DE68907365T2

DE68907365T2 - Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins leichter Ketten in Urinproben, Komplex von Vorbereitungen zur Erledigung des Verfahrens und damit verbundenes Reagenz.

Info

Publication number: DE68907365T2
Application number: DE89200687T
Authority: DE
Inventors: Leonardo Massaro
Original assignee: NEW SCIENT CO SpA
Current assignee: NEW SCIENT CO SpA
Priority date: 1988-04-01
Filing date: 1989-03-20
Publication date: 1994-02-03
Anticipated expiration: 2009-03-21
Also published as: EP0336472A1; ES2041967T4; IT1216698B; EP0336472B1; IT8820089A0; US5141877A; ES2041967T3; ATE91181T1; DE68907365D1

Description

Es ist bekannt, daß ein Immunglobulin schematisch aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten aufgebaut ist. Bestimmungen der Gegenwart freier leichter Ketten, von Bence Jones auch Proteine genannt, im Urin ist vom diagnostischen Standpunkt aus von großem Interesse.
Die freien leichten Ketten liegen in Spuren im Serum normaler untersuchter Personen vor, liegen im Urin jedoch praktisch nicht vor. Die Gegenwart der leichten Ketten im Urin ist ein Hinweis auf die Existenz eines pathologischen Zustands, insbesondere immunologischer Natur.
Tatsächlich setzt die Gegenwart freier leichter Ketten im Urin deren anomalen Anstieg in dem Serum der untersuchten Person voraus, jedoch passieren freie leichte Ketten aufgrund ihres leichten Molekulargewichts den Glomerulusfilter und bestehen im Blut nicht fort. Es ist daher notwendig, eine indirekte Untersuchung durchzuführen, um ihre Gegenwart im Urin festzustellen.
Die Gegenwart freier leichter Ketten im Urin, die eine Folge ihres Anstiegs im Blut ist, ist mit immunologischen Pathologien verbunden, die zusammengefaßt werden können als (a) die Gegenwart monoklonaler freier leichter Ketten, d. h. immunoproliferative Krankheiten, wie multiples Myelom, mikromolekulares Myelom, Waldenstrom's Makroglobulinämie, chronische lymphatische Leukämie und primäre Amyloidose; und (b) die Gegenwart von polykonalen freien leichten Ketten, d. h. Hyperimmunkrankheiten, wie systemischer Lupus erythematosus, akute primärchronische Polyarthritis und sekundäre Amyloidose.
Diagnostische Verfahren, die auf der Bestimmung von freien leichten Ketten im Urin basieren sind von großem Interesse, sie sind derzeit jedoch durch Schwierigkeiten bei der Durchführung einer solchen Untersuchung blockiert. Das derzeit am meisten verbreitetste Verfahren benötigt eine elektrophoretische Analyse des konzentrierten Urins.
Diese Technik erfordert notwendigerweise aufgrund des relativ geringen Prozentsatzes an freien leichten Ketten in der organischen Flüssigkeit selbst bei ernsthaften pathologischen Zuständen der untersuchten Person die Konzentration der Probe. Die elektrophoretische Untersuchung der unkonzentrierten Probe ergibt eine unakzeptabel geringe Empfindlichkeit und eine sich daraus ergebende Unzuverlässigkeit. Die Zeit, die für die Konzentration benötigt wird, addiert sich jedoch mit den offensichtlichen Nachteilen zu der Zeit, die für die elektrophoretische Analyse erforderlich ist. Die mit den konzentrierten Proben durchgeführte Analyse erhöht zweifellos die Zuverlässigkeit der Ergebnisse, ohne jedoch eine annehmbare Sicherheit zu erreichen. Es ist daher sehr ratsam, von den Proben, die sich bei der Elektrophorese als verdächtig herausstellen, Immunfixierungs- oder Immunelektrophoresetests durchzuführen, deren Arbeitsaufwand und Kosten bekannt sind, um wirklich einen zufriedenstellenden Empfindlichkeitsgrad und daher auch eine hinreichende Zuverlässigkeit der Analysenergebnisse zu erreichen.
