DE1648817A1 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw.peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Description

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Mannheim 1496'

Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden, bzw. von Substanzen, aus denen durch eine vorgeschalt.ete Reaktion Wasserstoffperoxid oder andere Hydroperoxide freigesetzt werden, sowie von Peroxidase bzw. anderen peroxidatisch wirkenden Substanzen. Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glucose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes, sowie der Kachweis peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Hämoglobin im Harn und Blut und der Nachweis von Hydroperoxiden z.B. in der Milohwirtschaft, Kosmetik und Polymerohemie.

Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid und Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Substanzen, die bevorzugt verwendet werden sind z.B. Benzidin,o-Dianisidin, o-Tolidin, Guajakol usw. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich ersaheint.

E3 wurde nun überraschenderweise eine Substanzgruppe gefunden, die z. T. bessere Indikator - eigenschaften als die bisher verwendeten Benzidinkörper zeigt. Die Substanzklasse ist geeignet, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl in optisohen Tests, als auoh mit Hilfe von Reagenzpapieren und Reagenzfilmen (gemäß unserer Anmeldung Aktenzeiohen B 89 944 IXb/42 l) zu bestimmen.

•A

10982S/0255 bad

Die Substanzen sind physiologisch sehr gut verträglich und besitzen die folgende allgemeine Formel Ii

(D,

in veloher bedeuten:

R eine Hydroxy- oder Amino-gruppe, welche gegebenenfalls einen ein- oder mehrfach duroh Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cyoloaliphatisohen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen,

Rp, R, und Rc Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe,

und R. Wasserstoff, oder den Rest R-.

Es ist bekannt, daß die Substanzen I im alkalischen - vorzugsweise im ammoniak-alkalischen-Medium Haare färben können, wenn größere Mengen Wasserstoffperoxid (3-10 $) anwesend sind; vgl. DAS 1 I4I 748, DAS 1 142 045, DAS 1 149 496, Fette-Seifen-Anstriohmittel 6χ, (1965),

S. 222-227· Es war nicht vorherzusehen, daß diese Verbindungsklasse

auch im neutrplen bis schwach sauren pH-Bereich, mit sehr geringen Mengen Wasserstoffperoxid (bis etwa 0,0005 $)und peroxidatisch wirkenden Substanzen starke Farbreaktionen zeigen würde, welche je nach Anwendungsart außerdem noch verschieden nuanciert sind. Die Empfindlichkeit der Substanzen I gegenüber Wasserstoffperoxid bzw. Systemen, die Wasserstoffperoxid freisetzen, steigt jedenfalls um mehr als 3 Zehnerpotenzen j wenn Feroxidase anwesend ist. Gleichzeitig verkürzt sich die beim Haarfärben übliche Reaktionszeit von oa. 10-30 Minuten (z.T. auch bei erhöhter Temperatur bis 60 ) bei der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode auf 1 Minute und weniger (jeweils bei Zimmertemperatur).

109825/0255 ^ßAD original

Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, beispielsweise für die Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten. Die routinemäi. ^; ge Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementaren Wichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittelchemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Gluoose beispielsweise; v.ird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff. Außer den einzelnen Substanzen I können erfindungsgemäß auch Gemische derselben oder Mischungen mit anderen Farbstoffindikatoren verwendet werden, wobei man besonders gut unterscheidbare Ff.rbnuancen erhält.

Weitere Beispiele für analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind L-Aminosäureoxidase + !-Aminosäure, Uricnse + Harnsäure, Xanthinoxidase ψ Hypoxanthin bzw. Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin etc.), Diamin-oxidase + Diamine (wie Histamin), Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure, Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galactoseoxidase + Galaotose, Edson's Flavinenzym + Milchsäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisoh wirksamen Substanzen durch Aus\iertung der Verfärbung ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß nan als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I oder Gemische solcher Substanzen verwendet. Die Auswertung erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektrophotometer oder bei Verwendung von Teatpapierstreifen und Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in folgenden Beispielen näher erläutert.

