DE2640211B2

DE2640211B2 - Prufmittel zum Nachweis peroxidativ wirksamer Substanzen

Info

Publication number: DE2640211B2
Application number: DE2640211A
Authority: DE
Inventors: Charles Tak Wai Lam; Raymond L. Mast
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-09-08
Filing date: 1976-09-07
Publication date: 1978-11-09
Also published as: JPS5831873B2; JPS5233594A; CA1052243A; US3986833A; FR2323148B1; DE2640211C3; JPS57172253A; FR2323148A1; GB1527030A; DE2640211A1

Description

in der Ri ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkyl-, Hydroxy- oder Thiophenylgruppe, R2 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe, R3 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Carboxy-, niedere Alkyl- oder niedere Alkoxygruppe und R5 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist, als Verstärkungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das Verstärkungsmittel als wasserlösliches Säureadditionssalz oder Addukt einer Mineralsäure oder einer organischen Säure vorhanden ist.

Der Nachweis kleiner Mengen peroxidativ wirksamer Substanzen, wie okkultem Blut, Hämoglobin, Myoglobin, Leukozyten und Bakterien usw. in Körperflüssigkeiten und Exkrementen wurde seit langem als unerläßliche Hilfe für den medizinischen Praktiker zur Diagnose verschiedener krankhafter (abnormer) Zustände angesehen. Zum Beispiel findet sich Blut im Mageninhalt, im Erbrochenen, im Urin und im Stuhl bei Krankheitszuständen, die oft verbunden sind mit einer Erosion der Schleimhautmembranen des Magens und Darms. Im Urin kann das Vorhandensein peroxidativ wirksamer Substanzen ein Zeichen für Erkrankungen wie Typhus, Skorbut, Purpura, Pyämie, Nephritis, Verbrennungen dritten Grades, karzinogene Zustände, Erkrankungen und Infektionen des Harnsystems, hämolytische Toxine und Zustände nach einem Herzinfarkt sein. Da peroxidative Substanzen üblicherweise in Körperflüssigkeiten und Exkrementen nicht in makroskopischen Mengen vorhanden sind, ist es häufig schwierig, das Vorhandensein dieser Substanzen nur durch klinische Verfahren allein schnell nachzuweisen, selbst durch mikroskopische Untersuchung. Daher wird es als äußerst wünschenswert angesehen, einen empfindlichen, schnellen und zuverlässigen Test für derartige Substanzen zur Verfügung zu haben.

In der Literatur sind verschiedene Verfahren, Mittel und Vorrichtungen zum Nachweis von okkulten, peroxidativ wirksamen Substanzen beschrieben. Zum Beispiel sind in den US-PS 22 90436, 27 99 660, 28 38 377,30 12 976,30 92 463 und 30 92 464 verschiedene Prüfmittel beschrieben, die angewandt wurden, um einen einfachen und zuverlässigen Test für okkultes Blut zu ermöglichen. Diese Prüfmittel beruhen auf der peroxidativen oder katalytischen Aktivität d,er prosthetischen Gruppe, die im Blut vorhanden ist Die peroxidativ wirksamen Substanzen, die in Hämoglobin identifiziert worden sind, gehören zu der allgemeinen Gruppe der Hämoproteine, konjugierte Proteine, die alle die gleiche prosthetische Gruppe besitzen, nämlich Eisenprotoporphyrin oder Harn. Diese prosthetische Gruppe besitzt die Fähigkeit, die Übertragung von Sauerstoff von einer Sauerstoffquelle an einen Akzeptor zu katalysieren, der oxidiert wird. Wenn der Akzeptor eine Farbstoffvorstufe ist, die bis sie oxidiert wird farblos und in der oxidierten Form gefärbt ist, wird das Vorhandensein einer peroxiiativ wirksamen Substanz durch die Farbentwicklung angezeigt Die Schnelligkeit der Farbänderung und die Tiefe oder Intensität der Farbe ist, wenn sie mit einer Reihe von Standards verglichen wird, dann ein Maß für die quantitative Abschätzung des vorhandenen Blutes.

