DE3012565A1

DE3012565A1 - Antitumor-antibakterielle mittel

Info

Publication number: DE3012565A1
Application number: DE19803012565
Authority: DE
Inventors: Hideo Koshiyama; Hiroaki Ohkuma; Fumihide Sakai
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1979-04-02
Filing date: 1980-03-31
Publication date: 1980-10-23
Also published as: NO800967L; JPS63139192A; DK153501C; DE3012565C2; JPS55162752A; YU41700B; GB2050384A; JPH0341157B2; FI67403B; SE441930B; DK138780A; FI800973A; DK153501B; FR2452930B1; IE49191B1; PH16970A; CH647247A5; JPH0341475B2; NL8001868A; AU533672B2

Description

PATENTANWÄLTE

J. REITSTÖTTER

PROP. DR. DR. DIPL. ING.

W. BUNTE (1ΟΒ8-1Ο7Θ) DR. ING.

W. KINZEBACH

DR. PHIL. DIPL. CHBM.

K. P. HÖLLER

DR. RBR. NAT. DIPL. CHBM.

TELEFON ι (089) 37 6883 TBLEXi 0210Ξ0Θ ISAR D

BAUBRSTRASSB 22. 80OO MÜNCHEN 4O

Müncheni 31. März 1980 M/21 065

BRISTOL-MYERS COMPANY 345 Park Avenue

New York, N.Y.10022 USA

Anti tumor-antibakteriel le Mittel

004 37 0725

■'■ ί! Ι

Die Erfindung betrifft einen neuen antitumor-antibiotischen Komplex und Verfahren für die Herstellung, Gewinnung und Trennung in bioaktive Bestandteile.

Aufgrund der vorliegenden Spektraldaten und der physikalischchemischen Eigenschaften scheint der erfindungsgemäße antitumorantibiotische Komplex strukturell verwandt zu sein mit der Chinoxalingruppe von Antibiotika wie z.B. Echinomycin, Dell et al, J. Am. Chem. Soc, 9_7, 2497 (1975), Chinomycine, Shoj i et al, J.Antibiotics, 14A, 335 (1961) und Triostin C, Merck Index, 9. Auflage, 9399. Jedoch unterscheidet sich der antitumor-antibiotische Komplex von diesen Antibiotika in folgender Hinsicht:

1. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile enthalten als Chromophor einen Chinolinkern anstelle von Chinoxalin, der bei der Actinoieukingruppe von Antibiotika vorhanden ist.

2. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile enthalten

kein Schwefel , während in der Struktur der Actinoleukin-Antibiotika eine Disulfid- oder Thioacetalbrücke vorhanden ist.

3. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile besitzen nur eine verhältnismäßig geringe antimikrobieile Aktivität im Vergleich zu den Actinoleukinen, die starke antibakterielle Antibiotika sind.

Die Erfindung betrifft einen neuen antitumor-antibiotischen Komplex, der als BBM-928 bezeichnet wird. Dieser Komplex enthält wenigstens sechs Bestandteile und wird gewonnen durch Kultivieren eines BBM-928 produzierenden Actinomycetesstammes (ATCC 31491) oder eines Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung des BBM-928-Komplexes aus dem Kulturmedium und die Trennung des Komplexes in seine bio-

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JS-

aktiven Bestandteile durch Gegenstromverteilung oder chromatographische Techniken.

Die Erfindung betrifft den BBM-928-Komplex und auch seine bioaktiven Bestandteile BBM-928 A₅ B, C, D, E und F. Sie betrifft insbesondere die Bestandteile BBM-928 A₅ B, C und D in verdünnter Form., als echte Konzentrate und in gereinigter Form.

Von den Zeichnungen zeigen:

Figur 1 ein Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928A in KBr₅

Figur 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928B in KBr,

Figur 3 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928C in KBr,

Figur 4 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928D in KBr₅

Figur 5 das NMR-Spektrum von BBM-928A,gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard,aufgezeichnet auf einem 90 MHz NMR-Spektrometer,

Figur 6 das NMR-Spektrum von BBM-928B, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet auf einem 90 MHz' NMR-Spektrometer,

Figur 7 das NMR-Spektrum von BBM-928C, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet mit einem 90 MHz NMR-Spektrometer,

Figur 8 das NMR-Spektrum von BBM-928D, gelöst in deuteriertem [ Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet; auf einem 90 MHz NMR-Spektrometer. ι

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copy

Die Erfindung betrifft einen neuen antitumor-antibiotischen Komplex, der als BBM-928 bezeichnet wird. Von diesem Komplex wird angenommen, daß er strukturell verwandt ist mit der Actinoleukingruppe von Antibiotika. Er wird gebildet durch Fermentation von einem bis jetzt unidentifizierten Stamm von Actinomyceten. Jeder Actinomycetenstamm, der zur Bildung von BBM-928 in einem Kulturmedium in der Lage ist, kann benutzt werden, wobei der bevorzugte produzierende Mikroorganismus in der Bristol-Banyu-Kulturensammlung als Actinomycetenspecies Stamm Nr. G455-101 bezeichnet wird. Der Mikroorganismus wurde aus einer auf den Philippinischen"Inseln entnommenen Bodenprobe isoliert und wurde in der amerikanischen Kulturensammlung von Mikroorganismen als ATCC 31491 hinterlegt.

Der neue antitumor-antibiotische Komplex der vorliegenden Er- ! findung besitzt mindestens sechs Bestandteile, die als BBM-928A, B, C, D, E und F bezeichnet sind. Bestandteile A, B, C und D ; vom BBM-928-Komplex wurden in kristalliner Form isoliert, wobei ; die chemischen Strukturen der Bestandteile A, B und C identifiziert wurden. Der erfindungsgemäße Komplex (und die einzelnen Bestandteile) besitzen antitumor-antibakterielle Eigenschaften. < Wegen der antibakteriellen Aktivität können der Komplex und seine einzelnen Bestandteile als Nahrungszusätze für Tierfutter \ und als therapeutische Mittel zur Behandlung von bakteriellen ^; Infektionen bei Säugetieren eingesetzt werden. Zusätzlich kön- l nen die Antibiotika für die Säuberung und Sterilisierung von Laborglasgeräten und chirurgischen Instrumenten eingesetzt wer- i den und können in Verbindung mit Seifen, Waschmitteln und Wasch-, lösungen für sanitäre Zwecke verwendet werden. Aufgrund der Antitumor-Eigenschaften sind der Komplex und seine einzelnen Bestandteile speziell wirksam gegen eine Vielzahl von intraperitoneal implantierten Mäusetumoren.

