DE2460903B2 - Neue 33'^3'Tetraalkylbenzidine - Google Patents

Neue 33'^3'Tetraalkylbenzidine

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Walter Dr.Rer.Nat. 6940 Weinheim Vogel
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Description

Die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Oxidationsindikatoren unter Katalyse durch Peroxidase oder peroxidatisch wirksame Stoffe zu farbigen Verbindungen spielt in der analytischen Chemie eine besondere Rolle, weil sie außer dem Nachweis von Wasserstoffperoxid und Peroxidasen auch die Bestimmung einer Reihe von Stoffen gestattet, die mit Sauerstoff und einer Oxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren. Im folgenden seien als Beispiele einige dieser Stoffe und in Klammern die entsprechenden Oxidasen aufgezählt: Glucose (Glucoseoxidase), Galactose (Galactoseoxidase), L-Aminosäure (L-AminosSureoxidase), Cholesterin (Choiesterinoxidase) und Harnsäure (Uricase). Es sind dies vor allem Stoffe, deren Nachweis und Bestimmung in der medizinischen Diagnostik und in der Lebensmittelchemie von großer Bedeutung sind.
Als Nachweisreaktion für Peroxidasen kommt die Methode insbesondere für die Bestimmung von Hämoglobin in Frage, wobei man auch anstelle von Wasserstoffperoxid organische Hydroperoxide als Oxidationsmittel verwenden kann.
Gemäß ihrer großen Bedeutung in der medizinischen Schnelldiagnostik sind für fast alle der oben genannten Reaktionen sogenannte Schnellteste beschrieben, die eine qualitative oder quantitative Bestimmung einzelner Reaktionskomponenten ermöglichen. Dabei werden saugfähige Träger oder Filme verwendet, die alle Reagenzien enthalten und bei denen nach dem Kontakt mit der Untersuchungsflüssigkeit die Farbreaktion abläuft, wenn die fragliche Substanz anwesend ist. Die gebildete Farbe wird mit Hilfe von Farbvergleichstafeln beurteilt oder an Remissionsphotometern gemessen, so daß aus der Farbintensität auf eine Konzentration der reagierenden Substanz geschlossen werden kann.
Als Oxidationsindikatoren für diese Schnellteste sind eine Reihe von Verbindungen in der Literatur und in Patenten beschrieben, jedoch haben sich in der Praxis nur wenige durchgesetzt. Es handelt sich hierbei fast ausschließlich um Verbindungen der Benzidinreihe und zwar von diesen wiederum insbesondere um o-Tolidin. Trotz der weiten Verbreitung dieses Indikators und seiner unzweifelhaften Vorteile gegenüber den anderen bekannten Indikatoren hat o-Tolidin jedoch auch Nachteile. Zum einen ist die Substanz in den Rezepturen für die Schnellteste nicht immer optimal haltbar, was zu unerwünscht? Verfärbungen und Empfindlichkeitseinbußen bei längerer Lagerung führen kann. Zum anderen ist das bei der Indikator-Reaktion entstehende blaugrüne Radikalkation nicht sehr stabil, da es relativ leicht unter Weiteroxidation in das braune Chinodiimin übergeht Die Reaktionsfarben haben daher durch die braune Nebenfärbung z. T. einen schmutzigen Charakter, zudem verändern sie sich rasch und sind daher meist schon kurz nach der vorgeschriebenen Ablesezeit nicht mehr richtig auswertbar. Bei Serienanalysen und für die Dokumentation ist dies ein entscheidender Nachteil. Man kann zwar das Radikalkation mit anionischen Netzmitteln in gewissem Umfang stabilisieren, diese sind jedoch nicht immer anwendbar, da sie auf die Oxidasen für die Primärreaktion destabilisierend wirken können.
Es stellte sich deshalb die Aufgabe, neue Oxidations-Indikatoren für Schnellteste zu finden, die die vorstehenden Nachteile nicht aufweisen.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß man Schnellteste der obigen Art erhält die haltbarer sind und die stabilere Farbstoffradikale liefern, wenn man anstelle von o-Tolidin die neuen 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine der allgemeinen Formel I
H2N
NH2
in der Ri und R2 eine i.-Propylgruppe oder Ri eine Methyl- und R2 eine Äthylgruppe bedeutet verwendet.
