DE2754350A1 - Verfahren zur bestimmung von antikoerpern, antigenen oder komplexen aus antikoerpern und antigenen in fluessigkeiten - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von antikoerpern, antigenen oder komplexen aus antikoerpern und antigenen in fluessigkeitenInfo
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Description
TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA
Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern, Antigenen oder Komplexen aus Antikörpern und Antigenen in Flüssigkeiten
Die Erfindung betrifft die Analyse von Flüssigkeiten, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich von biologischen
Flüssigkeiten, wie Seren oder Urin, wobei Antigene, Antikörper und Komplexe aus Antigenen und Antikörpern bestimmt
v/erden sollen. Im folgenden werden Antigene, unter ihnen Haptene und andere Substanzen, die durch Antikörper
oder ähnliche Bindeproteine gebunden werden können, als "Ag", Antikörper einschließlich ähnlich bindende Proteine
mit "Ab" und Komplexe aus Antikörpern und Antigenen mit "Ab:Ag" bezeichnet.
Bekanntlich ist es von großer Bedeutung, daß man Flüssigkeiten, insbesondere biologische Flüssigkeiten auf
ihren Gehalt an Ab, Ag oder Ab:Ag analysieren kann. Beispielsweise ist für viele Krankheiten die Anwesenheit von
Ab:Ag im Kreislauf charakteristisch, weshalb ihre Bestimmung und Charakterisierung wertvolle Informationen für die
Diagnose der Krankheit liefern kann. Es gibt eine Anzahl bekannter Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung
von Ag, Ab und Ab:Ag und insbesondere zur Bestimmung der Art und Menge des anwesenden Ag. Diese quantitativen
Bestimmungen werden "losainoassays* genannt.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Mäusevoll serum eine aktive Fraktion enthält, die ein außerordentlich
wertvolles Reagenz zur Bestimmung von Ab, Ag und Ab:Ag darstellt und deren Verwendung beispielsweise Immunoassays
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vereinfachen und genauere Ergebnisse liefern lassen kann. Insbesondere wurde gefunden, daß Mäuseserum eine Fraktion
enthält, die in der Lage ist, sich zwar an Ab:Ag Jedoch nicht an freies Ab oder Ag zu binden. Außerdem verursacht
die aktive Fraktion die Agglutination verschiedener Immunglobuline
im durch Hitze aggregierten, an einen Latex gebundenen oder in ähnlicher Weise modifizierten Zustand.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern, Antigenen oder Komplexen aus
Antikörpern und Antigenen in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man der Flüssigkeit vor oder nach
der Zugabe anderer Reagenzien die aktive Fraktion von Mausevoll serum zur Bindung an in der Flüssigkeit vorhandenem
oder erzeugtem Antikörper/Antigen-Komplex zusetzt.
Die aktive Fraktion von Mäuseserum, die erfindungsgemäß verwendet wird, ist ein Euglobulin. In einigen
ihrer Eigenschaften erinnert sie stark an menschliches C1q. Beispielsweise bindet sie sich an Ab:Ag, Jedoch nicht an
freies Ab oder Ag; sie besitzt eine Sedimentationskonstante von IOS; sie bindet sich selektiv an IgG und IgM, Jedoch
nicht an IgA; sie agglutiniert Latexteilchen, die mit IgG oder IgM beschichtet sind; und sie wird an denselben Anteil
der Fc-Kette des IgG gebunden wie menschliches C1q. In anderer Hinsicht ist sie Jedoch von menschlichem C1q völlig
verschieden. Beispielsweise bleibt sie bei hohen pH-Werten von beispielsweise über 8 und insbesondere über 9,2, wo
menschliches C1q inaktiv ist, aktiv; ihre Aktivität wird
nicht durch 0,1 molare Putrescin- oder 0,1 molare Hydrazinlösung
vernichtet.
Die aktive Fraktion von Mäuseserum wird durch herkömmliche Abtrennungsverfahren erhalten, beispielsweise
analog der Gewinnung von menschlichem C1q aus menschlichem Serum. Wenn Mäusevollserum beispielsweise über eine Chroma-
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tografiersäule mit aminierter Agarose, die über Glutaraldehyd
mit menschlichem IgG gekuppelt ist, geleitet wird, wird die aktive Fraktion des Mäuseserums adsorbiert. Die
Fraktion kann anschließend unter Verwendung von 1 molarer Natriumchloridlösung eluiert werden. Das Eluat kann zur
Abtrennung des Natriumchloridsdialysiert und die aktive
Fraktion in Glycinpufferlösung (GBS:0,1m Glycin; HCl-Puffer,
pH 9,2) aufgenommen werden.