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.■>**■■

Im folgenden wird der bevorzugte, den antibiotischen Antitumorkomplex BBM-928 produzierenden Mikroorganismus generell beschrieben. Die kulturraäBigen, physiologischen und morphologischen Eigenschaften des Organismus wurden nach den üblichen taxonomischen Methoden bewertet, z.B. Shirling et al, Int. J. Syst. Bacteriol. J_6_, 313 (1966) und Lechevalier et al, Biol. Actinomycetes Related Org. JJ_, (1976).

Mi kromorpholögie

Der Stamm Nr. G455-101 bildet sowohl Substrat- als auch Luftmyzele. Das Substratmyzel ist gut entwickelt, lang und verzweigt (0,5-0,8 μ breit). Eine ausgeprägte Fragmentierung des Substratmyzels wird nicht beobachtet. Im Gegensatz zu gewöhnlichen Specien von Streptomyces bildet der Stamm G455-101 nur kurze oder rudimentäre Luftmyzele. In einigen Agarmedien werden überhaupt keine gebildet. In dem Luftmyzel werden kurze oder lange Sporenketten gebildet, die 2-50 ovale Sporen in einer Kette (meistens 5-20 Sporen) enthalten. Die Sporenketten besitzen eine gerade, sich schlängelnde oder gewundene Form. Die Sporen besitzen eine sphärische (0,3-0,4 μ), ovale oder zylindrische (0,3 χ 1,5 - 3,0 μ) Form mit einer glatten Oberfläche. Die Sporen sind oft durch leere Hyphen voneinander getrennt. Gelegentlich wird eine amorphe Sporangium-ähnliche Blase auf dem Luftmyzel beobachtet, die kurze, spiralenförmige Sporenketten umschließt.

Zellwandzusammensetzung und Gesamtzel1 Zuckerbestandteile

Die Zellwand des Stammes G455-101 enthält Meso-diaminopimelinsäure jedoch kein Glycin. Das Hydrolyseprodukt der gesamten Zelle zeigt die Anwesenheit von Glukose, Mannose und Madurose (3-0-Methyl-D-galactose). Die zuvor erwähnte Zellwandzusammen-Setzung und die Gesamtzellzuckerbestandteile deuten darauf hin, daß der Stamm G455-101 eine Actinomycetesspecie des Zellwand-

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typs HIB ist.

Kulturroäßige und physiologische Charakteristika

Der Stamm G455-101 wächst reichlich, bildet ein blaß-rötliches oder gräulich-blaß-rötliches Luftmyzel und produziert in nährstoffreichen Agarmedien, wie Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar und Hafermehlagar, ein rötliches, wasserunlösliches Pigment. Im anorganischen SaIz-Stärkeagar , Glycerin-Asparaginagar und Tyrosinagar wächst es spärlich, bildet ein weißes oder beiges rudimentäres Luftmyzel und produziert nur geringe Mengen des rötlichen Pigmentes. Das Melanoidpigment wird in Pepton-Hefe-Eisenagar und Tyrosinagar nicht produziert. Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Es wächst reichlich bei 28°C, 37°C und 45°C, jedoch nicht bei 10⁰C oder 50⁰C. Pentosen und Hexosen werden gut von dem Stamm verwertet. Kulturmäßige und physiologische Charakteristika des Stammes G455-101 sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Die Verwertung von Kohlenstoffquellen ist in der Tabelle 3 gezeigt.

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TABELLE 1

Daten von Kulturen des Stammes Nr. G455-101*

1 . Czapeks Agar (Sucrose - Nitratagar) G**
R
A
D

kein oder dürftiges Wachstum

dunkel-rosa

weiß bis schwach-rosa

kein

2. Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr. 1) geringes Wachstum, flockig sedimentiert und nicht pigmentiert

3. Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP Nr. 2) G reichlich

R dunkelrot bis rötlich braun

A reichlich, gräulich rosa bis purpurrosa

D kein

4. Hafermehlagar (ISP Nr. 3)

5. anorganische Salze-Stärkeagar (ISP Nr. 4)

6. Glycerin-Asparaginagar (ISP Nr. 5)

G	reich!	ich	:h-braun bis
R	stark		bis beige
A	wenig,	gelblich-rot
D	gräuli	rosa
G	wenig	ch-gelb	bis rötlich
R	leicht dunkel
A	dürfti	gelbli( rot
D	kein	g , weiß
G	wenig
R	gelbli braun
A	dürfti	ch-rosa
D	kein	g, we i ß

Ö30CU3/072B-

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TABELLE 1 (Fortsetzung)

.47

7. Pepton-Hefeextrakt-Eisen· agar (ISP Nr. 6)

8. Tyrosinagar (ISP Nr. 7)

9. Glucose-Ammoniumsalzagar

10. Bennetts-Agar

G	wenig, faltig
R	stark rötlich-orange
A	kein
D	leicht gelblich-orange
G	wenig
R	dunkelrot
A	dürftig, weiß
D	kein
G	wenig
R	rötlich-braun
A	dürftig, leicht grau
D	kein
G	mäßig
R	rötlich-braun
A	eingeschränkt, qräulic

rosa kein

* beobachtet nach einer Inkubation von 3 Wochen bei 27°C.

** Abkürzung:

G - Wachstum

R - rückseitige Farbe des Substratmyzels

A - Luftmyzel

D - diffusionsfähiges Pigment

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TABELLE Physiologische Daten des Stammes Nr. G455-101

Test

Bildung von Melanoid

Ergebnis

Nitrit aus Nitrat	positiv
Nitrit aus Nitrat	positiv
Kaseinhydrolyse in Agarmedium	schwach positiv
MagermiIchkoagulation	positiv
Gelatineverflüssigung	negativ
H_?S-Produktion aus L-Cystein	positiv

negativ

Methode und Medium

anorganisches Medium: Czapeks Sucrosenitratbrühe

organisches Medium: 0,5 % Hefeextrakt, 1,0 % Glucose, 0,5 % KNO₃, 0,1 % CaCO₃

Lüdemanns Agarmedium

15 % Gelatine in Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr.1 Medium)

L-Cystein (0,1 %) hinzugegeben zu Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr.1 Medium) plus Agar. H^S nachgewiesen mit einem Papierstreifen 10 % wäßrige Bleiacetatlösung enthaltend.

Pepton-Hefe-Eisenagar (ISP Nr.6) und Tyrosinagar (ISP Nr.7).