Die erfindungsgemäßen Oxidationsindikatoren der allgemeinen Formel I sind neu und können insbesondere in Schnelltesten zum Nachweis und zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, Substanzen, die unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren, und peroxidatisch wirksamen Substanzen verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen, die denen der Formel I analog sind, sind bekannt (DE-AS 14 95 705), jedoch sind bisher lediglich 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (V. R. Holland et al., Tetrahedron 30, 3299-3302 [1974] und 3,3',5,5'-Tetraäthylbenzidin [R. Stroh et al., Angew. Chem. 69, 124-131 [1957]) näher charakterisiert. Besonders vorteilhaft lassen sich diese Verbindungen durch Umlagerung der entsprechenden Hydrazobenzolverbindungen oder durch Kondensation von o-Tolidin mit Äthylen bzw. Benzidin mit Propylen herstellen. Von V. R. Holland et al. ist in der genannten Arbeit ferner beschrieben, daß 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin zum Nachweis von okkultem Blut im Stuhl und Harn im Küvettentest geeignet ist, wobei als Vorteil gegenüber o-Tolidin die geringere Cancerogenität hervorgehoben wird. Auf Grund des hohen Substanzpreises hat sich dieser Test in der Praxis jedoch nicht durchgesetzt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind auch von den Ansprüchen und der allgemeinen Beschreibung des Can. Pat. Nr. 8 18 344 mitumfaßt, welches Schnellteste zum Halogenid- bzw. Pseudohalogenid-Nachweis in Körperflüssigkeiten beschreibt Diese Schnellteste enthalten noch Kupfer-(ll)-Verbindungen, welche mit den Halogeniden unter Bildung von
Kupfer-(I)-halogeniden und freien Halogenen reagieren, die ihrerseits die Benzidin-Verbindungen oxidierea Die Oxidation führt offenbar zu den gleichen farbigen Radikalkationen wie die peroxidase-katalysierte Oxidation mit Hydroperoxiden. In dem genannten Patent wird von den zahlreichen beanspruchten Benzidin-Abkömmlingen o-Tolidin (33'-Dimethylbenzidin) bevorzugt 33'5^'-Tetraalkylbenzidine und insbesondere die Verbindungen der Formel I sind in dieser Publikation nicht bespielhaft beschrieben, so daß auch ihre vorteilhaftere Verwendung gegenüber o-Tolidin daraus nicht hergeleitet werden kann.
Die größere Stabilität der Verbindungen der allgemeinen Formel I und ihrer Radikalkationen ist weiterhin insofern überraschend, als der elektronendrückende Einfluß der zusätzlichen Alkylgruppen eher eine gesteigerte Oxidierbarkeit und damit eine WeiterreaH-tion zum braunen Chinondiimin hätte erwarten lassen.
Die erfindungsgemäßen Tetraalkylbenzidine können in allen Fällen eingesetzt werden, in denen bisher o-Tolidin verwendet wurde, wobei, die bekannten Rezepturen entsprechend modifiziert werden. Gegebenenfalls können zur Farbstabilisierung verwendete anionische Netzmittel durch weniger aktive ersetzt oder ganz weggelassen werden. So können die Tetraalkylbenzidine beispielsweise verwendet werden in Testpapieren zum Nachweis von Glucose im Harn, von Blut im Harn, von Cholesterin im Serum, Wasserstoffperoxid in Milch oder in Testfilmen zur Bestimmung von Glucose in Blut und Serum und in vielen anderen Testen. Alie diese Teste zeichnen sich dadurch aus, daß die Farbreaktionen leuchtender, stabiler und z.T. besser abgestuft sind als bei der Verwendung von o-Tolidin, da die blaugrünen bis grünen Färbungen der Radikalkationen der Tetraalkylbenzidine nicht durch Anteile der braunen Chinondiimine »verschmutzt« sind.
Bei den in den folgenden Beispielen beschriebenen Schnelltcsten treten die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Tetraalkylbenzidine besonders hervor, wobei einzelne Vertreter der Verbindungsklasse gegebenenfalls noch besonders vorteilhafte Wirkungen haben können: So zeigt sich die gesteigerte Haltbarkeit der Tetraalkylbenzidine gemäß Formel I gegenüber o-Tolidin insbesondere bei der Lagerung von Testpapieren zum Nachweis von Blut im Harn. Die gesteigerte Stabilität der Radikalkationen führt bei den Testfilmen zur Glucosebestimmung dazu, daß die Messung in einem relativ langen Zeitraum vorgenommen werden kann. Die Verwendung der Tetraalkylbenzidine beim Harnglucose-Test führt zu Testpapieren, bei denen die Reaktionsfarbe tagelang nahezu unverändert bleibt, was für Früherkennungsaktionen, bei denen die Probanden die benutzten Teststreifen an eine zentrale Auswertungsstelle senden, von besonderer Bedeutung ist.
