DE2513854C2

DE2513854C2 - Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2513854C2
Application number: DE2513854A
Authority: DE
Inventors: Dennis Redhill Surrey Butterworth; Martin Dorking Surrey Cole; John Dick Partridge Green Horsham Sussex Hood
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1974-03-28
Filing date: 1975-03-27
Publication date: 1984-04-19
Also published as: AU530414B2; JPS50140692A; BE827332A; CA1050460A; LU72155A1; AU499459B2; NL7503672A; FR2265399B1; SE7503536L; GB1489235A; AU7959975A; ATA228475A; DE2513854A1; AU4549979A; JPS582675B2; FR2265399A1; OA05204A; AT345454B; CH626628A5

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 902 und ihrer Salze nach Anspruch 1 durch Züchten von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, ATCC 21 380, ATCC 21 381, ATCC 21 382 oder ATCC 31 !26 unter Bildung des Komplexes MM 4550, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des MM 4550-Komplexes chromatographisch in Fraktionen unterteilt, die ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm zeigen, und man die Substanz MM 13 902 oder ihre Salze daraus isoliert

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Substanz MM 13 902 oder deren Salze nach Anspruch 1.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an Penicillin oder Cephalosporin.

wesentlichen rein ist. Es ist jedoch gefunden worden, daß dies nicht der Fall ist, und daß man aus diesem Produkt in geringer Menge einen Bestandteil isolieren kann, der eine starke antibakterielle Wirksamkeit

besitzt Diese neue Substanz wild als »MM 13 902« bezeichnet, und man nimmt an, daß sie teilweise verantwortlich für die antibakterielle Wirksamkeit bei dem Produkt gemäß der GB-PS 13 63 075 ist, obwohl die Substanz nur zu einem sehr geringen Teil für die

ίο /J-Lactamase-Hemmwirkung verantwortlich ist, die dieses Produkt zeigt. Selbstverständlich umfaßt die vorliegende Erfindung nichts, was in der GB-PS 63 075 hinsichtlich des dort genannten Produkts beansprucht ist. Es sind auch andere ß-Lactamase-

Hemmstoffe bekannt, die durch Streptomyces-Stämme erzeugt werden, wie sie z. B. in der DE-OS 23 40 005 beschrieben sind. Jedoch ist von derartigen bekannten Substanzen nicht gezeigt worden, daß sie eine starke antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, wie sie die

Substanz MM 13 902 besitzt.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist nun diese Substanz MM 13 902 und ihre Salze mit den kennzeichnenden Merkmalen, daß

a) die feste Carbonsäure MM 13 902 in Forr» ihres praktisch reinen Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften besitzt:

aa) leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyl-

äther und Kohlenwasserstoffen;

ab) ein Ultraviolett-Spektrum mit einem Absorptionsinaximum bei etwa 305 nm;

ac) bei einer Menge von 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch hergestellten KBr-Platte ein

Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima

u.a. bei 3450,2950,1750,1620,1510,1400 und 1260 cm-¹;

ad) ein NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser mit u. a. einem Paar Niederfeld-Doubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 235 τ und 4,00 τ mit

Kopplungskonstanten von etwa 14 Hz, mit einem Dublett mit dem Zentrum bei etwa 8,55 τ und mit einem scharfen Singulett bei etwa 8,00r;

b) das reine Dinatriumsalz

ba) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit den nachstehenden Systemen die Rf-Werte aufweist: n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumen verhältnis 7 :7 :6, Ri = 0,72;

Isopro»anol/Wasser im Volumenverhältnis 7:3, Rf = 035;

n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 :7 :6, Rt = 031;

n-Propanol/Wasser im Volumenverhältnis

4:1.Rf = 0.75; und

bb) in Form der wäßrigen Lösung Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei etwa 305 und bei etwa 225 nm aufweist.

Nach den Ausführungen in der GB-PS13 63 075 kann man wertvolle p-Lactamase-Hemmstofie durch Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces olivaceus erhalten. Bisher hat man angenommen, daß das in dieser GB-PS 13 63 075 beschriebene Produkt im Man kann die Substanz MM 13 902 auch als Schwefel enthaltendes antibakterielles Mittel charakterisieren, dessen Salze während der Züchtung von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 erzeugt werden.

Für das als MM 13 902 bezeichnete Antibiotikum konnte nachträglich die nachstehende Formel (1) gesichert werden:

HO₃SO

S-C

C—NH-CO—CH₃

O CO₂H

Diese Formel wird durch folgende physikochemische Eigenschaften des Dinatriumsalzes von MM 13 902 bestätigt:

A. IR-Spektrum

Das !R-Spektrum des Dinatriumsalzes von MM 13 902 weist bei 0,4 Gewichtsprozent in einem KBr-Pressling u.a. Absorptionen bei 1750, 1675, 1620 und 1280 cm^-l auf, weiche jeweils der /Ϊ-Lactam-Carbonyl-Gruppe, der Amid-Carbonyl-Gruppe, dem Carboxylat-Ion und dem Sulfat-Ion zugeordnet werden können.

B. Elementaranalyse

[', Die Elementaranalyse des Dinatriumsalzes von MM t'i3 902 zeigt, daß es Natrium, Schwefel und Stickstoff im 'Verhältnis2:2:2enthält

C. PMR-Spektrum

Eine sorgfältige Analyse (einschließlich Entkoppelungsversuche) des PMR-Spektrum in Deuteriumoxid und d⁶-Dimethylsulfoxid zeigt, daß das Dinatriumsalz von MM 13 902 folgende Gruppierungen aufweist:

(a) (b) (C) (d) (e)
I H₃C-CH-CH-CH-CH₂-

I I I —ο

Π CH₃-

— ΗΝ Η

Systems befindet sich bei τ = etwa 5,8 und ist an ein anderes Methinproton gekoppelt, mit einer Kopplungskonstante von etwa 4,5 Hz. Nach diesem Schema ist das X-Proton des ABX-Systems das Methinproton (d), mit einer Kopplungskonstante von etwa 4,5 Hz mit dem Methinproton (c) und Kopplungskonstanten von 9,5 bzw. 10,5 mit der Methylengruppe (e).

Das scharfe Singulett bei r = etwa 8,00 im PMR-Spektrum ist zurückzuführen auf eine isolierte, freistehende Methylgruppe, während das Paar Niederfeld-Dubletten mit Zentrum bei r = etwa 2,85 und τ = etwa 4,00 einer trans-disubstituierten olefinischen Kohlen-'stoffdoppelbindung entspricht. Die Trans-Orientierung läßt sich von der Kopplungskonstante bei etwa 14 Hz ableiten.

Das Spektrum in d⁶-DimethyIsulfoxid bestätigt die obigen Signale, das Niederfeld-Signal, das auf ein Proton in der trans-disubstituierten Kohlenstoffdoppelbindung zurückzuführen ist, erscheint jedoch als doppelte Dubletten mit Zentrum bei τ = etwa 3,0 und Kopplungskonstanten von etwa 14 bzw. 10 Hz. Das andere Proton in der trans-disubstituierten Kohlenstoffdoppelbindung ergibt ein Dublett mit Zentrum bei τ = etwa 4,1 und einer Kopplungskonstante von etwa 14 Hz. Zusätzlich zu diesen Signalen zeigt sich ein Dublett mit Zentrum bei τ — etwa —0,25 und einer Kopplungskonstante von etwa 10 Hz. Dies deutet darauf hin, daß im Molekül eine substituierte Enaminogruppe

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Das Dublett mit Zentrum bei τ = etwa 8,55 ist auf die Methylgruppe (a) zurückzuführen. Entkoppeiungsversu- *che zeigen, daß die Methylgruppe an die Methingruppe

(b) gekoppelt ist, mit Zentrum bei τ = etwa 5 und einer > <> Kopplungskonstante von etv/a 7 Hz. Die Lage des Signals bei τ = etwa 5 zeigt, daß ein Sauerstoffatom an 'das Methin-Kohlenstoffatom und daß an das Sauerstoffatom eine Abschirmgruppe gebunden ist. Es kann nachgewiesen werden, daß das Methinproton (b) an eine andere Methingruppe (c) gebunden ist, und /iwar bei τ = etv/a 6,3. Die Kopplungskonstante zwischen (b) und

(c) ist etwa 9 Hz. Die Methingruppe (c) ist außerdem an eine andere Methingruppe gebunden, mit einer Kopplungskonstante von etwa 4,5 Hz.

Ein weiteres Signal des PMR-Spektrums in D₂O ist ein Multiple« mit Zentrum bei τ = etwa 6,85, das auf die CH₂-Gruppe (e) zurückzuführen ist Dieses Multiplett zeigt eine charakteristische Aufspaltung des AB-Teils eines ABX-Systems. Die Geminalkopplung der Methylengruppe liegt bei etwa 18 Hz, während die Einzelkopplungen der A- und B-Protonen am X-Proton bei etwa 9,5 bzw. 103 Hz liegen. Das X-Proton dieses — ΗΝ

C = C

45

vorhanden ist, mit einer Kopplungskonstante von = CH- NH von etwa 10 Hz.

D. ¹³C-NMR-Spektrum

Das ^I3-C-NMR-Spektrum des Dinatriumsalzes von M M 13 902 weist folgende 13 Absorptionen auf:

Verschiebung (ppm)

Zuordnung

178,44

172,05

C = O

Fortsetzung

Verschiebung (ppm)

Zuordnung

169,27
144,66
131,49

128,09
103,03

73,97
57,92

53,98

37,20
22,9S
19,55

C=O

C=

C =

-HC

-CH₂-

CH₃

Eine Summierung der unter Punkt A bis D geschilderten Fragmente ergibt, daß das Dinatriumsalz von MM 13 902 die Molekularformel CnHHN₂S₂O₈Na₂ und die der Formel I entsprechende Strukturformel besitzt.

In der Zeichnung bedeutet

F i g. 1 das UV-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 13 902 in wäßriger Lösung;

Fig.2 das IR-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 13 902;

Fig.3 das NMR-Spektrum des Dinatriumsalzes der Substanz MM 13 502.

Das Natriumsalz der Substanz MM 13 902 besitzt eine antibakterielle Wirksamkeit gegen zahlreiche Spezies u. a. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhi und Pseudomonas aeruginosa; und im Gemisch mit Ampicillin eine synergistische Wirksamkeit gegenüber Organismen, wie Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Staphylococcus aureus Russell.

Das reine Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 ist ein jJ-Lactamase-lnhibitor und hat den nachstehend näher erläuterten Iso-Wert zwischen 0,001 μg/ml und 0,0001 μ§/πιΙ gegenüber der /?-Lactamase von Escherichia coli B 11.

Die Substanz MM 13 902 neigt zur Instabilität, wenn sie in Form der freien Säure vorliegt. Demgemäß sind die Salze der Substanz MM 13902 bevorzugt.

Zweckmäßigerweise sind die Salze der Substanz MM 13 902 dibasische Salze. Am gebräuchlichsten werden diese Salze mit pharmakologisch verträglichen Ionen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, in üblicher Weise substituierten Ammoniumionen, und dergleichen, gebildet Besonders bevorzugte Salze sind die Alkalimetallsalze, wie die Natrium- und Kaliumsalze, z. B. das Dinatrium- oder das Dikaliumsalz.

Zweckmäßigerweise weist ein Präparat mit der

Substanz MM 13 902 und ihren Salzen gemäß vorliegender Erfindung einen Reinheitsgrad von mindestens 50 Prozent, besser von mindestens 70 Prozent und vorzugsweise von mindestens 80 Prozent, z. B. von 90 bis 100 Prozent, auf.
Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bilden Arzneimittel, die durch einen Gehalt an der erfindungsgemäßen Substanz MM 13 902 oder deren Salzen gekennzeichnet sind; gegebenenfalls können sie zusammen mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln eingesetzt wer-

jo den.