Katalasereaktion	positiv	H2O2 wäßrige Lösung
Oxidasereaktion	positiv	Kovacs-Reagens
Wachstumstemperatur	reichliches Wachstum bei 28, 37 und 45°C. Geringes Wachstum bei 2Ö°C, kein Wachstum bei 10⁰C und 50⁰C	Bennetts Agar

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TABELLE 3

Verwertung von Kohlenstoffquellen für Stamm Nr. G455-101

PG -H-

1,	Glycer i η
2.	D(-)-Arabinose
3.	L (+)-Arabinose
4.	D-Xylose
5.	D-Ribose
6.	L-Rhamnose
7.	D-Clucose
8.	D-Galactose
9.	D-Fructose
10.	D-mannose
11·	χ, (_)-Sorbose
12.	Sucrose
13.	Lactose
14.	Cellobiose
15.	Melibiose
16.	Trebalose
17.	Rafflnose
18.	D(+)-Melez±tose
19.	lösliche Stärke
20.	Dulcltol
21.	Inositol
22.	D-Mannitol
23.	D-Sorbitol
24.	Sallein
25.	Cellulose
26.	Chitin
27.	Keratin

■H- +

Grundmedium PG : Pridham-Gottliebs anorganisches Medium, ver sehen mit 0,1 % Hefeextrakt Lm : Liidemanns organisches Medium

Inkubation für ?. Wochen bei 37°C.

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ORIGINAL- J

Selbstverständlich ist die Herstellung des erfindungsgemäßen BBM-928-Komplexes nicht auf den durch die oben genannten Wachstums- und mikroskopischen Daten beschriebenen Actinomycetenspecien-Stamm Nr. Q455-101 beschränkt. Diese Daten sind nur für beispielhafte Zwecke genannt. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Stämmen oder Mutanten, die durch den oben beschriebenen Organismus mit Hilfe von konventionellen Mitteln des Standes der Technik hergestellt werden, wie Bestrahlung mit Röntgenstrahle Ul traviolettbestrahlung , Stickstoff lost (Senfgas),Phagenbestrahlung und ähnlichem, die in der Lage sind, den ßßM-928-Komplex oder einzelne Bestandteile von ihm herzustellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des antitumorantibiotischen BBM-928-Komplexes ist dadurch gekennzeichnet, daß der Actinomycetes-Stamm Nr. G455-101 in einer wäßrigen Lösung, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält, durch Fermentation unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis die Lösung eine beträchtliche antitumor-antibiotische Aktivität aufweist. Konventionelle Fermentationsmethoden werden für die Kultivierung des Actinomycetes-Stamm Nr. G455-101 angewendet. Die für die Herstellung der erfindungsgemäßen antibiotisehen Antitumormittel zweckdienlichen Medien enthalten eine assimilierbare KohlenstoffquelIe wie Stärke, Glucose, Dextrin, Maltose, Lactose, Sucrose, Fructose, Mannose, Melasse, Glycerin und ähnliches. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle enthalten, wie Protein, Proteinhydrolysate, Polypeptide, Aminosäuren, Getreidequel Ibriihe, Kasein, Harnstoff und ähnliches so wie anorganische Nährsalze, die anorganische Anionen und Kationen liefern wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid, Nitrat und ähnliches.

Für die Herstellung des BBM-928-Komplexes kann jede für ein befriedigendes Wachstum des Organismus förderliche Temperatur angewendet werden. Die Temperaturen können zwischen ungefähr

Ö 3 G Q 4 3 / Q 7 2 B

20° und 45°C liegen, wobei die für ein optimales Wachstum des Organismus bevorzugte Temperatur zwischen ungefähr 28° bis 34°C, am besten jedoch zwischen 30° und 32°C liegt. Eine maximale Produktion des BBM-928-Komples wird im allgemeinen in ungefähr 4 bis 6 Tagen erhalten. Konventionelle Methoden werden während der Fermentationsperiode angewendet. Die Herstellung von kleinen Mengen wird z.B. geeigneterweise in Schütte!kolben oder mittels Oberflächenkulturen durchgeführt..Die Herstellung von größeren Mengen wird vorzugsweise unter submersen aeroben Kulturenbedingungen in sterilen Behältern durchgeführt. Bei der Behälterfermentation wird zuerst ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe hergestellt. Dies geschieht durch Animpfen der KulturbrUhe mit einer Spore des Organismus, damit eine junge aktive Samenkultur erhalten wird, die dann aseptisch in das Medium des Fermentationsbehälters übertragen wird. Die Be-Vüftunq in den Behältern und Flaschen kann durch Einblasen von steriler Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentierungsmediums geschehen. Zudem wird das Fermentierungsmedium in den Behältern mit einem mechanischen Rührer gerührt. Antischaummittel, wie Silikonöl, Sojabohnenöl und Schweinefettöl, können, falls erforderlich, hinzugefügt werden.

Der antibiotische Gehalt in der Fermentationsbrühe oder den Extrakten des BBM-928-Komplexes kann durch Papierscheibenagar-Diffusionsanalyse bestimmt werden» indem Sarcina lutea als Testorganismus und ein Nähragar als Analysemedium benutzt werden. Für die optimale Empfindlichkeit des Analysesystemes, das für die Bestimmung der optimalen Wirksamkeit der Brühe benutzt wird, wird der pH auf 9,0 eingestellt.

Der BBM-928-Komplex wird mit konventionellen Mitteln wie Lösungsmittelextraktion aus der Fermentationsbrühe isoliert. Die Reinigung wird geeigneterweise durch präparative Gegenstromverteilunqs- und Chromatographierverfahren durchgeführt. Diese wer-

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-33-

den noch eingehender in den Beispielen 2 und 3 bei der Gewinnung der BBM-928-Bestandteile A, B, C, D, E und F beschrieben.

Physikalisch-chemische Eigenschaften der BBM-928-Bestandteile A, B, C und D von Beispiel 3

Die einzelnen Bestandteile von BBM-928 zeigen eine einander ähnliche Löslichkeit und Farbreaktionen. So sind sie z.B. gut löslich in Chloroform und Methylenchlorid, wenig löslich in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol und unlöslich in Wasser und η-Hexan. Sie zeigen eine positive Reaktion mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehr!ich-Reagens und eine negative Reaktion mit Tollens, Sakaguchi und N.inhydrin.

Die charakteristischen physikalisch-chemischen Eigenschaften der BBM-928-Bestandteile des Beispiels 3 sind in der Tabelle 4 gezeigt.

