DE2759974C2

DE2759974C2 -

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Publication number: DE2759974C2
Application number: DE2759974A
Authority: DE
Inventors: Tattanahalli L. Nagabhushan; Alan Parsippany N.J. Us Cooper; William N. Bloomfield N.J. Us Turner
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1976-06-17
Filing date: 1977-06-14
Publication date: 1988-05-26
Also published as: SE7706872L; JPS5576895A; IL52318A0; JPS6121558B2; JPS52153944A; JPS5549586B2; JPS5569598A; DK165451B; DK263277A; CH639979A5; FR2395277B1; SE8601074D0; BE855704A; SE469131B; SE8601074A; DE2760317C2; FR2395277A1; US4136254A; DE2726712A1; ES459791A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die folgenden selektiv blockierten 4,6-Di-O-(aminoglycosyl)-1,3-diamino- cyclitole:

3,2′,6′-Tri-N-Y-sisomicin,
3,2′,6′-Tri-N-Y-verdamicin,
3,2′,6′-Tri-N-Y-tobramycin,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C₁,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C_1a,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C₂,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C_2a,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C_2b,
3,2′,6′-Tri-N-Y-Antibiotikum G-52,
3,2′,6′-Tri-N-Y-kanamycin B,
3,2′,6′-Tri-N-Y-3′,4′-didesoxykanamycin B und
3,2′,6′-Tri-N-Y-3′,4′-didesoxy-3′,4′-dehydrokanamycin B;

3,6′-Di-N-Y-gentamicin B,
3,6′-Di-N-Y-gentamicin B₁,
3,6′-Di-N-Y-kanamycin A und
3,6′-Di-N-Y-N-methylkanamycin A; und
2′,6′-Di-N-Y-sisomicin,
2′,6′-Di-N-Y-verdamicin,
2′,6′-Di-N-Y-tobramycin,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C₁,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C_1a,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C₂,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C_2a,
2′,6′-Di-N-Y-Antibiotikum G-52,
2′,6′-Di-N-Y-3′,4′-didesoxykanamycin B und
2′,6′-Di-Y-3′,4′-didesoxy-3′,4′-dehydrokanamycin B,

wobei Y eine Acylgruppe ist.

Diese Verbindungen sind wichtige Ausgangsprodukte für die Herstellung von antibakteriell aktiven Umsetzungsprodukten der jeweiligen Stammantibiotika.

Die DE-OS 25 09 885 beschreibt 2′,6′-Di-N-acyliertes Gentamicin B und seine Verwendung als Antibiotikum.

GB-PS 14 26 908 beschreibt 1-N-(S)-α-Hydroxy-ω-aminoacylverbindungen von Aminoglycosid-Antibiotika, insbesondere 2′,6′-Di-N- benzyloxycarbonylverbindungen des Kanamicin B.

Die Acylschutzgruppen, Y, sind bekannt und umfassen beispielsweise Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyloxylcarbonyl, wie p-Nitrobenzyloxycarbonyl und p-Methoxy- benzyloxycarbonyl (durch katalytische Reduktion entfernbar); Aryloxycarbonyl, wie Phenoxycarbonyl; und Alkoxycarbonyl, wie Methoxycarbonyl, Aethoxycarbonyl und ähnliche (durch basische Hydrolyse leicht entfernbar); Trichloräthoxycarbonyl (durch Zn in Essigsäure entfernbar); Tertiäralkoxycarbonyl, wie tert.- Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl (durch schwach saure Hydrolyse entfernbar); Halogenalkylcarbonyl, wie Chloracetyl (durch Base, Thioharnstoff oder ähnlichem entfernbar) und Trifluoractetyl (unter schwach basischen Bedingungen entfernbar); Succinimid und Phthalimid (mit Hydrazin leicht entfernbar) und Alkanoyl, wie Acetyl, Propionyl, und Aroyl, wie Benzoyl (durch basische Hydrolyse entfernbar).

Bevorzugte Acylschutzgruppen sind Acetyl, tert-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl und 2,2,2-Trichloroethoxycarbonyl.

Die Ausgangsantibiotika zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen sind allesamt aus der Literatur bekannte Verbindungen.

Die Verbindungen der Erfindung können hergestellt werden indem man das jeweilige 4,6-Di-O-(aminoglycosil)-1,3-diaminocyclitol in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einem Salz eines divalenten Kations der Übergangsmetalle Kupfer, Nickel, Kobalt oder Kadmium oder von Gemischen dieser Übergangsmetalle umsetzt, wobei sich ein Polyamin-Komplex ausbildet zwischen dem Übergangsmetallsalz und zumindest einem Gruppenpaar bestehend aus der Aminogruppe und der dazu zugänglichen, benachbarten Hydroxylgruppe; daß man danach den entstandenen Komplex mit einem die Acyl-Schutzgruppen Y enthaltenden Amino-Blockierungsmittel umsetzt und den so erhaltenen Komplex, der nun Acyl-Schutzgruppen Y an den nicht komplexierten Aminogruppen aufweist, mit einem Fällungsmittel für Übergangsmetall-Kationen oder mit Ammoniumhydroxid umsetzt, um das Kation zu entfernen.

Übergangsmetallsalze, die als Komplexierungsmittel in dieser Erfindung Verwendung finden, sind zweiwertige Salze von Kupfer, Nickel, Kobalt und Kadmium. Jene mit stärkster Komplexierungskraft sind die divalenten Übergangsmetallsalze von schwachen Säuren, vorzugsweise schwachen organischen Säuren, wie Benzoe-, Propion- und Essigsäure. Bevorzugte divalente Übergangsmetallsalze sind die Acetate von Kupfer (II), Nickel (II), Kobalt (II) und Kadmium (II) und deren Gemische. Bevorzugt sind Nickel(II)- acetat, Kupfer(II)acetat und Kobalt(II)acetat.

Bevorzugte inerte Lösungsmittel sind polare, aprotische organische Lösungsmittel, insbesondere Dialkylamide (z. B. Dimethylformamid) und Dialkylsulfoxide (z. B. Dimethylsulfoxid). Polare protische Lösungsmittel, wie niedrige Alkanole, insbesondere Methanol und Äthanol, können auch verwendet werden, wenn dies aus Löslichkeitsgründen notwendig ist. Bei protischen Lösungsmitteln verwendet man meistens eine größere Menge des divalenten Übergangsmetallsalzes als bei aprotischen, da protische Lösungsmittel den Komplex schwächen.

Bevorzugt werden wasserfreie Lösungsmittel verwendet, um maximale Ausbeuten zu erhalten. Wasser kann jedoch gegenwärtig sein (oft erwünscht aus Löslichkeitsgründen) bis zu einem Gehalt von 25 Vol.% und noch mehr ohne die Ausbeuten des selektiv blockierten Produktes zu schmälern, wenn nur zusätzliches Übergangsmetallsalz zugegeben wird, da Wasser als protisches Lösungsmittel auch den Komplex schwächt.

Gewöhnlich werden zumindest equimolare Mengen an Übergangsmetallsalz multipliziert mit der Zahl der zugänglichen, benachbarten NH₂/OH Gruppen-Paare im Polyamin eingesetzt und die molare Menge des Acylierungsmittels in der zweiten Stufe des Verfahrens, die vorzugsweise in situ durchgeführt wird, ist gleich der molaren Menge des Polyamins multipliziert mit jener Zahl von nicht-komplexierten Aminogruppen, die geschützt werden sollen.

Falls ein Unterschied in der Reaktivität der nicht-komplexierten Aminogruppen besteht, kann man, falls nur die reaktiveren Aminogruppen geschützt werden sollen, entsprechend weniger Acylierungsmittel verwenden.