Am zweckmäßigsten enthalten die erfindungsgemäßen Arzneimittel das Natrium- oder Kaliumsalz der Substanz MM 13 902. z.B. das Dinatrium- oder das Dikaliumsalz der Substanz MM 13 902.

Derartige Arzneimittel können in Form zu einer oralen, lokalen oder parenteralen Anwendung vorliegen, z. B. können sie als Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirupe, rekonstituierbare Pulver und in sterilen Formen für Injektions- oder Infusionszwecke verwendet werden. Derartige Arzneimittel können übliche pharmakologisch verträgliche Substanzen, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Geschmackstoffe, Konservierungsmittel, Zerfallsmittel und dergleichen in Übereinstimmung mit der üblichen pharmazeutischen Praxis in der bei der Formulierung von Antibiotika, wie Penicillinen und Cephalosporine^ bekannter Art und Weise enthalten.

Die Substanz MM 13 902 oder ihre Salze können in den Arzneimitteln vorliegender Erfindung als einziger

so Wirkstoff oder auch zusammen mit einem 0-Lactam-Antibiotikum vorliegen. Geeignete 0-Lactam-Antibiotika umfassen solche bekannte Substanzen, die gegenüber /J-Lactamasen empfindlich sind und auch eine gewisse eigene Widerstandsfähigkeit gegen /5-Lactamasen besitzen. Beispiele derartiger /J-Lactam-Antibiotika sind Ampicillin, Amoxycillin, Benzylphenicillin, Phenoxymethylpenicillin Propicillin, Cephaloridin, Cefoxitin, Cephalothin, Cephalexin, Carbenicillin, Ticarcillin und in vivo hydrolysierbare Ester solcher Verbindungen, wie die Phenyl-, Tolyl- oder InJanylester von Carbenicillin oder Ticarcillin oder die Acetoxymethyl-, Trimethylacetoxymethyl- oder Phthalidylester von Ampicillin, Benzylpenicillin, Amoxycillin, Cephaloridin, Cephaloglycin und dergleichen.

Das Verhältnis der Substanz MM 13 902 oder ihrer Salze zu dem /J-Lactam-Antibiotikum liegt normalerweise zwischen 10:1 und 1 :10, z. B. zwischen 3 :1 und 1 :3.

Die Gesamtmenge der antibakteriellen Mittel in beliebigen Einzeldosierungen liegt normalerweise zwischen 50 und 1500 mg und gewöhnlich zwischen 100 und 1000 mg.

Bevorzugte Einzeldosierungen nach vorliegender Erfindung können einmal oder mehrere Male täglich, z. B. 2- bis 4mal täglich, zur Behandlung von Erkrankungen der Harnwege, der Atmungswege der Weichteile und dergleichen, verabreicht werden. Die Arzneimittel können zur Behandlung von Erkrankungen, wie Bronchitis, Gonorrhoe, Mittelohrentzündung, Brustentzündungen und dergleichen, verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Substanz MM 13 902 und ihrer Salze durch Züchten von Streptomyces olivaceus ATCC 21 379, ATCC 21 380, ATCC 21 381, ATCC 21 382 und ATCC 31 126 unter Bildung des {Complexes MM 4550, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung des MM 4550-K.omplexes in Fraktionen unterteilt, die ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm zeigen, und man die Substanz MM 13 902 oder ihre Salze daraus isoliert.

Der Ausdruck »ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm zeigen« bedeutet, daß entweder die einzige in dieser Lösung vorliegende antibiotische Substanz die Substanz MM 13 902 oder deren Salze ist oder daß, wenn irgendeine andere antibiotische Substanz vorhanden sein soll, dann diese Substanz in einer geringeren Menge als die Substanz MM 13 902 oder deren Salze vorhanden ist. Zweckmäßigerweise liegt die Substanz MM 13 902 oder ihre Salz in einer Menge von 70 Prozent, noch zweckmäßigerweise in einer Menge von 80 Prozent und vorzugsweise in einer Menge von 90 bis 100 Prozent in der Fraktion vor. Es ist gefunden worden, daß ein anwendbares Verfahren zur Bestimmung, welche Fraktionen hauptsächlich eine Lösung der Substanz MM 13 902 oder deren Salze enthalten, in der Überwachung des UV-Absorptionsspektrums jeder Probe liegt. Derartige Fraktionen, die ein UV-Spektrum ähnlich dem der Fig. 1 zeigen, enthalten normalerweise die Substanz MM 13 902 oder deren Salze im wesentlichen frei von anderen antibiotischen Substanzen, wie der nachstehend beschriebenen Substanz MM 4550. Gewöhnlich weisen diese Fraktionen die gewünschte Reinheit auf.

Normalerweise wird das Herstellungsverfahren zur Isolierung der Substanz MM 13 902 als dibasisches Salz angewendet. Wenn man jedoch die Herstellung eines monobasischen Salzes der Substanz MM 13 902 oder gar die freie Säure wünscht, können diese Verbindungen durch Ansäuern des dibasischen Salzes der Substanz MM 13 902 hergestellt werden, da gewöhnlich die monobasischen Salze der Substanz MM 13 902 und die freie Säure der Substanz MM 13 902 nicht in ausreichendem Maße stabil sind, um aus den Gemischen wie der nachstehend beschriebene MM 4550-K.omplex isoliert zu werden. Diese monobasischen Salze und die freie Säure sind wegen ihrer geringen Stabilität nicht leicht erhältlich.

Wie bereits ausgeführt worden ist, wird angenommen, daß die chromatographische Isolierung der Substanz MM 13 902 am besten unter Verwendung eines Salzes der Substanz MM 13 902, wie des Dinatriumsalzes, durchgeführt wird. Die Salze der Substanz MM 13 902 sind in wäßrigen Lösungsmittelsystemen löslicher als in stark lipophilen Lösungsmitteln, und demzufolge bevorzugt man die Verwendung wäßriger Lösungsmittelsysteme bei der chromatographischen Reinigung.

So haben sich annähernd neutral gepufferte wäßrige Lösungen von Elektrolyten als zweckmäßig zur Verwendung in Verbindung mit polaren Trägermaterialien, wie basischen Ionenaustauscherharzen, gezeigt. Demzufolge kann eine mittels eines üblichen Puffers, wie einem Phosphatpuffer, auf einen ungefähren pH-Wert von 7 gepufferte wäßrige Lösung von Natriumchlorid in Verbindung mit Trägermaterialien verwendet werden, die tertiäre Aminogruppen oder quartäre Ammoniumgruppen enthalten. Es ist gefunden worden, daß basische Celluloseaustauscher und basische Austauscher auf Basis vernetzter Dextrane als Trägermaterialien zv/eckmäßig sind, insbesondere ein vernetztes Dextran, das unter der Bezeichnung »QAE-Sephadex A 25« bekannt ist, wenn das Lösungsmittelsystem aus einer 0,7-m Natriumchloridlösung in einem Phosphatpuffer vom pH 7 besteht.
Es haben sich auch Lösungsmittelsysteme, die aus Gemischen von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie niederen Alkoholen, bestehen, als anwendbar in Verbindung mit inerten Trägermaterialen, wie Silikagel oder Cellulose, erwiesen. Ein besonders zweckmäßiges Lösungsmittelsystem zur Verwendung mit Cellulose ist ein Gemisch aus Wasser und Isopropanol, nämlich ein solches aus 7 Teilen Isopropanol und 3 Teilen Wasser.

Das Produkt nach den vorgenannten Verfahren unter Verwendung von lonenaustauscherharzen enthält jedoch häufig einen sehr hohen Anteil an Natriumchlorid, so daß es vorteilhaft ist, die vereinigten Lösungen zu entsalzen. Das Entsalzen kann dadurch bewirkt werden, daß man die Lösung durch eine Säule leitet, die ein lipophiles Material, an das die Substanz MM 13 902

absorbiert wird, enthält, doch die nicht Natriumchlorid adsorbiert. Zweckmäßige Säulenmaterialien sind Polystyrole, wie »Amberlite XAD 4«. Gegebenenfalls kann eine Gelfiltration unter Verwendung von Filtrier¹ .Wsmitteln angewendet werden, wie vernetzte Dex^>r e (»Sephadex G-25«), und Polyacrylamidgele (»Biogel P2«). Aus diesen Säulen können die Antibiotika unter Verwendung von Wasser, wäßrigem Methanol oder dergleichen, eluiert werden.

Wenn die gewünschten Lösungen nach dem vorgenannten Verfahren erhalten werden, kann man die dibasischen Salze der Substanz MM 13 902 in fester Form durch Entfernen des Lösungsmittels unter milden Bedingungen erhalten. Es wurde gefunden, daß ein geeignetes Verfahren zum Erhalten der festen Substanz im Eindampfen unter vermindertem Druck und Gefriertrocknen der vereinigten, die Substanz MM 13 902 enthaltenden Fraktionen besteht.

Gewünschtenfalls kann das Herstellungsverfahren in zwei oder mehreren Stufen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Lösung des MM 4550-K.omplexes in Fraktionen aufgeteilt werden, die die Substanz MM 13 902 oder deren Salze enthalten, welch letztere mit bis zu ihrem eigenen Gewicht mit anderen Antibiotika verunreinigt sind. Die Fraktionen können gefriergetrocknet werden, um ein Material zu liefern, das z. B. zu 50 bis 60 Prozent die Substanz MM 13 902 oder deren Salz enthält, die man dann nochmals chromatographiert, um ein Material zu erhalten, das zu 90 bis 100 Prozent die Substanz MM 13 902 oder deren Salze enthält.

In vorliegender Beschreibung wird der Ausdruck »MM 4550-Komplex« verwendet, um eine Substanz zu beschreiben, die ursprünglich als Substanz MM 4550 in der GB-PS 13 63 075 bezeichnet worden ist. Der MM

4550-Komplex, wie er bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS13 63 075 erzeugt worden ist, ist ein unreines Material, das in unterschiedlichen Anteilen Salze von MM 4550 (wie zuvor angegeben) und Salze der Substanz MM 13 902 sowie erhebliche Mengen anderer Substanzen enthält. Der MM 4550-Komplex zeigt nicht das charakteristische UV-Spektrum der Substanz MM 13 902. Der nachstehend erläuterte !»-Wert des bei der Wiederholung des Beispiels der GB-PS 13 63 075 hergestellten MM 4550-Komplexes liegt gewöhnlich unter 0,0004 μg/ml. Das Verhältnis der Salze von MM 4550 zu den Salzen der Substanz MM 13902 in dem MM 4550-Komplex scheint in hohem Maße variabel und deshalb abhängig von solchen Faktoren zu sein, wie dem verwendeten Organismusstamm und/oder den angewendeten genauen Isolationstechniken, doch ist im allgemeinen gefunden worden, daß der Komplex mehr MM 4550 als die Substanz MM 13 902 enthält Die Herstellung des MM 4550-Komplexes wird nachstehend auch angegeben.

In der Beschreibung wird der Ausdruck »MM 4550« zur Beschreibung der im wesentlichen reinen Substanz verwendet, die eine starke 0-Lactamase-Hemmsubstanz ist und die auch einen gewissen Grad einer antibakteriellen Wirksamkeit besitzt. Die Eigenschaften von MM 4550 sind nachstehend auch näher erläutert.

Ein besonders bevorzugter Organismus zur Verwendung beim Verfahren vorliegender Erfindung ist Streptomyces olivaceus ATCC 31 126.

