DE1917996A1 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirksamen Substanzen

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DE1917996A1 DE19691917996 DE1917996A DE1917996A1 DE 1917996 A1 DE1917996 A1 DE 1917996A1 DE 19691917996 DE19691917996 DE 19691917996 DE 1917996 A DE1917996 A DE 1917996A DE 1917996 A1 DE1917996 A1 DE 1917996A1
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Description

Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisoh wirksamen Substanzen»
Zusatz zur Patentanmeldung Aktenzeichen P 16 48 84O.7·
Gegenstand der Hauptanmeldung P 16 48 84O.7 sind diagnostische Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, aus denen durch eine vorgeschaltete Reaktion Wasserstoffperoxid-oder andere Hydroperoxide freigesetzt werden, sowie von Peroxidase bzw. anderen peroxidatisch wirkenden Substanzen. Als Indikatoren kommen im Hauptpatent die physiologisch unschädlichen Verbindungen der allgemeinen Formel I zur Anwendung
N-N
(D,
in der
R, eine niedere Alkylgruppe,
Rp Wasserstoff, eine Sulfoneäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe, ,
R, Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe,
X ein Schwerfeiatom, eine Vinylen- oder eine Iminogruppe, die gegebenenfalls durch niedere Alkylreste oder Arylreste substituiert ist,
•Λ
0098^2/0791
ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche auch zusammen mit R, einen durch R„ substituierten Benzolring bildet, bedeuten.
In Ausgestaltung der Hauptanmeldung F 16 49 84O.7 wurde nun gefunden, daß auch jene Verbindungen der Formel I, in denen X zusätzlich ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom und gegebenenfalls R, zusätzlich ein Chloratom bedeutet, hervorragende Eigenschaften als Indikatoren besitzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Feroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I1 verwendet,
in welcher
R1 eine niedere Alkylgruppe,
Rp Wasserstoff, eine SuIfonsäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe,
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R-· Wasserstoff, ein Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe, Y ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche gegebenenfalls auch zusammen mit R ' einen durch R- substituierten Benzolring bilden kann,
einer der Reste X* ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe, eine gegebenenfalls nieder-alkylierte oder-arylierte Iminogruppe, ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom bedeutet, während der andere Rest X1 ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom darstellt, wobei dieser für den Fall, daß R,· ein Halogenatom bedeutet, auch ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe oder eine gegebenenfalls niedere alkylierte oder arylierte Iminogruppe sein kann.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen , die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, sowie diagnostische Mittel zur Bestimmung ron Hämoglobin oder anderen peroxidatisoh wirksamen Substanzen.
Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, wie z.B. zur Bestimmung von Glucose, Galaktose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten. Die routinemäßige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementarenwichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittel-Chemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise, wird diese von Glucoseoxidaee zu Gluconsäure oxydiert, wobei der Luftsaueretoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird, ύββ Wasserstoffperoxid oxydiert dann mittels Peroxidaae oder einer peroxidatisch wirkenden Substanz den erfindungsgemäC verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff.
Die Auswertung -erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektralphotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen bzw. Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zu-
•Λ
009842/Q791
sammensetzung bzw. Farbtafeln. Besonders vorteilhafte und gut abgestufte Farbänderungen*erhält man überraschenderweise, wenn man die Substanzen i) zusätzlich mit Reduktionsmitteln der Formel II versetzt, . .
(II),
in welcher
Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe,
VI Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe,
W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-,· Aryl-, Carboxy- oder SuIfonsäuregruppe und
W1 Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder SuIfonsäuregruppe, sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze bedeuten.
Diese Substanzen, die als "Modifier" wirken, geben für sich alleine keine oder nur sehr unspezifische Verfärbungen und sind deshalb als Indikatoren im allgemeinen nicht geeignet. Zusammen mit den Substanzen der allgemeinen Formel I* erhält man aber besonders deutliche und gut abgestufte Farbumschläge. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
f
Erfindung enthalten daher eine Kombination der Substanzen I1 und II als
Indikator.
