DE3687189T2

DE3687189T2 - Antitumor- und antimikroben-verbindung, deren mikrobiologische herstellung und deren benutzung als arzneimittel.

Info

Publication number: DE3687189T2
Application number: DE8686107339T
Authority: DE
Inventors: Shuwa Residence Hamada; Hironobu Iinuma; Shonan Life Town Isshiki; Hiroshi Naganawa; Tsutomu Sawa; Yoshikazu Takahashi; New Fuji Mansion Takeuchi; Tsuyoshi Tamamura; Hamao Prof Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1985-06-12
Filing date: 1986-05-30
Publication date: 1993-07-01
Anticipated expiration: 2006-05-31
Also published as: EP0205981B1; JPH0571233B2; PT82743B; DE3687189D1; ES8800355A1; IE58885B1; PT82743A; ATE82981T1; JPS61285992A; DK274586A; GR861511B; EP0205981A3; ES555891A0; EP0205981A2; DK165449C; IE861552L; DK165449B; DK274586D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, das durch einen Mikroorganismus der Art Kitasatosporia produziert wird und anti-Tumor- und anti-mikrobielle Aktivitäten hat.
Verbindungen der Anthracyclin-Familie (z. B. Adriamycin und Acracinomycin) und viele weitere nützliche Verbindungen wurden als Antibiotika mit anti-Tumor- und anti-mikrobiellen Aktivitäten vorgeschlagen. Zur Kontrolle eines weiten Spektrums von Krebserkrankungen müssen jedoch viel mehr geeignete Verbindungen bereit gestellt werden.
Während mehrere Verbindungen vorgeschlagen und zur Erreichung dieses Ziels bekanntgemacht worden sind, hat die Substanz PR-1350 (Clerocidin) physikochemische Eigenschaften, die jenen des erfindungsgemäßen Antibiotikums MF 720-N6 ähneln (vgl. Tetrahedron Letters, Bd. 25, Nr. 4 (1984), 465-468). Die Substanz PR-1350 gehört zur Familie der oxidierten Diterpene und wird als Komplex betrachtet, worin ein Monomer mit einem Hydroxyaldehyd der Formel (I) und einem Hemiacetal der Formel (II) im Gleichgewicht mit einem Dimer der Formel (III) liegt, wie nachstehend gezeigt:
Wie angesprochen, werden durch den Stand der Technik viele Antibiotika einer neuen Familie angeboten, die anti-Tumor- und anti-mikrobielle Aktivitäten haben. Im Hinblick auf die vielen heute bekannten Typen von Krebserkrankungen wird jedoch die Forderung nach neuen Anti-Tumor-Substanzen noch viele Jahre bestehen.
Es wurde jetzt gefunden, daß das neue Antibiotikum MF 730-N6 starke Anti-Tumor-Aktivitäten in vitro und in vivo gegenüber einer Vielzahl von Tumorzellen in Labortieren hat und das Wachstum von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien merklich inhibiert.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum NF 730-N6 wird durch die folgenden physikochemischen und biologischen Eigenschaften gekennzeichnet:

Physiologische Eigenschaften des Antibiotikums MS 730-N6

Das Antibiotikum NF 730-N6 wird wie die bekannte Substanz PR-1350 als ein Komplex tautomerer Isomere betrachtet und weist verschiedene physikochemische Eigenschaften in Abhängigkeit der Meßbedingungen und des Verfahrens zur Herstellung von Proben auf. Die physikochemischen Eigenschaften von nachstehend beschriebenem NF 730-N6 sind jene eines weißen Pulvers, das gemäß des in nachstehendem Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestellt wird.

(1) Schmelzpunkt:

Das Antibiotikum MF 730-N6 weist üblicherweise einen Schmelzpunkt im Bereich von 115-119ºC auf.

(2) Drehung:

Der Drehungswert, unmittelbar nach Herstellung einer 0,46% Chloroformlösung des Pulvers von MF 730-N6 bestimmt, beträgt [α]D26 = -28,5º.

(3) Löslichkeit:

Das weiße Pulver des Antibiotikums MF 730-N6 ist leicht in Methanol, Ethanol, Ethylacetat und Benzol löslich, im wesentlichen jedoch in Wasser oder h-Hexan unlöslich.

(4) Farbreaktionen:

Die Ergebnisse von Farbreaktionen einer das Antibiotikum MF 730-N6 enthaltenden Fraktion, die durch eine Silikagel-chromatographische Entwicklung einer Methanollösung des nach dem Verfahren in Beispiel 1 hergestellten weißen Pulvers erhalten worden ist, sind wie folgt:
Triphenyltetrazoliumchlorid positiv
Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reaktion positiv
Joddampf positiv
Fehling's Reagens positiv
Silbernitrat-Ammoniak (Tollens) Reagens positiv
8% Phosphormolybdänsäure-Ethanol positiv
Dragendorff's Reagenslösung negativ
Eisen(III)-chlorid-Reagenslösung negativ.

(5) Infrarot-Absorptionsspektrum:

Ein weißes Pulver des Antibiotikums MF 730-N6, das durch das KBr-Tabletten-Verfahren hergestellt worden ist, zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 3430, 2960, 1705 und 1635 cm&supmin;¹.