In den Infrarot-Spektren zeigen

BBM-928A, B, C und D u.a. die folgenden Absorptionen (Wellenzahl in cm" ), wobei s =
b = breit, sh = Schulter.

zahl in cm" ), wobei s = stark, m = mittel, sw = schwach,

BBM-928 A

Figur 1 ca. 3450 m, b; 3330 m, b; 2970 sh; 2920 m; 2840 sh; 1740 s; 1680 sh; 1640 s; 1530 s; 1490 m; 1420m; 1395 m; 1340 m; 1290 m; 1230 s; 1195 m; 1150 sw; 1130 sw; 1025 m; 970 sw; 905 m; 830m;790 sw; 770 sw

BBM-928 B

Figur 2 3450 m, b; 3330 m, b; 2950 m; 2930 m;1740 s; 1670 sh 1640.s; 1530 s; 1480 m; 1420 m; 1340 m; 1290 m.;

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1230 s; 1195 m; 1150 sw; 1020 m; 970 sw; 905 m; 830 m; 760 m

BBM-928 C 3380 m, b; 2920 m; 2840 sh; 1740 m; 1670 sh; 1650 s; Figur 3 1530 s; 1485 m; 1430 m; 1340 m; 1285 m; 1225 m; 1195 sw; 1150 sw; 1025 m; 960 sw; 910 sw; 830 sw

BBM-928 D 3470 m, b; 3320 m; 2950 m; 2930 sh; 1740 s; 1640 s, b; Figur 4 1530 s; 1480 m; 1420 m; 1340 m; 1295 m; 1230 s; 1200 m; 1170 sh; 1130 sh; 1040 m; 970 sw; 910 m; 830 m; 810 sw; 770 m;

In den NMR-Spektren zeigen

BBM-928 A, B, C und D u.a. die folgenden Absorptionen (ppm):

BBM-928 A 11,7, 9,25, 9,15, 8,8, 7,65, 7,55, 7,45, 7,3, 6,9, Figur 5 ' 5,7, 5,5, 5,2, 4,45, 4,05, 3,9, 3,6, 3,25, 3,15, 2,9, 2,0, 1 ,25, 1,05

BBM-928 B 11,6, 11,55, 9,3, 7,4, 7,25, 6,9, 5,7, 5,3, 5,2, 4,5, Figur 6 3,9, 3,25, 3,2, 3,1, 2,9, 2,35, 2,05, 1,35, 1,05

BBM-928 C 11,5, 9,3, 9,4, 8,75, 7,7, 7,6, 7,45, 7,25, 6,85, Figur 7 5,65, 5,4, 5,2, 4,65, 4,2, 3,9, 3,65, 3,5, 3,2, 3,1, 2,85, 2,4, 1 ,8, 1 ,35, 1,05

BBM-928 D 11,6, 9,25, 9,2, 7,65, 7,6, 7,4, 7,2, 7,15, 7,0, Figur 8 6,9, 6,8, 5,8, 5,7, 5,5, 5,2, 4,4, 4,05, 3,9, 3,6, 3,3, 3,2, 2,95, 2,65, 2,3, 2,05, 1,3, 1,0.

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	Phys	C :	TABELLE	4	ile A, "B,	C und D	B	C	D
	der	H :		BBM-928	214-217°C	244-248°C	.224-227⁰C
		N :	ikalisch-chemische Eigenschaften	-74°	-91°	-13°
		O :	BB-928-Bestandte	50.14	51.77	50.75
			5.29	5.29	5.25
Schmelzpunkt	[a]⁵* (c 1, CHCl₃)	A	12.34	13.55	12.58
	Anal. gef.	246-248°C	32.23	29.39	31.42
	-27°
	53.19
( Differenz)	5.40
12.92
28.49

in η (E

in EtOH	235(586) 264(415) 345(165)	235(570) 264(400) 345(163)	235(638) 264(442) 345(173)	235(550) 264(380) 345(155)
in EtOH-HCl	234(610) 264(410) 345(165)	234(556) 264(446) 349(188)	234(650) 264(442) 345(173)	234(565) 264(405) 345(165)
in EtOH-NaOH	230(564) 256(763) 330(180) 383(170)	230(530) 256(775) 330(116) 383(122)	230(580) 256(704) 330(117) 383(122)	230(650) 256(930) 330(140) 383(145)
Mol.-Gew. (Osmometer, in CHCl.)	1,450	_	1,470

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. 25·

Infrarot-(IR) und kernmagnetisch Resonanz-(NMR) Spektren der Bestandteile A, B, C und D werden jeweils in den Figuren 1 bis und Figuren 5 bis 8 der begleitenden Zeichnungen gezeigt. Die NMR-Spektren von BBM-928A (Fig. 5), BBM-928B (Fig. 6) und BBH-928C (Fig. 7) ähneln einander sehr mit dem einzigen Unterschied, daß Acetylgruppen in den BestandteilenA (ti : 2,03 ppm, 2 Mol Äquivalente) und B [S : 2,05 ppm, 1 Mol Äquivalent) jedoch nicht in C vorhanden sind. Durch Acetylierung mit Acetanhydrid in Pyridin wurden 2, 3 und 4-molare Äquivalente von Acetylgruppen in die jeweiligen Bestandteile A, B und C von BBM-928 eingeführt. Die so erhaltenen Acetylierungsprodukte zeigen identische Eigenschaften in DC, UV, IR und NM.R-Spektren, wodurch angezeigt wird, daß BBM-928A ein Monoacetylderivat von BBM-928B und ein Diacetylderivat von BBM-928C ist.

Säurehydrolyse von BBM-928A ergab fünf in n-Butanol-lösliche UV-absorbierende Fragmente (I, II, III, IV und V) und fünf wasserlösliche Ninhydrin-postive Substanzen (NPS-1 , 2, 3, 4 und 5). Letztere Substanzen wurden durch Dowex 50 χ 4 Chromatographie getrennt und als folgende Aminosäuren identifiziert:

Verbindungen	Rf (S-123)*	Identifizierung
NPS-1	0,72	ß-Hydroxy-N-methylvalin (HM-VaI)
NPS-2	0,49	Glycin (GIy)
MPS-3	0,46	Serin (Ser)
NPS-4	0,45	Sarcosin (Sar)
NPS-5	0,23	(nicht zugeordnet)

*DC, Silikagelplatte

S-123: 10 % Ammoniumacetat-Methanol-10 %-ige Ammoniaklösung (9:10:1)

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M/21 065

M-

Die oben erwähnten fünf UV-absorbierenden Fragmente haben die folgenden Strukturformeln:

CH₇OH

CO-NH-CH-CO₂H

Fragment I .

^C14^H14^N2°6

MS: m/e 306 (M⁺)

¹I 227, 233, 251, 345 nm

Fragment II

^C20^H25^N3°8 OH O-CO-CH-C(CHj)₂ ms: m/e 377 (M⁺-58)

fs

NH OH

ι ι

CO-NH-CH-CO₂H

_λΜβ0Η.