Daß Mäuseserum eine aktive Fraktion enthalten könnte, die von menschlichem C1q unterschiedliche Eigenschaften
aufweist, ist gänzlich unerwartet, weil sowohl menschliches Serum als auch die Seren anderer Tiere, wie
beispielsweise diejenigen von Pferden, Ziegen und Kaninchen, offensichtlich eine derartige Fraktion nicht enthalten.
Der Unterschied in den Eigenschaften zwischen der aktiven Fraktion von Mäuseserum und menschlichem C1q führt
zu beträchtlichen Vorteilen bei der Analyse des menschlichen Serums, die weiter unten beschrieben werden.
Insoweit die aktive Fraktion von Mäuseserum menschlichem C1q ähnelt, kann sie für Analysen in der gleichen
Weise wie menschliches C1q eingesetzt werden. Die Verwendung von menschlichem C1q in Analysen ist in der GB-PS
(britische Patentanmeldung 21619/75) beschrieben.
Ein wichtiger Vorteil, den die Verwendung der aktiven Fraktion des Mäuseserums anstelle des menschlichen
C1q in Analysen bietet, besteht darin, daß Mäusevollserum
verwendet werden kann. Es ist nicht wesentlich und gewöhnlich auch nicht notwendig, die aktive Fraktion abzutrennen.
Im Gegensatz dazu ist bei den meisten Analysen, bei denen menschliches C1q als Reagenz verwendet wird, es nicht möglich,
menschliches Vollserum zu verwenden, sondern das C1q muß abgetrennt werden. Die Vermeidung einer derartigen Abtrennungsstufe
ist von großem Vorteil. Außerdem ist Mäuse-
serum weit leichter zugänglich als abgetrenntes menschliches C1q und daher ein wirtschaftlicheres Reagenz.
Bevorzugte Analysenverfahren gemäß der Erfindung
sind die folgenden:
(1) Ein Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers oder Antigens in einer Flüssigkeit, bei dem man
(a) die Flüssigkeit mit einem Antigen oder Antikörper versetzt, der spezifisch für den zu bestimmenden
Antikörper oder das zu bestimmende Antigen in der Flüssigkeit ist unter Ausbildung eines Komplexes
zwischen Antikörper und Antigen versetzt;
(b) das Gemisch aus Stufe (a) mit einer bekannten Menge des zu bestimmenden Antikörpers oder Antigens,
der bzw. das eine Markierung trägt, versetzt;
(c) das in Stufe (b) gebildete Gemisch mit der aktiven Fraktion in einer Menge versetzt, die mindestens
ausreicht, um sich an die Gesamtmenge des in dem Gemisch enthaltenen Komplexes aus Antikörper und
Antigen zu binden; und
(d) die Menge an markiertem Antikörper oder Antigen, das frei in dem Gemisch oder an die aktive Fraktion
gebunden vorliegt, mißt.
Die Markierung kann beispielsweise aus einem Enzym oder Koenzym bestehen, so daß die Aktivität des Enzyms
oder Koenzyms nach der Bindung des Komplexes aus Antikörper und Antigen oder des markierten Komplexes aus
Antikörper und Antigen an die aktive Fraktion inhibiert wird; die Menge an freiem markiertem Antikörper oder
Antigen wird dann durch Messung der Enzym- oder Koenzymaktivität des Gemisches bestimmt, ohne daß erst der Komplex
aus Antikörper und Antigen, der an die aktive Fraktion gebunden ist, entfernt zu werden braucht. Hierfür
geeignete Enzyme sind beispielsweise Catalase und Amylase.
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Alternativ wird bei dem obigen Verfahren (1) der an die aktive Fraktion gebundene Komplex aus Antikörper
und Antigen aus dem Gemisch abgetrennt und anschließend die Menge an markiertem Antikörper oder Antigen,
die in dem Gemisch verblieben ist, gemessen.
