ein Enzym an ein Lectin entweder direkt oder durch ein geeignetes Molekül, wie Biotin und Avidin, gebunden werden.
- Die Bestimmung des Galactosemangels mit dem diagnostischen Mittel der vorliegenden Erfindung kann im wesentlichen wie folgt ausgeführt werden. Zunächst wird Protein A auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert und anschliessend ein mit Puffer verdünntes Serum zugegeben. Dann wird eine Biotin-Concanavalin A-Lösung zur resultierenden Membran gegeben, um die Kohlehydrateinheiten nachzuweisen. Danach wird eine Avidin-Peroxidaselösung zugegeben, um eine weitere Reaktion auszuführen. Die resultierende Membran wird gewaschen und mit einer Lösung eines Substrats gegen die Peroxidfarbe behandelt. Obwohl ein diagnostisches Mittel mit Protein A und Biotin-Concanavalin A (markiertes Lectin) als essentielle Bestandteile im obigen Prozess verwendet wird, kann das erfindungsgemässe diagnostische Mittel geeignet mit anderen Komponenten zu einem Set von diagnostischen Mitteln kombiniert werden, um im Verlauf des Bestimmungsverfahrens zur Erleichterung des Benutzers verwendet zu werden, und Beispiele dafür schliessen Phosphatpuffer, Blockierlösung, Nitrocellulosemembran, Avidin-Peroxidase, Tris-Puffer, Substratlösung und Reaktionsabbruchlösung ein. Die vorliegende Erfindung schliesst solche diagnostischen Sets, wie oben beschrieben, ein.
- Obwohl bereits bekannt ist, dass IgG durch Protein A oder G gereinigt werden kann und dass ein Lectin eine Kohlehydratkette erkennen kann, ist die Kombination von Protein A oder G mit einem Lectin zu einem diagnostischen Mittel neu, und eine einfache und genaue Diagnose von RA wurde durch diese Zusammensetzung realisiert, wie in den folgenden Experimentalbeispielen beschrieben wird, obwohl bisher angenommen wurde, dass dies schwierig ist.
- Fig. 1 zeigt den Vergleich der Stärke des Signals, das nach Anfärbung des Serum-IgG eines Patienten mit RA mit Con A erzeugt wird, mit dem von gesunden Freiwilligen. Die Stärke des Signals wurde durch einen Flying- Spotscanner CS 9000 bestimmt.
- Fig. 2 zeigt den Vergleich der Stärken von Signalen, die nach Anfärbung des Serum-IgG eines RA- Patienten mit LCA generiert wurden, mit denen eines gesunden Menschen. Die Signalstärke wurde durch ein Flying-Spotscanner CS 9000 bestimmt.
- Fig. 3 zeigt die Menge des Serum-Agalactosyl-IgG eines Patienten mit der jeweiligen Krankheit, die in dem Verfahren unter Verwendung von Mikroplattenkavitäten auf der Horizontalachse und Entwicklung einer Farbe, gefolgt von einer Messung der Absorption bei 405 nm und 490 nm erhalten wird. Die Namen der Krankheiten werden in Beispiel 2 angegeben. Tabelle 1 zeigt den Prozentsatz positiver Werte nach den Ergebnissen gemäss Fig. 3.
- (1) Ein im Handel erhältliches Protein A (ein Produkt von z.B. Sigma oder Pharmacia) oder Protein G (ein Produkt von beispielsweise Sigma oder Pharmacia) wurde mit einem markierten Lectin (z.B. einem Peroxidase- oder Biotin-markierten Lectin) (im Handel erhältlich als Produkt von z.B. Sigma oder Seikagaku Kogyo) zum Erhalt eines diagnostischen Mittels gemäss der vorliegenden Erfindung kombiniert.
- (2) Die oben beschriebenen Komponenten wurden weiter mit einer Festkomponente zur Immobilisierung (Bindung) von Protein A (z.B. einer Nitrocellulosemembran oder einer Polystyrolmikroplatte), einem Blockierpuffer (wie z.B. Phosphat- oder Tris-Puffer mit BSA oder Gelatine), einem markierten Enzym (z.B. Streptoavidin-Peroxidase) und einem Substrat gegen das Enzym (wie z.B. 4-Chlornaphthol) zum Erhalt eines erfindungsgemässen diagnostischen Mittels kombiniert.