C0-(NPS-5)

Fragment III _xMe0H.

max

Fragment IV

MS: m/e 205 (M⁺) _xMe0H

max

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H₃C CH₃ Fragment V

""^ C H NO

OH 0-CO-CH-N-CO-CH₉NH ^{3 30 9} ι ι *t

CH- CH, CH,X"_ : 230, 235, 262, 345 nm

ι 2 3 J OBX

CO-NH-CH-CO₂H

Nach Säurehydrolyse (6N HCl) ergeben die Fragmente I, II, III und V die folgenden Abbauprodukte:

Hydrolysebedingung

	verschlossenes Gefäß	_ _	am	Rückfluß
Fragment	110°, 20 Stunden	11	0⁰C, 3 Stunden
I	IV, Ser
II	IV, Ser, HM-VaI	I,	HM-VaI
III	IV		--
V	I,	HM-VaI , Sar

Ser : Serin

HM-VaI : ß-Hydroxy-N-methylvalin Sar : Sarcosin

Basische Hydrolyse von BBM-928A oder BBM-928C mit 0,1 N NaOH bei 25°C für 3 Stunden ergibt Fragment VI (Abkürzungen Ser, HM-VaI und Sar wie oben angegeben, wobei Gly=Glycin und das Symbol "X" eine unzugeordnete Einheit darstellen)

Fragment VI

030043/0725

Die Behandlung von Fragment VI mit 0,1N HCl bei 110⁰C für eine Stunde ergibt das Fragment VII plus HM-VaI:

Fragment VII

Die Behandlung von Fragment VI mit 0,1N NaOH bei 37⁰C für 40 Stunden ergibt das Fragment VIII plus Fragment I:

χ _> GIy -^ Sar -» HM-VaI Fragment VIII

Die Behandlung von Fragment VII mit 0,1N NaOH bei 37°C für 40 Stunden ergibt das Fragment IX plus Fragment I:

X -» GIy -* Sar Fragment IX

Die unzugeordnete Einheit (X) besitzt eine Molekularformel von C₅HgN₂O₂ (in Peptidform), bestimmt durch Mikroanalyse von Fragment IX und anderen Peptidfragmenten, die (X) enthalten, und Spektralanalysen, die weiter unten zusammengefaßt sind.

Q30043/Q72S

M/21 065

13

C-NMR 30.14 (t)

61.4 (d)^ 61.7

140.7 (d) 171 (s)

- tf -

Protonen-KMR 2.36 ppm (2H, m)

4.2-4.5 (2H, m) 6.76 (IH, t)

2565

Zuordnung

-CH₂-

²¹^O od. N)

-CH-N- -CO- (Afflid) -OH NH

Gemäß den Spektraldaten für die Fragmente VIII und IX und einem 360 MHz Protonen-NMR-Spektrum von BBM-928A_Pdes Beispiels 4 scheint die nicht zugeordnete Aminosäureneinheit (X) am besten durch die folgende Tetrahydropyridazinstruktur wiedergegeben werden zu können:

(X)

Aufgrund der Ergebnisse der oben beschriebenen Abbauexperimente, Spektraldaten, Mikroanalysen und Molekulargewichtsbestimmungen wird angenommen, daß die nachfolgenden Strukturen BBM-928A, B und C am besten darstellen:

030043/0728

	A	!i	Ac	Ser	Senn
	B		H	GIy :	Glycin
BBM-928	C	Ac	H	Sar :	Sarcosin
BBM-928	Ac	HM-VaI:	ß-Hydroxy-N-methylvalin
BBM-928	H

Antimikrobiell Aktivität

Die antimikrobielle Aktivität der BBM-928-Bestandteile wurde gegenüber einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen mit Hilfe der Reihenagarverdünnungsmethode in einem Nähragar bei pH 7 bestimmt, wobei Steers Mehrfach-Impfvorrichtung benutzt wurde.Die Größe des Inoculums wurde standardisiert, um ein 0,0025 ml Aliquot des Testorganismus anzuwenden, das etwa MP Zellen/ml enthält bezogen auf alle Bakterien und Pilze mit Ausnahme von säurebeständigen Bakterien, für die eine Suspension mit 10⁶ Zellen/ml b'< nutzt wurde. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Mindesthemmkonzentrationen (MIC) bestimmt, die in Tabelle 5 gezeigt sind. Wie dort zu sehen ist, sind die BBM-928-Bestandteile mäßig bis schwach aktiv gegen gram-positive und säurebeständige Bakterien,jedoch praktisch inaktiv gegen gram-negative Bakterien und Pilze.

Die Aktivität der prophagen Induktion im lysogenen Bakterium (ILB) wurde für die BBM-928-Bestandteile bestimmt. Die BBM-928-Bestandteile A, B und C weisen bis zu einer Konzentration von 100 mcg/ml keine signifikante ILB-Aktivitat auf.

Ö3Q043/072S

M/21 065

	S.	*-34* TABELLE !	• 5	tat von	B	C	D	sn	F
	S.	Antimikrobielle in	vitro-Aktivi	Ten gegen aerobe Bakterii	5 25	50	100	mcg/ml)	25
	1: M.	BBM-928-Bestandtei		BBM-928-Bestandtei1e(MIC in	3 12.	.5 25	50	E	12.5
BBRI	Ci			A	3 12. 5 25	.5 50 50	50 100	100	25 25
Code	B.	Testoroanismus	12.	50	MOO	MOO	50	50
Sa-I	B.	aureus 209P	6.	25	100	100	50 100	25
Sp-I	B.	pyogenes S-23	6. 12.	25	50	100	MOO	25
Sl-I Mf-I	M.	_ lutea PCI 1001 flavus D12	25	3 12.	,5 25	50	100	12.5
Cr-I	M.	zerosis 53K-1	25	25	25	100	100	25
Bs-I	E.	subtilis PCI 219	25	5 12.	5 12.5	50	50	12.5
Bg-I	K.	megaterium D2	6.	>100	MOO	MOO	100	MOO
Ba-3	P.	anthracls A9504	25	MOO	MOO	MOO	50	MOO
M6-1	P.	smegmatis 607 D87	12.	MOO	MOO	MOO	MOO	MOO
Mp-I	P.	phlei D88	>100	MOO	MOO	MOO	MOO	MOO
Ec-I	P.	coil NIBJ	>100	MOO	MOO	MOO	MOO	MOO
Kp-I	S.	pneumoniae D-U	>100	MOO	MOO	MOO	MOO	MOO
Pa-3	A.	aeruginosa A9930	>100	MOO	MOO	MOO	MOO	MOO
Pv-I	C.	vulgaris A9436	>100	MOO	MOO	MOO	MOO	MOO
Pm-I	C.	mirabilis A9554	>100	MOO	MOO	MOO	MOO	MOO
Pg-I		morganll A9553	>100	MOO	100	MOO	MOO	MOO
Sm-I	marcescens A20019	>100		MOO
Al-I	faecalis ATCC 8750	>100		MOO
Ca-I	arbicans IAM 4888	100
Cn-3	neoformans