Nach Reaktion des Komplexes mit dem Acylierungsmittel kann das Übergangsmetallkation aus dem N-acylierten Komplex mit Fällungsmittel für Übergangsmetallkationen oder mit Ammoniumhydroxid entfernt werden. Im letzteren Fall bildet sich ein Komplex mit Ammoniumhydroxid aus, der in Ammoniumhydroxid und Wasser löslich ist. Dies kann dann von Vorteil sein, wenn das selektiv blockierte Polyamin in einem organischen Lösungsmittel löslich ist, da es dann vom wäßrigen, organischen Lösungsmittel, das den Ammoniumhydroxid-Übergangsmetallsalz-Komplex enthält, extrahiert werden kann.

Oft ist es einfacher, das Kation auszufällen. Geeignete Fällungsmittel sind u. a. das Dioxim von Dimethylglyoxal, 1,3-Dicarbonylalkane, wie Acetylaceton und Heptan-3,5-dion, Sulfide, wie Ammoniumsulfid, Alkalimetallsulfide (z. B. Natriumsulfid). Erdalkalimetallsulfide (z. B. Calciumsulfid), Alkalimetallhydrosulfide (z. B. Natriumhydrosulfid) und Schwefelwasserstoff. Davon sind das Dioxim von Dimethylglyoxal, Acetylaceton und Schwefelwasserstoff besonders gut geeignet.

Bei der Entfernung des Kations ist jedoch Schwefelwasserstoff meistens das Mittel der Wahl auf Grund der Einfachheit des Durchleitens von Schwefelwasserstoff durch das Reaktionsgemisch. Das entstehende Sulfid wird auch rasch und quantitativ gebildet und ist durch Filtration leicht zu entfernen.

Die beanspruchten Verbindungen sind wertvolle Zwischenprodukte für die Herstellung von 4,6-Di-O-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolen mit Substituenten an Aminogruppen, die während des Herstellungsverfahrens nicht geschützt waren. Substitution in Stellung 1 des Moleküls ergibt dabei ganz besonders wertvolle Verbindungen.

Besonders wertvoll sind Verbindungen, worin der 1-N-Substituent

ist und X Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl, mono- oder di-N-Alkylaminoalkyl, Aminohydroxyalkyl, mono- oder di-N-Alkylaminohydroxyalkyl, Phenyl, Benzyl oder Toluyl bedeutet, wobei die aliphatischen Radikale bis zu sieben Kohlenstoffatome aufweisen und, falls durch Amino und Hydroxy substituiert, diese Substituenten an verschiedenen Kohlenstoffatomen tragen und deren pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen. Ein besonders wertvolles Produkt ist das 1-N-Ethylsisomicin.

Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.

Beispiel 1 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin A. Über den Kupfer(II)-acetatkomplex

Man gibt 9 g (45 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat unter Rühren zu einer Lösung von 1,3 g (2,9 mMol) Sisomicin in 16 ml Wasser und 54 ml Dimethylformamid. Man rührt 35 Minuten bei Raumtemperatur und gibt dann zu dem hierdurch gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex 9,3 ml einer 1molaren Lösung von 9,3 mMol Essigsäureanhydrid in Dimethylformamid tropfenweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 Tropfen/Minute. Man rührt das Reaktionsgemisch weitere 30 Minuten, gibt dann 30 ml Wasser zu und läßt Schwefelwasserstoff etwa 10 Minuten durch die Lösung perlen, rührt das Gemisch weitere 30 Minuten, filtriert dann die Lösung durch eine Schicht eines Filterhilfsmittels auf Kieselgurbasis ("Celite®") und wäscht das als Rückstand verbleibende Kupfer(II)-sulfid dreimal mit je 20 ml Wasser. Man engt das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat ein und chromatograpiert den erhaltenen Rückstand an Kieselgel (150 g, 74-250 µ), wobei mit Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxid (30 : 10 : 1) eluiert wird. Man vereinigt gleiche Fraktionen, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines aus Chloroform, Methanol und Ammoniumhydroxyd bestehenden Lösungsmittelsystems (2 : 1 : 0,34), und dampft die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen unter vermindertem Druck ein und gefriertrocknet das erhaltene wäßrige Gemisch zu einem Rückstand in Form von 1,29 g 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin (Ausbeute 76%)

[α]+186,7° (c 4,4 in Wasser);
PMR (ppm) (D₂O): δ 1,22 (4′′-C-CH₃); 1,94, 1,98, 2,0 (N-Acetyle); 2,51 (3′′-N-CH₃); 2,59 (H-3′′, J_{2′′,3′′} = 9,5 Hz); 5,10 (H-1′′, J_{1′′,2′′} = 4,0 Hz); 5,51 (H-1′, J_1′,2′ = 2,5 Hz);
Massenspektrum: (M⁺) m/e 573, ferner m/e 392, 374, 364, 346, 233, 215, 205, 187; 160; 443, 425, 415, 397; 169.
Analyse: Berechnet für C₂₅H₄₃O₁₀N₅ · H₂CO₃: C 49,13; H 7,14; N 11,02. Gefunden: C 49,10; H 7,02; N 11,38%.

B. Über ein Gemisch von Kupfer(II)-acetatkomplex und Nickel(II)-acetatkomplex

1) Man gibt 8 g (40 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat und 10 g (40 mMol) Nickel(II)-acetattetrahydrat unter Rühren zu einer Lösung von 8,94 g (20 mMol) Sisomicin in 400 ml Dimethylsulfoxyd. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur gibt man tropfenweise eine Lösung von 5,4 ml Essigsäureanhydrid in 50 ml Tetrahydrofuran (60 mMol) zu. Nach erfolgter Zugabe rührt man das Reaktionsgemisch weitere 30 Minuten, gießt es in 1,5 l Äther und mischt den Inhalt sorgfältig. Man läßt das Gemisch absitzen und dekantiert die Ätherschicht. Man wiederholt die vorstehend beschriebene Behandlung dreimal unter Verwendung von je 500 ml Äther. Man löst den halbfesten Rückstand in 400 ml Methanol und läßt Schwefelwasserstoff durch die Lösung perlen, um Kupfer(II)- und Nickel(II)- ionen zu entfernen. Man entfernt den Feststoff durch Filtration durch das Filterhilfsmittel "Celite®" und wäscht den Rückstand mit Methanol. Man engt die vereinigten Filtrate unter vermindertem Druck ein und löst den Rückstand in 150 ml Wasser. Man behandelt die wäßrige Lösung mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" in der Hydroxydform, bis der pH-Wert etwa 9 beträgt. Man filtriert das Harz ab, wäscht gut und gefriergetrocknet entweder die wäßrige Lösung unter Bildung von 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin in 90%iger Ausbeute (10,3 g) oder engt die wäßrige Lösung zu einem dicken Sirup ein, löst den Rückstand in der geringsten Menge Isopropanol und fällt das Produkt mit überschüssigem Äther aus.

2) Als Alternative engt man das Filtrat nach Entfernung der Kupfer(II)- und Nickel(II)-ionen durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff und Filtration ein und löst den Rückstand in der Mindestmenge Isopropanol und fällt das Produkt mit überschüssigem Äther aus, wobei man das essigsaure Salz von 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin in 90%iger Ausbeute erhält.