2^r) Obwohl die oben beschriebenen Mittel geeignet sind zum schnellen Nachweis von okkultem Blut, sind sie verhältnismäßig unempfindlich besonders gegenüber sehr geringen Mengen von peroxidativ wirksamen Substanzen, entsprechend Blutverdünnungen von weniger als etwa 1 :20 000, d. h. ungefähr 200 bis 300 intakten roten Blutkörperchen pro μΐ Probe (RBC/μΙ). In der US-PS 32 90 117 ist angegeben, daß die Empfindlichkeit dieser Prüfmittel zum Nachweis von okkultem Blut deutlich verbessert und potenziert werden kann durch

Γ) Zugabe von Chinolin oder bestimmten Chinolinderivaten, wie Chinin. Durch Zugabe dieser Chinolinderivate zu den bekannten Mitteln zur Bestimmung von okkultem Blut ist es möglich, 5 bis 50 RBC/μΙ Probe nachzuweisen entsprechend einer so hohen Blutverdün-

4(i nung wie 1 :1 000 000. In der US-PS 38 53 472 ist die Verwendung kondensierter polycyclischer Derivate von Chinolin als Potentierungs- oder Aktivierungsmittel unter Erreichung ähnlicher Empfindlichkeiten angegeben.

Viele der bekannten empfindlichen Prüf mittel sind aufgrund der Flüchtigkeit der zugesetzten Verstärkungsmittel bei Raumtemperatur oder leicht darüber liegenden Temperaturen instabil. Außerdem werden bei nahezu allen bekannten Mitteln Verstärkungsmittel

^r>o angewandt, die in Wasser unlöslich sind und in organischen Lösungsmitteln suspendiert werden müssen, bevor sie in ein Prüfmittel eingebaut werden. Zum Beispiel werden nach der US-PS 32 90 117 die bekannten Verstärkungsmittel in einem organischen

)^r> Lösungsmittel, enthaltend die Indikatoren, suspendiert bzw. gelöst. Dadurch werden die Indikatoren in Gegenwart dieser Verstärkungsmittel häufig schnell verfärbt und müssen verworfen werden.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Prüfmittel zur

bo Verfügung zu stellen, die nicht nur schnelle Ergebnisse liefern und sehr empfindlich sind, sondern auch ihre Empfindlichkeit, ohne daß eine Verfärbung des Indikatorsystems eintritt, sowohl bei der Herstellung als auch bei längerer Lagerung, beibehalten.

b^r> Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Prüfmittel zum Nachweis peroxidativ wirksamer Substanzen in Körperflüssigkeiten, Exkrementen und ähnlichem, insbesondere zum Nachweis bzw. zur

Bestimmung von okkultem Blut, bestehend aus einem Indikator, der in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz unter Eintritt einer Farbänderung oxidiert wird, einem Oxidationsmittel, das den Indikator oxidieren kann und einem Chinolinderivat der allgemeinen Formel

in der Ri ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkyl-, Hydroxy- oder Thiophenylgruppe, R2 ei.i Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe, R3 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe, R₄ ein Wasserstoffatom, eine Carboxy-, niedere Alkyl- oder niedere Alkoxygruppe und R5 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist, als Verstärkungsmittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Verstärkungsmittel als wasserlösliches Säureadditionssalz oder Addukt einer Mineralsäure oder einer organischen Säure vorhanden ist Der Ausdruck »niedere« bezeichnet Gruppen, die bis zu 4 Kohlenstoffatome enthalten.

Da die erfindungsgemäß zu verwendenden Verstärkungsmittel, d. h. die Säureadditionssalze bzw. Addukte von bestimmten Chinolinen wasserlöslich sind, kann die Herstellung des Prüfmittels in zwei Stufen erfolgen, wobei, wie in Beispiel 1 ausführlich gezeigt, in der ersten Stufe zunächst die Matrix mit einer wäßrigen Lösung, welche das Verstärkungsmittel enthält, imprägniert und erst in einer zweiten Stufe eine zweite und diesmal organische Imprägnierlösung, die den Indikator enthält, aufgebracht wird. Dadurch werden eine unerwünschte Verfärbung des Indikators bei der Herstellung und damit verbundene Ungenauigkeiten bei der Anwendung mit Sicherheit und auf einfache Weise vermieden. Außerdem sind die erfindungsgemäßen Prüfmittel besser lagerbeständig als die bekannten.