0300A3/0725

m/21 065 · - au - . 3012S65

Antitumor-Aktivi fat

Für die Antitumor-Aktivitat der Bestandteile A, B, C und D von BBM-928 wurden Vergleichstests mit Mitomycin C mit intraperitoneal implantierten Tumoren durchgeführt: P388-Leukämie, L121O-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen(LL)-Karzinom und Sarkom 180 Aszites (S180). Testlösungen von BBM-928-Bestandteilen in 0,9 %-iger Salzlösung, die 10 % Dimethylsulfoxid enthält, und von Mitomycin C in 0,9 %-iger Salzlösung wurden einmal pro Tag entsprechend dem Dosierungsplan verabreicht. Dieser Dosierungsplan reichte von einer einmaligen Behandlung an einem Tag bis zu einer mehrtägigen Behandlung. Durch Variation der Dosis wurde die minimale effektive Dosis (MED) bestimmt, die bei den behandelten Tieren die Überlebenszeit mindestens um den Faktor 1,25 - im Vergleich zur Kontrollgruppe - vergrößert. Diese Aktivität wird als Maß einer signifikanten Antitumor-Aktivität betrachtet. Die Ergebnisse sind zusammen mit den berechneten Aktivitätsverhältnissen in der Tabelle 6 gezeigt, woraus sich ergibt, daß BBM-928A um den Faktor 10 bis 300 in Abhängigkeit von dem Tumorstamm und dem Dosierungsplan aktiver ist als Mitomycin C. Die nach der Methode von Van der Waerden, Arch. Expt. Path. Pharmak., 195, 389 (1940) bestimmten intraperitonealen LD_5Q-Werte von den BBM-928-Komponenten A, B, C und D und von Mitomycin C sind ebenfalls in der Tabelle 6 aufgeführt.

0300A3/0725

M/21 065

-X-•33.

TABELLE 6

Antitumor-Aktivi tat und Toxizitä't von BBM-928 A, B, C und D und Mitomycin C

Miniaale effektive Dosis(MED, mg/kg/Tag) ¹⁰SO^{4 1}^"

P388

L1210

3

B16

30

-

300

LL

S180

(mR/kR/Taq)

-

0.013

Behandlung⁸

100

1.4

BBM-928A

0.003

>O.l

0.003

0.03

0.003

0.13

BBM-928B

0.1

-

0.3

-

0.18

BBM-928C

-

0.81

BBM-928D

0.003

-

0.083

Mitomycin C

0.1

1

0.3

9.3

Behandlung

BBM-928A

0.001

0.003

0.0001

Mitomycin C

0.1

0.3

0.03

AktivitätsverhäTthis": (BBM-928A gegenüber

Mitomycin

O

Behandlung⁹

10

100·

Behänd!una

100

a. einmalige Behandlung am ersten Tag

b. tägliche Behandlung vom 1. bis 9. Tag

030043/0728

Beispiel 1_ Herstellung des BBM-928-Komplexes Agarfermentation

Ein gut gewachsener, schräg angelegter Agar eines Stammes von Actinomycetes Species G455-101 wird für die Animpung des vegetativen Mediums benutzt, das 2 % lösliche Stärke, 1 % Glucose, 0,5 % Pharmamedien, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NZ-Amin (Typ A) und 0,1 % CaCO₃ enthält, wobei der pH vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt wird. Die Saatkultur wird bei 32°C für 72 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung (250 Upm) inkubiert. Danacl werden 5 ml der gewachsenen Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, der 100 ml des Fermentationsmediums enthält, bestehend aus 2 %-iger löslicher Stärke, 1 % Pharmamedien, 0,003 % ZnS0₄-7H_?0 und 0,4 % CaCO₃. Die Herstellung des BBM-928-Komplexes erreicht normalerweise nach 5 Tagen Schütteln ihr Maximum. ;

Behälterfermentation

Eine Samenkultur wird für 4 Tage in Erlenmeyer-Kolben geschüttelt und dann in 100 Liter des Keimungsmediums eingeimpft, das aus 2,0 % Hafermehl (Quaker Produkte, Australien), 0,5 % Glucose 0,2 % trockene Hefe, 0,0008 % MnCl₂-4H₂0, 0,0007 % CuS0₄-7H₂0, 0,0002 % ZnS0₄-7H₂0 und 0,0001 % FeS0₄-7H₂0 besteht. Dieses Medium b( findet sich.in einem 200 Liter-Sa atfermentierungstank_s der bei 30⁰C 54 Stunden mit 200 Upm gerührt wird. 15 Liter dieser Saatkultur werden dann in 170 Liter des Fermentationsmediums eingeimpft, das 2,0 % lösliche Stärke, 1,0 % Pharmamedien, 0,003 % ZnS0₄-7H₂0 und 0,4 % CaCO₃ enthält. Dieses Medium befindet sich in einem 400 Liter-Fermentierungstank, der bei 3O⁰C mit 200 Upm gedreht wird, wobei die Belüftungsrate bei 150 Liter/Minute liegt. Der pH der Brühe steigt schrittweise mit dem Fortschreiten der Fermentation und erreicht nach 100 bis 120

Ö300A3/072S

Stunden 8,4 bis 8,5. Zugleich wird ein Antibiotikum-Höchstwert von 30 mcg/ml erhalten.

Beispiel Isolation des BBM-928-Komplexes durch Lösungsmittelextraktion

Die aus dem Beispiel 1 erhaltene Brühe (170 Liter, pH 8,5) wird mit einem Klärungsmittel filtriert. Eine Aktivität wird sowohl in dem Myzelkuchen als auch in dem Filtrat beobachtet. Der Myzel kuchen wird zweimal mit einem Lösungsmittel gemisch aus Aceton und Methanol (1:1, 30 Liter x 2) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Es ergibt sich ein wäßriges Konzentrat, das mit n-Butanol extrahiert wird. Das Filtrat der Brühe wird zweimal mit n-Butanol (40 Liter χ 2) extrahiert. Die Einengung der vereinigten n-Butanolextrakte unter vermindertem Druck und die Lyophilisation des Rückstandes ergeben ein festes Rohprodukt (21,4 g). Gemäß der Dünnschichtchromatographie-Analyse enthält dieses Material einen Komplex von drei Hauptbestandteilen A, B und C und drei Unterbestandteilen D, E und F, die die in der Tabelle 7 angegebenen R^-Werte aufweisen.