(2) Ein Verfahren zum Nachweis eines Komplexes aus Antikörper und Antigen in einer Flüssigkeit, bei dem man
die Flüssigkeit mit der agglutinierenden Fraktion sowie einem Material versetzt, das sich bei Berührung mit der
aktiven Fraktion, die nicht an den Komplex aus Antikörper und Antigen gebunden ist, agglutiniert, und feststellt, ob
eine Agglutination des Materials stattfindet oder nicht.
Vorzugsweise enthält das Material inerte Trägerteilchen, wie beispielsweise einen Latex mit einer Beschichtung
aus einem Immunoglobulin (IgG oder IgM).
(3) Ein Verfahren zum Nachweis eines bestimmten Antikörpers oder Antigens in einer Flüssigkeit, bei dem man die
Flüssigkeit mit einem Antigen oder Antikörper versetzt, das bzw. der in bezug auf den nachzuweisenden Antikörper
oder das nachzuweisende Antigen spezifisch ist, wobei ein Komplex aus Antikörper und Antigen mit dem nachzuweisenden
Antikörper bzw. Antigen gebildet wird, und die Anwesenheit oder Abwesenheit eines derartigen Komplexes
aus Antikörper und Antigen nach dem unter (2) beschriebenen Verfahren feststellt.
(4) Ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörper/Antigen-Komplexen
in einer Flüssigkeit, bei dem man die Flüssigkeit mit einer bekannten Menge inerter Trägerteilchen,
die mit IgG oder IgM beschichtet sind, versetzt, wobei die Teilchen nach Berührung mit des Komplex aus
Antikörper und Antigen und mit der aktiven Fraktion agglutinierbar sind, und außerdem zu der Flüssigkeit
eine Menge dieser aktiven Fraktion hinzusetzt, das so
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gebildete Gemisch inkubiert, die Zahl an nicht agglutinierten Teilchen feststellt und daraus die Menge an
in der Flüssigkeit vorhandenem Komplex errechnet.
Der Ab:Ag-Komplex in der Flüssigkeit kann gebildet
worden sein, indem man eine einen an zu bestimmenden Antikörper oder ein zu bestimmendes Antigen enthaltende Flüssigkeit mit einem entsprechenden Antigen bzw.
Antikörper versetzt, um eine Flüssigkeit zu erhalten, die den Ab:Ag-Komplex enthält, wobei die Menge an zu
bestimmendem Antikörper oder Antigen sich aus der errechneten Menge des Komplexes ableitet.
(5) Ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Flüssigkeit, bei dem die Flüssigkeit mit einer bekannten Menge inerter Trägerteilchen versetzt wird, die mit
einem für das Antigen spezifischen Antikörper beschichtet sind, wobei die Teilchen durch Inberührungbringen
mit dem Antigen und der aktiven Fraktion agglutinierbar sind, und die Flüssigkeit außerdem mit einer Menge der
aktiven Fraktion versetzt wird, das auf diese Weise gebildete Gemisch inkubiert, die Anzahl der nicht agglutinierten Teilchen gezahlt und daraus die Menge an
Antikörper in der Probe errechnet wird.
(6) Ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern in einer Flüssigkeit, bei dem die Flüssigkeit mit einer bekannten Menge inerter Trägerteilchen versetzt wird, die mit
einem für den Antikörper spezifischen Antigen beschichtet sind, wobei die Teilchen durch Inberührungbringen
mit dem Antikörper und der aktiven Fraktion agglutinierbar sind, und die Flüssigkeit außerdem mit einer Menge
der aktiven Fraktion versetzt wird, das auf diese Weise gebildete Gemisch inkubiert, die Anzahl der nicht agglutinierten Teilchen gezählt und daraus die Menge an Antigen in der Probe errechnet wird·
Bei den beiden Verfahren (5) und (6) sind die inerten Trägerteilchen vorzugsweise Latexteilchen, deren
Größe vorzugsweise bei etwa 0,8 bis 1,1/U liegt.
