DE69216408T2 - Charakterisierung oder bestimmung der menge von säugerzellen mittels antikörpern - Google Patents

Charakterisierung oder bestimmung der menge von säugerzellen mittels antikörpern

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Description

    Charakterisierung oder Bestimmung der Menge von Säugerzellen mittels Antikörpern TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung oder Bestimmung der Menge von Säugerzellen gemäß einem per se bereits bekannten Verfahren, bei dem für diesen Zweck Antikörper verwendet werden. Bis jetzt sind dazu Antikörper verwendet worden, die in Säugern, insbesondere in Kaninchen, erzeugt wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch die Verwendung anderer Antikörper-Typen in diesem Zusammenhang, wobei Nachteile beseitigt werden, die mit im Stand der Technik beschriebenen Verfahren verbunden sind, sogar so, daß die vorliegende Erfindung Charakterisierungen oder Bestimmungen ermöglicht, die andernfalls schwierig oder sogar unmöglich wären.
    • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Obwohl sich die vorliegende Erfindung allgemein auf die Charakterisierung oder Bestimmung vieler verschiedener Säugerzell-Typen anwenden läßt, was nachstehend im einzelnen erläutert wird, ist sie für Thrombozyten (Blutplättchen) besonders wertvoll, insbesondere bezüglich der entscheidenden Bereiche der verschiedenen Thrombozyten-Funktionen. Deshalb wird der technische Hintergrund der vorliegenden Erfindung in bezug auf Thrombozyten angegeben, da dadurch die durch die Erfindung gelösten Probleme und die Vorteile davon am deutlichsten werden. Entsprechende oder ähnliche Vorteile lassen sich jedoch auch bei der Bestimmung anderer Säugerzellen erreichen.
  • Thrombozyten spielen in der Hämostase eine zentrale Rolle. Es ist wohlbekannt, daß eine niedrige Anzahl von Thrombozyten im Blut Blutungs- Komplikationen verursacht. Es gibt auch Daten, die darauf hindeuten, daß eine erhöhte Anzahl aktivierter Thrombozyten und/oder ein verringerter Aktivierungs-Schwellenwert die Entwicklung von Blutgerinnseln beeinflußt.
  • Auch solche Krankheiten wie Präeklampsie (ein Syndrom bei Schwangeren mit Symptomen wie Bluthochdruck und Proteinausscheidung im Urin) stehen im Zusammenhang mit Veränderungen der normalen Thrombozyten- Funktionen. Es läßt sich erwarten, daß Untersuchungen der Thrombozyten- Funktionen auch für solche Entscheidungen, welche Patienten Thrombozyten- Konzentrate erhalten sollten, wichtig sind.
  • Hämostase erfordert die Aggregation von Thrombozyten. Eine Aggregation kann jedoch nur erfolgen, wenn auf der Zelloberfläche von Thrombozyten befindliche Rezeptoren für Fibrinogen zugänglich sind. In ihrer Ruhe-Phase können Thrombozyten nur in geringem Maße Fibrinogen binden und dann können sie auch keine Aggregate bilden, die bei der Blutstillung den Primärpfropf (die erste Blockierung einer Gefäßverletzung) oder einen Teil einer Thrombose (Gerinnsel) darstellen. Die Aktivierung von Thrombozyten bedeutet, daß sich die Fähigkeit der Thrombozyten zur Fibrinogen-Bindung signifikant erhöht.
  • Anders gesagt, besteht ein großer Bedarf, im Blut eines Patienten die Menge oder den Anteil von Thrombozyten zu bestimmen, die aktiviert werden, d.h. die in hohem Maße Fibrinogen binden können. Zum Testen von Thrombozyten- Funktionen, wie Blutungszeit und Thrombozyten-Aggregation, verwendete Routine-Verfahren sind jedoch komplex und unempfindlich und liefern lediglich unspezifische Informationen über die Funktion. Beispielsweise liefern sie kein genaues Bild diskreter oder einzelner Thrombozyten, sondern bloß Durchschnittswerte. Außerdem gibt es Verfahren zur Bestimmung von aus Thrombozyten freigesetzten Proteinen, wobei die Ergebnisse davon jedoch nicht verläßlich sind, da sie unter anderem durch den Stoffwechsel des Patienten beeinflußt werden.