C. Über den Kobalt(II)-acetatkomplex

1) Man rührt 0,447 g (1 mMol) Sisomicin in 20 ml Dimethylformamid und gibt 0,516 g (2,07 mMol) Kobalt- (II)-acetattetrahydrat zu. Man rührt 20 Minuten bei Raumtemperatur und gibt dem hierbei gebildeten Kobalt- (II)-acetatkomplex tropfenweise 3 ml einer 1molaren Lösung von Essigsäureanhydrid in Tetrahydrofuran zu. Man rührt eine weitere Stunde, gibt 10 ml Wasser zu und läßt dann Schwefelwasserstoff durch die Lösung perlen, bis das gesamte Kobalt(II) ausgefällt ist. Man entfernt das Kobalt(II)-sulfid durch Filtration durch eine Schicht des Filterhilfsmittels "Celite®" und wäscht den Rückstand mit Wasser. Man dampft das Filtrat unter vermindertem Druck ein und löst den erhaltenen Rückstand in der Mindestmenge Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxid (2 : 1 : 0,35). Man leitet die Lösung durch eine Kieselgelsäule (50 g, 74-250 µ) und wäscht die Säule mit dem gleichen Lösungsmittel. Man fängt die homogenen Fraktionen auf, die das durch Dünnschichtchromatographie bestimmte 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin enthalten, dampft die vereinigten Fraktionen unter vermindertem Druck ein und gefriertrocknet den erhaltenen Rückstand, wobei man 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin erhält (Ausbeute 0,498 g, 88% der Theorie).

2) Bei dem vorstehend beschriebenen Versuch wird durch Verwendung von Dimethylsulfoxyd an Stelle von Dimethylformamid und durch Isolieren und Reinigen des erhaltenen Produkts in der in Beispiel 1B beschriebenen Weise 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin in guten Ausbeuten erhalten.

D. Unter Verwendung von Acetylaceton als Reagens zum Ausfällen des Übergangsmetalls

Bei den in den Beispielen 1A, 1B und 1C beschriebenen Versuchen verwendet man Acetylaceton an Stelle von Schwefelwasserstoff als Reagens zur Ausfällung des Übergangsmetalls und filtriert die gebildete Fällung des entsprechenden Übergangsmetall-acetylacetonats und isoliert und reinigt jeweils das erhaltene Produkt in der beschriebenen Weise, wobei man 3,2′,6′-Tri-N- acetylsisomicin erhält.

Beispiel 2 3,2′,6′-Tri-N-acetylverdamicin über den Kupfer(II)- acetatkomplex

Zu einer Lösung von 4,61 g (10 mMol) Verdamicin in 300 ml Dimethylformamid und 90 ml Wasser gibt man unter Rühren 14 g (70 mMol) Kupfer(II)-acetatmonohydrat, rührt das Reaktionsgemisch etwa 30 Minuten bei Raumptemperatur und gibt dann zu dem hierdurch gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex trofpenweise 33 ml einer 1molaren Lösung von Essigsäureanhydrid in Dimethylformamid (3,3 Äquivalente). Man rührt weitere 18 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur, gibt Wasser zu und läßt Schwefelwasserstoffgas durch die Lösung perlen. Man filtriert das hierdurch gebildete Kupfersulfid durch das Filterhilfsmittel auf einer Glasfritte, wobei man mit 50 bis 200 ml Wasser spült. Man dampft das Filtrat unter vermindertem Druck und stellt den pH-Wert der wäßrigen Lösung mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" in der Hydroxydform auf etwa 9 ein. Man gefriertrocknet die Lösung zu einem Rückstand, der aus 5,5 g 3,2′,6′-Tri-N- acetylverdamicin besteht. Man reinigt durch Chromatographie an 300 g Kieselgel (74-250 µ), wobei man mit Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (28%) (30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt die Fraktionen, die gemäß Dünnschichtchromatographie gleich sind, und dampft die vereinigten Fraktionen unter vermindertem Druck zu einem Rückstand ein, der aus 1,68 g (2,8 mMol, 28% der Theorie 3,2′,6′-Tri-N-acetylverdamicin besteht.

PMR (ppm) (D₂O): δ 1,25 (4′′-C-CH₃); 1,36 (6′-C-CH₃, J_6′,7′ = 7 Hz); 1,97, 2,04 (N-Acetyle); 2,56 (3′′-N-CH₃); 4,91 (H-4′′); 5,11 (H-1′, J_1′,2′ = 4 Hz); 5,60 (d,H-1′′, J_{1′′,2′′} = 2,5 Hz);
Massenspektrum: m/e 587 [M]⁺; 392, 374, 364; 346, 233, 215, 205, 187; 457, 439, 429, 411; 183.

Beispiel 3 3,2′,6′-Tri-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)-derivate von Sisomicin und Gentamicin C_1a über den Kupfer(II)- acetatkomplex A. 3,2′,6′-Tri-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)sisomicin

Man gibt 14 g (70 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat unter Rühren zu einer Lösung von 5,0 g (11,1 mMol) Sisomicin in 300 ml Dimethylsulfoxyd, rührt 45 Minuten und gibt denn zu dem hierdurch gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex portionsweise 9,25 g (32 mMol) N-(2,2,2-Trichlor- äthoxycarbonyloxy)succinimid (innerhalb von 2 bis 3 Minuten). Man rührt die erhaltene grüne Lösung eine Stunde, verdünnt dann das Reaktionsgemisch mit 2n-Ammoniumhydroxyd (3 l) und extrahiert zweimal mit je 600 ml Äthylacetat. Man vereinigt die organischen Extrakte, wäscht mit 600 ml 2n-Ammoniumhydroxyd, das 60 g Natriumchlorid enthält, trocknet über Natriumsulfat und dampft unter vermindertem Druck ein. Man chromatographiert den erhaltenen Rückstand an Kieselgel (300-350 g), wobei man mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid (Volumenverhältnis 7 : 2 : 0,1) eluiert. Man vereinigt gleiche Eluate, die das gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), und dampft die vereinigten Eluate unter vermindertem Druck ein und trocknet den erhaltenen Rückstand bei 60°C und 0,133 mbar, wobei man 3,2′,6′-Tri-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)sisomicin in einer Ausbeute von 7,52 g (77% der Theorie) erhält. Schmelzpunkt 124-127°C.

[α]+91,0° (c 0,5 in Chloroform);
PMR (ppm) (CDCl₃): δ 1,17 (4′′-C-CH₃) 2,58 (3′′-N-CH₃) und 4,77 (-CH₂CCl₃).

B. 3,2′,6′-Tri-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)gentamicin C_1a

Man gibt 2,8 g (14mMol) Kupfer(II)-acetathydrat unter Rühren zu einer Lösung von 1,0 g (2,22 mMol) Gentamicin C_1a in 65 ml Dimethylsulfoxyd bei 25°C. Man rührt eine weitere Stunde und gibt dann zu dem hierdurch gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex portionsweise 1,8 g (62 mMol) N-(2,2,2-Trichloräthoxycarbonyloxy)succinimid über einen Zeitraum von 15 Minuten. Man rührt weitere 2 Stunden, verdünnt dann das Reaktionsgemisch mit 800 ml 2n-Ammoniumhydroxyd und extrahiert mit Äthylacetat (3 × 75 ml). Man dampft die vereinigten Extrakte unter vermindertem Druck ein und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an einer Kieselgelsäule (110 × 2,5 cm), wobei man zuerst mit 250 ml Chloroform und dann mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxyd (Volumenverhältnis 7 : 2 : 0,1) eluiert. Man vereinigt gleiche Eluate, die das gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), und dampft die vereinigten Eluate zu einem Rückstand ein, der aus dem gewünschten Produkt besteht. Ausbeute 1,51 g (78% der Theorie).

[a]+80,0° (c 0,3 in Chloroform);
ν:3330, 1730, 1520, 1040, 1025 cm^-1;
PMR (ppm) (CDCl₃): δ 1,14 (4′′-C-CH₃) 2,55 (3′′-N-CH₃) und 4,64 (-CH₂CCl₃).