- (3) Protein A oder G, gebunden oder immobilisiert an die Oberfläche einer festen Komponente, wird mit menschlichem Plasma oder Serum zur spezifischer Selektion des Immunoglobulins (IgG) umgesetzt. Die im IgG vorliegende Kohlehydratstruktur wird mit einem markierten Lectin (wie Peroxidase- Lectin) markiert, um die strukturelle Anomalie der Kohlehydratkette des IgG unter Ausnutzung der Aktivität des Lectins, das spezifisch die Kohlehydratkettenstruktur erkennt, nachzuweisen. Der Nachweis wird durch Bestimmung der Menge des an die IgG-Kette gebundenen Lectins aufgrund der Signalstärke, beispielsweise der entwickelten Farbe, ausgeführt. Spezieller wurden, da die Analyse der Struktur der Kohlehydratketten des Serum-IgG eines Patienten mit RA zeigten, dass der Galactosegehalt der Kohlehydratketten bemerkenswert verringert war, Lectine, die mit einem solchen Agalactosyl IgG reaktiv waren, gescreent. Als Ergebnis wurde gefunden, dass Mannose-erkennende Lectine, wie Concanavalin A (Con A) oder Linsen-Culinaris-Agglu tinin (LCA) sehr stark mit Agalactosyl-IgG reagieren. Daher wurde das Serum-IgG der RA-Patienten unter Verwendung dieser Lectine untersucht.
- Seren wurden aus Patienten mit RA und gesunden Freiwilligen zur Verwendung in den folgenden Experimenten gewonnen.
- Protein A (250 ug/ml) wurde in einem Phosphatpuffer (50 mM Phosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,4) gelöst, 10 ul dieser Lösung auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht (punktweises Auftragen) . Die resultierende Membran wurde getrocknet und mit einem Blockierpuffer blockiert (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 % NP-40, 2,5 % Gelatine (G/V), pH 7,4).
- Die resultierende Membran (IgG-einfangende Membran; nachstehend bezeichnet als "IGGTM") wurde bei der Analyse der Zuckerketten des Serum-IgG von Patienten mit RA oder gesunden Freiwilligen verwendet. Die Sera von Patienten mit RA und gesunden Freiwilligen wurden mit einem Blockierpuffer verdünnt und zu dem IGGTM gegeben, so dass das IgG an die Membran binden konnte (60 Minuten bei Raumtemperatur). Nach der Reaktion wurde das IGGTM unter milden Bedingungen abgespült und 5 Minuten gewaschen. Dann wurden 500 ug/ml Biotin-Con A (20 ug/ml) zum resultierenden IGGTM gegeben und eine Reaktion (60 Minuten bei Raumtemperatur) ausgeführt. Nach der Reaktion wurde das resultierende IGGTM unter milden Bedingungen abgespült und zweimal je 5 Minuten gewaschen. Dann wurden 500 ul Streptoavidin-Peroxidase zum resultierenden IGGTM gegeben und so eine weitere Reaktion ausgeführt. Nach der Reaktion wurde das resultierende IGGTM unter milden Bedingungen abgespült und zweimal je 5 Minuten gewaschen. Nach dem Waschen wurde das resultierende IGGTM unter milden Bedingungen mit TBS (20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,4) abgespült. Eine Substratlösung gegen Peroxidase (500 ug/ml) wurde auf das IGGTM gegeben, um eine Farbentwicklung zu starten (während 5 bis 10 Minuten). Nach Beendigung der Entwicklung wurde das resultierende IGGTM ausreichend mit destilliertem Wasser gewaschen und zur Messung der Stärke des entwickelten Signals auf dem IGGTM mit einem Doppelwellenlängen- Flying-Spotscanner CS 9000 (hergestellt von Shimadzu) (λ = 540 nm) getrocknet.
- (1) Das Serum-IgG von jedem von vier RA-Patienten und vier gesunden Freiwilligen wurde hinsichtlich der Reaktivität mit Con A getestet. Der mittlere Zahlenwert (Count) der gesunden Gruppe betrug 7603,85, während der der RA-Gruppe 43906,22 betrug. Somit wies die RA-Gruppe einen höheren Count als die gesunde Gruppe auf (Fig. 1)
- (2) Das Serum-IgG von jedem von zehn Patienten mit RA und von vier gesunden Menschen wurde hinsichtlich der Reaktivität mit LCA untersucht. Der mittlere Zahlenwert der gesunden Gruppe betrug 0, während der der RA-Gruppe 24501,8 betrug. Somit wies die RA-Gruppe einen höheren Zahlenwert als die gesunde Gruppe auf (Fig. 2).