  • In den letzten Jahren hat die Fluoreszenz-aktivierte Durchflußcytometrie die Entwicklung neuer Testsysteme für Thrombozyten-Funktionen ermöglicht. In diesem Zusammenhang werden Laserstrahlen verwendet, die Zellen in einer vorbeiströmenden Flüssigkeit bestrahlen. Die Lichtstreuung liefert Informationen über die Größe und Strukturen von Zellen. Weitere Informationen werden durch Zugabe von Antikörpern oder anderen Stoffen gewonnen, die an verschiedene Stoffe gebunden sind, die bei Bestrahlung zur Lichterzeugung angeregt werden (Fluoreszenz). Diese Verfahren sind schnell und empfindlich und können spezifische Informationen über Thrombozyten- Funktionen liefern. Außerdem ist es möglich, jeden Thrombozyten separat zu untersuchen und nicht nur einen Durchschnitt aller Thrombozyten. Für einen Test werden wenige Mikroliter Vollblut oder Thrombozyten-reiches Plasma benötigt. Die Thrombozyten lassen sich mittels eines spezifischen Antikörpers oder durch ihre Größe von anderen Blutzellen unterscheiden.
  • In diesem Zusammenhang sind im Handel erhältliche Fluoreszenzmarkierte Kaninchen-Antikörper zur Untersuchung der Fibrinogen-Bindung von Thrombozyten verwendet worden. Das wird in dem Artikel von R. M. Hardisty et al. "Measurement of fibrinogen binding to platelets in whole blood by flow cytometry: a micro method for the detection of platelet activation.", Br. J. Hematol. 76 (1990), 387-394, offenbart.
    • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Erfindungsgemäß ist unerwarteterweise gezeigt worden, daß wesentliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik erzielt werden, wenn andere Antikörper-Arten oder -Typen als die bislang zur Charakterisierung oder Bestimmung von Säugerzellen verwendeten Säuger-Antikörper gewählt werden.
  • Insbesondere stellte sich heraus, daß durch Auswahl von Vogel- oder Reptil-Antikörpern im Zusammenhang mit Säuger-Antikörpern auftretende verfahrensbedingte Artefakte vermieden oder beseitigt werden können. Säuger-Antikörper bilden z.B. im Plasma mit Fibrinogen Immunkomplexe, die Thrombozyten aktivieren und zu falschen Testergebnissen führen. Bei Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Antikörper ist dies offensichtlich überhaupt nicht der Fall bzw. tritt nur in sehr geringem Maße auf. Obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf eine bestimmte Theorie in diesem Bereich beschränkt ist, scheinen Vogel- und Reptil-Antikörper bei Komplex-Bildung mit Antigenen und Wechselwirkungen mit Antikörper-spezifischen Zellrezeptoren keine physiologischen Reaktionen hervorzurufen.
  • Anders ausgedrückt, basiert die vorliegende Erfindung auf der unerwarteten Entdeckung, daß bei Experimenten mit gegen Fibrinogen gerichteten Antikörpern, die durch Immunisierung von Hennen mit menschlichem Fibrinogen hergestellt worden waren, Fibrinogen auf der Thrombozyten-Oberfläche zu finden war, ohne daß die Thrombozyten aktiviert wurden, und das trotz der Tatsache, daß Immunkomplexe zwischen Plasma- Fibrinogen und Fluoreszenz-markierten Hennen-Antikörpern gegen Fibrinogen festgestellt werden konnten (bei den Experimenten ließen sich Thrombozyten und Immunkomplexe durch unterschiedliche Lichtstreuung oder mittels eines Thrombozyten-Antikörpers unterscheiden, der auf eine andere Art markiert war, z.B. mit einem anderen Farbstoff oder mit einem Radionuklid).