1 0 9 8 2 5 / 0,? 5 5 BAD OBlGINAL

Ieispiel 1

Kachweis von Hydroperoxides ir: Flüssigkeiten

50 ng Peroxidase werden in 100 ml eines 0,1 m Citrat- oder Phosphatpuffers vom pH 5,6 eel est und damit ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Sohüll) inprägniert. Danach werden JOO mg 2-Phenylamino-5-asino-pyridin-hydrochiorid in 100 ml Methanol gelöst und das Filterpapier nochmals imprägniert. Beim Eintauchen in Lösungen von Wasserstoffperoxid verschiedener Konzentrationen werden die Papiere entsprechend der Konsentration verschieden stark weinrot "bis dunkel-blaurot gefärbt. Mit Wasserstoffperoxidlösungen von 5y/nl erhält man noch eine deutliche Farbreaktion«

Beispiel 2 Kachweis von Glucose im Harn

100 mg Glucoseoxidase und 50 mg Peroxidase und 3OO ng 2-Dimethylamino-5-aiaino-pyridin-dihydrochlorid werden in 100 ml eines 0,1 m Citrat- oder Phosphatpuffers von: pH 5,6 gelöst. Mit dieser Lösung imprägniert man ein Filterpapier (23I6 der Firma Schleicher & Sohüll). Beim Eintauchen in glucosehaltigen Harn zeigt das Papier je nach Glucosekonzentration verschieden stark blauviolette Töne. Schon bei 50 mg % Glucose ist eine deutliche Farbreaktion zu sehen.

Beispiel 3 Kachweis von Glucose in Blut

9C g wässrige Polyvinylpropior.at-Dispersion ("Propiofan")» 1,30 g Natriumsalz einer Polymannuronsäure ("Algipon"), 70 ml eines 0,5 m Citrat- oder Phosphatpuffers, 2 g organisches Natriumeulfonat ("Texapon P")« 320 ng= 31ucoseoxidase, 300 ΰ,ς Peroxidase und 600 ag 2-Cyolohexylamino-5-aminopyridin in 20 ml "ethanol, werden zu einer homogenen Misohung verrührt, in einer Schichtdicke von 300 /u auf eine Folie aufgetragen und getrocknet.

109825/02S5 bad o_R,_g,_NAl

Bringt nan auf den so hergestellten FiIa einen Tropfen Blut und entfernt diesen wieder nach o·-. 1 Miaute, so färbt sich der Film je naoh Glucosekonzentration rötlich bis braun-rötlich.

Beispiel Jo von Glucose in aerur ~it eine.T Indik^torgeniisoh

90 g Polyvinylpropionat-Dispersion ("Propiofan"), 1,30 g liatriuasalz einer Poiycannuror.säure ("Algipon¹¹), 70 al eines 0,5 m Citrat- oder Phcsphatpuffers, 2 g organische Natriur.3ulf onate ("Texapon P"), 320 mg Giucoseoxidase, 300 ag Peroxidase und Lösungen von 300 mg 2,3-Oiaininopyridin-hydrochloria und 300 =g 2, 6-Diamino-pyridin-hydrochlorid in jeweils 12 al V/asser, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in einer Schichtdicke von 300 /U auf eine Folie aufgetragen und getrocknet. 3ringt nan auf einen sd hergestellten Film einen Tropfen Serum und entfernt diesen wieder nach ca. einer Minute, so färbt sich der Film je nach Gluoosekonzentration verschieden stark grün.

Beispiel 5 Nachweis von Glucose ir. Flüssigkeiten

In der folgenden Tabelle sind die Farbreaktionen und Farbnuanoen zusar.^er.gestellt, die eir.e Reihe weiterer Substanzen I mit Glucose (50 mg % und aehr) liefert, wobei die Testpapiere genä3 Beispiel 2 und die Filme gesäi Beispiel 3 r.ergestellt werden. Für die Tüpfelreaktionen wurden Lösungen analog Beispiel 2 verwendet. Bei Substanzen, die nicht wasserlöslich sind, wurden Lösungen in entsprechenden Lösungsmitteln oder Suspensionen eingesetzt.