Der hier verwendete Ausdruck »züchten« bedeutet sorgsames aerobes Wachsen des Organismus in Gegenwart assimilierbarer Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Mineralsalzquellen. Ein derartiges aerobes Wachsen kann auf oder in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Medium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Das Züchten kann auf einer aeroben Oberfläche oder submers stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt sein oder kann chemisch definiert vorliegen. Es wurden Medium gefunden, die komplexe Nährstoffe enthalten, wie Hefeextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen, die besonders zweckmäßig sind. Es ist ferner gefunden worden, daß der Zusatz von Kobaltionen, Sulfationen und Calciumcarbonat vorteilhaft ist.

Es ist gefunden worden, daß das Züchten bei einer Temperatur von 28 ± 2⁰C annehmbare Ausbeuten an dem Antibiotikum ergibt und daß man nach 2 bis 3 Tagen nach Beginn der Fermentation die Züchtung gewinnen kann.

Es ist gefunden worden, daß die Bestrahlung von Kulturen von Streptoniyces olivaceus ATCC 21 379 mit anschließender Isolierung des erhaltenen Stammes, Her die ausgedehnteste Aktivitätszone bei der nachstehend beschriebenen KAG-Probe zu erzeugen scheint, zur Isolierung von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 führte, der der bevorzugte Stamm zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung ist.

Für gewöhnlich sollen alle, zum Erhalten der gewünschten Antibiotika angewendeten Isolierungsund Reinigungsverfahren bei nicht erhöhten Temperaturen, z. B. unter 20⁰C und noch zweckmäßiger nicht oberhalb 12° C, stattfinden.

Die gewünschte Substanz wird gewöhnlich in der Hauptsache aus dem Kulturfiltrat erhalten, so daß die bevorzugte Anfangsstufe bei dem Isolierungsverfahren im Entfernen festen Materials aus der Fermentationsbouillon, z. B. durch Filtrieren, ist.

Eine mit Verunreinigungen vermischte Zubereitung der Substanz MM13 902 oder deren Falze kann aus dem geklärten Kulturfiltrat erhalten werden, indem man die Substanz MM 13 902 oder deren Salze an ein aktives Material, wie Aktivkohle oder dergleichen, adsorbiert und danach die gewünschte Substanz von dem aktiven Material unter Verwendung eines Lösungsmittels, wie wäßriges Aceton, eluiert. Üblicherweise wird das Verfahren bei einem dibasischen Salz der Substanz MM 13 902 durchgeführt.

Gegebenenfalls kann man eine verunreinigte Zubereitung der Substanz MM 13902 oder deren Salze aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion unter Verwendung eines lipophilen Ammoniumsalzes und eines mit Wasser

nicht mischbaren Lösungsmittels erhalten. Dies ist häufig wirkungsvoller als das zuvor beschriebene Verfahren. (Die Substanz MM 13 902 kann auch als substituiertes Ammoniumsalz durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck

erhalten werden.) Vorzugsweise wird dann die Ausgangslösung des substituierten Ammoniumsalzes der Substanz MM 13 902 unier Verwendung einer Lrsung eines Alkalimetalljodids, wie Natriumiodid, in die wäßrige Phase zurückextrahiert. Diese letztgenannte Verfahrensvariante führt im allgemeinen zur Herstellung einer wäßrigen Lösung eines unreinen dibasischen Salzes der Substanz MM 13 902.

Streptomyces olivaceus und verwandte Organismen besitzen die nachstehenden Haupteigenschaften:

(a) Sporenbildende Luftmycele entweder in der Grau-Reihe oder in der Gelb-Reihe;

(b) die Morphologie eines Sporenträgers entweder mit rektiflexib'en Sporen oder mit Spiralen;

(c) oberflächlich glatte Sporen und
(d) keine Melanin-Bildung.

Einige diese vorstehenden Eigenschaften besitzende Spezies sind in den Tabellen V bis IX aufgeführt.
Die zuvor beschriebenen verunreinigten Formen der Substanz MM 13 902 oder deren Salze werden der vorgenannten Chromatographie unterworfen, um die reine Substanz zu erzeugen.

Iso-Bestimmung

Der !»-Wert ist diejenige Menge an Substanz, die erforderlich ist, um eine 50prozentige Hemmung der Hydrolyse von Ampicillin durch das /?-Lactamase-En-

zym von Escherichia coli BIl zu erzeugen, einem Organismus, der den die /?-Laciamase steuernden R-Faktor enthält. Diese 0-Lactamase wird als Enzym vom Typ IHa gemäß der Klassifikation von Richmond and Sykes klassifiziert (vgl. Adv. in Microbiol. Physiol. 9 (1973), S. 31).

Die Geschwindigkeit der 0-Lactamase-Hydrolyse von Ampicillin zu seiner Penicillansäure kann mittels der Jodstärke-Probe verfolgt werden, bei der man die Geschwindigkeit der Bildung von Penicillansäure durch

Entfernung des Jodstärke-Komplexes mißt Dieses Verfahren und die Herstellung der ß-Lactamase sind beschrieben in dem Aufsatz von M. Cole, S. Elson und P.D. Fuilbrook in »Biochemical Journal« 127 (1972), S. 295 bis 308. Es wird eine geringfügige Modifikation des vorgenannten Verfahrens angewendet, indem eine Probe des Inhibitors mit dem Enzym 15 Minuten bei 37° C vorbebrütet wird, bevor es dem Ampicillinsubstrat zugegeben wird. Das Verfahren ist wie folgt:

Reagentien:

Puffer

O,üj-m Kaliumphosphatpuffer vom pH 7;

Jodstärke-Lösung

hergestellt gemäß Novick in »Biochemical Journal« 83 (1962), S. 236;

Substrat

40 μg/ml Ampicillin in der Pufferlösung;

ß- Lactamase- Enzym

hergestellt aus Escherichia coli BIl gemäß CoIe und Mitarbeiter »Biochemical Journal« 127 (1972), S. 295. Ein Verdünnen der Enzymzubereitung in der Pufferlösung erfolgt derart, daß man einen Abfall der optischen Dichte-Einheiten von etwa 03 auf 100 Sekunden bei der ungehemmten Reaktion erhält. Andere /?-Lactamase erzeugende Stämme von Escherichia coli können verwendet werden, insbesondere solche, die den R-Faktor enthalten, z. B. »R TEM«.

Bedingungen

Die Reaktionen werden in einer 1 cm-Cuvette bei 37°C in einem »SP 800-Pye-Unicarrw-Spektrophotometer durchgeführt. Dieses Instrument kann 4 Probecuvetten und die entsprechenden Cuvetten für Blindversuche tragen. Die erste Cuvette wird zur Kontrollreaktion verwendet und enthält keinen Inhibitor. Die zweite, dritte und vierte Cuvette werden mit verschiedenen Verdünnungen des Inhibitors eingesetzt.

Reagentien

Jodstärke-Reagens

E. coli-jS-Lactamase

Puffer

Inhibitor des Puffers

Substrat (nach 15minütigem Bebrüten des vorstehenden Gemisches bei 37⁰C zugegeben)

Probe	Blindversuch
1,0 ml	1,0 ml
0,1 ml	-
0,3 ml	0,4 ml
0,1 ml	0,1 ml
1,0 ml	1,OmI

Im Anschluß daran folgt die Aufzeichnung der Änderung der optischen Dichte bei 590 nm durch Messen der Geschwindigkeit der Reaktion als Änderung der optischen Dichte je 100 Sekunden während eines 3- bis 6minütigen Intervalls. Die Inhibitorprobe wird verdünnt, bis man eine Verdünnung erreicht, die 50 Prozent der bei der keinen Inhibitor enthaltenden Blindprobe gesehenen Reaktionsgeschwindigkeit entspricht.

Die KAG-Probe
(Klebsiella aerogenes-Penicillin G-Probe)

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Die KAG-Probe ist eine Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von jS-Lactamase-Inhibitor in Fermentationsbouillons oder während der Isolierungsstufen. Der geschmolzene Nähragar wird bei 45°C mit einem geeigneten /i-Lactamase erzeugenden Stamm von Klebsiella aerogenes beimpft und dann mit einer ausreichenden Menge einer sterilen Lösung von Penicillin G vermischt, so daß man eine Konzentration von 6 μg/ml Penicillin G in dem Agar erhält Der Agar 50 Bestandteile

wird dann in eine Petrischale gegossen. Nach seiner

Verfestigung werden unter Verwendung eines Metallbohrers in gleichen Abständen zylindrische Bohrungen in die Schicht gebohrt. Dann werden in die Bohrungen die zu untersuchenden Lösungen eingebracht. Die Schale wird dann bei konstanter Temperatur zwischen 27 und 37°C bebrütet Während der Bebrütungsdauer diffundieren die Inhibitoren in der zu untersuchenden Lösung aus den Bohrungen in den Agar und hemmen dort die Wirkung der durch die Klebsiella-Zellen erzeugten /?-Lactamase. Somit wird das Penicillin G vor dem Abbau durch ß-Lactamase geschützt und liegt in ausreichender Konzentration vor, um das Wachstum von Klebsiella zu verhindern. In denjenigen Teilen des Agars, in die der Inhibitor nicht in ausreichender es Konzentration diffundiert is*, wird das Penicillin G durch die ^-Lactamase abgebaut, wodurch sich ein dichtes Wachstum von Klebsielia entwickelt. Es bilden sich somit klare Ringzonen einer Hemmung des Klebsiella-Wachstums um die den Inhibitor enthaltenden Bohrungen, wobei die Größe jeder Zone von der Inhibitorkonzentration in der zu untersuchenden Lösung abhängt. Die Stärke der Prüflösungen (in beliebigen Einheiten je ml) wird unter Bezugnahme auf die Standardlinie des Logarithmus der Inhibitorkonzentration gegenüber dem Zonendurchmesser erhalten. Diese Versuchsanordnung kann auch für eine Bioautographie verwendet werden.

Herstellung des MM 4550-KornpIexes, der mit dem in der GB-PS13 63 075 vergleichbar ist

Man züchtet Steptomyces olivaceus ATCC 21 379 7 Tage lang bei 28⁰C auf einem festen Schrägagar in einer Röux-Flasche. Der Agar hat die folgende Zusammensetzung:

Menge (g/Liter)

Hefe-Extrakt	10,0
Glucose-monohydrat	10,0
Agar	15,0
Leitungswasser	ad 1 Liter

Zur Sterilisation wird das Medium auf pH 6,8 eingestellt. 50 ml steriles entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-Sorbitan-Monooleats werden in die Roux-Flasche mit der Züchtung gegeben und dann die Sporen durch Schütteln suspendiert. Diese Sporensuspension wird dann als Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmediums in einem 100 Liter fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile

Menge (g/Liter)

Sojabohnenniehl	10,0
Glucose-monohydrat	20,0
Leitungswasser	ad 1 Liter

Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml eines 10 Volumenprozent eines Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls vor der Sterilisation dem Fennentationsmedium zugesetzt.

Das Medium wird dann in dem Fermenter 20 Minuten bei 120⁰C durch Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit 340 UpM mittels eines Leitschaufelrührers mit 21,6 cm Durchmesser gerührt und durch eine offenendige Sprüheinrichtung mit 150 Liter steriler Luft/Minute versorgt. Das Züchtungsgefäß ist mit Prallblechen ausgerüstet. Die Temperatur wird auf 28°C eingeregelt. Nach einer 45stündigen Bebrütung unter diesen Bedingungen werden 7,5 Liter dieser Züchtungslösung als Impfstoff zu 150 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einen 300 Liter-Fermenter aus rostfreiem Stahl überführt. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile	Menge (g/Liter)
Sojabohnenmehl	10,0
Glucose-monohydrai	20,0
Kreide (gefälltes Calciumcarbonat)	0,2
Kobaltchlond (CoCl₂ · 6 H₂O)	0,001
Leitungswasser	ad 1 Liter

Zur Schaumverhinderung werden 300 ml des 10 Volumenprozent des vorgenannten Blockpolymerisats enthaltenden Sojabohnenöls zugegeben. Die Fermentation wird nach 48 Stunden gewonnen und durch Zentrifugieren geklärt Die geklärte Bouillon liefert eine 50prozentige Hemmung bei der Enzymprobe bei einer Verdünnung von 1 in 100000.100 Liter der geklärten Bouillon ■-.erden mit 12 kg einer Ionenaustausch-Cellulose in der Acetatform, feucht berechnet, verrührt, wobei die Cellulose eine mikrokristalline Cellulose mit Diäthylaminoäthyl-Gruppen ist.