An den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden:
Beispiel 1
3,3'-Dimethyl-5,5'-diäthylbenzidin
Variante I
In einem 2-l-Dreihalskolben mit Rührer und Tropftrichter und Thermometer suspendiert man 96,5 g (0,564 Mol) 2-Methyl-6-äthyl-anilin-hydrochIorid in einer Mischung von 79,5 ml konzentrierter Salzsäure fei= 1,18) und 330 ml Wasser und tropft unter guter Eiskühlung bei 0 bis 3°C eine Lösung von 39 g Natriumnitrit in 150 ml Wasser unter Rühren innerhalb 30 Minuten zu.
Man rührt dann noch ca. 1 Stunde bei 0 bis 3° C nach und verdünnt die Diazonijmsalzlösung durch Zugabe von 600 ml Eiswasser.
In der Zwischenzeit werden in einem δ-1-Dreihalskolben mit Rührer Tropftrichter und Thermometer (Y-Stück) 210 g Kupfer-(Il)-sulfat in 900 ml Wasser gelöst und mit 363 ml konzentriertem Ammoniak fy=0,88) versetzt Dann löst man 90 g Hydroxylammoniumchlorid in 150 ml Wasser und tropft unter
ίο Eiskühlung eine Lösung von 95 g Kaliumhydroxid in 72 ml Wasser zu. Diese gut gekühlte Lösung gibt man bei 10 bis 15° C unter Stickstoff innerhalb 15 Minuten zu der gerührten Kupfertetraaminlösung, wobei ein hellblauer Kupfer-I-salzkomplex gebildet wird. Unter Eiskühlung, kräftigem Rühren und unter Stickstoff wird nun bei 12 bis 15° C innerhalb von 1,5 Stunden die gekühlte Diazoniumsalzlösung zugetropft (Tropftrichter mit Einleitungsrohr versehen, das mit U-förmiger Biegung unter die Oberfläche der Kupfersalzlösung reicht). Nach beendeter Zugabe wird eine Stunde nachgerührt, danach schüttelt man die Reaktionslösung mit 4 χ 200 ml Äther aus. D: 2 vereinigten Ätherextrakte werden 3 χ 50 ml 25% Natronlauge, 2 χ 100 ml Wasser, 3 χ 100 ml 2 N-Salzsäure und 2 χ 100 ml Wasser durch-
r> geschüttelt. Man erhält 55,4 g Azoverbindung als rotes öl. Die chromatografische Trennung an einer Kieselgclsäule (Füllhöhe 100 cm, Säulendurchmesser 4,8 cm) mit Chloroform-Ligroin 1:4 (Kieselgelmenge 1,5 kg, 0 0,063—0,2 mm) gibt 33,7 g reines 2,2'-Dimethyl-6,6'-
)i) diälhylazobenzol als rotes öl. Man löst dieses in 1,61 Diäthyläther, gibt 330 ml Äthanol dazu, dann eine Lösung von 135 g Ammonchlorid in 1,51 Wasser und fügt unter kräftigem Rühren portionsweise bei 22° C 300 g Zinkstaub zu. Nach 5stündigem Rühren ist die
r> Reduktion beendet. Man trennt die fast völlig entfärbte, organische Phase ab und schüttelt die wäßrige Schicht dreimal mit je 250 ml Äther nach. Die vereinigten Ätherextrakte werden dann mit 210 ml 3 N-Schwefelsäure versetzt und gerührt. Dabei bildet sich das Sulfat als farblose, zunächst klebrige Fällung. Nach Zugabe von 200 ml Äthanol erhält man 30,5 g 3,3'-Dimethyl-5,5'-diäthylbenzidinsulfat als farblose Kristalle. Man trägt dieses Produkt in 150 ml siedend heißes Wasser ein, kühlt unter Rühren auf Zimmertemperatur, versetzt mit 200 ml 2 N-Natronlauge und extrahiert mit 4 χ 100 ml Chloroform. Die vereinigten Chloroformextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Rückstand 25,5 g hellbraune Kristalle. Dieses Rohprodukt wird aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Man erhält 23 g= 15,2% beigefarbene Kristalle, Schmp. 69 bis 700C.