Bei der Analyse von Proben menschlichen Serums unter Verwendung von menschlichem C1q muß die Tatsache
berücksichtigt werden, daß das Serum selbst menschliches Komplement C1 enthält. Um eine Störung durch das resultierende
C1q bei der Serumanalyse unter Verwendung von menschlichem C1q als zugesetztem Reagenz muß das Serum zunächst
einer InaktiVierungsbehandlung für das native C1q unterzogen werden. Ein Verfahren dazu besteht darin, das Serum auf
etwa 56 0C zu erhitzen und es bei dieser Temperatur etwa
30 min zu halten. Während diese Behandlung jedoch zur Inaktivierung des nativen C1q im Serum führt, übt sie auch andere
Wirkungen auf das Serum aus, die die anschließende Analyse weniger genau werden lassen können.
Durch die Verwendung von Mäuseserum oder der abgetrennten
aktiven Fraktion davon als Reagenz gemäß der Erfindung kann die Notwendigkeit für diese Erhitzung bei der
Bestimmung von menschlichen Sera vermieden werden, indem man die Analyse beispielsweise bei einem hohen pH-Wert von
beispielsweise 9,2 durchführt. Bei hohen pH-Werten ist jegliches menschliches C1q in dem zu untersuchenden Serum inaktiv,
während das als Reagenz verwendete Mäuse serum aktiv bleibt. Alternativ kann die Analyse auch in Gegenwart von
0,1m Hydrazin- oder 0,1m Putrescinlösung durchgeführt werden, wobei menschliches C1q inaktiv, Mäuseserum dagegen
nicht inaktiv ist. Diese Eigenschaften des Mäuseserums gestatten es somit, die von nativem C1q herrührenden Störungen
zu vermeiden.
Dies ist eine außerordentlich vorteilhafte Eigenschaft des Mäuseserums oder seiner aktiven Fraktion, die
sich bei der Analyse von menschlichen Sera ausnutzen läßt.
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Die Verfahren gemäß der Erfindung können mit Vorteil nach der bekannten kontinuierlichen Durchflußtechnik
durchgeführt werden. Bei der kontinuierlichen Durchflußanalyse kann Mäuseserum bequemer als menschliches
C1q als Reagenz verwendet werden, weil die Leitungen
und das Bebrütungssystem (manifold and incubation system) für den menschlichen Rheumatoidfaktor auch zur
Verwendung mit Mäuseserum, nicht jedoch mit menschlichem C1q geeignet ist.
Vorzugsweise wird Serum von Mäusen der Stämme BALBc oder DBA2 verwendet. FUr den Gebrauch wird das Mäuseserum
normalerweise im Bereich von etwa 1/25 bis etwa 1/75 verdünnt, wenngleich die genaue Verdünnung von dem im
einzelnen beabsichtigten Verwendungszweck abhängt; hierfür wird ein Lösungsmittel, beispielsweise 0,1m Glycinpuffer,
der mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 9f2 eingestellt
wurde und 0,15 Mol Natriumchlorid enthält, verwendet.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.
Mäuseserum verursacht die Agglutination von mit IgG überzogenen Latexteilchen sowie von durch Wärme aggregiertem
IgG, wobei die aktive Fraktion des Mäuseserums zunächst mit dem durch Hitze aggregierten IgG reagiert.
Wenn somit eine bestimmte Menge Mäuseserum mit Teilchen aus mit IgG überzogenem Latex (Latex-IgG) vermischt
wird, tritt eine Aggregation der Teilchen auf. Wenn danach durch Wärme aggregiertes IgG zugesetzt wird, wird
die aktive Fraktion des Mäuseserums zum Agglutinieren des durch Wärme aggregierten IgG verbraucht, bis schließlich
die Aggregation des Latex aufgehoben ist. Die Aktivität
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des Mäuseserums kann durch die Menge an durch Wärme aggregiertem IgG ausgedrückt werden, die erforderlich ist, um
eine Aggregation des Latex zu verhindern. Analog kann die Aktivität von menschlichem Serum durch die Menge an durch
Wärme aggregiertem IgG ausgedrückt werden, die notwendig gewesen wäre, um das gleiche Ausmaß der Agglutination von
Latex IgG zu verhindern. Durch Versuche mit Seren von 50
gesunden Blutspendern wurde gefunden, daß diese Aktivität höchstens 10*ug/ml von Äquivalenten von durch Wärme aggregiertem
IgG (EHAIgG) beträgt.