Nach dem Filtrieren der Aufschlämmung wird der MM 4550-Komplex mittels 12 Liter einer 0,5-m Kaliumsulfatlösung aus dem Austauscher eluiert. Das Eluat wird in einem aufsteigendem Filmverdampfer unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 6 Liter eingeengt. Durch eine Zugabe von 12 Liter Aceton wird der grö3te Teil des Kaliumsulfats ausgefällt. Die Lösung wird filtriert und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 200 ml eingeengt. Das Konzentrat wird auf eine Säule von 76 mm · 2 m, die mit einem nichtionischen Polystyrolharz beschickt worden ist, aufgegeben und mit entsalztem Wasser eluiert. Das Eluat wird in 140 ml-Fraktionen gesammelt Die aktiven Fraktionen, die mittels der KAG-Probe festgestellt werden, werden gesammelt (2,2 Liter) und auf 275 ml durch Ultrafiltrieren mittels einer »Amicon UM-05«-Membran von 150 mm Durchmesser unter

einem Stickstoffdruck von 4,20 kg/cm² eingeengt Das Konzentrat wird gefriergetrocknet Man erhält 2.2 g eines brauen Pulvers vom IwWert 0,004 μg/ml.
1 g dieses Pulvers wird in 1 Liter einer 0,2-m Natriumsuifatlösung gelöst und mit 1 Liter einer 2gewichtsprozentigen Tetra-n-butylammonium-nydrogensulfat-Lösung in Dichlormethan vermischt Die Dichlormethan-Phase wird durch Absitzenlassen abgetrennt, auf -70⁰C gekühlt zur Entfernung von Eis

ίο filtriert und dann durch Eindampfen auf 20 ml eingeengt. Zu dem Konzentrat werden 400 ml Petroläther vom Siedebereich 40 bis 60⁰C gegeben. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in 10 ml Dichlormethan wieder aufgelöst und mit 10 ml Wasser, das 80 mg Bariumjodid

und 70 mg Bariumcarbonat enthält, extrahiert. Die Phasen werden getrennt, wobei die wäßrige Phase filtriert und auf pH 6,5 eingestellt wird. Die Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält ein gelbes Pulver. Das Pulver wird mit Aceton gewaschen, um überschüssiges

Bariumjodid auszuwaschen. Der blaßgelbe Feststoff wird wiederum durch Zentrifugieren gewonnen und dann unter vermindertem Druck getrocknet Ausbeute beträgt 13 mg und der I₅₀-Wert 0.0004 μg/ml.

Darlegung dsr Adsorption des Kulturfiltrats

an Kohle, das zur Gewinnung des in der

GB-PS13 63 075 beschriebenen Materials

vorteilhaft ist

Das nach der vorstehenden Beschreibung erhaltene Kulturfiltrat liefert einen Zonendurchmesser von 17 mm bei einer antibakteriellen Diffusionsprobe mit Bohrungen in einer Agarplatte gegenüber Klebsieila aerogenes, einen Zonendurchmesser von 38 mm bei der KAG-Probe und einen Iso-Wert bei einer Verdünnung von 1 in 100 000. 170 Liter des geklärten Kulturfiltrats werden bei 5°C mittels eines aufwärts gerichteten Stroms durch eine Säule von 22,9 cm Durchmesser, die bis zu einer Höhe von 40,6 cm mit Aktivkohle (einer Korngröße von 0,17 bis 0,25 mm Durchmesser und vorgewaschen mit η-Salzsäure und mit Phosphatpuffer auf pH 6 eingestellt) gefüllt ist, bei einer Fließgeschwindigkeit von 800 bis 1000 ml/Minute perkoliert Die Brühe wird von der Aktivkohle mit 10 Liter entsalztem Wasser ausgewaschen, und die Säule wird bei 20⁰C mit 20 Prozent Aceton eluiert. Die in einer Menge bis zu 10 Liter anfallenden aktiven Fraktionen werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 6 Liter eingeengt und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 282 g eines rohen MM 4550-Komplexes mit einem Iso-Wert von 0,05 μg/ml. Die Hemmwirkung des gewonnenen Enzyms beträgt 22 Prozent

Anstelle der aktivierten Kohle liefern auch andere Aktivkohlen die gleichen Ergebnisse.

Darstellung der Chromatographie

des Kulturfiltrats an einem lonanaustauscherharz,

das zur Gewinnung des in der GB-PS13 63 075

beschriebenen Materials vorteilhaft ist

Eine Säule mit 1 cm Innendurchmesser wird bis zu einer Höhe von 6 cm (Bettvolumen 4,7 ml) mit einem lonenaustauscherharz in der Chloridform und einem Teilchendurchmesser von 03 bis 032 mm gefüllt. Das lonenaustauscherharz ist ein Polystyrol-Di vinylbenzol-Harz mit basischen Gruppen. Das Harzbett wird dann 4mal mit etwa 4,7 ml 5prozentigem wäßrigen Methanol und anschließend einmal mit etwa 4,7 ml destilliertem Wasser gewaschen. Es werden 2 Liter Kulturfiltrat

angewendet. Das Harz wird dann mit 50prozentigem wäßrigen Methanol zum Entfernen der Verunreinigungen gewaschen.

Der MM 4550·Komplex wird vom Harz mit 5 Prozent Natriumchlorid enthaltendem 50prozentigen Methanol eluiert. Die nachstehende TabrJle I zeigt die erhaltenen Ergebnisse in Wirkungseinheiten. Der MM 4550-Komplex-Gehalt des Kulturfiltrats wird willkürlich mit 8 Einheiten/ml festgesetzt. Die aus der Säule eluierten Fraktionen werden unter Anwendung der antibakteriellen Diffusionsmethode gegenüber Klebsieila aerogenes geprüft. Die Aktivitätseinheiten werden unter Bezug-Tabelle I

10 nähme auf die Standardlinie berechnet, die durch Aufzeichnen des Zonendurchmessers gegen die Einheiten/ml für verschiedene Verdünnungen des Kulturfiltrats ermittelt worden ist, d. h. daß das Kulturfiltrat als Standard verwendet worden ist

Es ist ersichtlich, daß die Säule einen wirksamen Weg zur Konzentrierung des MM 4550-Komplexes darstellt. Die Fraktionen 2 bis 5 enthalten 60 Prozent der Aktivität in einem Gesamtvolumen von nur 37 ml. Das Gesamttrockengewicht dieser Fraktionen beträgt etwa 210 mg, während 35 g Feststoffe auf die Säule gegeben worden sind.

Ergebnisse der Chromatographie an einem basische Gruppen enthaltenden Polystyrol-Divinylbenzol-Harz

Probe

pH

Kulturfiltrat

Perkolat 1
Perkolat 2
Perkolat 3
Perkolat 4

Eluat 1
Eluat2
Eluat3
Eluat 4
Eluat 5
Eluat 6
Eluat7
Eluat 8

6,5

6,9 7,0 7,0 7,0

7,8 7,8 7,7 7,7 7,6 7,5 7,6 7,6

Volumen	Einheiten	Insgesamt:	Gesamteinheiten
(ml)	(ml)
1970	8	15 760
550	<1	<100
525	<1	<100
595	<1	<100
300	<1	<100
7,0	84	588
7,0	328	2 296
8,5	440	3 740
10,0	?20	2 200
11,5	160	1 840
11,0	80	880
14,2	66	937
20,0	33	660
	13 141

Darstellung der lonenpaar- Extraktion

eines Kulturfiltrats, das zur Gewinnung des

in der GB-PS 13 63 075 beschriebenen Materials

vorteilhaft ist

248 g Natriumsulfat werden zu 10 Liter eines geklärten Kulturfiltrats gegeben, das wie vorstehend so angegeben, hergestellt worden ist. Die Lösung wird unter 30nnnütigem Rühren mit 10 Liter 2 Prozent Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfat enthaltenden Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und auf 2° C gekühlt. Eine geringe Menge suspendierten Wassers wird durch Filtrieren durch ein »Whatman No, l-PS«-Papier entfernt. Dann wird die Dichlormethan-Lösung durch Eindampfen unter vermindertem Druck und einer Temperatur unter 30° C auf 20 ml eingeengt. Nach Zugabe von 400 ml eines Petroläthers vom Siedebereich 40 bis 60° C fällt eine gummiartige Substanz aus, die den MM 4550-Komplex enthält

Die gummiartige Substanz wird abzentrifugiert, in 50 ml Dichlormethan wieder gelöst und mit 50 ml Wasser, das 1 g Bariumjodid und 1 g Bariumcarbonat enthält, durch 2minütiges Schütteln extrahiert. Die vorhandenen Feststoffe werden abfiltriert, und die beiden Phasen aufgetrennt Die wäßrige Phase mit dem MM 4550-Komplex als Bariumsalz wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und gefriergetrocknet Man erhält 317 mg des rohen MM 4550-Komplexes mit einem Im-Wert von 0,001 μg/ml.

Herstellung eines teilweise gereinigten

antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an

MM 4550 und MM13 902 unter Verwendung von

Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensulfai

12,5 g eines wie vorstehend angegebenen hergestellten rohen MM 4550-Komplexes werden in 125 ml Wasser wieder aufgelöst und mit 125 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 10 Gewichtsprozent Tetra-n-butyl-ammonium-hydrogensuiiat extrahiert. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und nochmals mit 100 ml Wasser, das ISO mg Natriumiodid enthält, bei 2°C unter langsamem Rühren und Einstellen der wäßrigen Phase mittels 2prozentiger Natriumbicarbonatlösung auf pH 6,4 extrahiert Die Lösung wird gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit Aceton gewaschen. Die Ausbeute beträgt 88 mg der gemischten Natriumsalze von MM 4550 und MM 13 902 mit einem I50-Wert von 0,0002 μg gegenüber der Escherichia coIi-ji-Lactarnase.

Die Gewinnung der Antibiotika beträgt 70 Prozent.

Die antibakterielle Wirksamkeit von Gemischen aus Ampicillin und der nach diesen Angaben hergestellten

Substanz wird mittels der Reihenverdünnungsmethode in einem Nähragar bestimmt. Die erhaltenen Mindesthcmmkonzentrationen sind in der Tabelle H angegeben.

Tabelle I!

Organismus

Ampicillin Ampicillin + MM 4550-Komplex bei

(allein) 0,1 pg/ml 1 μg/ttll 1

10 μg/ml

E.coliBll
E. coli JT417
E. coli JT 39
ShigeüasonneiS239
Klebsiella aerogenes A
Klebsieila aerogenes IP 282
Proteus mirabilis 889
..Proteus mirabilis 247
''Proteus morganii F
Proteus rettgeri RIlO
/Staph. aureus (Russell)
"Staph.aureus (Rüssel H)

>500
250

>500

250

>500

125

25

50

>500

125

50

125

500
250
500
125
5*)

12,5

5,0

25*)

50
50
25*)
25*)

0,5*)

0,5

0,25*)

0,25

*) teilweise Hemmung durch den MM 4550-Komplex allein bei diesen Konzentrationen.