  • Die Verwendung von Hennen- oder Hühner-Antikörpern in einem Test vom ELISA-Typ ist bereits per se bekannt (vgl. z.B. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., Bd. 13, Nr.4 (1990), S.199-201). Unerwartet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist jedoch, daß ein störender Einfluß auf die untersuchten oder getesteten Zellen vermieden wird.
  • Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf die Charakterisierung oder Bestimmung solcher Zellen abzielt, die mit Säuger- Antikörpern oder ihren Komplexen mit einem Antigen auf eine Weise in Wechselwirkung treten, die nicht auf der Fähigkeit der Antikörper zur Antigen-Bindung beruht. Das bedeutet allgemein, daß es sich um solche Zellen handelt, die eine Transformation oder Umwandlung, d.h. eine Veränderung der Oberflächenstruktur, durchmachen können und Säuger-Antikörper oder ihre Komplexe mit Antigenen eine solche Transformation oder Umwandlung induzieren.
  • Das Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Untersuchung oder im Nachweis, in welchem Zustand oder Status die Zellen vorliegen, bzw. in der Untersuchung oder im Nachweis der Menge oder des Anteils von Zellen in mindestens einem dieser Zustände, wobei durch die vorliegende Erfindung verfahrensbedingte Artefakte oder Umwandlungen von Zellen vermieden werden, die andernfalls zu hohe oder falsche Werte betreffs des Anteils von Zellen in einem Status oder Zustand ergeben würden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Nachweis von Säuger-Blutzellen in aktivierter Form und/oder zur Bestimmung des Anteils aktivierter Säuger-Blutzellen, wobei die Aktivierung nicht auf die Antigen-Bindungsaktivität von Antikörpern zurückzuführen ist, sondern die Folge der Bindung von Säuger-Antikörpern oder ihrer Komplexe an Zellen ist, dadurch charakterisiert, daß der Nachweis und/oder die Bestimmung mit Vogel- oder Reptil-Antikörpern bzw. Fragmenten der Vogel- oder Reptil-Antikörper bzw. rekombinanten Antikörpern durchgeführt wird, die im wesentlichen die gleiche oder eine ähnliche Antigen-Bindungsaktivität aufweisen wie die Vogel- oder Reptil-Antikörper.
  • Obwohl vorstehend eine allgemeine Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit Hühner- oder Hennen-Antikörper erfolgte, sollte sie im allgemeinen sowohl für Vogel- oder Geflügel-Antikörper als auch Reptil- Antikörper geeignet sein. Außerdem ist die Verwendung von Antikörpern per se nicht erforderlich, da entsprechende oder ähnliche Ergebnisse auch mit immunologisch ähnlichen Proteinen erzielt werden, d.h. solchen Proteinen, die im wesentlichen die gleiche oder eine ähnliche Antigen-Bindungsaktivität aufweisen wie die vorstehend genannten Vogel- oder Reptil-Antikörper. Beispielsweise können Fragmente von Antikörpern oder rekombinante Antikörper verwendet werden.
  • Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Vogel-Antikörper Antikörper von Hennen oder Hühnern verwendet, z.B. Antikörper aus Hühnerblut.
  • Außerdem kann die Verwendung von Hennen- oder Hühner-Antikörpern aus Eiern oft vorteilhaft sein, da die daraus erhältliche Antikörper-Menge beträchtlich größer ist als bei Verwendung von Hühnerblut als Ausgangsmaterial.
  • Insbesondere im Hinblick auf die vorstehend im Zusammenhang mit Thrombozyten gemachten Anmerkungen kann auch die Verwendung von gegen Fibrinogen gerichteten Hühner-Antikörpern bevorzugt sein (die Beschreibung und Patentansprüche hindurch wird der Begriff "Hühner" so verwendet, daß auch Hennen dazugehören).