(6) ¹H-NMR-Spektrum:

Ein weißes Pulver von MF 730-N6 zeigt unmittelbar nach seiner Lösung in Deuteromethanol charakteristische Absorptions- δ-Werte bei 1,35 (s), 1,50-1,80 (m), 1,75 (brs), 1,80-2,30 (m), 2,70-2,85 (m) und 5,30 - 5,40 (m).

(7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Ein weißes Pulver von MF 730-N6 zeigt unmittelbar nach seiner Lösung in einem der nachstehend aufgelisteten Lösungsmittelsystemen die folgenden Absorptionsmaxima und E1%/1cm-Werte (in Klammern):
Methanol: 203 (60), 280 (3)
0,1N HCl-Methanol: 203 (58), 280 (3)
0,01N NaOH-Methanol: 207 (124), 267 (48).

(8) Derivate des Antibiotikums MF 730-N6 und ihre physikochemischen Eigenschaften

Experiment 1: Herstellung eines Wittig-Additionsprodukts

Einer Lösung von 30 mg eines Rohprodukts von MF 730-N6 in 50 ml wasserfreiem Benzol wurden 100 mg Carbomethoxymethylentriphenylphosphoran zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde über eine Säule (15 mm·240 mm) gegeben, die mit 30 g Silikagel gepackt war und das adsorbierte Gemisch wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol und Ethylacetat (10:1) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und durch eine mit Sephadex LH-20 (100 ml) gepackte Säule (20 mm·350 mm) gefolgt von einer Elution mit einem Lösungsmittelgemisch aus Ethylacetat und Methanol (2:1) gereinigt. Durch diese Verfahrensschritte wurden 125 mg eines 3:1 Gleichgewichtsgemisches der Additionsprodukte 1 und 2 erhalten.
Rf: 0,44 (Benzol-Aceton, 1:1)
0,40 (Benzol-Ethylacetat, 3:1)

Additionsprodukt 1 (Hauptprodukt):

¹H = NMR (CDC &sub3;) δ:
0.99 (3H, d, J = 7.0 Hz)
1.00 (3H, s)
1.35 (3H, s)
1.47 (1H, dd, J = 10.5 Hz, 15.0 Hz)
1.50 1.75 (3H, m)
1.76 (4H, brs)
1.95 2.10 (2H, m)
2.25 (1H, brs)
2.64 (1H, dd, J = 2.0 Hz, 12.0 Hz)
2.85 (1H, d, J = 5.0 Hz)
3.17 (1H, d, J = 5.0 Hz)
3.66 (1H, d, J = 4.0 Hz)
3.79 (3H, s)
3.80 (3H. s)
4.20 (1H, brd, J = 13.0 Hz)
4.27 (1H, dd, J = 4.0 Hz, 14.0 Hz)
5.35 (1H, br)
6.18 (1H, s)
6.38 (1H, d, J = 16.2 Hz)
8.47 (1H, d, J = 16.2 Hz)

Additionsprodukt 2 (Nebenprodukt):

0.84 (3H, s)
0.89 (3H, s)
1.26 (3H, d, J = 7.0 Hz)
1.46 (1H, dd, J = 9.5 Hz, 15.0 Hz)
1.50 2.75 (4H, m)
1.81 (3H, brs)
1.95 2.10 (2H, m)
2.18 (1H, brs)
2.80 (1H, q, J = 7.0 Hz)
2.85 (1H, d, J = 5.0 Hz)
3.16 (1H, d, J = 5.0 Hz)
3.79 (3H, s)
3.81 (3H, s)
3.85 (1H, d, J = 5.0 Hz)
4.03 (1H, brd, J = 9.5 Hz)
4.38 (1H, d, J = 5.0 Hz)
5.23 (1H, br)
6.12 (1H, s)
6.37 (1H, d, J = 16.2 Hz)
8.43 (1H, d, J = 06.2 Hz)

Experiment 2: Herstellung einer p-Brombenzoylform

10 mg eines Gemisches der Additionsprodukte 1 und 2 wurden in 1 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Nach Zugabe von 20 mg p-Brombenzoylchlorid wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum konzentriert und der Rest in 30 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigten wäßrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat und Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abdestilliert. Der Rest wurde durch eine mit 10 g Silikagel gepackte Säule (15 mm·105 mm) und anschließender Elution mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol und Ethylacetat (20:1) gereinigt. Durch diese Verfahrensschritte wurden 8,2 mg einer p-Brombenzoylform 3 erhalten.
Rf = 0,34 (Benzol-Ethylacetat, 5:1)
[α]D20 - 66.5º (C 0.2 CHC &sub3;)
UV CH&sub3;OH/max nm (c); 247 (27700), 268 (17100)
IR ν CHC &sub3;/max cm&supmin;¹ 2950, 1720, 1280, 1175
FD-MS (m/z); 660, 658 (M&spplus;)
HI-MS (m/z); 660, 1707 (C&sub3;&sub3;H&sub3;&sub9;O&sub9;Br)
658, 1768 (C&sub3;&sub3;H&sub3;&sub9;O&sub9;Br)