Ähnliche synergistische Wirkungen werden bei Gemischen von Amoxyc'illin und dem MM 4550-Komfplex beobachtet.

Herstellung eines teilweise gereinigten
antibiotischen Komplexes mit MM 4550 und MM 13 902 .. unter Verwendung von

ί Cetyl-dimethylbenzyi-ammoniumchlorid

Das vorstehend aus der Aktivkohlesäule mit Aceton und Wasser eluierte gefriergetrocknete Produkt mit dem I5o-Wert von 0,02 μg/ml wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 13 mg/ml gelöst. Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.

100 ml dieser Lösung werden mit dem gleichen Volumen Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,1 Prozent Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid extrahiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt. Die organische Phase wird nochmals mit 100 ml einer 0,05prozentigen Natriumjodidlösung extrahiert Die Phasen werden aufgetrennt, und Dichlormethan in der wäßrigen Phase wird entfernt, indem die Lösung 10 Minuten unter vermindertem Druck gehalten wird.

Die wäßrige Lösung wird gefriergetrocknet Das gefriergetrocknete Produkt wird 3mal mit je 50 ml Aceton gewaschen. Das mit Aceton gewaschene Produkt wird unter vermindertem Druck im Trockenschrank getrocknet. Man erhält 4,3 mg eines schwachbraunen Pulvers mit einem 150-Wert von 0,002 μg/m!.

Herstellung eines teilweise gereinigten
antibiotischen Komplexes mit einem Gehalt an

MM 4550 und MM 13 902
unter Verwendung der Gelfiltration

1 g des vorstehend hergestellten rohen MM 4550-Komplexes mit dem Im-Wert von 0,2 μg/ml wird an einem vernetzten Dextran chromatographiert und unter Verwendung eines Gemisches von Aceton und Wasser im Volumverhältnis von 4:6 eluiert. Die Säulenabmessungen betragen 24 cm · 32 cm. Die Eluierung wird mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/Minute durchgeführt Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C eingeengt und schließlich gefriergetrocknet Man erhält 22 mg eines amorphen gelbbraun gefärbten Feststoffes mit einem I₅O-Wert von 0,005 μg/ml. Die Ausbeute beträgt 88 Prozent und die Reinigung 4Ofach.

40

45

Herstellung eines gereinigten antibiotischen

Komplexes mit MM 4550 und MM 13 902 unter

Anwendung einer Chromatographie an Cellulose

610 mg des vorstehend hergestellten MM 4550-Komplexes werden an einer Säule von 2,5 cm · 32 cm mit einer Füllung von Cellulose vom Typ »Whatman CC 31« chromatographiert. Die Säule wird mit einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis von 7:3 mit einer Geschwindigkeit von 15ml/Minute

. eluiert. Die antiDakteriell wirksamen Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30°C eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 40 mg eines amorphen braunen Feststoffes eines antibiotischen Komplexes mit einem i5o-Wert von 0,00007 ^g/ml. Der sehr kleine I₅₀-Wert zeigt an, daß die aktive Substanz eine verbesserte Reinheit besitzt

Bei einer Wiederholung der Verfahrensschritte erhält man eine Substanz mit einem Is₀-Wert von 0,001 μg/ml. Diese Substanz besitzt eine antibakterielle Wirksamkeit gemäß der Tabelle III, wenn sie mittels der Standard-Mikrotiter-Methode in einer OxokJ-Empfiridlichkeits-Bouillon unter Verwendung schwacher Impfstoffe (1 Prozent einer über Nacht stehengelassenen Bouillon) bestimmt wird.

Tabelle Hl

Antibakterielle Wirksamkeit eines Gemisches von
MM 4550 und MM 13 902 mit einem I₅₀-Wert von
0,001

Organismus

Mindesthemmkonzen (ration in |ig/ml

Staphylococcus aureus (Oxford) 7,5

Staphylococcus aureus (Russell) 7,5

Streptococcus fwcalis 125

Bacillus subtilis 0,9

Escherichia coli (10 418) 3,7

Escherichia coli (B 11) 15

Klebsiella aerogenes 1,8

Enterobacter cloacae 62

Proteuc mirabilis 7,5

Providentia stuartii 7,5

Acinetobacter anitratus 0,9

Pseudomonas aeruginosa 250

Serratia marcescens 7,5

Salmonella typhimurium 15

Shigella sonnei 7,5

Die Substanz MM 4550

Die Substanz MM 4550 kann durch ihre nachstehenden Eigenschaften erkannt werden:

Die Substanz MM 4550 ist ein saurer Feststoff, der in Form des Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften aufweist:

(1) er ist leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;

(2) in wäßriger Lösung besitzt er ein charakteristisches Ultraviolett-Spektrum mit Absorptionsmaxima bei etwa 238 nm und etwa 287 nm;

(3) wenn er zu 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch zubereiteten KBr-Platte vorliegt, hat er ein charakteristisches Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei etwa 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 und 1260 cm-·. Wenn nach etwa 1 Woche seit der Herstellung der KBr-Platte nochmals ein Spektrum aufgenommen wird, zeigt es beträchtliche Änderungen, z. B. wird das zuvor breite Maximum bei etwa 1765cm~' beträchtlich abgebaut oder ist verschwunden;

(4) die Substanz besitzt ein charakteristisches NMR-Spektrum, wenn es in deuteriertem Wasser aufgenommen wird. Dieses Spektrum besitzt u. a.

(a) ein Paar Niederfeld-Dubletten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,45 t und 3,65 ν mit Kopplungskonstanten bei etwa 15 Hz,

(b) ein Dublett mit dem Zentrum bei etwa 8,55 τ und

(c) ein scharfes Singulett bei etwa 7,95 r;

(5) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose weist die Substanz bei den nachstehenden Lösungsmittelsystemen die sehr angenäherten Rf-Werte auf:

(a) Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7:7:6, einen Rj-Wert von 0,6;

(b) Isopropanol/Wasser im Volumverhältnis 7 :3, einen Rr- Wert von 0,7;

(c) n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumverhältnis 7 :7 :6, einen Rt- Wert von 0,7 und
(d) n-Propanol/Wasser im Volumverhältnis 4 :1,

einen Rf-Wert von 0,6;

(6) die Substanz besitzt eine antibakterielle Wirksam-ίο keit gegen zahlreiche Spezies, u. a. gegen Stämme von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens und Shigella sonnei;

(7) die Substanz besitzt eine Enzymhemmwirkung gegen die von zahlreichen Spezies erzeugte /?-Lactamase, u.a. Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Staphylococcus aureus. Sie besitzt einen !»-Wert von unter 0,0001 μg/ml gegen die /f-Lsctamase von Escherichia coli BIl;

(8) wenn die Substanz mii Ampicillin vermischt wird, weist sie eine synergistische Wirksamkeit gegen Organismen auf, wie Stämme von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morgana und Staphylococcus aureus Russell;

(9) die Aminosäuren-Analyse zeigt, daß die Substanz kein Polypeptid oder Protein ist. Nach saurer Hydrolyse findet man keine «-Aminoadipinsäure;

(10) die Substanz reagiert mit Ehrlich-Reagens (300 mg 4-Dimethylaminobenzaldehyd gelöst in einem Gemisch von 54 ml n-Butanol, 9 ml Äthanol und 9 ml konzentrierter Salzsäure), wobei eine blaue Farbe auf dem Papierchromatogramm und auf den Folien des Dünnschichtchromatogramms erzeugt wird;

(11) die Substanz ist kein allgemeines Enzymgift und hemmt nicht die nachstehenden Enzyme bei Konzentrationen, die im Überschuß gegenüber der zur Hemmung der j?-Lactamase von Escherichia coli, Monamin-oxidase, Carbonsäure-anhydrase, Dopadecarboxylase, Trypsin, Chymotrypsin oder Urease erforderlich ist.

Beispiel 1

Herstellung des MM 4550-Komplexes und Auftrennung in die Substanzen MM 4550 und MM 13 902

Die vorstehend irr einzelnen ausgeführten Isolierungsverfahren können bei ihrer Anwendung in verschiedener Weise aufeinanderfolgen. Eine besonders zweckmäßige Reihenfolge ist die Adsorption an Kohle, die Ionenpaar-Extraktion und die Chromatographie an Cellulose, wie es nachstehend beschrieben wird:

Liter des vorstehend erhaltenen Kulturfiltrats werden in aufsteigender Richtung mit einer Geschwindigkeit von 800 bis 1200 ml/Minute durch eine Säule von 22,9 cm Durchmesser und 533 cm Höhe, die mit Aktivkohle gefüllt war, perkoliert. Die Aktivkohle ist zuvor zur Adsorption des MM 4550-Komplexes verwendet worden und anschließend durch Waschen mit folgenden Reagentien regeneriert worden:

0,5-n Natronlauge;

O^-n Natronlauge/Aceton im Verhältnis 3:2;
Wasser;

«-Salzsäure;

Wasser;

Phosphatpufferlösung vom pH 6 und Wasser.

Die Säule wird mit 20 Liter Wasser gewaschen, um das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann durch Abstrom mit einem Gemisch von Aceton und Wasser im Volumverhältnis 2:8 mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 250 ml/Minute eluiert. Das Eluat wird in

1 Liter-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen mit einem Gehalt an dem MM 4550-Kornplex, der durch die antibakterielle Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebsieila aerogenes bestimmt worden ist, werden vereinigt (11 Liter) und durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf ein Volumen von 5,5 Liter eingeengt. Die Gewinnung an MM 4550-Komplex bei dieser Stufe beträgt 20 Prozent.

Das Konzentrat wird auf 2° C gekühlt und dann mit 5,5 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 2 Gewichtsprozent Tetra-n-butylammonium-hydrogensulfat bei -5⁰C versetzt. Die beiden Phasen werden

2 Minuten miteinander vermischt. Dann wird die Dichlormethan-Phase abgetrennt und bei 0⁰C zu 1 Liter einer 0,6prozentigen Natriumjodidlösung gegeben. Die beiden Phasen werden langsam miteinander verrührt, und die wäßrige Phase wird allmählich mittels einer 2prozentigen wäßrigen Bicarbonatlösung auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 eingestellt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumiodid zu lösen. Das Aceton wird vom unlöslichen Rückstand unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 1,1 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-Komplex in dieser Stufe beträgt 10 Prozent. Die auf die gelösten Gesamtfeststoffe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 125fach.

Eine Säule von 2,5 cm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von Isopropanol und Wasser im Volumverhältns von 7 :3 bis zu einer Höhe von 32 cm beschickt. 500 mg des gelbbraunen Pulvers werden in 2 ml eines Gemisches von Isopropanol und Wasser im Volumverhältnis 7 :3 gelöst und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute chromatographiert. Es werden 3 ml-Fraktionen aus der Säule gesammelt. Diejenigen mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm werden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält den MM 4550-Komplex. Frühere Untersuchungen haben ergeben, daß die bei 285 nm absorbierenden Fraktionen eine enzyminhibierende, antibakteriell wirksame Substanz enthalten. Die Ausbeute an dem gefriergetrockneten MM 4550-Komplex beträgt 35 mg der ein amorphes braunes Aussehen und einen !»-Wert von 0,0001 μg/mI besitzt Die Gewinnung der aktiven Substanz bei dieser Stufe beträgt insgesamt 3 Prozent und die Reinigung insgesamt ist 600fach.

Die antibakterielle Wirksamkeit dieser Substanz wird mittels der Standard-Mikrotiter-Methode bei der Oxoid-Empfindlichkeits-Testbouillon unter Verwendung eines schwachen Impfstoffes bestimmt Die erhaltenen Mindesthemmkonzentrationen sind denjenigen in der Tabelle IH beschriebenen ähnlich.