Selbstverständlich läßt sich umgekehrt das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung der Indikatoren I1 sowie der Modifier II mit Hilfe von Hydroperoxiden und einer peroxidatisch wirksamen Substanz benutzen,
•Λ
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was bei der Produktionaüberwachung dieser Diagnostika sehr nützlich ist,
to
Die Herstellung der Verbindungen I? erfolgt in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von 2-Halogen- oder 2-Mercapto-Quartäraalzen mit einem entsprechenden N-alkylierten Hydrazonsalz unter Zugabe eines Amins, vorzugsweise von Triäthylamin in einem polaren Lösungsmittel (z.B. Methanol) bei einer Temperatur von 15-100 C. Die Reaktion ist je nach Reaktivität der einzelnen Komponenten innerhalb von 10 Minuten bis 2 Stunden beendet [S. Hünig et al.fLiebigs Ann. Chem. 676, S. 32-65 (1964)].
Die Darstellung der als Ausgangaprodukte verwendeten Hydrazone sowie der Ν-quaternisierten Salze erfolgt analog den von S. Hünig (Ann. Chem. 6Ο9, S.160-180 [1957J) und H. Balli (Liebigs Ann. Chem. £££, S.1-8 [196IJ) angegebenen Vorschriften. Die Verbindungen I1 können erfindungsgemäß sowohl für den optischen Test in der Küvette, als auch auf Reagenzpapieren und in Reagenzfolien allein oder zusammen mit den "Modifiern" der Formel II eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in den folgenden Beispielen näher erläutert:
-Λ
00984270791
Beispiel Reagenzfilm zum Nachweis von Glucose
45 g Propiofan (BASF), 35 g einer Lösung von 37 g Algipon in 2 Liter eines 0,5 molaren Phosphat- oder Citratpuffers vom pH 5»7» 1 E Texapon P. (Pa. Henkel Düsseldorf), 10 ml Wasser, 0,075" 6 Peroxidase und 0,15 g Glucoaeoxidase werden zu einem homogenen Brei verrührt. Zu dieser Mischung gibt man 6 ml einer maximal 5 foigen methanolischen Lösung eines der nachstehend aufgeführten Indikatoren, sowie gewünschtenfalls einen der Modifier der Formel II, welcher in den nachfolgend angeführten Lösungsmitteln gelöst und zu der Indikatormischung gegeben wird. Mit den so hergestellten Mischungen, in denen bis zu 0,3 $ Indikator enthalten sind, werden Folien in einer Schichtdicke von 300 /u beschichtet und getrocknet. Auf einen derart hergestellten Teststreifen bringt man einen Tropfen glucosehaltigen Blutes, läßt diesen einige Zeit einwirken und erhält nach dem Abwischen des Tropfens die in der Tabelle I angegebenen Farbreaktionen, welche je nach Glucose-Konzentrationen mehr oder weniger stark abgestuft sinda
Indikatoren der Formel I1:
A 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzoxazolon(2)] B l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)3-2-[l-äthylpyridon(2)]-azin C l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)J-azin D l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azin
E 1-[l-Äthyl-3 s 3-dimethyl-indolinon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin
F l-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-L,-athyl-6-chlorpyridon(2)J-azin
G l-[l-Äthylchinolon(2)]-2-[l-äthyl-6-chlorpyridon(2)]-azin
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Tabelle I
Indikator : I1 Modifiersubatanzen j
II 		Modifier-
Könzentratioi 		gelöst
ι in 		Farbreaktionen I
' orange
A fliederfarben violett
A (1-Amino-naphthol-
8)-2,4-diaulfon-
säure 		0,2 Wasser grün I
grün
A Naphthylamin(1) -
sulfonsäure(6) 		0,05 |0Na0H rosa i rosa
!