Beispiel 4 2′,6′-Di-N-substituiertes Sisomicin A. 2′,6′-Di-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)sisomicin über den Nickel(II)-acetatkomplex

Man gibt 5 g (11,1 mMol) Sisomicin und 15 g (75 mMol) Nickel(II)-acetathydrat zu 350 ml Methanol und rührt bis zur Auflösung. Zu der hierbei gebildeten und in einem Eisbad gekühlten Lösung des Nickel(II)-salzkomplexes gibt man 6,40 g (22 mMol) N-(2,2,2-Trichloräthoxycarbonyloxy)succinimid in Portionen über eine Zeit von 2 bis 3 Minuten und rührt das Reaktionsgemisch eine Stunde bei Raumtemperatur. Man gibt 5 ml konzentriertes Ammoniumhydroxyd zum Reaktionsgemisch, dampft unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 100 ml ein, gibt 500 ml 2n-Ammoniumhydroxyd zusammen mit 50 g Natriumchlorid zu und extrahiert dreimal mit je 300 ml Chloroform. Man vereinigt die organischen Phasen, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man chromatographiert den erhaltenen Rückstand an 300 g Kieselgel, wobei man mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid (Volumenverhältnis 3 : 1 : 0,1) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen, die daß gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie, und dampft die vereinigten Fraktionen unter vermindertem Druck ein. Man trocknet die Fällung bei 60°C und einem Druck von 0,133 mbar zu einem Rückstand aus 2′,6′-Di-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)sisomicin. Ausbeute 5,80 g (72% der Theorie); Schmelzpunkt 115-119°C.

[α]+94° (c 0,4 in Chloroform);
PMR (ppm) (CDCl₃): δ 1,16 (4′′-C-CH₃); 1,33 (H-2, J₂ax,₂eq=J₁,₂ax=J₂ax,₃=10 Hz); 2,60 (3′′-N-CH₃); 4,73 (-CH₂CCl₃); 4,95 (H-1′′ und (H-4′); 5,50 (H-1′, J_1′,2′ = 3 Hz; 6,28 (2′-NH, J = 8 Hz) und 7,45 (6′-NH).

B. 2′,6′-Di-N-t-butoxycarbonylisomicin über den Kupfer(II)-acetatkomplex

Man gibt 0,6 g (3 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat zu einer Lösung von 447 mg (1 mMol) Sisomicin in 10 ml Dimethylsulfoxyd und rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur. Zu dem hierdurch gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex gibt man tropfenweise eine Lösung von 576 mg (2,2 mMol) N-t-Butoxycarbonyloxyphthalimid in 3 ml Dimethylsulfoxyd. Man rührt 18 Stunden bei Raumtemperatur und gibt dann die Reaktionslösung tropfenweise unter Rühren zu 75 ml Diäthyläther. Man läßt die gebildete Fällung absitzen, dekantiert die Diäthylätherlösung und verreibt die Fällung zweimal mit je 75 ml Diäthyläther. Man löst die Fällung in Methanol, läßt Schwefelwasserstoff durch die Methanollösung perlen, trennt das hierbei ausgefällte Kupfer(II)-sulfid durch Filtration ab, entionisiert die methanolische Lösung mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" (OH⊖) (20 g), filtriert, engt das Filtrat unter vermindertem Druck ein und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an 75 g Aluminiumoxyd in einer Säule von 2,4 × 30 cm, wobei man mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxyd (Volumenverhältnis 30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), und dampft die vereinigten Fraktionen ein und gefriertrocknet den erhaltenen Rückstand, wobei man das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 258 mg (40% der Theorie) erhält.

Massenspektrum (M⁺) m/e 647, ferner m/e 547, 530, 517, 499, 489, 471, 462, 350, 332, 322, 304, 191, 160.

C. 2′,6′-Di-N-t-butoxycarbonylsisomicin über den Kobalt(II)-acetatkomplex oder den Nickel(II)-acetatkomplex

Bei dem in Beispiel 4B beschriebenen Versuch wird durch Verwendung von Methanol als Lösungsmittel (an Stelle von Dimethylsulfoxyd) und entweder Nickel(II)-acetat oder Kobalt(II)-acetat als Übergangsmetallsalz (an Stelle von Kupfer(II)-acetat) 2′,6′-Di-N-t-butoxycarbonylsisomicin in verbesserten Ausbeuten erhalten.

Beispiel 5 3,6′-Di-N-Acylaminoglykoside A. 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin B über ein Gemisch von Kupfer(II)-acetat- und Nickel(II)- acetatkomplexe

Man gibt 8 g (40 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat und 9,92 g (40 mMol) Nickel(II)-acetattetrahydrat unter Rühren zu einer Lösung von 9,64 g (20 mMol) Gentamicin B in 400 ml Dimethylsulfoxid. Man rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur und gibt dann zu dem hierbei gebildeten Kupfer(II)-nickel(II)-salzkomplex 14 g (47,2 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxyphthalimid in 70 ml Dimethylsulfoxid tropfenweise über eine Zeit von 10 Minuten. Man rührt eine Stunde bei Raumtemperatur, gießt das Reaktionsgemisch dann in 4 l Äther und schüttelt 1 Minute. Man läßt das Öl absitzen und dekantiert den überstehenden Äther ab. Man wiederholt diese Behandlung noch zweimal unter Verwendung von 1500 ml bzw. 1000 ml Diäthyläther. Man löst den hierbei erhaltenen gummiartigen Rückstand in 400 ml Methanol und 40 ml konzentriertem Ammoniumhydroxyd und läßt Schwefelwasserstoff durch die Lösung perlen, trennt die hierbei gebildete Fällung aus Kupfer(II)-sulfid und Nickelsulfid durch Filtration durch eine Lage des Filterhilfsmittels "Celite®" ab. Man wäscht den Rückstand mit Methanol und rührt dann das mit den zum Waschen verwendeten Methanol vereinigte Filtrat mit 400 ml des Ionenaustauscherharzes "Amberlite® IRA-401S" (OH⊖) zur Entfernung des N-Hydroxyphthalimids. Man filtriert die Lösung, wäscht das Harz mit Methanol, dampft das mit dem zum Waschen verwendeten Methanol vereinigte Filtrat ein und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an 900 g Kieselgel, wobei man mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxyd (30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt die gleichen Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), und dampft die vereinigten Fraktionen unter vermindertem Druck zu einem Rückstand ein, der das 3,6′-Di-N-benzyloxycarbongentamicin B enthält. Ausbeute 10,86 g (75% der Theorie).

[α]+105,3° (c 4,07 in Wasser).
Analyse: Berechnet für C₃₅H₅₀O₁₄N₄ · CO₂ · 2 H₂O: C 52,04; H 6,55; N 6,74%. Gefunden: C 51,94; H 6,33; N 6,83%.

B. 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin B über den Kobalt(II)-acetatkomplex

Man löst 4,82 g (10 mMol) Gentamicin B in 195 ml Dimethylsulfoxyd und 5 ml Wasser. Man gibt 2 ml Triäthylamin zu und rührt. Man gibt 7,08 g (28,5 mMol) Kobalt- (II)-acetattetrahydrat zu und rührt weitere 30 Minuten. Dann gibt man zu dem hierbei gebildeten Gentamicin B- Kobalt(II)-acetatkomplex tropfenweise eine Lösung von 6,5 g (20 mMol) N-(Benzyloxycarbonyloxy)phthalimid in 20 ml Dimethylsulfoxyd, rührt 3 Stunden, gießt dann in Äther und isoliert in der in Beispiel 5A beschriebenen Weise. Man reinigt den erhaltenen Rückstand durch Auflösen in einer geringen Methanolmenge und Zugabe von Äthylacetat und anschließend von Diäthyläther im Überschuß. Man trennt die gebildete Fällung durch Filtration ab und trocknet an der Luft, wobei man reines 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin B in einer Ausbeute von 90% der Theorie erhält.