- Seren wurden aus Patienten mit den nachstehend angegebenen Krankheiten und von gesunden Freiwilligen zur Verwendung in den folgenden Experimenten gewonnen. Proben rheumatoide Arthritis rheumatoide Arthritis in Frühphase (E-RA) seronegative rheumatoide Arthritis (S-N-RA) (RA-Test: -, Rose, 8 oder weniger) Osteoarthritis (OA) Osteoarthritis in Frühphase (E-OA) systemisches Lupus-Erythem (SLE) gesunde Freiwillige
- Jede Mikroplattenkavität wurde mit 100 ul Protein A (2,5 ug/ml) befüllt und beschichtet. Sie wurde mit 100 ul eines Blockierpuffers (1 % BSA, 50 mM Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,4) blockiert. 100 ul Gelatinepuffer (50 mM Tris-HCl, 0,15 M Nacl, 0,05 % NP-40, 2,5 % (G/V) Gelatine, pH 7,4) wurden in jede Kavität gegeben und anschliessend 1 ul Probe zugegeben. Dann wurden zu jeder Kavität ausserdem 100 ul Gelatinepuffer gegeben. Ale Kavitäten wurden bei 25ºC 60 Minuten inkubiert. Nach der Reaktion wurde jede Kavität mit Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 % NP-40, pH 7,4) gewaschen. Dann wurden 100 ul Biotin-Con A-Lösung (0,0625 ug/ml) zugegeben und die Reaktion bei 25ºC 60 Minuten ausgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde mit dem Waschpuffer gewaschen. Dann wurden 100 ul Streptoavidin-Peroxidaselösung zugegeben. Eine Reaktion wurde bei 25ºC 60 Minuten lang ausgeführt.
- Das Reaktionsprodukt wurde mit dem Waschpuffer gewaschen und anschliessend 100 ul Substratlösung (3 % H&sub2;O&sub2;, 10 ul + ABTS 6 mg/4 ml, Zitronensäurepuffer, pH 4,2) zugegeben, um eine Reaktion bei 37ºC während 60 Minuten auszuführen.
- Zu jeder Kavität wurden 100 ul Natriumazidlösung gegeben, um die Reaktion zu beenden, und die Absorption bei 405 nm und 490 nm der resultierenden Probe wurde unter Verwendung eines Doppelwellenlängen-Spektrophotometers gemessen.
- Fig. 3 zeigt folgendes:
- (1) Die Absorption 0,14 ist definiert als Cut-Off-Wert; rheumatoide Arthritis wird als RA erkannt, wenn die gemessene Absorption einer Probe grösser ist als der Cut-Off-Wert. Der Positivanteil für jede Krankheit wird in Tabelle 1 gezeigt.
- (2) Ein hoher Positivanteil wird bei anderen Krankheiten ausser RA, d.h. bei SLE, OA und LD, durch einen herkömmlichen RA-Test, wie beispielsweise der Hämagglutinierungsmethode und der Latexkoagulationsmethode nach Tatsu ABE, General Clinic (Sogo Rinsho) 34, 1915 (1985) festgestellt. Das Assayverfahren der vorliegenden Erfindung ergibt einen sehr niedrigen Positivanteil bezüglich dieser Krankheiten, jedoch eine sehr hohe Selektivität bei der RA-Krankheit. TABELLE 1 Krankheit CUP Anteil Leberkrankheit Kontrolle
Claims (4)
1. Diagnostische Zusammensetzung für die rheumatoide Arthritis,
umfassend Protein A oder G und Concanavalin A oder Culinaris-Linsen-Agglutinin
als markiertes Lectin als wesentliche Bestandteile, wobei dieses Lectin zum
Erkennen von Galactose-defizienten Zuckerketten vorliegt.
2. Verfahren zur Bestimmung von Galactosemangel unter Verwendung der
diagnostischen Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, umfassend die Schritte
der Umsetzung von Protein A oder Protein G mit Serum, Umsetzen des
Resultierenden mit Concanavalin A oder Culinaris-Linsen-Agglutinin als
markiertes Lectin, und Ausführung einer Farbentwicklung.
3. Reagenziensatz für eine diagnostische Zusammensetzung für die
rheumatoide Arthritis, bestehend im wesentlichen aus
(a) Protein A oder G in einem ersten Teil und
(b) Concanavalin A oder Culinaris-Linsen-Agglutinin als markiertes
Lectin in einem zweiten Teil zur Erkennung von Galactose-defizienten
Zukkerketten.
4. Reagenziensatz für eine diagnostische Zusammensetzung gemäss
Anspruch 3, wobei diese Zusammensetzung ausserdem einen Phosphatpuffer, eine
Blockierlösung, eine Nitrocellulosemembran, eine Avidin-Peroxidase, einen
Tris-Puffer, eine Substrat lösung und/oder eine Reaktionsabbruchlösung
umfasst.
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