Gleichfalls wurde die Aktivität von menschlichen Seren von Patienten mit multipler Sklerose (75 Patienten)
und mit Schilddrüsenstörungen (thyroid disorders; 58 Patienten) gemessen. Unter den Patienten mit multipler Sklerose
wiesen 30% Serumaktivitäten oberhalb 10/Ug/ml (EHAIgG) und unter den Patienten mit Schilddrüsenerkrankungen 65,5% Serumaktivitäten
oberhalb 10/Ug/ml (EHAIgG) auf. Die höheren Aktivitäten gehen auf die Anwesenheit von Immunkomplexen
in den Sera zurück, die bei gesunden Patienten nicht oder praktisch nicht vorhanden sind.
Mäuseserum besitzt eine weitaus größere Affinität gegenüber einigen Immunkomplexen als gegenüber anderen. RF
besitzt ebenfalls eine unterschiedliche Affinität gegenüber Immunkomplexen. Es wird daher empfohlen, daß bei Analysen
menschlicher Sera auf das Vorhandensein von Immunkomplexen sowohl Mäuseserum- als auch RF-Tests parallel durchgeführt
werden. Bezüglich der Verwendung von RF wird auf die GB-PS (britische Patentanmeldung 21619/75) verwiesen.
(1) Herstellung von Mäuseserum
Das Mäuseserum wird in Glycinpufferlösung verdinnt (0,1m
Glycin/HCl-Puffer, pH-9,2, NaCl-Gehalt 0,17 Mol). Die Verdünnung
reicht von 1/50 bis 1/80 je nach der Charge des Mäusesertuas.
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(2) Vorbereitung der Patientenseren vor der Analyse
Ein Serumvolumen von 50/ul wird zu 170 alL Glycinpufferlöäung mit einem Gehalt von 5OmH Ethylendiamintetraessigsäure (pH-9,2) hinzugegeben und das Ganze anschließend
durch 1,5 mM Dithiothreit (15alL) während 15 min bei 37 0C
reduziert. Die Probe wird danach mittels 15/ul 0,2#igen
Wasserstoffperoxids reoxydiert. Die Reduktion der Serumprobe ist dazu bestimmt, jeglichen agglutinierenden Faktor
zu eliminieren, der den Inhibierungsprozeß stören könnte. Die Reoxydation ist erforderlich, um das restliche Dithiothreit zu desaktivieren, das sonst den agglutinierenden Faktor des Mäuseserums zerstören könnte, während diese Behandlung in beschränktem Ausmaß endogenes C1q in den Seren inaktiviert, besteht ihr Hauptzweck darin, andere agglutinierende Faktoren, wie RF, zu desaktivieren. Eine vollständige
Desaktivierung von C1q wird dadurch erzielt, daß man die
Analyse bei einem pH-Wert von 9,2 durchführt.
(3) Latexherstellung
Polystyrolteilchen (0,794/u) der Firma Dow Chemical Company, Indianapolis, Indiana wurden wie folgt mit
menschlichem IgG beschichtet· 400/Ul der 5-fach verdünnten
Glycinpufferlösung wurden mit 25/Ul einer 1#igen (Gewicht/
Volumen) IgG-Lösung, 150>ul einer 1£igen (Gewicht/Volumen)
Lösung von menschlichem Serumalbumin der Behringwerke, Marburg/Lahn und anschließend 50 ail der 10bigen (Gewicht/
Volumen) Latexsuspension zugesetzt. Nach heftigem Rühren während einiger Sekunden und anschließendem 45-minütigem
Bebrüten bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen 5 m-iTi
lang bei 1000 UpM zentrifugiert, die Teilchen einmal mit
1 ml verdünnter Glycinpufferlösung gewaschen und schließlich in 10 ml Glycinpufferlösung mit einem Gehalt von 1tf gewicht/
Volumen) Rinderserumalbumin erneut suspendiert.