H-NMR (CDCL&sub3;) δ :

0.88 (3H, d, J = 7.0 Hz)
1.04 (3H, s)
1.39 (3H, s)
1.55 (1H, dd, J = 10.0 H:, 15.0 Hz)
1.66 (1H, d, J = 15.0 Hz)
1.6 (1H, br)
1.75 (1H, br)
1.74 (3H, br)
2.07 (2H, br)
2.17 (1H, dq, J = 14.0 Hz, 7.0 Hz)
2.29 (1H, br)
2.84 (1H, d, J = 5.0 Hz)
3.18 (1H. d, J = 5.0 Hz)
2.91 (1H, dd, J = 1.5 Hz, 12.0 Hz)
3.75 (3H, s)
3.77 (3H, s)
4.42 (1H, brd, J = 10.0 Hz)
5.36 (1H, br)
5.81 (1H, d, J = 14.0 Hz)
6.18 (1H, s)
6.45 (1H, d, J = 16.5 Hz)
7.59 (2H, d, J = 8.5 Hz)
7.94 (2H, d, J = 8.5 Hz)
8.40 (1H, dd, J = 1.0 Hz, 16.5 Hz)
Aus den vorstehenden Daten geht hervor, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum MF 730-N6 der bekannten Substanz PR-1350 sehr stark ähnelt, ersteres jedoch eine neue Verbindung ist, die sich von der bekannten Verbindung klar unterscheidet darin, daß sie vier Methylreste und zwei Hydroxylreste hat.

Biologische Eigenschaften des Antibiotikums MF 730-N6

(1) Antimikrobielles Spektrum:

Tabelle 1 zeigt die Minimum-Konzentrationen des Antibiotikums MF 730-N6, die zur Inhibierung des Wachstums mehrerer Bakterien auf einer allgemein erhältlichen Nährstoffagarplatte notwendig sind.

Tabelle 1

Microorganismen MIC (mcg/m )
Staphylococcus aureus 209P 6.25
Staphylococcus aureus Smith < 0.05
Micrococcus albus FDA 16 0.39
Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 0.39
Sarcina lutea PCI 1001 0.39
Bacillus anthracis 0.2
Bacillus subtilis NRRLB-558 0.1
Bacillus subbtilis PCI 219 < 0.05
Bacillus cereus ATCC 10702 0.1
Corynebacterium bovis 1810 < 0.05
Escherichia coli NiHJ 25
Escherichia coli K-12 3.12
Escherichia coli ML 1629 6.25
Shigella dysenteriae JI 11910 < 0.05
Shigella flexneri 46JS 11811 1.56
Shigella sonnei- JS 11746 12.5
Salmonella typhi T-63 3.12
Salmonella enteritidis 1891 0.1
Proteus vulgaris OX19 12.5
Proteus inirabilis IFMCM-9 12.5
Proteus rettgeri GN311 12.5
Proteus rettgeri GN466 6.25
Serratia marcescens 50
Pseudoinonas aeruginosa A&sub3; 25
Klebsiella pneumoniae PCI 602 0.39
Mycobacter 607 0.39
Xanthomonas citri 3.12
Xanthomonas oryzae 25

(2) Anti-Tumor-Aktivität

Tabelle 2 zeigt die therapeutischen Effekte des Antibiotikums MF 730-N6 auf Maus-Leukämie L1210 und Maus-Ehrlich's Ascites-Krebs (EAC) Tabelle 2 Dosis (mcg/Maus/Tag) Prozentuale Lebensverlängerung
* prozentuale Lebensverlängerung = Anzahl der Tage, die behandelte Mäuse überlebten/Anzahl der Tage, die unbehandelte Mäuse überlebten.·100
Die behandelten Mäuse waren jene, denen das Antibiotikum unmittelbar nach intraperitonealer Inokulation mit 1· 10&sup5; L-1210-Zellen pro ml oder 2·10&sup6; EAC-Zellen pro ml intraperitoneal 10 Tage lang verabreicht wurde. Wie Tabelle 2 zeigt, wurden bedeutsame Lebensverlängerungseffekte durch das erfindungsgemäße Antibiotikum erreicht.