A p-Aminosalicyl-
eäure 		0,1 Methanol orange
A m-Aminophenol 0,007 Wasser orange
B o-Aminophenol-
p-sulfonsäure 		0,2 Wasser blau
B (1-Amino-naph-
thol-8)-2,4-
disulfonsäure 		0,2 Wasser grün
B p~Aminosalicyl~
eäure 		0,1 Methanol rosa
B m-Aminophenol 0,007 Wasser rosa
B p-Phenetidin 0,05 Methanol rotbraun
C Naphthylamin(I)-
sulfonsäure(6) 		0,05 |0Na0H fleischfarben
C Napthylamin(l)-
sulfonsäure(e) 		0,1 Dimethyl
formamid rosa-violett
C p-Aniino-sali-
cy!säure 		0,1 Methanol
D o-Arainophenol-
p-aulfonsaura 		0,2 Wasser
D (i-Amino-naph-
thol-8)-2,4-
disulfonsäure 		0,2 Wasser
D p-Aminoaalicyl-
säure
• 		0,1
I
t		 Methanol
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Fortsetzung Tabelle!
Indikator I' ν
Modifiersubstanzen		 Modifier- gelöst Farbreaktionen
II Konzentratior 1 in
E _ _ rot
E p-Aminosalicyl-
säure 0,1 Methanol fliederfarben
E · m-Aminophenol 0,007 Wasser violett
E (1-Aminonaphthol-
8)-2,4-disulfon-
säure 0,2 Wasser hellgrün-graugr
F p-Aminosalicyl-
säure 0,1 Methanol geIbgrün
ΰ p-Aminosalicycl-
säure 0,1 Methanol braun
Beispiel 2
Hochempfindlicher Nachweis von Wasserstoffperoxid in Flüssigkeiten.
1 ml einer 0,2 $igen methanolischen Lösung von l-[l-Äthyl-3,3-dimethylindolinon-(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin, 1 ml einer 0,1 $igen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylsäure, 0,03 nl einer 1 ^igen Lösung von Peroxidase in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 5,7 und 0,05 ml einer Lösung von Wasserstoffperoxid werden zusammen pipettiert, umgerührt und bei einer Wellenlänge von 530 nm gemessen. Die
Wasserstoffperoxid-Konzentration wird mit Hilfe einer vorher aufgestellten Eichkurve bestimmt.
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Beispiel 3
Nachweis von Glucose im Harn
Ein Filterpapier (2316 der Fa. Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 75 mg Peroxidase, 143 mg Glucoseoxidase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5»6 imprägniert und getrocknet. Das in dieser Weise imprägnierte Papier wird anschließend in eine Lösung von 0,2 g l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azin und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100 ml Methanol getaucht und getrocknet. Beim Benetzen eines Streifens des so hergestellten Heagenzpapieres mit Harn, welcher pathologische Glucosemengen enthält, verfärbt sich dieser je nach Glucosekonzentration verschieden stark rotviolett.
Beispiel 4 Nachweis von Blut in Körperflüssigkeiten
Ein Filterpapier (23 S der Fa. Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) und 100 mg Natriumalginat in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,6 imprägniert und getrocknet. Das so hergestellte Papier wird mit einer Lösung von 0,2 g l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azin und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100 ml Methanol imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Reagenzpapier einen Tropfen einer Körperflüssigkeit, welche,Blut enthält, und tropft anschließend 3 /£iges Wasserstoffperoxid auf das Papier, so färbt ea sich noch bei einer Blutkonzentration von 1:50.000 rotviolett.
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Beispiel 5
Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeiten
Ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 40 m8 Peroxidase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffeis vom pH 5,6 imprägniert und getrocknet. Anschließend wird das so vorbereitete Papier mit einer kalt gesättigten methanolischen Lösung von l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Reagenzpapier Lösungen von Wasserstoffperoxid in verschiedener Konzentration, so färben sich die Papiere je nach Wasserstoffperoxid-Konzentration verschieden stark grünblau. Die untere Nachweisgrenze liegt bei 0,01 γ Wasserstoffperoxid/ml.