Ein anderes Verfahren zum Nachweis der Gegenwart freier leichter Ketten in einer Urinprobe ist in Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1984, 44(2), 173-6, beschrieben, worin die turbidimetrische Bestimmung von Bence-Jones-Proteinen mit Anti-leichte-Kette-Antiseren beschrieben ist. Das Dokument lehrt die Konzentration von Bence-Jones-Proteinen aus Urin, und es gibt keinen Hinweis auf die relative Menge von Anti- leichte-Kette-Antiseren. In diesem Teil des Standes der Technik wird diese Art von Bestimmung jedoch so bewertet, daß diese einen durch verschiedene polymere Formen leichter Ketten verursachten Artifakt gibt.
Das Journal of Immunological Nethods 39 (4), 355 - 362 (1980) beschreibt ebenfalls die turbidimetrische Bestimmung, jedoch lediglich von kappa- und lambda-IgG in Serum und mit zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern.
EP-A-0 044 219 beschreibt die Analyse von kappa- und lambda-IgG mittels Präzipitierung mit zwei monoklonalen Antikörpern, die für zwei spezifische antigene Stellen auf dem IgG spezifisch sind.
Die Analyse von Bence-Jones-Proteinen, die durch andere Standardverfahren als die Trübungsanalyse durchgeführt wird, ist beispielsweise in US-A-3 907 502 beschrieben.
Das Ziel der Erfindung ist es, ein quantitatives und qualitatives Bestimmungsverfahren für die Gegenwart von freien leichten Ketten in Urin vorzuschlagen, das in äußerst kurzer Zeit mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit auf einfache Weise durchzuführen sein soll, insbesondere im Vergleich zu den Zeiten, die bei den derzeitig verwendeten Analyseverfahren erforderlich sind.
Ein zusätzliches Ziel der Erfindung ist es, dem Benutzer einen Komplex von Substanzen in Kitform verfügbar zu machen, der geeignet ist, das vorgeschlagene Diagnoseverfahren in die Praxis umzusetzen.
Die Erfindung basiert auf der Beobachtung, daß eine Antigen-Antikörper-Reaktion zur Bestimmung der Gegenwart freier leichter Ketten im Urin ohne vorherige Konzentration verwendbar ist, die zu Trübungswerten führt, die die Bewertung der Gegenwart solcher Ketten mit signifikanter qualitativer und quantitativer Zuverlässigkeit erlaubt. Insbesondere schlägt die Erfindung ein Diagnoseverfahren vor, das auf der Bestimmung der Konzentration leichter Ketten im Urin basiert, umfassend die Phasen (a) Zentrifugieren der Urinprobe und Abtrennen des Überstands, (b) Zugabe eines Anti-freie-leichte-Kette-Antiserum-Reagenzes, das mit einem Überschuß an Antikörpern arbeitet, zu der Probe, und (c) Bewertung der Trübung der umgesetzten Probe.
Insbesondere, wenn eine quantitative Bewertung erforderlich ist, ist bei dem Verfahren die Zugabe eines Antiserum-Reagenzes zu der Eichprobe, die freie leichte Ketten enthält, in einer vorher bestimmten Quantität notwendig, um Kalibrierungskurven für das quantitative Analyseverfahren mittels Trübungsvergleich zu erhalten.
Das Anti-leichte-Kette-Antiserum ist durch jedes beliebige der bekannten Verfahren für diesen Zweck erhältlich, im allgemeinen von einem Tier, das mit freien leichten Ketten immunisiert wurde.
Es sind zwei Typen von leichten Ketten bekannt, die herkömmlicherweise als kappa und lambda bezeichnet werden, die zur Immunisierung der Tiere verwendet werden können, um die korrespondierenden Antiseren zu erhalten.