0300A3/0728

M/21 065

TABELLE 7 Silikagel DC von BBM-928-Beständteilen

BBM-928A BBM-928B BBM-928C BBM-928D BBM-928E BBM-928F

	R_f-Werte *
System N-1	18 System N-103*
0,71	0,48
0,53	0,26
0,27	0,07
0,73	0,53
0,56	0,34
0,39	0,17

* aufgezeichnet mit einem UV-Detektor (Shimadzu CS-910) bei 345 nm

** n-Butanol-Methanol-Wasser (63:27:10) *** Xylol-Methyläthylketon-Methanol (5:5:1)

B e i spiel

Reinigung des BBM-928-Komplexes.

Der Rohkomplex des Beispiels 2 wird in einem präparativen Gegenstromvertei1ungsapparat (Mitamura, 1.00 ml/Röhre) gereinigt, wobei ein Lösungsmittel system von Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform-Methanol-Wasser (5:2:5:1) verwendet wird. Nach 50 Durchgängen werden die Röhren Nr. 5 bis 20 vereinigt und konzentriert was ein schwach-gelbes Pulver (4,4 g) ergibt, das die Bestandteile A, B, D, E und F enthält. Die Mischung wird in geringen Mengen von Chloroform gelöst und auf eine Säule von Silikagel

Ö300A3/072I

• 3?·

C-200 (500 ml) gegeben, die mit Äthylacetat vorbehandelt wurde. Die Säule wird mit Äthylacetat entwickelt, wobei der Anteil an Methanol (2 bis 5 %_t V/V) steigt und die Fraktionen werden durch Messung der optischen Dichte bei 345 nm überwacht. Der geringere Bestandteil D wird zuerst mit Äthylacetat eluiert gefölgt von dem Bestandteil A. Die Bestandteile E, B und F werden danach in dieser Reihenfolge bei einer 3 /£-igen Methanol konzentration eluiert. Jede Fraktion, die die entsprechenden Bestandteile enthält, wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wird aus Chloroform-Methanol kristallisiert. In ähnlicher Weise wird die Rohherstellung des Bestandteiles C aus den Röhren Nr. 21 bis 35 der oben beschriebenen Gegenstromverteilung durchgeführt. Die Reinigung des Bestandteiles C wird mit Silikagelchromatographie und Kristallisation aus Chloroform-Methanol durchgeführt. Ausbeuten für die Bestandteile A, B, C, D, E und F sind jeweils 988 mg, 420 mg, 848 mg, 130 mg, 119 mg und 114 mg.

Beispiel Weitere Reinigung des BestandteilesBBM-928A des Beispiels 3

Die Dünnschichtchromatographie-Analyse des BBM-928A-Bestandteiles des Beispiels 3 (wobei ein System von 10 % Methanol in Toluol benutzt wird) zeigte, daß die Probe nicht vollständig homogen war. Sie enthielt zusätzliche Substanzen, die gerade vor dem BBM-928A-Bestandteil liefen. Die folgenden Schritte wurden unternommen, um eine Reinigung durchzuführen.

(1) Die Probe wird auf iSil ikagel chromatographiert, wobei ein linearer Gradient von Chloroform nach 6 % Methanol in Chloroform eingestellt wird. Die bei 2,4 bis 3,3 % Methanol in Chloroform eluierten Fraktionen (den BBM-928A-Bestandteil und etwas Verunreinigung enthaltene} werden für die nächste Stufe zusammengegeben.

Ö30043/0726

(2) Ein konkaver Gradient wird dadurch eingestellt, daß drei Gefäße benutzt werden, die 2 % Methanol in Toluol in den beiden ersten und 6 % Methanol in Toluol in dem dritten enthalten. Die bei diesem Gradienten chromatographierten zusammengegebenen Fraktionen aus Stufe 1 (SiIikagelsäule) ergeben einen kleineren Anteil, der als erstes eluiert wird, dicht gefolgt durch den gereinigten Bestandteil BBM-928A (hier bezeichnet als BBM-928A ).

Molekulargewicht von BBM-928A , bestimmt durch Feld-Desorptions massen-Spektrometrie, beträgt 1427 und entspricht einer empirischei Formel von C₅₄H₇₈N₁₄O₂₄ (MW 1427.417).

Elementaranalyse (Proben getrocknet bei 100⁰C für 18 Stunden) für C₆₄H₇₈N₁₄O₂₄:

	• a	53	C	5	H	1	3	N	26	0^a
ber	b. • a	52	,85	5	,51	1	3	,74	28	,90
gef		,47	,48		,81	,24^a

a. durch Differenz

b. Durchschnitt von drei Bestimmungen.

Ill/V.

Ö 3 0 (H 3 / Q 7 2 S

L e e r s e 11 e

Claims

.j Antitumor-antibiotische Verbindung BBM-928A, dadurch gekennzeichnet:

(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;

(b) daß sie eine positive Reaktion mit Eisen-(III )-Chl orid '. und Ehrlich-Reagentien und eine negative Reaktion mit Tollens-, Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien ergibt;

(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukämie, L1210-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen-Karzinom und intraperitoneal in "Mäuse implantierte Sarkom 180 Aszitestumore darstellt;

(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 246 bis 248°C hat;

tJ~\ ²⁵

(e) daß sie eine spezifische Drehung von I⁰M _n = 27° (c 1 ,

CHCl₃) aufweist;

D .