Das Dihydrochlorid (Ci8H24N2 · 2 HCl) schmilzt bei 289 bis 29 Γ C (Zersetzung).
Variante II
1,5 g Aluminium und 0,1 g Quecksilberchlorid werden mit 75 g Anilin im Autoklaven auf 3000C erhitzt, wobei sich das Aluminium unter Wasserstoff-Entwicklung auflöst. Nach dem Erkalten werden 92 g o-Tolidin und 4,5 g wasserfreies Aluminiumchlorid zugegeben. Danach wird auf 280 bis 3000C hochgeheizt und Äthylen von 200 atm. aufgepreßt. Nach ca. 3 Stunden ist die Äthylenaufnahme beendet. Danach wird abgekühlt und die Reaktionsmasse mit verdünnter Natronlauge ausgebt schüttelt. Aus der organischen Phase werden im Vakuum 2-Äthylanilin und 2,6-Diäthylariilin abdestilliert (bis ca. 120°/10mm).
Der Rückstand wird mehrfach aus verdünnter
Salzsäure umkristallisiert. Man erhält das Dihydrochlorid des W-Dimethyl-S^'-diäthylbenzidins.
Schmp. 288 bis 292° C (Zersetzung).
Beispiel 2
3,3',5,5'-Tetraisoprop) ibenzidin
Eine Lösung von 100 g 2,6-Diisopropylanilin in 1280 ml Wasser und 102 ml konzentrierter Satzsäure (d= 1,18) wird auf 900C erwärmt und rasch zu einer 97°C heflien Lösung aus Kaliumhexacyanoferrat-(Ill) in 5100 rnl Wasser und 143 g Natriumhydroxid getropft. Wegen der auftretenden freien Blausäure wird unter einem gut ziehenden Abzug gearbeitet Die entstehende, rotgefärbte Suspension wird 15 Minuten nachgerührt, abgekühlt und mit 6 χ 300 ml Äther ausgeschüttelt. Die Ätherextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, abgesaugt und eingeengt. Man erhält 97 g Azoverbindung als rotes Öl. Die chromatografische Trennung an einer Kieselgelsäule (Füllhöhe 110 cm, Säulendurchmesser 8 cm) mit Chloroform-Ligroin 1 :4 (Kieselgelmenge 1,5 kg, 0 0.05-0.2 mm) gibt 32.45 g ziegelrote Kristalle, Schmp. 134 bis 1360C.
Die Azoverbindung wird in 500 ml Eisessig gelöst. 150 g Zinkstaub zugegeben und 30 Minuten unter Rühren unter Rückfluß erhitzt. Danach wird der überschüssige Zinkstaub abgesaugt und das Lösungsmittel im Vakuum eingeengt. Man erhält 17.5 g farblose Kristalle, diese rührt man mit 150 ml Wasser an, gibt 150 ml 2 N-Natronlauge zu und schüttelt dreimal mit je 150 ml Chloroform durch. Dabei erhält man 12.4 g rohes 3,3',5,5'-Tetraisopropylbenzidin; dieses wird mit 90 ml Acetanhydrid versetzt, kurz aufgekocht und das überschüssige Acetanhydrid am Rotationsdampfer eingeengt. Man löst den Rückstand in 20 ml Isopropanol, gibt 180 ml Ligroin zu und saugt die gebildeten Kristalle ab. Die erhaltene N,N'-Diacetylverbindung wird nochmals aus Isopropanol-Ligroin 2 :1 umkristallisiert. Man isoliert 7,6 g farblose Kristalle, Schmp. 366° C. Diese werden zur Abspaltung der N-Acetylgruppen in einem Gemisch von 180 ml Eisessig und 50 ml konzentrierter Salzsäure im Autoklaven 6 Stunden auf 130 bis 1400C erhitzt.
Danach wird die Reaktionslösung eingeengt, der Rückstand mit 200 ml 2 N-Natronlauge versetzt und die in Freiheit gesetzte Base mit 4 χ 50 ml Chloroform extrahiert. Man trocknet die Chloroformextrakte über Natriumsulfat, saugt ab und engt ein. Dabei wird 3,3',5,5'-Tetraisopropylbenzidin als bräunliches Öl erhalten.
Ausbeute 5,6 g (Mol-Gew. 352).
Das Dihydrochlorid (C24H36N2 ■ 2 HCI) schmilzt bei 263 bis 265° C (Zersetzung).
