DE1917997C3 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Description

(D

in welcher

25

Ri eine niedere Alkylgruppe,
R₂ Wasserstoff, eine Alkylgruppe oder zusammen mit Y einen ankondensierten Benzol- oder

Naphthalinkern,
X ein Schwefel- oder Sauerstoffatom, eine alkylier-

te Imino- oder eine Vinylengruppe und Y eine Methingruppe, welche auch zusammen mit R₂ einen Benzol- oder Naphthalinkern bilden

kann,
bedeutet, verwendet werden. ·

2. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase . oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel i enthalten.

3. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel I enthalten.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Substanzen der allgemeinen Formel II

Ar

/ \
W W'

(H)

55

in welcher

5. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen ein Gemisch von Substanzen der Formel I und der Formel II enthalten.

6. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen ein Gemisch von Substanzen der Formel I und der Formel II enthalten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung. Die Erfindung betrifft ferner diagnostische Mittel zur Durchführung derartiger Verfahren.

Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glukose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes sowie der Nachweis von Hydroperoxiden z. B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und Polymerchemie.

Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Die Substanzen, die hierfür verwendet werden, sind z. B. Nadi-Reagenzien, p-Phenylendiaminderivate, Carboazine, Guajakharz, Aldazine etc. Bevorzugt eingesetzi wurde bisher Benzidin, o-Dianisidin und o-Tolidin. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Substanzen zu finden, die als Chromogene für ein Verfahren der obengenannten Art geeignet und zugleich stabil und unschädlich sind.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die physiologisch unschädlichen Verbindungen der allgemeinen Formel I

N-N=C

f)O

in welcher

Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern,

V eine Amino- oder Hydroxylgruppe,

V Wasserstoff, eine Amino- oder Hydroxylgruppe,

W eine Amino-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe Ri eine niedere Alkylgruppe,

_und R₂ Wasserstoff, eine Alkylgruppe oder zusammen mit

W' Wasserstoff, eine Amino-, Carboxy- oder 65 Y einen ankondensierten Benzol- oder Naphthalin-Sulfonsäuregruppe kern,

bedeutet, sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze ^{x ein} Schwefel- oder Sauerstoffatom, eine alkylierte

verwendet werden. Imino- oder eine Vinylengruppe und

Y eine Methingruppe, weiche auch zusammen mit R₂ einen Benzol- oder Naphthalinkern bilden kann, bedeutet,

absolut beständig sind und sich besonders gut dazu s eignen, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl im optischen Test als auch mit Hilfe von Reagenzpapieren und Reagenzfilmen zu bestimmen.

Es ist zwar bekannt, daß sich einige dieser Substanzen mittels starker Oxidationsmittel wie Bleitetraacetat, Cer-IV-Sulfat und Kaliumpersulfat oxidieren lassen und dabei gefärbte Oxidationsprodukte liefern (vgl. S. H ü η ig et al, Liebigs Ann. Chem. 676, [1964], S. 32-05 sowie H. L a η g et al. Z. analyt Chem. 201,[ 1964], S. 321). Da jedoch mit Wasserstoffperoxid allein keine Reaktion erfolgt, war es nicht vorauszusehen, daß sich in Anwesenheit von Peroxidase oder peroxidatisch wirksamen Substanzen ebenfalls reproduzierbare deutliche Verfärbungen erzielen lassen.

Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, wie z. B. zur Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, sowie Enzymaktivitäten. Die routinemäßige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementaren Wichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittelchemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirkenden Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff. Weitere Beispiele für derartige analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind

L- Aminosäureoxidase + L-Aminosäuren, D-Aminosäureoxidase + D-Aminosäuren,

Uricase + Harnsäure,

Xanthinoxidase + Hypoxanthin bzw. Xanthin,

Glycinoxidase + Glycin,

Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin etc.),

Diaminooxidase + Diamine (wie Histamin),

Luciferase + Luciferin,

D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure,

Leber- Aldehydoxidase + Aldehyd, Gaiactoseoxidase + Galactose,

Edsons Flavinenzym + Milchsäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswer- f,₀ tung der Verfärbung in an sich bekannter Weise, ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel I verwendet.