C. 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin B über den Cadmium(II)-acetatkomplex

Man löst 4,82 g (10 mMol) Gentamicin B in 195 ml Dimethylsulfoxyd und gibt 7,98 g (30 mMol) Cadmium(II)- acetatdihydrat zu. Man rührt 30 Minuten und gibt dann zu dem hierbei gebildeten Gentamicin B-Cadmium(II)- acetatkomplex eine Lösung von 6,5 g (20 mMol) N-(Benzyloxycarbonyloxy)phthalimid in 20 ml Dimethylsulfoxyd. Man rührt 3 Stunden bei Raumtemperatur und isoliert und reinigt dann auf die in Beispiel 5A beschriebene Weise, wobei man 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin B erhält.

C. 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylkanamycin A über den Nickel(II)-acetatkomplex

Man gibt 24,8 g (10 mMol) Nickel(II)-acetattetrahydrat unter Rühren zu einer Lösung von 9,7 g (20 mMol) Kanamycin A in 400 ml Dimethylsulfoxyd. Man rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur und gibt dann zu dem hierbei gebildeten Nickel(II)-salzkomplex 13,0 bis 15,6 g (44 bis 52 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxyphthalimid in 70 ml Dimethylsulfoxid über eine Zeit von 10 Minuten. Man rührt eine Stunde bei Raumtemperatur, gießt das Reaktionsgemisch dann in 2500 ml Äther und schüttelt 1 Minute. Man läßt das Öl sich absetzen und dekantiert die überstehende Dimethylsulfoxydätherphase. Man wiederholt diese Behandlung noch zweimal unter Verwendung von 1500 ml bzw. 1000 ml Äther. Man löst den erhaltenen gummiartigen Rückstand in 1000 ml Methanol und 50 ml konzentriertem Ammoniumhydroxyd. Man läßt Schwefelwasserstoff durch die Lösung perlen und filtriert das hierbei ausgefällte Nickel(II)-sulfid durch eine Lage des Filterhilfsmittels "Celite®" ab und wäscht den Rückstand mit Methanol. Man rührt das mit dem zum Waschen verwendeten Methanol vereinigte Filtrat mit 300 g des Ionenaustauscherharzes "Amberlite® IRA-401S" (OH⊖), filtriert das Harz ab und dampft das Filtrat unter vermindertem Druck ein. Man verreibt den hierbei erhaltenen gummiartigen Rückstand mit einem 50 : 50-Gemisch von Acetonitril und Äther und filtriert den hierbei gebildeten weißen kristallinen Feststoff ab, wobei man 3,6′-Di-N- benzyloxycarbonylkanamycin A in einer Ausbeute von 12,5 g (83,5% der Theorie) erhält.

[α]+78° (c 4,84 in 50%igem wäßrigem Methanol).
Analyse: Berechnet für C₃₄H₄₈O₁₅N₄ · H₂O: C 56,2; H 6,75; N 6,94. Gefunden: C 51,2; H 6,26; N 6,85%.

E. Man behandelt die nachstehend genannten Aminoglykoside mit einem Gemisch von Kupfer(II)-acetathydrat und Nickel(II)-acetattetrahydrat bzw. mit Kobalt(II)-acetattetrahydrat bzw. mit Cadmium(II)-acetatdihydrat auf die in den Beispielen 5A bis 5D beschriebene Weise:

1) Gentamicin B₁,
2) Gentamicin A₃,
3) 6′-N-Methylkanamycin A.

Man isoliert und reinigt die hierbei erhaltenen Produkte und erhält

1) 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin B₁,
2) 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin A₃,
3) 3,6′-Di-N-benzyloxycarbonyl-6′-N-methylkanamycin A.

F. Herstellung von 3,6′-Di-N-t-butoxycarbonylgentamicin B aus 6′-t-Butoxycarbonylgentamicin über den Kupfer(II)-acetatkomplex

Zu einer Lösung von 10 g (17,1 mMol) 6′-N-t-Butoxycarbonylgentamicin B in 300 ml Dimethylsulfoxyd gibt man 6,9 g (34,5 mMol) Kupfer(II)-acetatmonohydrat und rührt 20 Minuten. Dem hierbei in situ gebildeten Kupfer(II)- salzkomplex gibt man tropfenweise eine Lösung von 4,5 g (17,1 mMol) N-t-Butoxycarbonyloxyphthalimid in 20 ml Dimethylsulfoxyd zu und rührt weitere 2 Stunden. Dann gibt man weitere 2,4 g N-Butoxycarbonyloxyphtalimid zu und rührt das Reaktionsgemisch weitere 10 Stunden. Man gießt das Reaktionsgemisch unter Rühren in 1,5 l Äther, läßt die hierbei gebildete Fällung bzw. das Öl absitzen und dekantiert die überstehende Flüssigkeit vorsichtig. Man wäscht den Rückstand zweimal mit je 300 ml Äther, löst ihn in 100 ml Äthanol und läßt Schwefelwasserstoff durch die Lösung perlen, wobei das Kupfer(II)-sulfid vollständig ausgefällt wird. Man filtriert die Feststoffe durch eine Lage des Filterhilfsmittels "Celite®" ab und wäscht mit Methanol. Man rührt die methanolische Lösung mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" (OH⊖) in einer Menge, die gerade genügt, um den pH-Wert auf etwa 9 einzustellen, und entfernt das N-Hydroxyphthalimid. Man entfernt das Harz durch Filtration, wäscht mit Methanol und engt das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat auf ein Volumen von etwa 50 ml ein, das das gewünschte Produkt enthält.

Isolierung der Verbindung kristallisiert man durch Verreiben des Rückstandes nach dem Eindampfen mit Äther, wobei man 3,6′-Di-N-t-butoxycarbonylgentamicin B in einer Ausbeute von 90% der Theorie erhält. Als Alternative reinigt man durch Chromatographie an Kieselgel (Verhältnis der Verbindung zu Kieselgel 1 : 40) unter Verwendung von Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (2 : 1 : 0,35) als Lösungsmittelgemisch zum Entwickeln. Man gießt gleiche Fraktionen, die 3,6′-Di-N-t-butoxycarbonylgentamicin B enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), engt ein und gefriertrocknet, wobei man 3,6′-Di-N-t-butoxycarbonylgentamicin B erhält.

[α]+113,3° (c 0,39 in Wasser);
PMR (ppm) (D₂O): δ 1,17 (4′′-C-CH₃); 1,38 (t-Butyl); 2,5 (3′′-N-CH₃); 2,54 (H-3′′, J_{2′′,3′′} = 10 Hz); 4,02 (H-5′′ eq, J₅′′ax,eq = 12 Hz); 5,04 (H-1′′, J_1′,2′ = 3,5 Hz); 5,23 (H-1′, J_1′,2′ = 3,0 Hz)
Analyse: Berechnet für C₂₉H₅₇O₁₅N₄ · H₂O: C 49,63; H 8,19; N 7,98%. Gefunden: C 49,83; H 7,81; N 7,68%.

G. 3,6′-Di-N-t-butoxycarbonylgentamicin B aus Gentamicin B über den Kupfer(II)-acetatkomplex

Man gibt 5,0 g (25 mMol) Kupfer(II)-acetatmonohydrat unter Rühren zu einer Lösung von 4,82 g (10 mMol) Gentamicin B in 250 ml Dimethylsulfoxyd. Man rührt 30 Minuten und gibt dann zu dem hierbei in situ gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex tropfenweise eine Lösung von 10,5 g (40 mMol) N-t-Butoxycarbonyloxyphthalimid in 20 ml Dimethylsulfoxyd. Man rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur und gibt dann weitere 1,5 g (5,7 mMol) N-t-Butoxycarbonyloxyphthalimid zu. Man rührt 16 Stunden und gibt dann weitere 0,35 g (1,33 mMol) N-t-Butoxycarbonyloxyphthalimid zu. Man rührt weitere 6 Stunden und gießt dann das Reaktionsgemisch unter Rühren in 1,5 l Äther. Man rührt 30 Minuten, läßt das Reaktionsgemisch stehen, dekantiert die überstehende Lösung, gibt erneut 500 ml Äther zum Rückstand, läßt stehen und dekantiert die überstehende Lösung. Man löst den erhaltenen Rückstand in 100 ml Methanol und läßt Schwefelwasserstoff 15 Minuten durchperlen. Man filtriert das feste Kupfer(II)-sulfid durch eine Lage des Filterhilfsmittels "Celite®" ab und wäscht den Rückstand mit Methanol. Man behandelt die Methanollösung mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" (OH⊖) und stellt hierdurch den pH-Wert der Lösung auf etwa 8,5 bis 9,0 ein, filtriert die Feststoffe ab und wäscht sich mit Methanol. Man dampft die Lösung bis nahezu Trockene ein und gefriertrocknet zur Entfernung des Wassers. Man kristallisiert das 3,6′-Di-N- t-butoxycarbonylgentamicin B durch Verreiben mit Äther. Das rohe Konzentrat kann auch als Ausgangsmaterial bei dem im Verwendungsbeispiel 3 beschriebenen Versuch verwendet werden.