Beispiel 3
Testpapier zum Nachweis von Blut im Harn
2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid (ca. 70%ig)
Phosphorsäuretrimorpholid
Äthanol
Dest. Wasser
Lösung2
ad
lZ7g
30,0 ml
100,0 ml
33'-Diäthyl-5.5'-dimethyI- ad 0.3 g
benzidin oder 3,3\5.5'-Tetraiso- 0.2 g
propylbenzidin 100,0 ml
Phenanthridin
Toluol
K)
Man erhält ein weißes Testpapier, welches sich beim Eintauchen in bluthaltigen Urin nach ca. 20 bis 30 Sekunden blaugrün bzw. grün verfärbt. Sind die Erythrozyten intakt, so sind die Papiere grün gesprenkelt. Ist Hämolyse eingetreten, oder befindet sich von vornherein freies Hämoglobin im Urin, so werden die
-'ι' Papiere gleichmäßig grün gefärbt. Die Empfindlichkeit liegt bei ca. 5 Erythrozyten/mm3 oder der entsprechenden Menge Hämoglobin. Eine niedrige Zahl intakter Erythrozyten kann unter Umständen noch einzelne grüne Punkte auf dem Testpapier hervorrufen. Die
-' Empfindlichkeit gegenüber Myoglobin entspricht der von Hämoglobin.
Nach dreitägiger Temperaturbelastung bei 60°C sind die Testpapiere ganz schwach gelblich gefärbt, ihre Empfindlichkeit ist im wesentlichen gleich geblieben.
i» lediglich die Reaktionszeiten haben sich auf ca. 60 bis 90 Sekunden verlängert. Ein Testpapier der gleichen Zusammensetzung mit o-Tolidin anstelle von Tetraalkylbenzidin ist nach der gleichen Belastung gelbbraun verfärbt, die Empfindlichkeit liegt etwa bei 20
r> Erythrozyten/mm3.
Beispiel 4
Testpapier zum Nachweis von Glucose im Harn
Filterpapier (Schleicher und Schüll 597 NF) wird mit ""' Lösungen folgender Zusammensetzung getränkt und bei 50°C getrocknet:
55
Lösung 1 Lösung 2 ad 222 mg
Glucoseoy.idase (70 U/mg) 3,3'-Diäthyl-5,5'-dimethyl- 28 mg
Peroxidase(70U/mg) benzidin
Morpholinäthanolsulfonat- Puffer Äthanol 50 ml
(pH 6,1,0 m) ad 80 mg
TTartrazin 300 mg
Polyvinylpyrrolidin 100 ml
Wasser, dest.
600 mg
100 ml
Filterpapier (Schleicher und Schüll Nr. 23SL) wird nacheinander mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 4O0C getrocknet:
Lösung
1,2molarer Citratpuffer vom
pH 5,25
Äthylendiamintetraessigsäure,
Dinatriumsalz
DioctylnatriumsulFosuccii/at
Auf die gleiche Weise werden Testpapiere hergestellt, die äquimolare Mengen o-Tolidin enthalten. Die Reaktionsfarben dieser Testpapiere mit glucosehaltigen bo Harnen ca. 60 bis 120 see. nach dem Eintauchen sind in untenstehender Tabelle zusammengefaßt. Die Farben mit 3,3'-Diäthyl-5,5'-dimethylbenzidin verblassen beim Trocknen geringfügig ohne den Farbwert zu ändern und sind dann über Tage stabil. Die mit o-Tolidin erhaltenen 35,0 ml b5 Farben beginnen schon nach 5 bis 10 Min. zu vergilben und zu verblassen und sind nach dem Trocknen in ca. 2 0,1 g bis 4 Std. je nach Glucosekonzentration ganz verblaßt
0.5 g oder schwach olivbraun.
mg % Glucose o-Tolidin 3,3'-Diäthyl-5,5'-
climclliylbenzidin
0 gelb gelb
50 hellgrün hellgrün
100 grün mittclgrün
250 blaugrün grün
500 grünblau dunkelgrün
1000 olivschwarz tief grün

Claims (2)

  1. Patentansprüche:
    1. Tetraalkylbenzidine der allgemeinen Formel 1
    H,N
    NH2
    in der Ri und R2 eine i.-Propylgruppe oder Ri eine Methyl- und R2 eine Äthylgruppe bedeutet
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise entweder die entsprechende Hydrazobenzolverbindung umlagert oder o-ToIidin bzw. Benzidin mit Äthylen bzw. Propylen kondensiert
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