Die Verbindungen, die sich erfindungsgemäß als geeignet erwiesen haben, umfassen die Säure-Salze oder Addukte der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit den meisten Mineralsäuren oder organischen Säuren, vorausgesetzt, daß die Säure mit den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) unter Bildung eines Produktes, d. h. des wasserlöslichen Säure-Salzes oder Adduktes reagieren kann. Geeignete Mineralsäuren, die ein Addukt bilden können, sind unter anderem Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und ähnliche. Geeignete organische Säuren sind unter anderem Zitronensäure, Malonsäure, Sulfosalicylsäure, Weinsäure und ähnliche. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), die für die erfindungsgemäßen Mittel besonders geeignet sind, umfassen die Säure-Salze oder Addukte von in 4-, 6- oder 7-Stellung substituiertem Chinolin. Geeignete Mittel enthalten z. B. die Säuresalze oder Addukte von Chinolin, 6-Methoxychinolin, 6-Methylchinolin, 7-Methylchinolin, 2,6-Dimethylchinolin und 4,6-Dimethylchinolin. Bevorzugte Mittel enthalten die sauren Salze oder Addukte von Chinolin selbst und 6-Methoxychinolin. Andere geeignete Verbindungen sind Chinolinsulfat, 6-Methoxychinolinsulfat, 6-Methoxychinolinhydrochlorid, 6-Methoxychinolinphosphat, 6-Methoxychinolinmalonat, 6-Methoxychinolinsulfosalicylsäuresalz und 6-Methoxychinolinweinsäuresalz.

Die oben beschriebenen Säure-Salze sind entweder im Handel erhältlich oder können leicht ijus im Handel erhältlichen Substanzen hergestellt werden. Zum Beispiel können die Säure-Salze oder Addukte bequem hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einem organischen Lösungsmittel, wie Äthanol, suspendiert und dazu eine

ίο ausreichende Menge einer der oben erwähnten Mineralsäuren oder organischen Säuren zusetzt Es entsteht nahezu sofort ein starker Niederschlag des Säuresalzes oder Addukts. Der Niederschlag wird dann von dem organischen Lösungsmittel abgetrennt, wieder

is in neuem Lösungsmittel suspendiert, um überschüssige Säure auszuwaschen, erneut abgetrennt und getrocknet Die so hergestellten Säuresalze oder Addukte können leicht durch übliche Verfahren identifiziert werden und ihre scharfen Schmelzpunkte zeigen, daß sie ohne weitere Reinigung verwendet werden können.

Die Prüfmittel, die durch Zusatz der oben beschriebenen Säuresalze oder Addukte verbessert werden können, enthalten mindestens einen Indikator und ein Oxidationsmittel und können in Tablettenform oder in Form eines Prüfmittels, umfassend einen Träger oder eine Matrix, wie eine absorbierende Matrix, hergestellt werden. Geeignete Indikatoren sind solche, die in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz unter Eintritt einer Farbänderung oxidiert werden können, und umfassen bekannte Substanzen wie o-Tolidin, o-Toluidin, p-Toluidin, o-Phenylendiamin, N,N'-Dimethyl-p-phenylendiamin, N,N'-Diäthyl-p-phenylendiamin, Benzidin, p-Anisidin, Dianisidin, o-Kxesol, m-Kresol, «-Naphthol, /J-Naphtol, Catechol, Guaiacol, Pyrogallol

j > oder solche der heterocyclischen Reihe ζ. B. Bis-(N-äthylchinol-2-on)-azin oder (N-Methylbenzthiazol-2-on)-(l-äthyl-3-phenyl-5-methriazol-2-on)-azin. Als Oxidierungsmitte! können z. B. Cumolhydroperoxid, Diisopropylbenzolhydroperoxid, Paramethanhydroperoxid, 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid und andere bekannte Oxidationsmittel angewandt werden, die die Indikatoren oxidieren können.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen verbesserten Prüfmittel auf oder in eine Matrix eingebaut und werden in Form einer Vorrichtung zum Eintauchen und Ablesen angewandt. Die Prüfvorrichtung kann auf verschiedene bekannte Arten hergestellt werden, wie Imprägnieren eines absorbierenden Matrixmaterials mit einer Lösung oder Lösungen des Prüfmittels und anschließendes Trocknen der imprägnierten Matrix, wodurch in die Matrix ein feinteiliges inniges Gemisch der Bestandteile eingebaut wird und auf ähnliche Arten. Geeignete absorbierende Matrices, die angewandt werden können, umfassen Papier, Cellulose, Holz, Bahnen aus synthetischen Harzen, Glasfaserpapier, Polypropylenvliesstoff, andere gewebte oder gefilzte Stoffe und ähnliches. Die bevorzugte Herstellungsart besteht darin, die Matrix in zwei getrennten Stufen zu imprägnieren. Zum Beispiel

bo wird die Matrix zunächst mit einem wäßrigen Gemisch imprägniert, enthaltend mindestens ein Oxidationsmittel und das Säuresalz oder Addukt der allgemeinen Formel (I) und anschließend getrocknet. Die getrocknete Matrix wird dann mit einem zweiten Gemisch imprägniert, enthaltend mindestens einen Indikator und ein organisches Lösungsmittel, und erneut getrocknet. Die so hergestellte getrockente imprägnierte Matrix wird vorteilhaft -zur leichteren Anwendung an einem