Beispiel 6 Andere 3,2′,6′-Tri-N-acylaminoglykoside A. 3,2′,6′-Tri-N-benzyloxycarbonylgentamicin C₂ über ein Gemisch des Kupfer(II)-acetatkomplexes und Nickel(II) acetatkomplexes

Man gibt 0,6 g (3 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat und 0,743 g (3 mMol) Nickel(II)-acetattetrahydrat unter Rühren zu einer Lösung von 0,925 g (2 mMol) Gentamicin C₂ in 40 ml Dimethylsulfoxyd. Man rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur und gibt dann zu dem hierbei gebildeten Gemisch von Kupfer(II)- und Nickel(II)-salzkomplex 1,8 g (6,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxyphthalimid in 7 ml Dimethylsulfoxyd über eine Zeit von 10 Minuten. Man rührt eine weitere Stunde und gießt dann das Reaktionsgemisch unter Rühren in 400 ml Äther. Man dekantiert den überstehenden Äther und wiederholt diese Behandlung mit 200 ml bzw. 100 ml Äther. Man löst den erhaltenen gummiartigen Rückstand in 100 ml Methanol und 5 ml konzentriertem Ammoniumhydroxyd und läßt dann Schwefelwasserstoff durch die Lösung perlen. Man entfernt das hierbei ausgefällte Kupfer(II)-sulfid und Nickel(II)-sulfid durch Filtration durch eine Lage des Filterhilfsmittels "Celite®", wäscht die Fällung mit Methanol und rührt dann das mit dem zum Waschen verwendete Methanol vereinigte Filtrat mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" (OH⊖). Man filtriert das Harz ab und wäscht mit Methanol. Man dampft das mit dem zum Waschen verwendeten Methanol vereinigte Filtrat unter vermindertem Druck ein und chromatographiert den erhaltenen gummiartigen Rückstand an 50 g Kieselgel, wobei man mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxyd (30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), und dampft die vereinigten Eluate zu einem Rückstand ein, der aus 3,2′,6′-Tri-N- benzyloxycarbonylgentamicin C₂ besteht. Ausbeute 1,4 g (81% der Theorie). Massenspektrum: m/e 484, 411, 325, 160.

B. Auf die in Beispiel 6A beschriebene Weise behandelt man Gentamicin C₁ mit Kupfer(II)-acetathydrat und Nickel(II)-acetattetrahydrat in Dimethylsulfoxyd, behandelt den hierbei gebildeten Salzkomplex mit N-Benzyloxycarbonyloxyphtthalimid und dann mit Schwefelwasserstoff und isoliert und reinigt das gebildete Produkt, wobei man 3,2′6′-Tri-N-benzyloxycarbonylgentamicin C₁ in einer Ausbeute von 1,3 g (72,5% der Theorie) erhält. Massenspektrum: m/e 749, 615, 484, 466, 456, 425, 407, 325, 307, 297, 291, 160.

C. Gemischte 3,2′,6′-Tri-N-acylaminoglykoside und Umwandlung in 3,6′-Di-N-acylaminoglykosid 1) 6′-N-Acetyl-2′-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)- sisomicin über den Kupfer(II)-acetatkomplex

Auf die in Beispiel 4A beschriebene Weise behandelt man 6′-N-Acetylsisomicin mit etwa 7 Äquivalenten Kupfer(I)-acetathydrat in Methanol und gibt dann zu dem hierbei gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex portionsweise etwa 1 Äquivalent N-(2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl)succinimid. Man rührt das Reaktionsgemisch 1 Stunde, behandelt mit Ammoniumhydroxyd und isoliert und reinigt das hierbei gebildete Produkt auf die in Beispiel 4A beschriebene Weise, wobei man 2′-N-(2,2,2- Trichloräthoxycarbonyl)-6′-N-acetylsisomicin erhält.

2) 3,6′-Di-N-acetyl-2′-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)- sisomicin über den Kupfer(II)-acetatkomplex

Man gibt 24 g (120 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat unter Rühren zu einer Lösung von 26,5 g (40 mMol) 2′-N-(2,2,2- trichloräthoxycarbonyl)-6′-N-acetylsisomicin in 1 l Dimethylsulfoxyd. Man rührt weitere 20 Minuten und gibt dann zu dem hierbei gebildeten Kupfer(II)-salzkomplex tropfenweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 Tropfen/Minute 40 ml einer 1molaren Lösung von Essigsäureanhydrid in Tetrahydrofuran (40 mMol). Man rührt das Reaktionsgemisch weitere 30 Minuten und gießt dann in 8 l Äther. Man schüttelt gut und stellt bei Seite. Man dekantiert die Ätherschicht und wäscht den Rückstand noch zweimal mit je 1 l Äther. Man löst den Rückstand in 800 ml Methanol und läßt Schwefelwasserstoff 15 Minuten durchperlen. Man rührt das Gemisch weitere 30 Minuten, filtriert die Lösung dann durch eine Lage des Filterhilfsmittels "Celite®" und wäscht das als Rückstand verbleibende Kupfer(II)-sulfid mit Wasser. Man engt das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat ein und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an Kieselgel, wobei man mit Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), und dampft die vereinigten Fraktionen unter vermindertem Druck auf einen Rückstand ein, der aus 3,6′-Di-N- acetyl-2′-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)sisomicin besteht.

3) 3,6′-Di-N-acetylsisomicin

Man gibt 3,9molare Äquivalente Zinkpulver zu einer Lösung von 3,6′-Di-N-acetyl-2′-N-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyl)sisomicin in 10% Essigsäure enthaltendem Methanol. Man erhitzt die Lösung 2 Stunden am Rückflußkühler, wobei man die Reaktion durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (30 : 10 : 1) als Lösungsmittelsystem überwacht. Wenn die Reaktion beendet ist (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), filtriert man die Lösung, gibt zum Filtrat Natriumcarbonat, filtriert und engt das Filtrat unter vermindertem Druck ein. Man reinigt den erhaltenen Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel, wobei man mit Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), dampft die vereinigten Fraktionen unter vermindertem Druck ein und gefriertrocknet das erhaltene wäßrige Gemisch zu einem Rückstand, der aus 3,6′-Di-N-acetylsisomicin besteht.