(3) Akute Toxizität

Die akute Toxizität des Antibiotikums MF 730-N6 betrug für intraperitoneale Verabreichung an Mäuse LD&sub5;&sub0; = 100 mg/kg.
Das vorstehend gekennzeichnete Antibiotikum MF 730-N6 kann vorteilhaft durch das nachstehende Verfahren gemäß des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung hergestellt werden: Ein das Antibiotikum MF 730-N6 produzierender Mikroorganismus wird in einem Nährmedium kultiviert und das gewünschte Antibiotikum aus der Kultur erhalten.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus kann jeglicher Gattung und Art sein, die die Fähigkeit zur Produktion des Antibiotikums MF 730-N6 haben. Ein vorteilhaftes Beispiel ist der Actinomycet MF 730-N6, der ein Mikroorganismus der Gattung Actinomyceten ist und vorliegend aus einer Bodenprobe in der Nähe der Umawatashi-Brücke über den Iwaigawa-Fluß, Nara, Japan isoliert und beim Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, MITI unter FERM P-Nr. 8247 (überführt in FERM BP-1045) am 21. Mai 1985 hinterlegt worden ist.
Der Mikroorganismus kann mit jeglichen Nährquellen kultiviert werden, die allgemein in der Kultivierung von Actinomyceten verwendet werden, wie Kohlenhydrate, Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere assimilierbare Quellen. Verwendbare Kohlenstoffquellen umfassen Kohlenhydrate, wie Glucose, Glycerin, Maltose, Sucrose, Molassen, Dextrin und Stärke, und Fette sowie Öle, wie Sojabohnenöl und Erdnußöl. Verwendbare Stickstoffquellen umfassen Pepton, Fleischextrakt, Baumwollsamenpulver, Sojabohnenpulver, Hefeextrakt, Casein, Kornlauge, NZ-Amin, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumchlorid. Verwendbare anorganische Salze umfassen Dikaliumphosphat, Natriumphosphat, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat und Manganchlorid. Wenn notwendig können Spurenelemente, wie Kobalt und Eisen, zugegeben werden. Jegliche weitere bekannte Nährstoffquellen können verwendet werden, die durch den MF 730-N6 produzierenden Mikroorganismus zur Produktion des gewünschten Antibiotikums genutzt werden können.
Die Mengen der vorstehend angegebenen Nährstoffquellen sind nicht auf bestimmte Werte beschränkt und können über einen breiten Bereich variieren. Das Nährstoffquellenoptimum für das Wachstum des verwendeten, das Antibiotikum MF 730-N6 produzierenden Mikroorganismus und die Mengen der spezifischen Quellen können leicht durch einen Fachmann auf der Basis eines einfachen Experimentierens in kleinem Umfang bestimmt werden.
Das Nährstoffmedium, das die vorstehend aufgelisteten Nährstoffquellen enthält, kann vor Kultivierung sterilisiert werden. Vorteilhafterweise wird der pH des Mediums auf den Bereich 6-8, insbesondere 6,5-7,5, entweder vor oder nach Sterilisierung eingestellt.
Die Kultivierung des das Antibiotikum MF 730-N6 produzierenden Mikroorganismus in dem Nährstoffmedium kann nach jedem der Verfahren durchgeführt werden, die allgemein in der Produktion von Antibiotika aus Actinomyceten verwendet werden. Eine Kultivierung unter aeroben Bedingungen ist im allgemeinen vorteilhaft und kann durch Rühren und/oder Belüften begleitet werden.
Stationäre Kultur, Schüttelkultur oder Submerskultur mit Belüften und Rühren kann verwendet werden und eine Submerskultur eignet sich zur Massenproduktion des Antibiotikums MF 730-N6.
Die Kultivierungstemperatur ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, so lang sie innerhalb des Bereiches liegt, der ein wesentliches Wachstum des das Antibiotikum MF 730-N6 produzierenden Mikroorganismus erlaubt, wodurch die Produktion des beabsichtigten Antibiotikums gewährleistet wird. Während eine geeignete Kultivierungstemperatur in Abhängigkeit des verwendeten, MF 730-N6 produzierenden Mikroorganismus ausgewählt werden kann, liegt eine besonders bevorzugte Temperatur im Bereich von 25-30ºC.
Die Kultivierung kann fortgesetzt werden, bis eine beträchtliche Anhäufung des beabsichtigten Antibiotikums MF 730-N6 eingetreten ist. Die Kultivierungszeit variiert mit der Mediumszusammensetzung, der Kultivierungszeit, der Umgebungstemperatur oder des verwendeten Bakterienstammes. Üblicherweise ist eine Kultivierung von 12-24 Stunden ausreichend, um das gewünschte Antibiotikum zu erhalten.
Die Menge des in der Kultur angehäuften Antibiotikums MF 730-N6 kann mit dem Pneumobacillusstamm KP PCI 606 über das Zylinder-Plattenverfahren bestimmt werden, das üblicherweise zur Bestimmung von Antibiotika verwendet wird.
Das so in der Kultur angehäufte Antibiotikum MF 730-N6 kann in der isolierten und reinen Form erhalten werden, indem das Filtrat oder die Kultur oder der Überstand einer Lösungsmittelextraktion (mit Hilfe eines geeigneten organischen Lösungsmittels) oder einer Chromatographie (über Adsorption oder Ionenaustausch) unterworfen wird, die unabhängig voneinander oder in Kombination verwendet werden. Das Filtrat oder der von Zellen freie Überstand der Kultur kann durch ein bekanntes Trennverfahren, wie Filtration oder Zentrifugation, erhalten werden. Organische Lösungsmittel, die in der Extraktionstechnik verwendet werden können, umfassen Chloroform, Ethylacetat und jegliche weitere Lösungsmittel, die zur Lösung des Antibiotikums MF 730-N6 fähig und im wesentlichen in Wasser unlöslich sind. Beispiele des chromatographischen Trägers mit adsorptiven oder Ionen-Austauscherfähigkeiten umfassen aktivierten Kohlenstoff, Silikagel, poröses Polystyrol-Divinylbenzolharz und viele weitere Ionenaustauscherharze.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren wird das Antibiotikum MF 730-N6 mit den bereits spezifizierten Eigenschaften erhalten.
Die folgenden Beispiele erläutern weiterhin die Vorteile der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1:

Herstellung des Antibiotikums MF 730-N6

Der Actinomycetenstamm MF 730-N6 (FERM P-Nr. 8247, überführt in FERM BP-1045) wurde auf einem schrägen Agarmedium kultiviert. Ein flüssiges Medium (500 ml, pH 7,2) mit 1% Glucose und 1% Hefeextrakt wurde in zwei Flaschen in Mengen von 110 ml gegossen und routinemäßig bei 120ºC 20 Minuten sterilisiert. Jedes der sterilisierten Medien wurde mit den kultivierten Zellen von MF 730-N6 inokuliert und einer Rotations-Schüttelkultur (180 rpm) 48 Stunden bei 27ºC unterworfen, wodurch eine Saat-Kulturlösung hergestellt wurde.
Die Saatkulturlösung (110 ml) wurde in einen 30 l Porzellanfermenter mit 15 l eines MF 730-N6 produzierenden Mediums (vgl. nachstehend seine Zusammensetzung) überführt und einer 30-stündigen Kultivierung bei 27ºC und 150 rpm unterzogen, währenddessen Luft mit einer Rate von 15 1 pro Minute zugegeben wurde. Während des Fortsetzens der Kultivierung wurden einige Tropfen von Silikon KM-75 (Handelsname von Shinetsu Chemical Industry Co., Ltd. für ein Antischaummittel) dem Medium zugegeben.
Eine in zwei Einheiten des Porzellanfermenters hergestellte Kulturlösung wurde unter Verwendung einer Filtrationshilfe saugfiltriert, wodurch 24 l eines Kulturfiltrats erhalten wurden (auf den nachfolgenden Seiten werden Materialbilanzen unter der Annahme erstellt, daß 1 ml des Filtrats eine antibakterielle Aktivität von 1 U gegenüber dem Pneumobacillusstamm KP PCI 606 hat).
Das Filtrat wurde auf einen pH von 5,0 eingestellt und zwei Extraktionen mit 12 l Chloroform (Gesamtaktivität des Extrakts: 15000 U/T) unterworfen.
Der Extrakt wurde auf ein Volumen von 1 l unter Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde mit Glaubersalz dehydriert und nach Filtrierung mit 0,5% aktiviertem Kohlenstoff entfärbt. Nach Abfilterung des aktivierten Kohlenstoffs wurde das Filtrat unter Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Silikagel-Chromatographie (3,5 cm ·11 cm) und anschließender Elution mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform/Methanol (100/3) unterworfen. Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden unter Vakuum konzentriert und das Konzentrat wurde unter Verwendung von Diaion HP-20 (Warenzeichen von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd) einer Säulenchromatographie (3,5 cm·11 cm) unterzogen und durch einen linearen Dichtegradienten von 50% wäßrigen Methanol bis 100% Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, von Methanol unter Vakuum befreit und gefriergetrocknet, wodurch 108 mg eines schwachgelben Pulvers (6500 U/T) erhalten wurden.
Dieses Pulver wurde einer Umkehrphasen TLC unterworfen, die mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril/Wasser (7/3) entwickelt worden war. Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden einer Extraktion mit Methanol unterzogen, wodurch 39 mg (5460 U/T) der reinen Form des Antibiotikums MF 730-N6 erhalten wurden. Dieses Material zeichnet sich durch die bereits beschriebenen physikochemischen Eigenschaften aus.

Zusammensetzung des MF 730-N6 produzierenden Mediums

Glucose 0.08 (%)
Galactose 0.16
Maltose 0.16
Dextrin 0.32
Bactosoytone 0.16 (%)
Ammoniumsulfat 0.16
Antischaummittel 1 oder 2 Tropfen
pH 7.2 (PR)

Mycologische Eigenschaften:

Der in Beispiel 1 verwendete Stamm MF 730-N6 (FERM P-Nr. 8247, überführt in FERM BP-1045) hat die nachstehenden mykologischen Eigenschaften.

1. Morphologie

Der unter einem Mikroskop beobachtete Stamm MF 730-N6 hat ein relativ langes, gerades ("restiflexibles") Luftmycel, das von einer verzweigten Lufthyphe ausgeht, eine Spirale für eine Bewegung oder ein Wirbel wird jedoch nicht beobachtet. Reife Sporenketten haben eine nachweisbare Kette von nicht weniger als 10 bis 20 Sporen. Die Sporengröße liegt im Bereich von 0,4-0,6·0,8-1,4 um. Die Sporen haben eine glatte Oberfläche, eine SEM-Beobachtung zeigt jedoch getrennte "Furchen" auf der Sporenoberfläche.