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(4) Automatisierte Analyse
Gleiche Volumina (70 /ul) der Serumprobe, des
Mäuseserums und der Latexsuspension, wie oben beschrieben, wurden zusammen in die Leitung gesaugt. Die Inkubationszeit
betrug 10 min. Nach der Inkubation wurde das Gemisch automatisch
auf das 200-Fache mit Glycinpufferlösung, die 0,1% Sorbimacrogollaurat (Tween 20) enthielt, verdünnt, wonach
die nicht agglutinierten Latexteilchen in einem Zähler mit optischer Zelle (Autocounter von Technicon) mit einer unteren
und oberen Schwelle gezählt wurden. Der Ansatz erforderte eine 2000-fache Verdünnung der Latexsuspension, um die
Zählung auf einen Maximalwert von 4000 Teilchen/s zu begrenzen.
(5) Ergebnisse
Eine Verdünnungsreihe mit dem Faktor 2 für Mäuseserum ergibt die Agglutinationskurve von Fig. 1. Die Ordinaten
geben die Höhen der Maxima auf dem Aufzeichnungsgerät wieder. Die Höhe ist direkt der Zahl der freien (nicht
agglutinierten) Teilchen proportional.
Die Standardkurve (Fig. 2) wurde über einen Konzentrationsbereich von durch Hitze aggregiertem IgG in
Glycinpufferlösung bestimmt. Die Ergebnisse sind in /Ug/ml
Äquivalente von durch Wärme aggregiertem menschlichen IgG ausgedrückt. Letzteres wurde durch Chromatografie an
2-Diethylaminoethylcellulose aus einem Vorrat an menschlichen
Seren hergestellt und durch 30-minütiges Erhitzen auf 63 0C aggregiert.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Inhibierung von Mäuseserum durch Sera von gesunden Blutspendern, Patienten
mit Brustkrebs und Patienten mit systemischem Lupus Erythematosus (SLE; Schmetterlingsflechte). Die Obergrenze für
die normalen Werte liegt bei 7 /Ug/ml Äquivalente von durch Wärme aggregiertem IgG.
Leerseite
Claims (21)
- Potexücnrwräli· 8967Dr-H SiIlMm KöicbelBiri-'ijfl. V."-:-';;^-g Hcichal
b ^iaux- ίία. 1Paxkafrαϋθ 13TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStAPatentansprüche1J Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern, Antigenen oder Komplexen aus Antikörpern und Antigenen in Flüssigkeiten,dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit vor oder nach der Zugabe anderer Reagenzien unter Ausbildung einer Bindung mit in der Probe vorhandenem oder erzeugtem Komplex aus Antikörper und Antigen mit der aktiven Fraktion von Mäusevollserum versetzt. - 2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man die aktive Fraktion in Form von Mäusevollserum zusetzt. - 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen,dadurch gekennzeichnet, daß man(a) die Flüssigkeit mit einem Antigen oder Antikörper, das bzw. der gegenüber dem in der Flüssigkeit zu bestimmenden Antikörper bzw. Antigen spezifisch ist, unter Ausbildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes versetzt,(b) das Gemisch aus Stufe (a) mit einer bekannten Menge des zu bestimmenden Antikörpers bzw. Antigens, der bzw. das eine Markierung trägt, versetzt,(c) das in Stufe (b) gebildete Gemisch mit der aktiven Fraktion in einer Menge, die mindestens zur Bindung an die Gesamtmenge des Antikörper/Antigen-Komplexes in dem Gemisch ausreicht, versetzt und809826/0605275A350(d) die Menge an markiertem Antikörper bzw. Antigen, das frei in dem Gemisch oder an die aktive Fraktion gebunden vorliegt, mißt.