(f) daß sie ein Molekulargewicht von 1427 besitzt; ;

(g) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von ; 52,47 % Kohlenstoff, 5,48 % Wasserstoff, 13,81 % Stick- . stoff und 28,24 % Sauerstoff hat,

(h) daß sie bei der SiIikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system n-Butanol-Methanol-Wasser (63:27:10) einen R_f-Wert von 0,71 besitzt, und daß sie bei Verwendung eines Lösungsmittelsystemes Xylol-Methyl-

030043/Q725 original inspected

äthylketon-Methanol (5:5:1) einen R^-Wert von 0,48 besitzt;

(i) daß sie bei der sauren Hydrolyse wasserlösliche Ninhydrin-positive Substanzen inklusive ß-Hydroxy-N-methyl valin, Glycin, Serin und Sarcosin ergibt;

(j) daß sie bei der basischen Hydrolyse das Fragment VI ergibt:

Fragment VI

wobei Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin, HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methylvalin und das Symbol X für eine Aminosäureneinheit steht;

(k) daß sie ein Infrarot-Absorptionsspektrum in KBr aufweist, das in der Figur 1 gezeigt.ist; und

(1) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst das in Figur 5 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum ergibt.
2. Antitumor-Antibiotikum gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäureneinheit X in der Peptid-"form die empirische Formel C₅H-N₂O₂ besitzt.
3. Antitumor-Antibiotikum gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Peptidform die Aminosäureein- ;

030ÖA3/072S

M/21 065

heit X der Tetrahydropyridazinrest

It

c—

OH

ist.
4. Antitumor-antibiotische Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Struktur besitzt:

C+Gly+Sar*BM-Val

O ^ HO

«-SerKJO

OCH.

wobei Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin, HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methylvalin und R. und Rg für Acetyl stehen.
5. Antitumor-antibiotische Verbindung BBM-928B, die eio Chinolinchromophor enthält und die bei saurer Hydrolyse wasserlösliche Bestandteile inklusive Serin, Glycin, Sarcosin und ß-Hydroxy-N-methylvalin ergibt, und die in ihrer im wesentlichen reinen Form dadurch gekennzeichnet ist:

(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich

030043/0726

M/21 065 - 4 -

und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;

(b) daß sie mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien eine positive Reaktion und mit Tollens·; Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien eine negative Reaktion ergibt;

(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukämie, intraperitoneal in Mäuse implantiert, darstellt;

(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 214 bis 217°C besitzt;

(e) daß sie eine spezifische Drehung von [oi u = -74° (c 1, CHCl₃) aufweist;

(f) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 50,14 % Kohlenstoff, 5,29 % Wasserstoff, 12,34 % Stickstoff und 32,23 % Sauerstoff besitzt;

(g) daß sie bei der Si 1ikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system von n-Butanol-Methanol Wasser (63:27:10) einen R^-Wert von 0,53 und bei Verwendung eines Losungsmittelsystemes Xylol-Methyläthylketon-Methanol (5:5:1) einen R^-Wert von 0,26 aufweist;

(h) daß sie das in Figur 2 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Spektrum aufweist; und

(i) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst im wesentlichen das in Figur 6 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.

030043/0725

M/21 065
6. Verbindung gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet durch die Strukturformel:

worin Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin, HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methylvalin und R^ für Acetyl steht.
7. Antitumor-antibiotische Verbindung BBM-928C, die ein Chinolinchromophor besitzt und bei saurer Hydrolyse wasserlösliche Bestandteile inklusive Serin, Glycin, Sarcosin und ß-Hydroxy-N-methylvalin ergibt und die in ihrer im wesentlichen reinen Form dadurch gekennzeichnet ist:

(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich,

in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlös-1 ich ist;

(b) daß sie mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien eine positive Reaktion und mit Tollens-, Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien eine negative Reaktion ergibt;

(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukämie, L121O-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen-Karzinom und intraperitoneal in Mäuse implantierte Sarkom 180-Aszites-Tumore darstellt;

030043/0726

M/21 065 - 6 -

(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 244 bis 248⁰C besitzt;

7 c

(e) daß sie eine spezifische Drehung von [<* ~\i = -91° (c 1, CHCl₃) besitzt;

(f) daß sie ein ungefähres Molekulargewicht von 1470 besitzt;

(g) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 51,77 % Kohlenstoff, 5,29 % Wasserstoff, 13,55 % Stickstoff und 29,39 % Sauerstoff aufweist;

(h) daß sie bei der SiIikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system von n-Butanol-Methanol Wasser (63:27:10) einen R_f-Wert von 0,27 und daß sie mit einem Lösungsmittelsystem von XyI öl-Methyl äthyl keton-Methanol (5:5:1) einen R--Wert von 0,07 aufweist;

(i) daß sie im wesentlichen das in Figur 3 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Absorptionsspektrum aufweist; und

(j) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst im wesentlichen das in Figur 7 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.
8. Verbindunq gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Strukturformel:

030043/0725

M/21 065

V—μ ♦— SerKJO

OCH.

worin Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin und HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methyl valin steht.
9. Antitumor-Antibiotikum BBM-928D, dadurch gekennzeichnet:

(a) daß es in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;

(b) daß es eine positive Reaktion mit Eisen-(III )-Chlorid und Ehrlich-Reagentien und eine negative Reaktion mit Tollens-; Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien ergibt;

(c) daß es ein wirksames Antitumormittel gegen intraperitoneal in Mäuse implantierte P388-Leukämie darstellt;

(d) daß es einen Schmelzpunkt von 224 bis 227°C besitzt;

(e) daß es eine spezifische Drehung von [VJn ⁼ "13° (c 1, CHCl₃) besitzt;

(f) daß es eine ungefähreelementare Zusammensetzung von 50,75 % Kohlenstoff, 5,25 % Wasserstoff, 12,58 % Stickstoff und 31,42 % Sauerstoff besitzt;

(g) daß es bei cferSil ikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system von n-Butanol-Methanol-Was-

030043/072B

ser (63:27:10) einen R^-Wert von 0,73 und mit einem Lösungsmittelsystem von XyI öl-Methyläthylketon-Methanol (5:5:1) einen R_f-Wert von 0,53 aufweist;

(h) daß es im wesentlichen das in Figur 4 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Spektrum aufweist; und

(i) daß es in deuteriertem Chloroform im wesentlichen das in Figur 8 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.
10. Fermentationsverfahren für die Herstellung des antitumor-antibiotischen BBM-928-Komplexes,dadurch gekennzeichnet, daß ein'Actinomycetesstamm, der die Charakteristi ka des Stammes Nr. G455-101 aufweist, in einer wäßrigen Lösung, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis der hergestellte BBM-928-Komplex der Lösung eine beträchtliche antitumor- ' antibiotische Aktivität verleiht. ■
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der BBM-928-Komplex in einer weiteren Stufe aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß

in einer weiteren Stufe der BBM-928-Komplex in die Bestandteile A, B, C, D, E und F getrennt wird, wobei die Bestandteile bei der Si 1ikageldünnschichtchromatographie die folgenden R-r-Werte aufweisen:

030<U3/072B

R_f-Werte

η-Buta no1-Methanol - XyI öl-Methläthylke-Wasser (63:27:10) ton-Methanol (5:5:1)

BBM-928A 0,71 0,48

BBM-928B 0,53 0,26

BBM-928C 0,27 0,07

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0300A3/072B