Eine Analyse der Substanz mittels Dünnschichtchromatographie an Cellulose, wobei mit einem Gemisch von n-Butanol-Isopropanol-Wasser im Volumverhältnis 7:7:6 entwickelt wird, liefert eine Auftrennung in zwei aktive Substanzen, von denen die eine einen Rf-Wert von annähernd 0,58, der die Substanz MM 4550 anzeigt und die andere mit einem Rr-Wert von annähernd 0,72 aufweisen, was die Substanz MM 13902 anzeigt. Diese beiden Substanzen werden durch Bioautographie an verschiedenen Organismen bestimmt, z. B. Bacillus subtilis. Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (penicillinresistent), Escherichia coli (penicilunempfindlich und penicillinresistent), Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganii und Klebsieila aerogenes. Einige der erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV zusammengefaßt.

Bei einem weiteren Versuch werden die beiden Substanzen auf einer Cellutosedünnschicht getrennt, die mit einem Gemisch von Isopropanoi und Wasser im Verhältnis 8 :2 entwickelt worden ist, und dann aus der Cellulose mittels Phosphatpuffer extrahiert Jeder Extrakt wird auf eine 0-Lactamase-Hemmung geprüft Beide Substanzen zeigen, daß sie Inhibitoren der Escherichia coli-.ß-Lactamase sind. Beide Substanzen zeigen auch, daß sie mit Benzylpenicillin gegenüber Klebsieila aerogenes synergistisch wirken.

Tabelle IV

Antibakterielle Wirksamkeit von MM 4550 und MM 13 902, bestimmt durch Bioautographie (Dünnschichtchromatographie mit Cellulose und Butanol/lsopropanol/ Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6)

Organismus

Zor.endurchmesser bei Bioautographie

MM 4550-Zone in MM 13 902-Zone in
mm bei Rf = 0,58 mm bei R_f = 0,70

Klebsiella aerogenes	20,0 mm	20,0 mm
Proteus mirabilis	17,5 mm	13,5 mm
Proteus morganii	16,0 mm	9,5 mm
Salmonella typhi	19,5 mm	21,0 mm
Escherichia coli 10 418	20,0 mm	13,5 mm
Escherichia coli BIl	17,5 mm	10,5 mm
Enterobacter aerogenes	6,5 mm	keine Zone
Staphylococcus aureus (Oxford)	13,0 mm	4,0 mm
Staphylococcus aureus (Russell)	12,0 mm	4,0 mm
Bacillus subtilis	24,0 mm	15,0 mm

Beispiel 2

Herstellung des MM 4550-Komplexes

und Auftrennung in die Substanz
MM4550 und in die Substanz MM 13 902

1100 Liter Kulturfiltrat aus der Fermentation von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 werden bei einem pH von 6,5 und bei 5° C mit einer Geschwindigkeit von 3,2 Liter/Minute durch eine mit granulierter Aktivkohle gefüllten Säule von 03 ■ 1 m perkoliert. Die Aktivkohle ist bereits einmal zur Adsorption des MM 4550-Komplexes verwendet, aber vor Anwendung durch Waschen mit den nachstehenden Mitteln regeneriert worden:

0,5-n Natronlauge;

0,2-n eines Gemisches von Natronlauge

und Aceton im Verhältnis 3 :2;
Wasser;
n-Salzsäure;
Wasser;

Phosphatpuffer vom pH 6 und
Wasser.

Die Säule wird mit 60 Liter Wasser gewaschen, um das Kulturfiltrat zu verdrängen, und dann mit einem Gemisch aus Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 2 :8 bei 3O⁰C mit einer Geschwindigkeit von 1,1 Liter/ Minute eluiert. Es werden 60 Liter aufgefangen, gefolgt von 5 10-Liter-Fraktionen. Diese Fraktionen, die den MM 4550-Komplex enthalten, wie sich mittels der antibakteriellen Diffusions-Probe unter Verwendung von Klebsiella aerogenes bestimmen läßt, werden vereinigt (40 Liter) und unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 32 Liter eingeengt. Die Gewinnung des MM 4550-Komplexes in dieser Stufe beträgt 15 Prozent

Das Konzentrat wird auf 5" C gekühlt und dann bei 5° C mit 16 Liter Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetyl-dimethylbenzyl-ammoniumchlorid versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt. Die Dichlormethan-Phase wird abgetrennt und bei 5°C mit 3,75 Liter einer Natriumjodidlösung versetzt. Die beiden Phasen werden 5 Minuten miteinander vermischt Dann wird die wäßrige Phase abgetrennt und gefriergetrocknet. Der trockene Feststoff wird mit wasserfreiem Aceton extrahiert, um überschüssiges Natriumiodid herauszulösen. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,87 g eines gelbbraun gefärbten Pulvers. Die Gesamtausbeute an dem MM 4550-Komplex dieser Stufe beträgt 6 Prozent. Die auf die gelösten Gesamtfeststoffe berechnete Reinigung bei dem Kulturfiltrat ist 160fach.

Eine Säule mit 63 mm Durchmesser wird mit Mikrocellulosepulver in einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser im Volumenverhältnis 7 :3 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. 2,0 g des gelbbraun gefärbten Pulvers werden in 5 ml eines Gemisches von Isopropanol und Wasser im Volumenverhältnis 7 :3 gelöst und dann in dem gleichen Lösungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute Chromatographien. Die Fraktionen, die den MM 4550-Komplex enthalten, wie durch eine Probe gegenüber Klebsiella aerogenes bestimmt worden ist, werdenvereinigt, durch Verdampfen unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30° C eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 207 mg eines braunen Feststoffs. Die Gewinnung des MM 4550-Komplexes in dieser Stufe beträgt

51 Prozent, und die Reinigung ist 5fach.

Eine Säule mit 16 mm Durchmesser wird mit pulverförmiger Mikrocellulose in einem Gemisch von n-PropanoI und Wasser im Volumenverhältnis 4 :1 bis zu einer Höhe von 300 mm gefüllt. Dann werden 198 mg des braunen Feststoffes in einem Gemisch von Wasser und n-Propanol im Volumenverhältnis 1 :1 gelöst und in einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis von 4:1 mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute chromatographiert Es werden 6-ml-Fraktionen gesammelt, die gegen Klebsiella aerogenes geprüft werden. Es werden auch bei jeder Fraktion die UV-Spektren gemessen. Die Fraktionen Nr. 23 bis Nr. 28 mit einem UV-Maximum bei etwa 305 nm enthalten das Dinatriumsaiz der Substanz MM 13 902. Diese Fraktionen werden vereinigt unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet Man erhält 30 mg eines Feststoffes. Diese Substanz zeigt lediglich eine einzige Zone von antibiotischer Wirksamkeit bei einem Rf-Wert von 0,77 bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Celluloseplatten mit einem Gemisch aus n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4:1. Die Zone wird mittels Bioautographie an Bacillus subtilis bestimmt. Die Fraktionen Nr. 29 bis Nr. 40 mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 285 nm enthalten die Substanz MM 4550. Diese Fraktionen werden ebenfalls vereinigt unte-- vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 53 mg eines Feststoffes, der ein Salz der Substanz MM 4550 enthält, das mit einer geringen Menge des Salzes der Substanz MM 13 902 verunreinigt ist.

Organismen

Die Eigenschaft, den MM 4550-Komplex zu erzeugen, ist zuerst in den Kulturen der Stämme ATCC 21 379, ATCC 21380, ATCC 21381 und ATCC 21 382 festgestellt worden, die aus Bodenproben isoliert worden sind, die man aus Spanien, Neusee'a·" Südafrika und Israel erhalten hat. Im Laboratorium scheinen diese Kulturen identisch zu sein, und sie wurden sämtlich als Streptomyces olivaceus identifiziert, wobei die 1967 weltweit anerkannte Klassifikation von Hütter (»Systematik der Streptomyceten«, S. Karger, Basel, S. 382 ff.) verwendet worden ist Eine MM 455Ö-Erzeugung ist bisher bei anderen Sireptomyces Spezies gefunden worden, wie dies aus Tabelle IV ersichtlich ist

Streptomyces olivaceus ist zuerst von Waksman 1919

so beschrieben worden (vgl. »Cultural Studies of Species f >f Actinomyces« Soil. Sei. 8 S. 71 bis 215). Anschließend hat im Jahre 1960 eine Gruppe von russischen Forschern eine Spezies mit sehr ähnlichen Eigenschaften beschrieben, doch ist sie als Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis bezeichnet worden (vgl. Kuchaeva und Mitarbeiter, Trud. Inst. Mikrobiol., Akad. Nauk. SSSR. 8 (1960), S. 226 bis 253).

Die Mikroorganismen der Gattung Streptomyces sind außerordentlich variabel in ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaften in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter denen sie wachsen. Beschreibungen von zahlreichen Spezies sind veröffentlicht worden, bevor die Existenz dieser außerordentlichen Veränderlichkeit erkannt worden ist, mit der Folge von Duplikationen und Synonyma. Hütter (1967) führt 25 Spezies auf, die mit Streptomyces olivaceus synonym sind, einschließlich Streptomyces fulvoviridis. Um diese Verwirrung bei der Nomenklatur und der Klassifikation

zu lösen, ist 1962 ein »International Streptomyces Project« begonnen worden (vgl. Shirling und Mitarbeiter, Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (1968), S. 69 bis 189). Mitarbeiter an diesem Projekt haben eine Reihe von Studien durchgeführt, die bei der Erstellung genauer Beschreibungen der Spezies von Streptomyces unter Standardbedingungen hilfreich sind In diesem Schema sind Standardbeschreibungen von typischen Stämmen von über 400 benamten Spezies aufgenommen worden, einschließlich Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis.

Die I. S. P.-Beschreibung von Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvovirid'is unterscheidet sich nur in zwei Eigenschaften:

,(a) In Form der Sporenträger und
(b) der Fähigkeit, Inosit als einzige Kohlenstoffquelle zu spalten.

Streptomyces olivaceus wird wie folgt beschrieben:

Sporenkettenmorphologie: Sektion Spiralen, mit offenen Spiralen, die allmählich in gekrümmte Sporenketten übergehen, die Sektion rektiflexible Sporen andeutend. Die reifen Sporenketten sind gewöhnlich •lang, häufig mit über 50 Sporen je Kette.

Kohlenstoff quellen: D-GIucose, L-Arabinose, D-Xylose. 1-lnosit. D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose werden für das Wachstum benötigt Auf Saccharose und Raffinose findet kein Wachstum oder nur ein spurenweises Wachstum statt.

Streptomyces fulvoviridis wird wie folgt beschrieben:

Sporenkettenmorphologie: Sektion rektiflexible Sporen. Die reifen Sporenketten sind mäßig kurz mit 10 mit 50 Sporen je Kette. Kohlenstoffquellen: D-Glucose, L-Arabinose. D-Xylose, D-Mannit, D-Fructose und Rhamnose werden für ein Wachstum benötigt. Die Spaltung von Saccharose ist zweifelhaft. Auf I-Inosit oder Raffinose findet kein Wachstum oder nur spurenweises Wachstum statt.

Die Charakterisierung einer Anzahl von Kulturen, die als Streptomyces olivaceus oder Streptomyces fulvoviridis und andere verwandete Spezies benannt oder dami! synonym sind, werden unter Anwendung von Standardmethoden und Mitteln, wie sie in dem »International Streptomyces Project« (I. S. P.) empfohlen worden sind, bestimmt (vgl. Shirling und Mitarbeiter, Int. J. Syst Bacteriol. 16 (1966), S. 313 bis 340).