Ein solches Antiserum reagiert mit allen Antigenstellen auf der leichten Kette, einschließlich derjenigen, die als "versteckt" bezeichnet werden können, wenn die leichte Kette mit der schweren Kette verknüpft ist. Dieses Antiserum zeigt dann sowohl die verknüpften leichten Ketten als auch die freien leichten Ketten.
Es ist möglich, ein Anti-freie-leichte-Kette-Antiserum zu erhalten, indem man von diesen die Antikörper abtrennt, die gegen die antigenen Stellen gerichtet sind, die durch die leichte Kette nicht "versteckt" sind; dies kann dadurch erreicht werden, daß man das Antifreie-leichte-Kette-Antiserum mit ganzen Immunglobulinen umsetzt und die Antikörper, die nicht reagiert haben, wiedergewinnt. Solch ein Antiserum reagiert lediglich mit kappa- oder respektive mit lambda-freien leichten Ketten und reagiert nicht mit verknüpften leichten Ketten.
Zur besseren Klarstellung der Eigenschaften des Verfahrens gemäß der Erfindung ist im folgenden eine praktische Ausführungsform desselben beschrieben.
Ein Kit von Produkten, die zur Durchführung der Analyse gemäß der Erfindung notwendig sind, enthält typischerweise die folgenden Komponenten.
(a) Anti-freie-leichte-Kette-Antiserum-Reagenz, bestehend aus Verdünnungsantiserum, z. B. in Konzentrationen von 20 % Anti-freie- kappa-leichte-Kette-Antiserum. 20 % Anti-freie-lambda-leichte-Kette- Antiserum und 60 % einer 4 %-igen Lösung von PEG 6000 in einer physiologischen Pufferlösung (PBS) (Phosphatpuffer bei pH 7,4). Es ist vorteilhaft, ein Konservierungsmittel, wie 0,1 %-iges Natriumazid zuzugeben.
(b) Eichmittel
Diese können als positive Kontrollen des qualitativen Verfahrens und als Eichmittel für das quantitative Verfahren verwendet werden.
Die verwendeten Proben stammen von Patienten mit sezernierendem mikromolekularem Myelom. Da in der Literatur kein Referenzverfahren angegeben war, wurde Elektrophorese an den Proteinen im Urin durchgeführt, wobei das Vorliegen einer breiten Bande beobachtet wurde, die nachfolgend durch Immunfixieren als freie kappa- und -lambda-leichte Ketten, begleitet von einer kaum sichtbaren Albuminbande, typifiziert wurde. Die Gesamtproteinmenge wird daher als mit der Menge der freien leichten Ketten praktisch zusammenfallend angesehen. Die Dosis sämtlicher Proteine wurde mittels der Bradford-Methode bestimmt. Die Proben werden unter Zugabe eines Konservierungsmittels (1 % Natriumazid) gefriergetrocknet, zur Verwendung mit destilliertem Wasser verdünnt, dann mit PBS, um die Standardkurve für das quantitative Verfahren aufzutragen.
(c) Reagenz ohne Antiserum. Die Zusammensetzung dieses Reagenzes ist dieselbe wie diejenigen des Antiserum-Reagenzes, jedoch ohne das letztere, und ist im Kontroll- und Eichverfahren als Standard zu verwenden.
Der Arbeitsvorgang bei der Durchführung der Analyse gemäß der Erfindung kann wie folgt zusammengefaßt werden.
Die Reagentien mit und ohne Antiserum werden auf die Temperatur der Umgebung gebracht, wobei das Volumen des ersteren, das für die Analyse notwendig ist, gefiltert wird, falls es nicht klar sein sollte.
Das Reagenz ohne Antiserum wird in einem Teströhrchen mit dem Eichmittel gemischt, und die so erhaltene umgesetzte Substanz muß klar sein.
Dann wird das Antiserum-Reagenz mit dem Eichmittel gemischt, und die umgesetzte Substanz muß trübe sein.
Wenn die Anzeigen nicht so sind, wie es erwartet wurde, liegt dies an einem Vorgehensfehler oder einer Anomalie des Reagenzes, und diese müssen daher verworfen werden.
Nach Zentrifugieren der Probe wird diese mit Antiserum-Reagenz behandelt. Trübung ist ein Zeichen auf das Vorliegen von kappa- oder lambda-leichte-Ketten oder von beiden.