Träger befestigt

Neben den oben angegebenen Bestandteilen des Prüfmittels, die aktiv an der Testreaktion teilnehmen, können in dem erfindungsgemäßen Prüfmittel oder der Vorrichtung auch weitere Bestandteile, wie Verdikkungsmittel, Netzmittel, Puffer, Emulgatoren und andere bekannte Zusätze vorhanden sein. Zum Beispiel können als Verdickungsmittel verschiedene Substanzen, wie Gelatine, Algin, Carragenin, Casein, Albumin, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon und ähnliches angewandt werden. Als Netzmittel wird vorzugsweise Natriumlaurylsulfat angewandt, aber es können auch andere langkettige organische Sulfate oder Sulfonate angewandt werden, wie Dioctylnatriumsulfosuccinat oder Natriumdodecylbenzolsulfonat Als Puffersysteme sind unter anderem Tartrat-, Phosphot-, Phthalat-, Zitrat-, Acetat- oder Succinatpuffer geeignet Vorzugsweise wird das Prüfmittel auf einen pH-Wert von ungefähr 4,0 bis 7,0 gepuffert Als Emulgatoren kommen unter anderen Polyvinylalkohol, Gu.nmi arabicum, Carboxyvinylpolymere und ähnliches in Frage. Die organischen Lösungsmittel, die geeignet sind den Indikator zu suspendieren, umfassen die meisten nicht reagierenden flüchtigen Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylendichlorid, Benzol, Äthylacetat und ähnliche.

Bei der Anwendung wird die imprägnierte Matrix der Prüfvorrichtung in die Flüssigkeit oder flüssige Suspension der nachzuweisenden Substanz eingetaucht und sofort daraus entfernt. In Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz ergibt das Prüfmittel eine positive Farbreaktion. Die entstehende Farbe wird dann mit vorher hergestellten und geeichten Farbstandards verglichen zur Abschätzung der quantitativen Mengen an peroxidativ wirksamer Substanz in der Probe. Intakte peroxidativ wirksame Substanzen, wie intakte rote Blutzellen, erscheinen als Punkte oder Flecken auf der sonst nicht gefärbten Matrix. Hämolysierte peroxidativ wirksame Substanzen färben die Matrix einheitlich und können leicht von intakten peroxidativ wirksamen Substanzen unterschieden werden. Neben dem visuellen Vergleich können verschiedene instrumenteile Verfahren angewandt werden, um die Art der entwickelten Farben zu bestimmen, wodurch die Genauigkeit des Test erhöht wird, indem man die subjektive Bestimmung der Farben durch das menschliche Auge vermeidet.

Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen verbesserten Prüfmittel und Vorrichtungen nicht nur stabil, sondern auch hoch empfindlich sind. Sie sind geeignet zum Nachweis selbst von einzelnen intakten peroxidativ wirksamen Substanzen in so geringen Konzentrationen wie 5 bis 50 RBC/μΙ Probe, entsprechend einer so hohen Blutverdünnung wie 1 :1 000 000. Diese hohe Empfindlichkeit der Prüfmittel enthaltend die Säuresalze oder Addukte der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ist höchst überraschend. Aufgrund der Wasserlöslichkeit der Säuresalze oder Addukte der Verbindung der allgemeinen Formel (I) können diese Verbindungen in wäßrigen Suspensionen dispergiert werden (gelöst). Auf diese Weise kann bei der Herstellung der Prüfmittel ein direkter Kontakt in Lösung mit dem Indikator, der ein organisches Lösungsmittel erfordert, um in Lösung zu gehen, vermieden werden. Dadurch kann die Gefahr der Verfärbung des Indikatorsystems wesentlich verringert werden. Die erfindungsgemäßen Prüfmittel sind daher sehr viel zuverlässiger als die bekannten.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt ein typisches Verfahren zur Herstellung eines Säuresalzes oder Adduktes von Verbindungen der allgemeinen Forme! (I) und den Einbau eines verbesserten Prüfmittels in einen Träger.

5 g Chinolin wurden in ungefähr 50 ml absolutem Äthanol suspendiert Zu dieser Lösung wurden dann 2 ml konzentrierte Schwefelsäure unter Mischen zugegeben. Es entstand sofort ein reichlicher weißer Niederschlag, der von dem Lösungsmittel abfiltriert wurde. Der Niederschlag wurde in neuem Äthanol suspendiert, wieder abgetrennt und getrocknet Das so gewonnene Material war Chinolinsuifat Fp. 130⁰C

Die folgenden Bestandteile wurden nacheinander vermischt, um eine erste Imprägnierlösung zu erhalten.