  • Im Zusammenhang mit allen bevorzugten Ausführungsformen betreffs Hühner-Antikörper ist es selbstverständlich, daß die Anwendungen auch die Verwendung entsprechender immunologisch ähnlicher Proteine umfassen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf den Nachweis oder die Bestimmung beliebiger Blutzellen, wie z.B. von Thrombozyten und weißen Blutkörperchen oder Leukozyten, anwenden. Aus den vorstehend erwähnten Gründen ist jedoch der Nachweis und/oder die Bestimmung von Thrombozyten natürlich besonders interessant, wobei das Ziel im Nachweis von Thrombozyten in aktivierten Formen oder in der Bestimmung des Anteils aktivierter Thrombozyten besteht. In diesem Zusammenhang bedeutet Aktivierung hauptsächlich die Fähigkeit zur Bindung von Fibrinogen.
  • Hinzu kommt, daß das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise als Fluoreszenz-aktivierte Durchflußcytometrie (FACS = Fluoreszenz-Antikörper- Zellsortiervorrichtung) durchgeführt wird, insbesondere aufgrund der Tatsache, daß das Verfahren schnell und empfindlich ist und spezifische Informationen liefert.
    • BEISPIELE
  • Um das erfindungsgemäße Verfahren mit der Verwendung von Antikörpern entsprechend dem Stand der Technik zu vergleichen, wurden in Plasma befindliche Thrombozyten mit Hühner- bzw. Kaninchen-Antikörpern gemischt, die gegen die menschlichen Plasmaproteine Fibrinogen, α-2- Makroglobulin und IgA gerichtet waren. Die Konzentrationen dieser Antikörper wurden so ausgewählt, daß sich in großem Umfang Immunkomplexe bilden konnten. Das Ausmaß der Aktivierung wurde mittels Fluoreszenz-markierter, gegen Fibrinogen gerichteter Hühner-Antikörper bestimmt. Bei der Negativ-Kontrolle wurde lediglich physiologische Kochsalz- Lösung zugegeben und bei der Positiv-Kontrolle der bekannte Thrombozytenaktivierende Stoff Adenosindiphosphat.
  • Eine genaue Beschreibung des Verfahrens erfolgt nachstehend. Die Ergebnisse sind in der angefügten Figur beschrieben, aus der sich ersehen läßt, daß mit allen Immunkomplexen, die Kaninchen-Antikörper enthielten, eine starke Aktivierung erreicht wurde. Im Gegensatz dazu konnte nur bei einer einzigen Kombination mit Hühner-Antikörpern eine Aktivierung erreicht werden, nämlich bei dem IgA-Komplex. In diesem spezifischen Fall ist jedoch wahrscheinlich das menschliche Immunglobulin A selbst für diese Aktivierung verantwortlich.
    • GENAUE BESCHREIBUNG DES VERFAHRENS Reagenzien
  • Normales Maus-IgG, Adenosin-5-diphosphat (Güteklasse 1) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden von Sigma (St. Louis, Mo, USA) gekauft. Sephadex G-25 und DEAE-Sepharose wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) gekauft. Aus Eidotter aufgereinigte IgG-Fraktionen von Hühner-Antikörpern, die gegen menschliches Fibrinogen, menschliches IgA, menschliches α-2-Makroglobulin bzw. Maus-Immunglobulin gerichtet waren, wurden von Immunsystem AB (Uppsala, Schweden) bezogen. Die gegen Fibrinogen gerichteten Antikörper wurden an insolubilisiertem menschlichem Fibrinogen affinitätsgereinigt (Larson, A. et al., J. Immunol. Meth. 113 (1988), 93-99). Nach Dialyse über Nacht gegen 0,1 Mol/l NaHCO&sub3;, pH 9,5, wurden einige der Antikörper mit FITC konjugiert. Das Konjugationsverhältnis betrug 11:1, d.h. 11 Molteile FITC pro 1 Molteil Antikörper. Das Gemisch wurde drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. In 0,01 Mol/l Tris, pH 7,3, wurden konjugierte Antikörper mittels Gelfiltration auf Sephadex G-25 von freiem FITC getrennt. Antikörper mit einem geeigneten F/P-Verhältnis wurden mittels Ionenaustausch- Chromatographie auf DEAE-Sepharose CL 6B abgetrennt. Die Säule wurde mit Tris-Puffer unter Zugabe von 0,1 Mol/l NaCl gewaschen. Die Antikörper wurden mittels eines Gradienten von physiologischer Kochsalzlösung in Konzentrationen bis 0,25 Mol/l eluiert. Von Dakopatts AS (Glostrup, Dänemark) wurden nicht-konjugierte und FITC-konjugierte Kaninchen-Antikörper gekauft, die gegen menschliches Fibrinogen, menschliches IgA, menschliches α-2-Makroglobulin bzw. Maus-Immunglobulin gerichtet waren.