Die Einzelheiten des Verfahrens zur Durchführung der Antiserum- Probe-Reaktion werden hier nicht angegeben, da dies die üblichen sind, die dem Durchführen von Antigen-Antikörper-Reaktionen folgen. Es ist klar, daß der Vorgang mit einem Überschuß des letzteren durchgeführt wird, und daß bei zweifelhaften oder negativen Proben eine extra Menge Urin zu dem Teströhrchen zugegeben werden kann, und dann bestimmt wird, ob diese Zugabe die Trübung in der erwünschten Weise modifiziert.
Für eine instrumentelle Mengenanzeige muß die Eichkurve so konstruiert sein, daß das Analyseverfahren mit dem Antiserumreagenz mit Proben wiederholt wird, die von Lösungen mit verschiedenen Prozentsätzen des Eichmittels in Kochsalzpufferlösung erhalten wurden.
Beispielsweise können Trübungswerte mit 20 %-igen, 40 %-igen, 60 %-igen, 80 %-igen und 100 %-igen Eichlösungen bestimmt werden. Auf diese Weise ist es möglich, auf einer kartesischen Karte die Konzentrationen der freien leichten Ketten von den Eichlösungen auf der Basis der optischen Dichte verglichen mit dem Standard zu zeigen, wobei die Messung mit einer geeigneten Vorrichtung, wie dem Mod. 336 Biotron Photometer oder dem Cobas Bio Analysator (Roche) bestimmt wird.
Wie zuvor erwähnt, ist die Konzentration der freien leichten Ketten in dem Eichmittel, die gefriergetrocknet vorliegen und durch Verdünnen in einer vorbestimmten Menge destillierten Wassers dekonstituiert werden, bekannt.
Es ist eine Alternative zu dem zuvor genannten Verfahren möglich, bei der nicht ein einzelnes kappa- und lambda-Anti-freie-leichte- Kette-Antiserum-Reagenz, sondern zwei separate kappa- bzw. lambda- Anti-freie-leichte-Kette-Reagentien verwendet werden. Auf diese Weise werden getrennte Ergebnisse der Konzentration der beiden Kettentypen erhalten, wenn dies für besondere diagnostische oder experimentelle Anforderungen erwünscht ist. Ansonsten ändert sich in dem zuvor genannten Verfahren nichts. In diesem Fall ist es ratsam, vorher kappa- bzw. lambda-Eichmittel für die Kontrollen herzustellen, die dem Analyseverfahren der Probe und der Herstellung der Eichkurven für die quantitative Analyse vorangehen.
Die Analysenergebnisse wurden nachgeprüft, indem man eine herkömmliche Elektrophoreseuntersuchung der Proben, die gemäß der Erfindung analysiert wurden, durchführte, wobei die Korrektheit der durch letztere erhaltenen Ergebnisse bestätigt wurde. Proben, die bei herkömmlicher Elektrophoreseuntersuchungen negativ waren, waren positiv, wenn sie je nach den Praktiken der verschiedenen Laboratorien auf das 10- bis 50-fache konzentriert wurden.
Die einzigartige und erstaunliche Wirksamkeit des Verfahrens wird durch die Tatsache gezeigt, daß eine Konzentration von annähernd 4 mg/dl leichter Ketten mit diesem bestimmt wurde, was zeigte, daß die Verwendung auf diesem speziellen Gebiet der Technik der Antigen-Antikörper-Reaktion für das Problem der Identifizierung freier leichter Ketten im Urin zu zufriedenstellenden Ergebnissen geführt hat. Die einzige Beschränkung des Verfahrens ist praktisch seine Unfähigkeit, zwischen monoklonalen und polyklonalen leichten Ketten zu unterscheiden, wie dies bei Verwendung der Analyse mittels Elektrophorese mit Immunfixierung möglich ist.
Die positive Natur der Analyse für nur eine der beiden leichten Ketten, kappa oder lambda, kann jedoch als ein ziemlich sicheres Zeichen angesehen werden. daß die in der Probe vorliegenden Ketten monoklonal sind.