Die Kulturen leiten sich von verschiedenen Quellen ab. Die Stämme ATCC 21 379.21 380,21 381 und 21 382 wurden aus Bodenproben auf der Basis isoliert, den MM 4550-Komplex zu erzeugen. Die anderen Stämme wurden aus zahlreichen Kultursammlungen für Vergleichszwecke erhalten.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Erzeugung des M M-4550-Komplexes, der Farbe des Luftmycels.die Gestalt der Sporenträger, die Farbe des Mycelsubstrats, lösliche Pigmenterzeugung, Melaninerzeugung und Spaltung von Kohlenstoffquellen sind in den Tabellen IV bis VIII angegeben. Bei allen Stämmen ist die Sporenoberfläche bei Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop glatt.

Aus der I. S. P.-Beschreibung ist es offensichtlich, daß das Spiralenwachstum des Sporenträgers bei Streptomyces olivaceus von unterschiedlichem Charakter ist. Echte Spiralen werden mit unterschiedlicher Häufigkeit bei den typischen Spezies von Streptomyces olivaceus beobachtet, nämlich bei ATCC 3335. Die Mehrzahl der Sporenträger ist lang. Keine echten Spiralen werden bei Kulturen der Spezies ATCC 21 379,21 380,21 381 oder 21 382 beobachtet, obwohl die Sporenträger lang sind und die Neigung zu Spiraien bei einem Hintergrund der rektiflexiblen Arten zeigen. Jedoch bei zwei Streptomyces olivaceus-Stämmen, nämlich NCIB 8238 und NCIB 8509, ist die Mehrzahl der Sporenträger von der rektiflexiblen Art. Beim Stamm NCIB 8230 sind sie mäßig lang, während sie beim Stamm NCIB 8509 lang sind.

Die bei dem Stamm ATCC 15 863 beobachteten Sporenträger, einer typischen Spezies von Streptomyces fulvoviridis, sind kurzer als die von den isolierten Stämmen ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 und 31 126 und stellen lediglich rektiflexible Arten dar. Im Hinblick auf diesen Charakter entsprechen deshalb die isolierten Stämme ATCC 21 379, 21 380, 21 381. 21 382 und 31 126 ziemlich gut, jedoch nicht genau der Beschreibung von Streptomyces olivaceus.

Die reinen Stämme ATCC 21 379, 21 380, 21 381, 21 382 und 31 126 zeigen eine gewisse Variabilität im Hinblick auf die Inositspaltung die ein anderes Unterscheidungsmerkmal gemäß den I. S. P.-Typenbeschreibungen der Spezies zwischen den Spezies Streptomyces olivaceus und Streptomyces fulvoviridis sind (vgl. Tabelle VIII). Die Stämme ATCC 31 126 und ATCC 21 380 spalten Inosit, was für Streptomyces olivaceus charakteristisch ist, während die anderen Stämme eine zweifelhafte oder eine negative Spaltbarkeit zeigen. Es wird jedoch nicht als allgemein zufriedenstellend betrachtet, eine Spezies aufgrund seiner Fähigkeit, ein einzelnes Kohlehydrat zu spalten, auseinanderzuhalten. Solch ein Unterschied kann durch eine einzige Genmutation hervorgerufen werden und wird häufig lediglich als Stamnisignifikanz betrachtet. Der Unterschied bei der Zuckerspaltbarkeit bei den Streptomyces olivaceus-Stämmen NCIB 8138, NClB 8509, ATCC 21 549. ATCC 12 019 und ATCC 3335 deutet darauf hin, daß zahlreiche Fachleute sie nicht als signifikantes Merkmal dieser Spezies betrachten. Demzufolge werden die Stämme ATCC 21 379, 21 380, ίο 21 381, 21 382 und 31 126 mit Recht als Streptomyces olivaceus bezeichnet

Die Untersuchung der Kulturfiltrate der Stämme von Streptomyces olivaceus und der verwandten Spezies hinsichtlich der Erzeugung des MM 4550-Komplexes kann wie folgt durchgeführt werden:

Kulturfüiraie der aufgeführten Stämme werden auf Papierstreifen (Whatman No. 1) in einer Menge von 20 μίηβΓ je Ausgangslösung getüpfelt und über Nacht in der Kälte mit einem Gemisch von n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:7:6 Chromatographie«. Ein anderer Satz Streifen wird ebenfalls über Nacht in der Kälte mit einem Gemisch von n-Butanol/ Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 12:3:5 Chromatographien. Gleichzeitig läuft eine teilweise gereinigte Probe des MM 4550-Komplexes in den beiden Systemen als Markierungsmittel mit.

Es ist gegebenenfalls möglich, 25 ml der geklärten Bouillon mit 12,5 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 0,2 Prozent Cetylbenzyl-ammoniumchlorid zu extrahieren, die Phasen zu trennen, die organische Phase beizubehalten und diese mit 2,5 ml einer 0,5prozentigen Natriumjodidlösung zu versetzen, die Lösung zu schütteln, in Phasen aufzutrennen, die wäßrige Phase beizubehalten und diese chromatographisch zu verwenden, indem z. B. 5 μ auf die Dünnschichtchromatographie-Streifen getüpfelt werden, und diese sich in einem Gemisch von n-Butanol/Isopropano!/Wasser im Volumenverhältnis 7 :7 :6 entwickeln.

27

28

Tabelle V

Vermögen der Kulturen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies, den MM 4550-Komplex zu erzeugen

Kultur

Streptomyces olivaceus
Streptornyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces olivaceus
Streptomyces plivaceus
Streptomyces favovirens
Streptomyces flavus
Streptomyces fulvoviridis
Streptomyces argenteolus
Streptomyces sioyaensis
Streptomyces lipmanii

ATCC 21 379 ATCC 31 126 ATCC 21 380 ATCC 21 381 ATCC 21 382 NClB 8 238 NCIB 8 509 ATCC 3 320 ATCC 3 369 ATCC 15 863 ATCC 11 009 ATCC 13 989 NRRL 3 584

MM 4550-Komplex-Erzeugung

(Streptomyces olivaceus ATCC 21 549, ATCC 12 019 und ATCC 3355 erzeugen keinen MM 4450-Komplex; der Stamm ATCC 15 863 wird auch als hinterlegter Stamm RIA 660 bezeichnet.)

Tabelle VI

Farbe und Morphologie des reifen sporenbildenden Luftmycels von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies auf ISP-Medien nach Htägigem Wachstum

' Kultur

SS

YM

GA

OM

Morphologie des Sporenträgers (mittlere Größe)

ATCC 21379 grau grau grau-weiß grau lange RF

ATCC 31 126 grau-braun grau-braun grau grau lange RF

ATCC 21380 grau grau grau grau lange RF

ATCC 21381 grau grau blaß-grau grau-weiß lange RF

ATCC 21382 grau-weiß grau grau grau lange RF

NCIB 8 238 grau-weili grau grau grau mittlere RF

NCIB 8 509 grau grau grau grau lange RF

ATCC 21549 grau grau grau grau lange S

ATCC12 019 grau grau grau grau lange RF/S

ATCC 3 335 grau grau grau grau lange RF/S

ATCC15 863 grau-weiß grau grau-weiß grau mittlere RF

ATCC 3 320 grau-blau grau grau-grün grau lange RF

ATCC 3 369 grau grau grau blaß-grau-braun mittlere RF/RA

ATCC11009 blaß-grau grau-braun grau-weiß grau-grün mittlere RF/RA

ATCC13 898 weiß-grau weiß weiß-gelb grau-weiß kurze S

SS = Anorganische Salze - Stärkeagaf (ISP-Medium Nr. 4). YM = Hefe-Extrakt - Malz-Extrakt-Agar (ISP-Medium Nr. 2). GA = Glycerin - Asparaginsäure-Agar (ISP-Medium Nr. 5). OM = Hafermehl-Agar (ISP-Medium Nr. 3).
RF = rektiflexible Sporen.
RA >= retinaculiaperte Sporen.
S = Spiralen.

29

30

Farbe des Substrats und des Myce's von der Rückseite gesehen von Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandten Spezies

Kultur

SS

YM

GA

OM

ATCC 21 379	oliv	ohvbraun	grau-braun	olivgrün
ATCC 31126	olivbraun	olivbraun	braun	olivbraun
ATCC 21 380	oliv	olivgrün	olivgrün	olivgelb
ATCC 21 381	dunkelbraun	dunkelbraun	olivgrün	olivgrün
ATCC 21 382	oliv	oliv	braun	olivgrün
NCIB 8 238	braun	oliv-braun	braun	olivgelb
NCIB 8 509	braun	oliv	olivbraun	olivgelb
ATCC 21 549	braun-gelb-schwarz	braun-schwarz	braun-schwarz	braun-gelb-grau
ATCC 12 019	braun-gelb	braun-gelb	braun-gelb	braun-gelb
ATCC 3 335	braun	braun	braun	grau
ATCC 15 863	braun-grau	dunkelbraun	< olivbraun	olivgelb
ATCC 3 320	gelb-braun	oliv-braun	oliv-braun	orange-braun
ATCC 3 369	braun-gelb-grau	gelbbraun	braun-gelb-grün	gelb
ATCC 11 009	schwarz	schwarz-gelb	schwarsrgelb	grau-grün
ATCC 13 989	orange	gelb	gelb	farblos
Tabelle VIII

Erzeugung von Pigmenten in Kulturmedium durch Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Spezies

Kultur

Lösliche nicht-melanoide Pigmente SS YM

OM

Melanih-

Erzeu-

gung*)

schwach gelb

schwach braun

schwach braun schwach braun

schwach gelb

schwach rotbraun schwach braun

ATCC 21 379

ATCC 31J 26 ATCC 21 380 ATCC 21 381 ATCC 21 382 NCIB 8 238

NICB 8 509 ATCC 21 549

ATCC 12 019 ATCC 3 335 ATCC 15 863 ATCC 3 320

ATCC 3 369 -

ATCC 11009 - +

schwach braun

ATCC 13 989 +

schwach orange

+ = Pigment erzeugt. - = Pigment nicht erzeugt.

*) Untersucht auf einem Pepton-Hefe-Eisen-Agar (ISP6), Tyrosin-Agar (ISP17) und in einer Trypton-Hefe-Kulturlösung (ISP1).

schv/ach rosa

Tabelle IX

Spaltung von Kohlenstoffquellen durch Streptomyces olivaceus, Streptomyces fulvoviridis und verwandte Spezies

Kultur

Rhamnose

Ra(Tinose

Suprose Inosit Glucose Xylose Fructose Mannit Arabin.ose

ATCC 21 379 +	—	—
ATCC 31 126 +	-	-
ATCC 21 380 +	-	-
ATCC 21 381 +	-	-
ATCC 21 382 +	+	-
NCIB 8 238 +	-	-
NCIB 8 509 +	±	-
ATCC 21 549	-	-
ATCC 21 019 +	±	+
ATCC 3 335 +	-	±
ATCC 15 863 +	-	-
ATCC 3 320 +	-	±
ATCC 3 369 +	-	±
ATCC 11 009 +	-	-
ATCC 13 989	-1-

35

+ = die Verbindung wird gespalten;

- = die Verbindung wird nicht gespalten;

± = die Spaltung ist zweifelhaft oder sehr schlecht.

Beispiel 3

Das bevorzugte Isolierungsverfahren zur Herstellung der Substanz MM 13 902

Ein Vorrat von Sporen von Streptomyces olivaceus ATCC 31 126 wird in Röhrchen mit trockenem Boden in einem geschlossenen Behälter mit einem Trockenmittel bei einer Temperatur von 20⁰C auf Lager gehalten. Eine ao geringe Menge der Bodenprobe (etwa 20 mg) wird aseptisch in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 100 mg des folgenden Mediums enthält:

45

Bestandteile Menge (g/Liter)

Glucose-monohydrat	20,0
Sojabohnenmehl	10,0
Entsalztes Wasser	ad 1 Liter

50

Vor dem Sterilisieren wird der pH auf 6,5 eingestellt.