- 4. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung ein Enzym oder Koenzym verwendet, so daß die Aktivität des Enzyms oder Koenzyms nach der Bindung des Antikörper/Antigen-Komplexes oder markierten Antikörper-Antigen-Komplexes an die aktive Fraktion inhibiert wird, und daß die Menge an freiem markiertem Antikörper oder Antigen dadurch bestimmt wird, daß man die Enzym- oder Koenzymaktivität des Gemisches mißt, ohne vorher den Antikörper/Antigen-Komplex, der an die aktive Fraktion gebunden ist, zu entfernen. - 5. Verfahren gemäß Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß man einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen verwendet, das als Markierung Katalase oder Amylase trägt. - 6. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper/Antigen-Komplex, der an die aktive Fraktion gebunden ist, von dem Gemisch abtrennt und anschließend die Menge an markiertem Antigen oder Antikörper, die in dem Gemisch zurückgeblieben ist, mißt. - 7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zum Nachweis eines Antikörper/Antigenkomplexes in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit mit der agglutinierenden Fraktion und einem Material versetzt, das nach Inberührungbringen mit demjenigen Teil der aktiven Fraktion, der nicht an Antikörper/ Antigen-Koraplexe gebunden ist, zur Agglutination veranlaßt wird, versetzt und feststellt, ob eine Agglutination des Materials stattfindet oder nicht.809826/0605
- 8. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Material eine Beschichtung aus IgG oder IgM auf inerten Trägerteilchen verwendet. - 9. Verfahren gemäß Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen ein Latex enthalten. - 10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zum Nachweis eines bestimmten Antikörpers oder Antigens in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit mit einem Antigen bzw. Antikörper versetzt, das bzw. der gegenüber dem nachzuweisenden Antikörper bzw. Antigen spezifisch ist, um einen Antikörper/ Antigen-Komplex mit dem vorhandenen Antikörper bzw. Antigen zu bilden, und das Vorhandensein oder NichtVorhandensein eines Antikörper/Antigen-Komplexes nach dem Verfahren gemäß Anspruch 7, 8 oder 9 bestimmt.
- 11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung von Antikörper-Antigen-Komplexen in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit mit einer bekannten Menge von mit IgG oder IgM überzogenen inerten Trägerteilchen versetzt, die nach Inberührungbringen mit dem Antikörper/Antigen-Komplex und mit der aktiven Fraktion agglutinierbar sind, die Flüssigkeit außerdem mit einer Menge der aktiven Fraktion versetzt, das auf diese Weise erhaltene Gemisch inkubiert, die Anzahl an nicht agglutinierten Teilchen zählt und daraus die Menge an Komplex in der Flüssigkeit errechnet.
- 12. Verfahren gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper/Antigen-Komplex in der Flüssigkeit dadurch "bildet, daß man eine einen zu bestimmenden Antikörper oder ein zu bestimmendes Antigen enthaltende Flüssigkeit mit einem entsprechenden Antigen bzw. Antikörper unter Herstellung einer den Antikörper/Antigen-Komplex enthaltenden Flüssigkeit versetzt und daß man die Menge des zu bestimmenden Antikörpers oder Antigens von der berechneten Menge des Komplexes ableitet. - 13. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung eines Antigens in einer Flüssigkeit,dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit mit einer bekannten Menge von mit einem Antikörper für das Antigen beschichteten inerten Trägerteilchen versetzt, die nach Inberührungbringen mit dem Antigen und der aktiven Fraktion agglutinierbar sind, und daß man die Flüssigkeit außerdem mit einer Menge der aktiven Fraktion versetzt, das auf diese Weise hergestellte Gemisch inkubiert, die Anzahl der nicht agglutinierten Teilchen feststellt und daraus die Menge an Antigen inAer Probe errechnet.
- 14. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung eines Antikörpers in einer Flüssigkeit,dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit mit einer bekannten Menge von mit einem Antigen für diesen Antikörper überzogenen inerten Trägerteilchen versetzt, die durch Inberührungwbringen mit dem Antigen und mit der aktiven Fraktion agglutinierbar sind, und daß man die Flüssigkeit weiter mit einer Menge der aktiven Fraktion versetzt, das auf diese Weise gebildete Gemisch inkubiert, die Anzahl an nicht agglutinierten Teilchen bestimmt und daraus die Menge an Antikörper in der Probe errechnet.809826/0605
- 15. Verfahren gemäß Anspruch 11, 12, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als inerte Trägerteilchen Latexteilchen verwendet.
- 16. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Latexteilchen mit einer Größe von etwa 0,8 bis 1,1 /U verwendet.
- 17. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit eine biologische Flüssigkeit menschlichen Ursprungs verwendet.
- 18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die aktive Fraktion mit dem Komplex aus Antikörper und Antigen bei einem pH-Wert von mindestens 8 bindet.
- 19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als pH-Wert einen solchen von mindestens 9,2 wählt.
- 20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die aktive Fraktion mit dem Antikörper/Antigen-Komplex sich in Gegenwart von 0,1m Putrescin- oder 0,1m Hydrazinlösung binden läßt.
- 21. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man es nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip durchführt.809826/0605
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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