2. Wachstumszustand im Medium

Nachstehend werden Farbstandarde eingeklammert, sie stimmen mit Color Harmony Manual of Container Corporation of America überein.
(1) Sucrose-Nitrat-Agarmedium (inkubiert bei 27ºC) Klebende leicht braungraue [3dc, Natural - 3fe, Silver Gray] Luftmycelform auf farblosem Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(2) Glucose-Asparagin-Agarmedium (27ºC) Klebende, leicht braungraue [3fe, Silver Gray] Luftmycelform auf schwach gelbbraunem [2ec, Oatmeal] Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(3) Glycerin-Asparagin-Agarmedium (Iso-Medium 5, inkubiert bei 27ºC) Klebende, leicht braungraue [3dc, Natural] Luftmycelform auf farblosem Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(4) Stärke-anorganisches Salz-Agarmedium (ISP-Medium 4, inkubiert bei 27ºC) Klebende, leicht braungraue [3fe, Silver Gray-5fe, Ashes] Luftmycelform auf schwach gelbbraunem [3gc, Bamboo] Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(5) Tyrosin-Agarmedium (ISP-Medium 7, inkubiert bei 27ºC) Klebende, leicht braungraue [5fe, Ashes] Luftmycelform auf farblosem Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(6) Nährstoff-Agarmedium (inkubiert bei 27ºC) Schwach gelbbraunes [2gc, Bamboo] Wachstum. Kein klebendes Luftmycel. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(7) Hefemalz-Agarmedium (ISP-Medium 2, inkubiert bei 27ºC) Klebende, leicht braungraue [3fe, Silver Gray] Luftmycelform auf schwach gelbbraunem [2ie, Lt Mustard Tan] Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(8) Hafermehl-Agarmedium (ISP-Medium 3, inkubiert bei 27ºC) Klebende, leicht braungraue [5fe, Ashes] Luftmycelform auf farblosem Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(9) Glycerin-Nitrat-Agarmedium (inkubiert bei 27ºC) Klebende, leicht braungraue [3dc, Natural - 3fe, Silver Gray] Luftmycelform auf farblosem Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(10) Stärke-Agarmedium (inkubiert bei 27ºC) Dünne Schicht von klebenden, weißen Luftmycelformen auf schwach gelbem [3ca, Shell] Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(11) Calciummalat-Agarmedium (inkubiert bei 27ºC) Dünne Schicht von klebenden, weißen Luftmycelformen auf farblosem bis schwach gelbem [2ca, Lt Ivory] Wachstum. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(12) Zellulose (inkubiert bei 27ºC in einer synthetischen, Filterpapierstückchen enthaltenden Lösung) Farbloses Wachstum und leicht braungraues Luftmycel. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(13) Gelatine-Stechkultur Bei Inkubation mit einem einfachen Gelatinemedium bei 20ºC und Inkubation mit einem Glucose-Peptongelatinemedium bei 27ºC ist das Wachstum farblos und es bildet sich kein klebendes Luftmycel aus. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.
(14) Entrahmte Kuhmilch (inkubiert bei 37ºC) Farbloses Wachstum und kein klebendes Luftmycel. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet.

3. Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperaturbereich Ein Wachstumstest wurde auf Glucose-Asparagin-Agarmedien bei variierenden Temperaturen, 20ºC, 24ºC, 27ºC, 30ºC, 37ºC und 50ºC, durchgeführt. Außer bei 50ºC wuchs der Mikroorganismus bei jeder der getesteten Temperaturen, eine optimale Temperatur liegt jedoch im Bereich von 27-30ºC.
(2) Verflüssigung der Gelatine (auf 15% einfachem Gelatinemedium bei 20ºC oder auf Glucose-Pepton- Gelatinemedium bei 27ºC). Mit dem einfachen Gelatinemedium begann die Verflüssigung etwa am fünften Inkubationstag und der. Verflüssigungsgrad war gemäßigt bis stark.
Mit dem Glucose-Pepton-Gelatinemedium begann die Verflüssigung etwa am zweiten Inkubationstag und der Verflüssigungsgrad war eher stark.
(3) Stärkehydrolyse (inkubiert bei 27ºC auf einem Stärke-anorganischen Salz-Agarmedium und einem Stärke-Agarmedium) Eine Stärkehydrolyse begann auf jedem Medium etwa am fünften Inkubationstag und der Hydrolysegrad war gemäßigt.
(4) Coagulation und Peptonisierung von entrahmter Kuhmilch (inkubiert auf entrahmter Kuhmilch bei 37ºC) Coagulation von entrahmter Kuhmilch begann etwa am zweiten Inkubationstag und war bald abgeschlossen, anschließend folgte eine Peptonisierung, die am 15. Inkubationstag abgeschlossen war. Der Coagulations- und Peptonisierungsgrad war eher stark.
(5) Bildung eines Melanin-ähnlichen Pigments (mit Trypton-Hefe-Agar, ISP-Medium 1; Pepton-Hefe-Eisen-Agar, ISP-Medium 6; oder Tyrosin-Agar, ISP-Medium 7, bei 27ºC). Kein Melanin-ähnliches Pigment wird in einem Medium beobachtet.
(6) Verwertung von Kohlenstoffquellen (auf Pridham-Gottlieb-Agarmedium, ISP-Medium 9, bei 27ºC) Der Mikroorganismus wuchs unter Verwertung von D-Glucose, D-Xylose und L-Arabinose, jedoch nicht unter Verwertung von D-Fructose, Sucrose, Inositol, Rhamnose oder D-Mannitol. Der Mikroorganismus wird wahrscheinlich nicht Raffinose verwerten.
(7) Lösung von Calciummalat (auf Calciummalat-Agar bei 27ºC) Keine Lösung von Calciummalat wird beobachtet.
(8) Reduktion von Nitrat (in wäßriger Lösung von Pepton mit 0,1% KNO&sub3;, ISP-Medium 8, bei 27ºC) ist negativ.