    • Blutuntersuchung
  • Gesunden Spendern, die während der vorangegangenen 2 Wochen keine Medikamente genommen hatten, wurde mit einer offenen Nadel ohne Stase Venenblut entnommen.
  • 4,5 ml Blut wurden in Plastikröhrchen gesammelt, die 0,5 ml 3,8%-iges Natriumcitrat enthielten. Plasma mit angereicherten Thrombozyten wurde mittels 10-minütiger Zentrifugation bei 140 x g hergestellt.
    • Herstellung von Proben zur Durchflußcytometrie
  • 5 µl Plasma mit angereicherten Thrombozyten wurden in Plastikröhrchen gegeben, die 50 µl oder 55 µl HEPES-Puffer (137 mMol/l NaCl, 2,7 mMol/l KCL, 1 mMol/l MgCl&sub2;, 5,6 mMol/ml Glucose, 1 mmol/l Rinderserumalbumin und 20 mMol/l HEPES, pH 7,40) und bei einigen Experimenten 5 µl Antikörper enthielten. In einigen Fällen war dem HEPES-Puffer ADP zugegeben worden. Die Proben wurden einmal sorgfältig gemischt. Dann ließ man sie bei Raumtemperatur genau 10 Minuten stehen. Danach wurden 10 µl FITCkonjugierte Hühner-Antikörper gegen Fibrinogen (0,35 g/l) zugegeben und man ließ die Teströhrchen für weitere genau 20 Minuten stehen. Die Reaktion wurde durch 500 µl eiskaltes PBS mit oder ohne 1 % Paraformaldehyd beendet. Wasch-Schritte waren nicht erforderlich. Die Proben wurden bis zu ihrer Untersuchung im Durchflußcytometer, die immer am gleichen Tag durchgeführt wurde, im Dunkeln auf Eis aufbewahrt.
    • Durchflußcytometrie
  • Die Fluoreszenz-markierten Thrombozyten im Puffer wurden mittels eines FACScan-Cytometers (Becton Dickinson, Mt View, Kalifornien, USA) untersucht, das mit einem luftgekühlten 15 mW-488 nm-Argon-Laser ausgerüstet war, wobei die Lichtstreuung vorwärts (FwSc) und seitwärts (SSc) gerichtet war.
  • Grün (FITC)- und Rot (PHYCO)-Signale wurden durch logarithmische Verstärkung mit einem 530/30 nm- bzw. einem 585/42 nm-Filter gesammelt. Die Datengewinnung von 10 000 Zellen pro Probe und die Computer-Verarbeitung davon erfolgten mit einem Consort-30-Programm (ebenfalls Becton Dickinson) auf dem Personalcomputer 310 von Hewlett Packard. Auf der Basis der Lichtstreuungs-Eigenschaften wurde jede Zelle durch einen Punkt in einem rechtwinkligen Koordinatensystem dargestellt. Um die gehäuften Punkte, die die Thrombozyten darstellten, wurde ein Datengewinnungs-Fenster gelegt. Mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern, die gegen die Thrombozyten-Rezeptoren GPIIIa und GPIb gerichtet waren, wurden Kontrollen durchgeführt. Das Meßgerät liefert den Prozentsatz positiver Zellen (bei Fibrinogen wurden als Negativ-Kontrolle im allgemeinen Thrombozyten in einem Puffer ausgewählt, dem Adenosin und Theophyllamin oder EDTA zugegeben worden waren, bei den vorstehend erwähnten Glykoproteinen ein Fluoreszenz-markierter Antikörper gegen das Leukozyten-Oberflächenantigen CD-3), die durchschnittliche Fluoreszenz-Intensität, die Komplexität (SSc) und das durchschnittliche Partikel-Volumen (FwSc) der Zellpopulation innerhalb des Analyse-Fensters.