Diese Einschränkung wird jedoch bei weitem durch die Geschwindigkeit, die Zuverlässigkeit und die Einfachheit der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung, verglichen mit den bislang für diesen Zweck verwendeten Verfahren, kompensiert. Lediglich bei denjenigen Proben, die sich bei der Analyse gemäß der Erfindung als positiv herausstellten, ist es erforderlich, darüber hinaus immunoelektrophoretische Analysen oder Immunofixierung durchzuführen, um, falls gewünscht, die Natur der freien leichten Ketten zu bestimmen.
An dieser Stelle sollte beachtet werden, daß bei dieser Art der diagnostischen Analyse ein positives Ergebnis als, wenn nicht außergewöhnlich, sicherlich als statistisch sehr selten anzusehen ist. Es ist daher sehr hilfreich, das Verfahren gemäß der Erfindung verfügbar zu haben, das ein erstes Screenen der Proben mit sehr hoher Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Ergebnisses gestattet, da die Untersuchungen darüber hinaus an einer begrenzten Anzahl von Proben fortgesetzt werden können, die sich bei der Analyse als positiv herausgestellt haben.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von freien leichten Ketten in unverdünnten und unkonzentrierten Urinproben, umfassend die Phasen (a) Zentrifugieren der Urinprobe und Abtrennen des Überstands, um die Bestimmung durchzuführen, (b) Zugabe eines Antileichte-Kette-Antiserum-Reagenzes zu der Probe, wobei mit einem überschuß von Antikörpern gearbeitet wird, und (c) Bewertung der Trübung der umgesetzten Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe sukzessive mit jeweils kappa- und lambda-Anti-freie- leichte-Kette-Antiseren umgesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trübung der umgesetzten Probe durch Vergleich mit dem Produkt der Reaktion des Antiserum- Reagenzes mit einem Eichmittel bewertet wird, das einen vorbestimmten Gehalt an freien leichten Ketten aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß für den Vergleich eine Eichkurve erstellt wird, wobei der Trübungswert des Reaktionsprodukts von Antiserum-Reagenz mit Proben, die aus Eichlösungen verschiedener Konzentrationen hergestellt wurden, instrumentell bewertet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz durch Immunisierung von Tieren mit freien leichten Ketten erhalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eichmittel aus dem Urin von Patienten mit mikromolekularem Myelom erhalten wird.

7. Komplex von Produkten in Form eines Kits zum Bestimmen der Gegenwart von freien leichten Ketten in unkonzentrierten Urinproben, bestehend aus (a) einem Anti-freie-leichte-Kette-Antiserum-Reagenz, (b) einem Reagenz ohne Antiserum mit einer Zusammensetzung, die im wesentlichen dieselbe ist, wie diejenige des Antiserum-Reagenzes und (c) einem Eichmittel, das aus einer Substanz besteht, die freie leichte Ketten in vorher bestimmten Konzentrationen enthält.

8. Komplex von Produkten nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum-Reagenz Anti- kappa- und Anti-lambda-freie-leichte-Kette- Antikörper enthält.

9. Komplex von Produkten nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum-Reagenz in dem Komplex von Produkten als separate Portionen von kappa-Anti-leichte-Kette-Antiserum und lambda- Anti-leichte-Kette-Antiserum enthalten ist.

10. Komplex von Produkten nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Eichmittel aus einer gefriergetrockneten Substanz aus dem Urin von Patienten besteht, die an mikromolekularem Myelom leiden, und daß er vor der Verwendung mit destilliertem Wasser rekonstituiert wird.