4. Chemische Eigenschaften

(1) 2,6-Diaminopimelinsäure, DAP Meso-2,6-Diaminopimelinsäure und eine kleine Menge von LL-2,6-Diaminopimelinsäure wurden in der ganzen Zelle und der Zellwand beobachtet. Luftmycel-Fraktionen wurden nach dem Verfahren von Ohmura et al., (Journal of Antibiotics, 34 (1981), 1633) erhalten und sie enthielten eine Hauptmenge von LL-2,6-Diaminopimelinsäure und eine kleine Menge von Meso-2,6-Diaminopimelinsäure. Lufthyphen-Fraktionen wurden ebenfalls nach dem gleichen Verfahren erhalten und sie enthielten eine Hauptmenge von Meso-2,6-Diaminopimelinsäure mit einer Spurenmenge der LL-Form.
(2) Zucker Mannose, Galactose, Glucose und Ribose wurden in der ganzen Zelle gefunden, während Mannose und Galactose in der Zellwand beobachtet wurden. Jede ganze Zelle und Zellwand produzierten eine kleine Menge nicht identifizierbarer Flecken in einem Farbreaktionstest.
(3) Gehalt von GC (Guanin und Cytosin) in der DNA (Desoxyribonucleinsäure) Ein GC-Gehalt von 70,8 % wurde nach dem in S. Ulitzur, Biochimica et Biophysica Acta (1972), 272) beschriebenen UV-Absorptionsverfahren erhalten.
(4) LCN-A (Lipid-charakteristische Nocardia - A) Keine LCN-A wurde nach Analyse durch die in Mordarska, H. und Mordarski, M.: Journal of General Microbiology (1972), 71 beschriebene Technik beobachtet.
(5) Acyl-Typ von Aminozuckern in der Zellwand Die Aminozucker in der Zellwand zeigten sich nach dem in Kinya Uchida und Ko Aida: Journal of General Applied Microbiology, 23 (1977), 249-260 beschriebenen Verfahren von Uchida et al., vom Acetyl-Typ.
(6) Glycin in der Zellwand Glycin wurde in der Zellwand gefunden.
Die vorstehenden Beobachtungen können wie folgt zusammengefaßt werden: morphologisch gesehen haben die Luftmycele des Stammes MF 730-N6 weder Spiralbildung noch Wirbel. Eine reife Sporenkette hat mindestens 10-20 Sporen. Der Organismus hat Sporen mit glatter Oberfläche. Er wächst auf einer Vielzahl von Medien, wobei reichlich hellbraun graue Luftmycele auf farblosem bis schwach gelbbraunem Wachstum bereitgestellt werden. Kein löslicher Farbstoff wird beobachtet. Kein Melanin-ähnliches Pigment wird ausgebildet. Der Organismus hat eine starke Fähigkeit Protein abzubauen. Der Grad einer Stärkehydrolyse ist gemäßigt.
Meso- und LL-2,6-Diaminopimelinsäure wie auch Glycin und Galactose werden in der Zellwand des Stammes MF 730-N6 gefunden. Der vorherrschende Teil der 2,6-Diaminopimelinsäure in Luftmycelen ist die LL-Form, während jene in Lufthyphen-Fraktionen die Meso-Form ist. Der Acryl-Typ der Aminozucker in der Zellwand ist der Acetyl-Typ. Kein LCN-A wurde gefunden. Der GC-Gehalt der DNA ist 70,8%.
Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde vorliegend bestätigt, daß der Stamm MF 730-N6 zu keinem der Typen I-IX gehört, die von Lechevalier et al., (International Journal of Systematic Bacteriology, 20, (1970), 435) zur Klassifikation der vorherrschenden Komponenten von Zellwänden vorgeschlagen worden sind.
Der Stamm MF 730-N6 zeigt Eigenschaften, die jenen von Mikroorganismen der durch Ohmura et al., 1982 eingeführten Gattung Kitasatosporia ähnlich sind (vgl. The Journal of Antibiotics, 35, (1982), 1013, gefolgt von Bulletin of Nippon Hosenkin Kenkyukai, Nr. 45, Dezember 1984). Im einzelnen gab die Tatsache, daß dieser Stamm morphologisch getrennte, und submerse Sporen in einer flüssigen Kulturlösung ausbildete, vorliegend einen starken Grund dafür, den Stamm innerhalb der Gattung Kitasatosporia einzureihen. Von den bekannten vier Spezien von Kitasatosporia zeigt Kitasatosporia setae Eigenschaften, die jenen des Stammes NF 730-N6 am ähnlichsten sind (vgl. Ohmura et al., vorstehend, und "Hosenkin no Dotei Jikkenho (Experimental Methods for Identification of Actinomycetes"), herausgegeben durch Nippon Hosenkin Kenkyukai, 1985, 246).
Der Stamm Kitasatosporia setaruba (jetzt setae bezeichnet) wurde für einen Vergleich mit MF 730-N6 kultiviert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 MF 730-N6 Kitasatosporia setaruba Experimentelle Angaben Literaturangaben Sporenoberfläche glatt (mit "Furchen") Form von Luftmycelen gerade Farbe von Luftmycelen hellbraun grau weiß-bräunlich weiß-hellbraun grau weiß-hellgrau Sporenkette Farbe des Wachstums farblos-schwach gelbbraun löslicher Farbstoff schwach gelb Bildung von Melanin ähnlichem Pigment ISP-Medium Stärkehydrolyse Koagulation und Peptonisierung von Kuhmilch stark Verflüssigung von Gelatine Reduktion von Nitrat Verwendung von Kohlenstoffquellen D-Glucose L-Arabinose D-Xylose D-Fructose Sucrose L-Rhamnose Raffinose D-Mannitol Wachstumstemperaturbereich Optimale Temperatur 2,6-Diaminopimelinsäure-Zucker in der ganzen Zelle Meso- und LL-Formen, hauptsächlich Galactose, Mannose und Ribose Meso- und LL-Formen, Galactose (Xylose) Meso- und LL-Formen, Galactose und Mannose Meso- und LL-Formen, Galactose Glycin Acyltyp eines Aminozuckers Acetyl-Typ 2,6-Diaminopimelinsäure-Zucker in Luftmycelen hauptsächlich LL-Form LL-Form 2,6-Diaminopimelinsäure-Zucker in Lufthyphen hauptsächlich Meso-Form Meso-Form GC-Gehalt der DNA LCN-A produziertes Antibiotikum Terpenticin Setamycin
Wie die Tabelle zeigt, ist der Stamm MF 730-N6 sehr ähnlich zu Kitasatosporia setae mit den einzigen Ausnahmen hinsichtlich der Nitratreduktion, des GC-Gehalts der DNA und Zuckerkomponenten (Rhamnose und Ribose) der ganzen Zelle. Von diesen vier Unterschieden ist der die Nitratreduktion betreffende nicht als bedeutsam hinsichtlich der Daten in der Literatur zu betrachten. Die Bedeutsamkeit des Unterschiedes hinsichtlich des GC-Gehalts der DNA ist schwierig zu beurteilen, da sie stark von dem Meßverfahren abhängt. Hinsichtlich der Zuckergehalte der ganzen Zelle wurde gefunden, daß der Stamm MF 730-N6 eine kleine Menge Rhamnose enthält, während Kitasatosporia setaruba eine kleine Menge Ribose enthält. Daher wird vermutet, daß der Stamm MF 730-N6 eine Spezies ist, die sehr homolog zu Kitasatosporia setae (ursprünglich setaruba) ist.