	Substanz I	FiIa	Papier	Tüpfelplatte
1.	2,3-Biaaino-pyrilin.	grau-braun	rosa-braun	rotbraun
2.	2,6-Diaoinc-pyridLn	blau	blau-grau« blau	blau

109825/0255

ßAD ORIGiNAl.

I ο *- d ο- · ι

Substanz I

FiIa

Papier ' Tüpfelplatte

2 , 5-3ian;inodihydrochlor:

gelblich= braun

rotbraun rotbraun

roaa-blau

blau

grünlich

hydrochloric.

karninrot

pyridin-hyär^chlorid

weinrotdunkelblau

dunkelro^J

2-(2-Hydroxyi-:.yl-u..ino) - braun 5-ä=ino-pyriii:;-dihydrochiorid

rotbraun

ro χ, ο raun

7.	2-3is-(ii-hydro:iyi;hyl- aaino)-5-acir.o-pyridin- hydrochlorid	braun	rotbraun	rotbraun
3.	2-Cyclohexylatino-5- anino-pyridir.	hellbraun	braunrot	orange
9-	2- (γ-D ine thy 1 n.= i no- propyl-aaino}-3- aciho-pyridir.	braun	orange	orange
10.	2-Diaethylan:ino-5-aniir.o- pyridin-dihydrochlorid ·	blauviolett	blau	blaugrau
11.	5,5' -DiamirlOK^-pyridyliy - amin !	rot	rot	rot
12.	2-(Y-Methoxypropylaaino)- 5-amino-pyridir. I I	rötlich	rotbraun	rotbraun

-A

109825/0255

Beispiel 6

} ho ten, etri s eher ]'^r.c:.ve:s vcr. Glucose

Ic z-s Glucoseoxiü--se, ^ z.c Peroxidase werden in 10 ml Phosphatpuffer von pK 6,0 gelost. Je 1 r-,1 dieser Lösung, 1 ml einer 0,0005 π wässrigen lösung von 2,5-1. .· ir.^-pyriair.-dihydrochlorid, 1 nl der zu untersuchenden ilucoselösung Ei-. ]\.ysclogisch interesssierenden Glucosekonzentrationen werden zusanaenpi^ettiert und sit Phosphatpuffer (pH 6,0) auf 10 ml aufrefüllt. Die Sxtir.kticr. dieser Lösung ia Vergleich zu einer BlindproTse •wird bei 435 ^nE geressen und der Glucoaegehalt anhand einer vorher aufgestellten Sichkurve errechnet.

109825/0?55 BAD ORISINAt.

Claims (2)

1. P c. t ο η t η r. s ρ r ü c h e ,

   Verfahren zur Besti;r.rr.ung von Hydroperoxiden bzw, von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man .Chroroogene der allgemeinen Formel I

   (D,

   in welcher bedeuten:

   R eine Hydroxy- oder Amino-gruppe, welche gegebenenfalls einen ein- oder -ehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, oycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen,

   Rg, R- und s< V.'asserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe,

   und R. Wasserstoff, oder den Rest R₁,.

   oder Gemische solcher Substanzen verwendet.

   109825/0255 s^ _0R1QINau
2. 2. Diagnostisches Vi-.tel zur Bestimmung von. Ilydroperoxiden bzw. Substanzen, die ιΐ;.-ί;Γ Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidaso oder einer peroxidatisch wirkaaaea Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie ala Ohroffiogen Substanzen der Formel I enthalten.

   5- Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch -!.rksarr.en Substanzen bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid b:."'.- endfii Substanzen und einesn Gavpmogen, dadurch gekennzeichnet, C:. ire als Ghromogen Substanzen der Formel I enthalten.

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   BAD