    • Andere experimentelle Ergebnisse
  • Die Aktivierung der Immunkomplexe kann zumindest teilweise neutralisiert werden, wenn die Thrombozyten zuerst mit einem gegen den Fc- Rezeptor gerichteten monoclonalen Antikörper gemischt werden. Immunkomplexe zwischen Maus-Antikörpern und Kaninchen-Antikörpern aktivieren Thrombozyten, Komplexe zwischen Maus-Antikörpern und gegen Maus-Antikörper gerichteten Hühner-Antikörpern jedoch nicht. Zumindest einige gegen Thrombozyten-Oberflächenantigene gerichtete monoclonale Antikörper können ohne Zugabe eines anderen Antikörpers zu einer gewissen Aktivierung führen. Die Aktivierung wird durch Kaninchen-Antikörper, die gegen Maus-Antikörper gerichtet sind, stark erhöht, nicht jedoch durch Hühner-Antikörper, die gegen Maus-Antikörper gerichtet sind.
  • Die Warenzeichen Sephadex, Sepharose und FACScan können in einigen oder allen der benannten Staaten registriert sein.

Claims (1)

1. Verfahren zum Nachweis von Säuger-Blutzellen in aktivierter Form und/oder Bestimmung eines Anteils von aktivierten Säuger-Blutzellen, wobei die Aktivierung nicht von einer Antigen-Antikörper-Bindungsaktivität verursacht wird, die eine Folge der Bindung von Säuger-Antikörpern oder deren Komplexen mit Zellen ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis und/oder die Bestimmung mit Vogel- oder Reptil-Antikörpern oder Fragmenten dieser Vogel- oder Reptil-Antikörper oder rekombinanten Antikörpern mit im wesentlichen der gleichen oder ähnlichen Antigen-Bindungsaktivität wie die Vogel- oder Reptil-Antikörper durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper vom Huhn oder Fragmente davon oder entsprechende rekombinante Antikörper verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper von Hühnereiern verwendet werden.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an Thrombocyten oder Leukocyten durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es an Thrombocyten durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Anti-Fibrinogen-Antikörper vom Huhn verwendet werden.
17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer fluoreszenzaktivierten Durchflußcytometrie durchgeführt wird.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1246621A4 (de) * 1999-12-23 2004-11-24 Nitromed Inc Nitrosierte und nitrosylierte cyclooxygenase-2-inhibitoren, zusammensetzungen und methoden für deren verwendung
US10032853B2 (en) 2014-09-17 2018-07-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Microstructural architecture to enable strain relieved non-linear complex oxide thin films
US9506153B2 (en) 2014-09-17 2016-11-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Integrated composite perovskite oxide heterostructure

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4357272A (en) * 1978-03-22 1982-11-02 The South African Inventions Development Corporation Recovering purified antibodies from egg yolk
US4474893A (en) * 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4820505A (en) * 1985-04-04 1989-04-11 Scripps Clinic And Research Foundation Detection of activated platelets with antibodies to thrombospondin
SE454812B (sv) * 1986-10-22 1988-05-30 Anders Larsson Forfarande och komposition for uppfangande av eller detektering av immunkomplex och anvendning av fagelantikroppar herfor
US5049502A (en) * 1987-12-31 1991-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Chicken-derived immunoglobulin-producing cell lines

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Publication number Publication date
SE9102014D0 (sv) 1991-06-28
SE469451B (sv) 1993-07-05
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ES2097339T3 (es) 1997-04-01
EP0593558B1 (de) 1997-01-02
JPH06508922A (ja) 1994-10-06
US5776697A (en) 1998-07-07
DE69216408D1 (de) 1997-02-13
SE9102014L (sv) 1992-12-29
AU2233092A (en) 1993-01-25
WO1993000585A1 (en) 1993-01-07

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