Bestandteil

Menge

(1) Gummi arabicum

(2) Gelatine

(3) Natriumlaurylsulfat

(4) Cumolhydroperoxid

(5) Natriumeitrat

(6) Zitronensäure, wasserfrei

(7) Chinolinsuifat

(8) destilliertes Wasser

pH des Gemisches

15g

0,5 g

1,0g

3,0 ml

8,92 g

1,86 g

0,75 g

auf 100,0 ml

4,8

Whatman 3MM-Filterpapier wurde mit der Lösung imprägniert und bei einer Temperatur von ungefähr 100° C getrocknet. Das trockene Papier wurde dann in eine zweite Imprägnierlösung, bestehend aus 0,4 g o-Tolidin, in 100 ml Chloroform getaucht und 5 bis 10 min bei einer Temperatur von ungefähr 50° C getrocknet. Das imprägnierte Papier, das weiß bis cremefarben war, wurde in Quadrate von ungefähr 5x5 mm geschnitten, die dann jeweils an einem Polystyrolträgerstreifen befestigt wurden, um eine Prüfvorrichtung zu erhalten.

Um die Empfindlichkeit des Prüfmittels zu untersuchen, wurde der Matrixteil der entstehenden Prüfvorrichtung augenblicklich in Urinproben getaucht und daraus entfernt, die verschiedene Mengen an intakten roten Blutzellen enthielten. Es zeigte sich, daß das Prüfmittel mit intakten roten Blutzellen unter Bildung grün bis blauer Flecken auf dem imprägnierten Papier

so reagierte und damit eine positive Reaktion anzeigte. Dieses Prüfmittel erwies sich empfindlich bis heran zu einer Menge von 2 bis 5 intakten Blutzellen pro μΐ Urin, entsprechend einer Blutverdünnung von 1 :1 000 000. Ähnlich hergestellte Prüfmittel erwiesen sich als ähnlich empfindlich gegenüber hämolysierten Blutzellen, reagierten in diesen Fällen jedoch durch eine gleichmäßige Verfärbung des imprägnierten Papiers.

Beispiel 2

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Herstellung des Säuresalzes oder Adduktes wurde 6-Methoxychinolin in Äthanol suspendiert und mit 50 ml Äthanol, enthaltend 7 g Sulfosalicylsäure, vermischt Der entstehende Niederschlag wurde auf ähnliche Weise abgetrennt, gewaschen und getrocknet. Die gewonnene Substanz wurde identifiziert als 6-Methoxychinolinsulfosalicvlsäuresalz. Fd. 225⁰C.

Verbesserte Prüfmittel wurden dann entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wobei anstelle des Chinolinsulfats 0,75 g ö-Methoxychinolinsulfosalicylsäuresalz verwendet wurde. Die Empfindlichkeit gegenüber intakten roten Blutzellen und hämolisiertem Blut der Prüfvorrichtungen, enthaltend dieses Prüfmittel, erwies sich als in der gleichen Größenordnung wie diejenige des Prüfmittel nach Beispiel 1.

Beispiel 3

Entsprechend Beispiel 1 wurden Prüfmittel hergestellt unter Ersatz des Chinolinsulfats durch eines der im folgenden angegebenen Säuresalze oder Addukte:

Süuresalz oder Addukt

o-Methoxychinolin-hydrochlorid

6-Methoxychinolin-phosphat

6-Methoxychinolin-malonat

6-MethoxychinoIin-weinsäuresalz

6-Methoxychinolin-sulfat

6-Methylchinolin-sulfat

7-Methylchinolin-sulfat

Fp

212¹C

180⁰C

116"C

105X

215¹C

92 C

Die Empfindlichkeit gegenüber intakten roten Blut zellen und hämolysiertem Blut der Prüfvorrichtungeri enthaltend die entsprechenden Prüfmittel, war in de gleichen Größenordnung wie diejenige der Prüfvorrich tungnach Beispiel 1.

Claims

Patentanspruch:

Prüfmittel zum Nachweis peroxidativ wirksamer Substanzen in Körperflüssigkeiten, Exkrementen und ähnlichem, insbesondere zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von okkultem Blut, bestehend aus einem Indikator, der in Gegenwart einer peroxidativ wirksamen Substanz unter Eintritt einer Farbänderung oxidiert wird, einem Oxidationsmittel, das den Indikator oxidieren kann und einem Chinolinderivat der allgemeinen Formel