Verwendungsbeispiel 1 Umwandlung von 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin in 1-N- Äthylsisomicin A. 3,2′,6′-Tri-N-acetyl-1-N-äthylsisomicin

Man gibt 0,1 n-Salzsäure unter Rühren zu einer Lösung von 1,146 g (2 mMol) 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin in 20 ml Wasser, bis der pH-Wert der Lösung 2,7 erreicht. Man kühlt das Reaktionsgemisch auf 3°C und gibt 2,2 ml einer 1molaren Lösung von Acetaldehyd in Tetrahydrofuran (2,2 mMol) und dann tropfenweise eine Lösung von 0,16 g (2,6 mMol) Natriumcyanborhydrid in 2 ml Wasser zu. Man rührt das Reaktionsgemisch eine Stunde, wobei man die Temperatur unter 5°C und den pH-Wert durch Zusatz von 0,1 n-Salzsäure bei etwa 2,7 hält, und gibt dann 0,44 ml einer 1molaren Lösung von Acetaldehyd in Tetrahydrofuran (0,44 mMol) und anschließend eine Lösung von 35 mg (0,56 mMol) Natriumcyanborhydrid in einigen Tropfen Wasser zu, wobei man den pH-Wert durch Zusatz von 0,1 n-Salzsäure bei 2,7 hält. Man rührt das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde und wiederholt zweimal die vorstehend genannte Zugabe von 0,22 ml Acetaldehydlösung und 10 mg Natriumcyanborhydrid. Man rührt weitere 18 Stunden bei Raumtemperatur und bringt die Lösung dann auf pH 9, indem sie mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" in der Hydroxyd- form rührt. Man filtriert das Harz ab, wäscht mit Wasser und engt das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat unter vermindertem Druck ein und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an 100 g Kieselgel (74 bis 250 µ), wobei man mit Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie) an Kieselgel oder unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems, wie vorstehend beschrieben, jedoch im Mengenverhältnis von (30 : 10 : 1) und engt die vereinigten Eluate, die das Hauptprodukt enthalten, unter vermindertem Druck ein und gefriertrocknet das erhaltene wäßrige Gemisch zu einem Rückstand aus 3,2′,6′-Tri-N-acetyl-1-N-äthylsisomicin. Ausbeute 0,84 g. (70% der Theorie).

[α]+165° (c 0,8 in Wasser);
PMR (ppm) (D₂O): δ 1,05 (CH₂CH₃, J=7, O Hz); 1,17 (4′′-C-CH₃); 1,84, 1,9, 1,91 (N-Acetyle); 2,52 (3′′-N-CH₃); 4,80 (H-4′); 4,92 (H-1′′, J_{1′′,2′′} = 4,0 Hz); 5,4 (H-1′′, J_1′,2′ = 2,5 Hz);
Massenspektrum: (M⁺) m/e 601, (M+1)+m/e 602; ferner m/e 402, 392, 374, 160; 171, 453, 443, 425; 211 und 261.
Analyse: Berechnet für: C₂₇H₄₇N₅O₁₀ · 1,5 H₂O: C 51,58; H 8,02; N 11,14%. Gefunden: C 51,47 H 8,89; N 10,91%.

B. 1-N-Äthylsisomicin

Man gibt 0,1 g 3,2′,6′-Tri-N-acetyl-1-N-äthylsisomicin zu 10 ml 1 n-Natriumhydroxyd und erhitzt die Lösung unter einer Stickstoffatmosphäre auf die Rückflußtemperatur, bis die Analyse eines aliquoten Teils durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches von Chloroform, Methanol und Ammoniumhydroxyd (2 : 1 : 0,35) als Entwicklersystem anzeigt, daß die De-N-acetylierung im wesentlichen vollendet ist (etwa 48 Stunden). Man kühlt die Reaktionslösung, stellt das Volumen durch Zugabe von Wasser auf etwa 50 ml ein und rührt mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRC-50" in der Protonenform (das mit Wasser gewaschen worden ist), bis der pH-Wert etwa 5,5 erreicht. Man filtriert das Harz ab, wäscht mit Wasser und rührt das Harz etwa 30 Minuten mit 100 ml 7%igem wäßrigem Ammoniumhydroxyd, dekantiert die überstehende Lösung und wiederholt diese Maßnahmen zweimal unter Verwendung von je 50 ml 7%igem wäßrigem Ammoniumhydroxyd, worauf man das Harz abfiltriert. Man vereinigt das Ammoniumhydroxydfiltrat und die dekantierten Lösungen, engt unter vermindertem Druck ein und extrahiert den erhaltenen Rückstand mit Methanol. Man vereinigt die Methanolextrakte und engt unter vermindertem Druck ein, löst den erhaltenen Rückstand in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Ammoniumhydroxyd (2 : 1 : 0,35) und leitet die Lösung durch eine Aluminiumoxydsäule (8 g, 0,8 × 30 cm), wobei man mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Ammoniumhydroxyd eluiert. Man vereinigt die gleichen Eluate (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie) und dampft die vereinigten Eluate, die 1-N-Äthylsisomicin enthalten, ein und gefriergetrocknet das erhaltene wäßrige Gemisch zu einem Rückstand aus 1-N-Äthylsisomicin (71 mg, Ausbeute 90%).

C. Umwandlung von Sisomicin in 1-N-Äthylsisomicin ohne Reinigung der Zwischenprodukte 1) 3,2′,6′-Tri-N-acetylsisomicin

Man gibt 3 g (15 mMol) Kupfer(II)-acetathydrat unter Rühren zu einer Lösung von 0,447 g (1 mMol) Sisomicin in 5,33 ml Wasser und 18 ml Dimethylformamid. Man rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur und gibt dann tropfenweise mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Tropfen alle 3 Sekunden 3,1 ml einer 1molaren Lösung von Essigsäureanhydrid in Dimethylformamid (3,1 mMol) zu. Man rührt weitere 30 Minuten, gibt dann 10 ml Wasser zu und läßt Schwefelwasserstoff durch die Lösung perlen. Man rührt das Reaktionsgemisch 30 Minuten, filtriert das ausgefällte Kupfer(II)-sulfid durch eine Lage des Filterhilfsmittels "Celite®" ab. wäscht das als Rückstand erhaltene Kupfer(II)-sulfid mit Wasser und stellt das vereinigte Filtrat durch Rühren mit dem Ionenaustauscherharz "Amberlite® IRA-401S" in der Hydroxydform auf pH 9 ein. Man filtriert das Harz ab, wäscht mit Wasser und engt das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat auf einen Rückstand aus 3,2′,6′-Tri-N-acetylisomicin ein.

2) 3,2′,6′-Tri-N-acetyl-1-N-äthylisisomicin

Man löst das gemäß Verwendungsbeispiel 1C (1) erhaltene Produkt in 10 ml Wasser und stellt die Lösung mit 0,1 n-Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 2,7 ein. Man kühlt das Reaktionsgemisch auf etwa 3°C und gibt 0,73 ml einer 1molaren Lösung von Acetaldehyd in Tetrahydrofuran (0,73 mMol) und dann tropfenweise eine Lösung von 0,55 g Natriumcyanborhydrid in 0,7 ml Wasser zu. Man rührt eine Stunde, wobei man den pH-Wert der Lösung durch Zusatz von 0,1 n-Salzsäure bei etwa 2,7 hält, und gibt dann 0,15 ml einer 1 molaren Lösung von Acetaldehyd in Tetrahydrofuran (0,15 mMol) und anschließend eine Lösung von 12 mg Natriumcyanborhydrid in einigen Wassertropfen zu, wobei man den pH-Wert wieder bei 2,7 hält. Man wiederholt diese Behandlung zweimal unter Verwendung von je 0,7 ml einer 1molaren Lösung von Acetaldehyd in Tetrahydrofuran und 3 mg Cyanborhydrid. Man rührt über Nacht bei Raumtemperatur und stellt dann den pH-Wert der Lösung mit 1 n-Natriumhydroxyd auf etwa 9 ein. Man engt die Lösung unter vermindertem Druck auf einen Rückstand aus 3,2′,6′-Tri-N-acetyl-1-N-äthylsisomicin ein.