Der Kolben wird etwa 30 Stunden bei 28° C auf einem Rotationsschüttler, der sich mit 240 UpM dreht, bebrütet 2 ml der erhaltenen vegetativen Anzucht werden, dann zur Überimpfung auf einen festen Schrägagar in einer Roux-Flasche verwendet Der Schrägagar hat die folgende Zusammensetzung:

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt

Die Beimpfung erfolgt über die gesamte Agaroberfläche durch Schütteln der Flasche, die dann aufgerichtet bei 30⁰C bebrütet wird. Nach 2tägiger Bebrütung wird überstehende Flüssigkeit der Flasche mittels einer Pipette abgezogen und die Bebrütung weitere 4 Tage fortgesetzt

Es äst früher gefunden worden, daß eine Entwicklung von Actinophagen in der Schrägkultur unterdrückt wird, wenn man sich dieses Herstellungsverfahren der Kultur in der Roux-Flasche zu eigen macht.

Zu der Kultur in der Roux-Flasche werden dann 50 ml sterilisiertes, entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,02 Prozent eines Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleats zugegeben. Die Sporen werden durch Schütteln suspendiert Diese Sporensuspension wird dann als . Impfstoff zu 75 Liter eines sterilisierten Nährmediums in einem 100-Liter-Fermentor aus rostfreiem Stahl gegeben. Die Zusammensetzung des Nährmediums lautet wie folgt:

Bestandteile Menge (g/Liter)

Bestandteile

Menge

Gemüsesaft

Entsalztes Wasser

20,0 ml 20,0 g ad 1 Liter

65 Sojabohnenmehl

Glucose-monohydrat

Leitungswasser

10,0
20,0
ad 1 Liter

Zur Steuerung des Schäumens werden 50 ml Sojabohnenöl mit einem Gehalt von 10 Volumenprozent des bereits genannten Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockplymerisats zu dem Fermentationsmedium vor einem Sterilisieren gegeben.

Das Medium wird 20 Minuten bei 12O⁰C in dem

Fermenter mit Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit 140UpM mittels eines Leiischaufelrllhrers von 19 cm Durchmesser gerührt und durch einen offenendigen Zerstäuber mit 75 üter je Minute steriler Luft belüftet.
Die Temperatur wird auf 28⁰C eingeregelt. Nach

48stündiger Bebrütung unter diesen Bedingungen wird der Inhalt des Fermenters als Impfstoff zu 1500 Liter eines sterilen Fermentationsmediums in einem 20(K) Liter fassenden, voll mit Prallblechen ausgerüsteten Fermenter aus rostfreiem Stahl gegeben. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile	Menge (g/Liter)
Sojabohnenmehl	10,0
Glucose-monohydrat	20,0
Kreide (gefälltes Calciumcarbonat)	0,2
Kobaltchlorid (CoCl₂ · 6 H₂O)	0,001
Natriumsulfat (wasserfrei)	1,0
Leitungswasser	ad 1500 Liter

Vor einem Sterilisieren wird der pH-Wert mit "'■ Natriumhydroxid auf 6,0 eingestellt. Zur Verhinderung ./eines Schäumens werden ebenfalls vor einem Sterilisieren 3 Liter Sojabohnenöl mit einem Gehalt an ⁵JlO Volumenprozent des bereits genannten Äthylenoxid-' Propylenoxid-Blockpolymerisats gegeben. Nach dem ■Sterilisieren wird der pH-Wert wiederum mit einer sterilen Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt :Die Fermentationslösung wird mit 106 UpM gerührt. iDer Rührschaft ist mit 2 Leitschaufeln mit 483 cm Durchmesser ausgerüstet Die Temperatur wird auf 30⁰C und der Luftstrom auf 1200 Liter/Minute eingestellt Nach 60 Stunden wird die Fermentation gesam- ^- melt und durch Zentrifugieren geklärt.
* Das vorstehend erzeugte Produkt wird willkürlich mit einer Aktivität von 340 Einheiten je ml bezeichnet. Die Proben werden wie vorstehend beschrieben bestimmt

1050 Liter des Kulturfiltrats mit 340 Einheiten je ml ^werden bei 10⁰C und einem pH-Wert von 8 mit ''31O Liter Dichlormethan von 1O⁰C extrahiert, das 1200 g Cetyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid enthält, indem die beiden Flüssigkeiten bei vorbestimmten Fließgeschwindigkeiten durch Vermischen in den Rohrleitungen gepumpt werden. Die Phasen werden in einer kontinuierlichen Zentrifuge nach vorherigem, . etwa 2minütigen Vermischen getrennt. Die Dichlorme-Uhan-Phase (300 Liter) wird mit wäßrigem Natriumjodid nochmals extrahiert Die abermalige Extraktion wird in 4 Ansätzen unter Verwendung von insgesamt 7 Liter Wasser mit einem Gehalt von 210 g Natriumjodid durchgeführt Die Phasen trennen sich aufgrund der Schwerkraft Die wäßrige Phase wird mittels Salzsäure vom pH 7,7 auf pH 7,0 eingestellt und filtriert Der Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) enthält 21 900 Einheiten je ml.

Es wird eine Ionenaustauschersäule vorbereitet, indem sie mit vernetztem Dextran in einer 0,05-m-Phosphatpufferiösung vom pH 7 mit einem Gehalt von 03 m-Natriumchlorid beschickt wird. Die Glassäule hat einen Durchmesser von 10 cm und eine Höhe von 40 cm. Der Natriumjodid-Extrakt (7 Liter) wird bei 5° C mit einer Geschwindigkeit von 50rnl/Minute durch den Ionenaustauscher perkoliert. Die Säule wird mit einer 0,05-m Phosphatpufferlösung ebenfalls vom pH 7 mit einem Gehalt von 0,7-m Natriumchlorid bei 5⁰C und einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/Minute eluiert 2 Liter des Eluats werden verworfen und 90 Fraktionen zu 100 ml gesammelt Die Fraktionen werden in einem Ultraviolett-Spektrophotometer genau untersucht, und diejenigen Fraktionen, die ein Absorptionsmaxima bei etwa 305 nm zeigen, werden gesammelt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt Es handelt sich hierbei um die Fraktionen Nr. 50 bis 62, die nach Vereinigen ein Volumen von 1440 ml und eine Wirksamkeit von 71 000 Einheiten je ml haben. Es ist zuvor gezeigt worden, daß diese Fraktionen mit einem Maximum in diesem Bereich die Substanz MM 13 902 enthalten.

Zu den vereinigten Fraktionen wird Natriumchlorid (5 g je 100 ml) gegeben. Die Fraktionen werden bei 5° C mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Minute durch eine Säule von 63 cm perkoliert, die bis zu einer Höhe von 30 cm mit »Amberlite XAD 4«-Harz beschickt ist. Unter diesen Bedingungen adsorbiert die Substanz MM 13 902 an das Harz, während dies anorganische Verunreinigungen nicht tun. Die Substanz MM 13 902 wird bei Raumtemperatur mit 200 ml destilliertem Wasser und anschließend 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert Das Eluat (1 Liter) wird unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30⁰C auf 70 ml eingeengt auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und gefriergetrocknet Man erhält 1,62 g eines braunen Feststoffes, der das teilweise gereinigte Salz der Substanz MM 13 902 mit einer Aktivität von 37 000 Einheiten je mg darstellt.

1,0 g der teilweise gereinigten Substanz MM 13S02 (37 000 Einheiten/mg) wird an einer Säule von 33 · 30 cm mit einer Beschickung von Mikrocellulose Chromatographie« und dann mit einem Gemisch von n-Propanol und Wasser im Volumenverhältnis von 4 :1 mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/Minute eluiert 170 ml Eluat werden verworfen und 115 ml-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen, die das Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 enthalten, nämlich die Fraktionen Nr. 37 bis 43, wie durch UV-Absorption festgestellt worden ist werden vereinigt (89 ml), zum Entfernen des n-Propanols bei einer Temperatur unter 30⁰C und unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 219 mg gelblichen Pulvers mit einer Aktivität von 73 000 Einheiten je mg.

Die vorgenannte Substanz zeigt ein UV-Absorptionsmaximum bei etwa 308 nm mit einer Extinktion \*_m von etwa 343. Diese Substanz besitzt ein Infrarot- und NMR-Spektrum, wie es aus den F i g. 2 und 3 ersichtlich ist. Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz ist in Tabelle X angegeben. Die Elementaranalyse der Substanz läßt erkennen, daß sie u. a. Stickstoff, Schwefel und

Natrium wahrscheinlich in einem Verhältnis von N : S: Na wie 2:2:2 besitzt. Die positiven und negativen Maxima der kreisförmigen Dichroismus-Kurven für das Dinatriumsalz der Substanz MM 13 902 werden auf einem »Cary-ölÄ-Aufzeichnungsspektropolarimeter bei Konzentrationen von 0,37 mg/ml bei einer Lauflänge von 1 cm bestimmt Man erhäl* folgende Ergebnisse:

Tabelle X

Λ (mn)

EL·

+67,24 X 10"⁴ -67,24 χ ΙΟ"⁴

- 3,3 χ ΙΟ"⁴

- 8,2 x lO"⁴

Antibakterieile Wirksamkeit des Dinatriumsalzes des MM 4550-Komplexes (Mikrotiter-Methode: starker Impfstoff, 1 Prozent einer über Nacht stehengelassen Bouillon)

Organismus	Mindesthemm-	Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
	«conzentration
	(με/ml)
' Bacillus subtihs A	0,15
Staph. aureus Oxford	'■ ^:i0,3
Staph. aureus Russell	0,6
Strep, faecalis	3,1
Enterbacter cloacae N1	25
'E.colil0 418	0,15
E. coli JT410	5
' Kleb, aerogenes A	0,03
Proteus mirabilis 13	0,6
Proteus vulgaris WO 90	0,6
Prov. stuartii	0,07
Ps. aeruginosa A	50
Salmonella typhimurium CT10	0,3
Serratia inarcescens US 39	2,5
Shigella sonnei	0,6-0,3
Haemophilus influenzae P6	0,08
Neisseria genorrhoeae	0,08

Claims

Patentansprüche:

1. Substanz MM 13 902 und ihre Salze, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die feste Carbonsäure MM 13 902 in Form ihres praktisch reinen Natriumsalzes die folgenden Eigenschaften besitzt:

aa) leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in Chloroform, Diäthyläther und Kohlenwasserstoffen;

ab) ein Ultraviolett-Spektrum mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 305 nm;

ac) bei einer Menge von 0,4 Gewichtsprozent in einer frisch hergestellten KBr-Platte ein Infrarot-Spektrum mit Absorptionsmaxima u.a. bei 3450, 2950, 1750, 1620, 1510, 1400 und 1260Cm-';

ad) ein NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser mit u. a. einem Paar Niederfeld-Dublet-

! ten mit ihrem Zentrum bei etwa 2,85 τ und

4,00 τ mit Kopplungskonstanten von etwa 14Hz, mit einem Dublett mit einem Zentrum bei etwa 8,55 τ und mit einem scharfen Singulett bei etwa 8,00 τ;

b) das reine Dinatriumsalz

ba) bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit den nachstehenden Systemen die Rf-Werte aufweist: n-Butanol/Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7 :7 :6, Rf = 0,72; Isopropanol/Wasser im Volumenverhältnis 7:3, Rt = 035;

n-Butanol/Äthanol/WaEser im Volumenverhältnis 7 :7 :6. Rf = 0,81; n-Propanol/Wasser im Volumenverhältnis 4:1,Rf = 0,75;

und

bb) in Form der wäßrigen Lesung Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei etwa 305 und bei etwa 225 nm aufweist