Beispiel Nachweis von Glucose in Lösung
1 ml einer Lösung, welche eine der nachstehend aufgeführten Indikatorverbindungen I1 je nach Löslichkeit bis zu einer Konzentration von 1 fo enthält, wird mit 1 ml einer Lösung von 150 mg Glucoseoxidaae und 75 cig Peroxidase in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphat puffers vom pH 5 »6 und 1 ml einer Qlucoselöaung vereinigt. Man erhält die in der Tabelle II angegebenen Farbreaktionen. Als Modifier wird jeweils 0,1 ml einer 1 foigen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylaäure zugegeben.
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Tabelle II Indikator I«
Fp. 0C Reaktionsfarbe ohne mit Modifier
2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzozazolon(2)J
l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2- [1- äthylpyridon(2)]-azin
1-Γ 3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[l- äthylohinolinon(2)J-azin
l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-
2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin
l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[lf3-diäthylbenzimidazolon (2)]-azin
216-217 I45-I46
199
I93-I94
215-216
l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[l-äthyl-6-chlor-pyridon(2)J-azin
l-[l-Xthyl-3,3-dioethylindolinon(2)J-2-ί3-äthylbenzthiazolon(2)J-azin
1-[l-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)J-2-Γ3-nethylbenzthiazolon(2)J-azin
1-[l-Äthyl-3,3-dinethylindolinonf 2)]-2~t1- äthylchinolinon(2)J-azin
2,2·-Azino-di[3-äthylbenzoxazolon-2-aulfonsäure-6]
2,2'-Azino-di[3-äthylbenz oxazolon-2-ama'oniuiD8ul- fonat-6]
206-209
199 j
258-260[Zers.]
300 [Zers.] blau
violett violett blau
violett violett
rotbraun
rot
rot
rot
braunorange
rot
rotbraun rotviolett rotbraun rotviolett rotorange braunorange
blau
blau
rotbraun
rotbraun
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Claims (6)

  1. in welcher
    R, eine niedere Alkylgruppe,
    R_ Wasserstoff, eine Sulfonsäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe,
    R,1 Wasserstoff, ein Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe,
    Y ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche gegebenenfalls auch zusammen mit R ' einen durch R„ substituierten Benzolring bilden kann,
    einer der Reste X1 ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe, eine gegebenenfalls nieder-alkylierte oder-arylierte Iminogruppe, ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen Substituiertes Kohlenstoffatom bedeutet, während der andere Rest X1 ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffe ton; darstellt, wobei dieser für den Fall, daß R' ein Halogene ton bedeutet, auch ein ochwefelatoc, eine Vinylengruppe oder eine gegebenenfalls niedere alkylierte oder arylierte Iminogruppe sein kann.
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    BAD ORIGINAL
  2. 2. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxida'se oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel I' enthalten.
  3. 3. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel I1 enthalten.
  4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich Substanzen der allgemeinen Formel II
    (II),
    in welcher
    Ar einen Benzol- oder Naphtha linkem,
    V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe,
    V Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe,
    W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe und
    V/1 Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe bedeuten, sowie gegebenenfalls deren Alkali'salze, verwendet.
    009842/0791
    BAD ORiGiNAL
  5. 5. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen ein Gemisch von Substanzen der Formel I1 und der Formel II. enthalten.
  6. 6. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chronogen ein Gemisch von Substanzen der Formel I' und der Formel II enthalten.
    009842/0791
    BAD ORIGINAL
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0161436A1 (de) * 1984-03-31 1985-11-21 Roche Diagnostics GmbH Neue Redox-Indikatoren
DE2462952C2 (de) * 1974-12-21 1987-10-01 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim, De

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