3) 1-N-Äthylsisomicin

Man löst das gemäß Verwendungsbeispiel 1C (2) hergestellte 3,2′,6′-Tri-N-acetyl-1-N-äthylisomicin in 60 ml 1 n-Natriumhydroxyd und erhitzt 48 Stunden am Rückflußkühler unter einer Stickstoffatmosphäre. Man kühlt und stellt das Reaktionsgemisch durch Zugabe des Ionenaustauscherharzes "Amberlite® IRC-50" in der Protonenform auf etwa 5,5 ein. Man filtriert das Harz ab und wäscht mit Wasser. Man rührt das Harz 30 Minuten mit 100 ml 7%iger wäßriger Ammoniumhydroxydlösung, dekantiert die Lösung und wiederholt diese Behandlung zweimal unter Verwendung von je 100 ml 7%igem Ammoniumhydroxyd und filtriert dann. Man vereinigt das Ammoniumhydroxydfiltrat mit den dekantierten Flüssigkeiten, dampft unter vermindertem Druck ein und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an einer Kieselgelsäule (25 g), wobei man mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Ammoniumhydroxid (2 : 1 : 0,34) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems, und engt die vereinigten Eluate, die 1-N-Äthylsisomicin enthalten, unter vermindertem Druck ein und gefriertrocknet das erhaltene wäßrige Gemisch zu einem Rückstand aus 1-N-Äthylsisomicin. Ausbeute 0,233 g (49% der Theorie).

Verwendungsbeispiel 2 Umwandlung von 3,2′,6′-Tri-N-acetylaminoglykosiden in 1-N-Äthylaminoglykoside A. 3,2′,6′-Tri-N-äthylverdamicin

Man löst 880 mg (1,5 mMol) 3,2′,6′-Tri-N-acetylverdamicin in 15 ml Wasser und stellt die Lösung mit 0,1 n-Salzsäure (etwa 28 ml) auf pH 2,7 ein. Man kühlt in einem Eisbad auf 8 bis 10°C und gibt dann unter Rühren wäßriges Acetaldehyd (4,1 ml, 0,37molares Acetaldehyd) in 2 Äquivalenten Wasser zu. Man rührt 5 Minuten bei 8°C, gibt dann tropfenweise eine Lösung von 182 mg (3 mMol, 2 Äquivalente) Natriumcyanborhydrid in 2,5 ml Wasser zu und stellt die Lösung mit 0,1 n-Salzsäure auf pH 2,7 ein. Man hält den pH-Wert durch Zusatz von 0,1 n-Salzsäure weiterhin bei etwa 2,7, bis die Reaktion beendet ist, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie. Man läßt das Reaktionsgemisch 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen, gefriertrocknet das Reaktionsgemisch und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an 90 g Kieselgel in einer Säule von 1,5 × 126 cm, wobei man mit Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (28%) (30 : 10 : 1) eluiert. Man vereinigt gleiche Fraktionen, die 3,2′,6′-Tri-N-acetyl-1-N-äthyl- verdamicin enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie). Man dampft die vereinigten Eluate unter vermindertem Druck auf einen Rückstand aus 3,2′,6′-Tri- N-acetyl-1-N-äthylverdamicin ein. Ausbeute 550 mg (0,84 mMol, 56% der Theorie). Massenspektrum: m/e 485, 467, 457, 439, 420, 402, 392, 374, 261, 243, 233, 215, 183.

B. 1-N-Äthylverdamicin

Man behandelt 200 mg (0,304 mMol) 3,2′,6′-Tri-N-acetyl- 1-N-äthylverdamicin mit 20 ml 1 n-Natriumhydroxyd bei der Rückflußtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre und isoliert und reinigt das gebildete Produkt auf die in Beispiel 13B beschriebene Weise, wobei man 1-N-Äthylverdamicin in einer Ausbeute von 88 mg (59% der Theorie) erhält.

Verwendungsbeispiel 3 Umwandlung von 3,6′-Di-N-acylsubstituierten Aminoglykosiden in die entsprechenden 3,6′-Di-N-unsubst.-1-N-alkyl- aminoglykoside Umwandlung von 3,6′-Di-N-t-butoxycarbonylgentamicin B in 1-N-Äthylgentamicin B

Zu einer gerührten Lösung von 1,36 g-Di-N-t-butoxycarbonylgentamicin B in 15 ml Wasser gibt man 2 ml einer 1molaren Lösung von Acetaldehyd in Tetrahydrofuran. Man stellt die Lösung mit 0,1 n-Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 4,9 ein, gibt 0,2 g Natriumcyanborhydrid zu und stellt den pH-Wert periodisch auf etwa 4,9 ein. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, dampft dann die Lösung zur Trockne ein, gibt 10 ml Trifluoressigsäure zum erhaltenen Rückstand und läßt 5 Minuten stehen. Man gießt die Reaktionslösung in Äther, isoliert die hierbei gebildete Fällung durch Filtration und wäscht mit Äther. Man chromatographiert die Fällung an 100 g Kieselgel unter Verwendung von Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxyd (3 : 4 : 2) als Lösungsmittelgemisch. Man vereinigt gleiche Fraktionen, die 1-N-Äthylgentamicin B enthalten (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie), dampft unter vermindertem Druck ein, löst den erhaltenen Rückstand in Wasser und gefriergetrocknet. Ausbeute 40% der Theorie.

[α]+126,2° (c 1 in Wasser);
PMR (ppm) (D₂O): δ 5,55 (H-1′,J_1′,2′ = 3,0 Hz); 5,505 (H-1′′, J_1′,2′ = 4 Hz); 2,9 (3′′-N-CH₃); 1,05-1,5 (2 C-CH₃); Massenspektrum: [M+1]⁺ 511; ferner m/e 380, 352, 334; 378, 350, 332; 219, 191, 173.
Analyse: Berechnet für C₂₁H₄₂O₁₀N₄ · 2 CO₂3 H₂O; C 42, 33; H 7,41; N 8,58%. Gefunden: C 42,37; H 7,43; N 8,81.

Claims

1.In den Stellungen 3, 2′ und 6′ selektiv blockiertes 4,6-Di-O-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, ausgewählt aus 3,2′,6′-Tri-N-Y-sisomicin,
3,2′,6′-Tri-N-Y-verdamicin,
3,2′,6′-Tri-N-Y-tobramycin,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C₁,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C_1a,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C₂,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C_2a,
3,2′,6′-Tri-N-Y-gentamicin C_2b,
3,2′,6′-Tri-N-Y-Antibiotikum G-52,
3,2′,6′-Tri-N-Y-kanamycin B,
3,2′,6′-Tri-N-Y-3′,4′-didesoxykanamycin B und
3,2′,6′-Tri-N-Y-3′,4′-didesoxy-3′,4′-dehydrokanamycin B,worin Y eine Acyl-Gruppe ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Y Acetyl, 2,2,2-Trichloroethoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl ist.

3. In den Stellungen 3 und 6′ selektiv blockiertes 4,6-Di-O-(aminoglycosil)-1,3-diaminocyclitol, ausgewählt aus 3,6′-Di-N-Y-gentamicin B,
3,6′-Di-N-Y-gentamicin B₁,
3,6′-Di-N-Y-kanamycin A und
3,6′-Di-N-Y-6′-N-methylkanamycin A,worin Y eine Acyl-Gruppe ist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Y Acetyl, tert-Butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl und 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl ist.

5. In den Stellungen 2′ und 6′ selektiv blockiertes 4,6-Di-O-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, ausgewählt aus 2′,6′-Di-N-Y-sisomicin,
2′,6′-Di-N-Y-verdamicin,
2′,6′-Di-N-Y-tobramycin,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C₁,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C_1a,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C₂,
2′,6′-Di-N-Y-gentamicin C_2a,
2′,6′-Di-N-Y-Antibiotikum G-52,
2′,6′-Di-N-Y-3′,4′-didesoxykanamycin B und
2′,6′-Di-Y-3′,4′-didesoxy-3′,4′-dehydrokanamycin B,worin Y eine Acyl-Gruppe ist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Y 2,2,2-Trichloroethoxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl ist.