Claims

1. Verbindung NF 730-N6, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(A) Schmelzpunkt 115-119ºC

(B) Drehung, gemessen unmittelbar nach Herstellung einer Lösung des Antibiotikums:

[α] D26 = -28.5º (C = 0.46, Chloroform)

(C) Löslichkeit: löslich in Methanol, Ethanol, Ethylacetat und Benzol

(D) Farbreaktionen: Triphenyltetrazoliumchlorid-Reaktion positiv

Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reaktion positiv

Joddampf positiv

Fehling's Reagens positiv

Silbernitrat-Ammoniak (Tollens) Reagens positiv

8% Phosphormolybdänsäure-Ethanol positiv

Dragendorff's Lösung negativ

Eisen(III)-chlorid-Reagenslösung negativ

(E) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

λ CH&sub3;OH/max (E 1%/1 cm) = 203 nm (60), 280 nm (3)

(F) Infrarot-Absorptionsspektrum: klare, charakteristische Absorptionsmaxima bei Wellenlängen 3430, 2960, 1705 und 1635 cm&supmin;¹ ermittelt durch das KBr-Tablettenverfahren, und

(G) ¹H - NMR Spektrum (CH&sub3;OD):

δ = 1.35 (s), 1.50-1.80 (m), 1.75 (brs),

1.80-2.30 (m), 2.70-2.85 (m), und

5.30-5.40 (m).

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, umfassend die Kultivierung eines zur Produktion der Verbindung MF 730-N6 fähigen Mikroorganismusstamm der Art Kitasatosporia in einem Nährmedium und die Sammlung der Verbindung aus der Kultur mittels üblicher Lösungsmittelextraktions- und/oder Chromatographie-Verfahren.

3. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments mit Antitumor und antimikrobieller Aktivität.

4. Stamm Kitasatosporia setae MF 730-N6 (FERN p-Nr. 8247, übergeben an FERN BP-1045).