Die Auswertung erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektralphotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen bzw. Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln. Besonders vorteilhafte unJ gut abgestufte Farbänderungen erhält man überraschenderweise, wenn man die Substanzen 1 zusätzlich mit Reduktionsmitteln der Formel II

Ar

W'

(H)

in welcher

Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern,

V eine Amino- oder Hydroxylgruppe,

V Wasserstoff, eine Amino- oder Hydroxylgruppe,

W eine Amino-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe und W' Wasserstoff, eine Amino-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe

bedeutet, sowie gegebenenfalls deren Alkalisalzen versetzt.

Diese Substanzen, die als »Modifier« wirken, geben für sich alleine keine oder nur sehr unspezifische Verfärbungen und sind deshalb als Indikatoren im allgemeinen nicht geeignet. Zusammen mit den Substanzen der allgemeinen Formel I erhält man aber besonders deutliche und gut abgestufte Farbumschläge. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten daher eine Kombination der Substanzen I und II als Indikator.

Selbstverständlich läßt sich umgekehrt das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung der Indikatoren I sowie der Modifier II mit Hilfe von Hydroperoxiden und einer peroxidatisch wirksamen Substanz benutzen, was bei der Produktionsüberwachung dieser Diagnostika sehr nützlich ist.

Die Herstellung der Verbindungen i erfolgt in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von 2-Halogen- oder 2-Mercapto-Quartärsalzen mit einem entsprechenden N-alkylierten Hydrazonsalz unter Zugabe eines Amins, vorzugsweise von Triäthylamin in einem polaren Lösungsmittel (z. B. Methanol) bei einer Temperatur von 15-100⁰C. Die Reaktion ist je nach Reaktivität der einzelnen Komponenten innerhalb von 10 Minuten bis 2 Stunden beendet (S. Hünig et al., Liebigs Ann. Chem. 676, S. 32 - 65 [1964]).

Die Darstellung der als Ausgangsprodukte verwendeten Hydrazone sowie der N-quatorniisierten Salze erfolgt analog den von S. H ü η i g (Ann. Chem. 609, S. 160-180[1957]) und H. B a 11 i (Liebigs Ann. Chem. 647, S. 1 -8 [1961]) angegebenen Vorschriften. Die Verbindungen I können erfindungsgemäß sowohl für den optischen Test in der Küvette als auch auf Reagenzpapieren und in Reagenzfolien allein oder zusammen mit den »Modifiern« der Formel II eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in den folgenden Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1
Reagenzfilm zum Nachweis von Glucose im Blut

45 g 60%ige wäßrige Dispersion eines Vinylpropionat/Vinylacetat-Kopolymerisats, 35 g einer Lösung von 37 g Polymannuronsäurenatriumsalz in 2 Liter eines 0,5molaren Phosphat- oder Citratpuffers vom pH 5,7, 1 g eines Gemisches aus Fettalkoholsulfaten und Alkylbenzolsulfaten (ca. 2O°/oige wäßrige Lösung), 10 ml

Wasser, 75 mg Peroxidase und 150 mg Glucoseoxidase werden zu einem homogenen Brei verrührt. Zu dieser Mischung gibt man 8 ml einer konzentrierten methanolischen Lösung von l-[l-Methyl-benzo(f)chinolinon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin sowie 4 ml einer 2%igen Lösung von p-Aminosalicylsäure. Mit Ger so hergestellten Mischung wird eine Folie in einer Schichtdicke von 300 μ beschichtet und getrocknet. Tropft man auf einen so hergestellten Reagenzstreifen glucosehaltiges Blut, läßt dieses einwirken und entfernt das Blut wieder, so erhält man eine rotbraune Farbreaktion.

Gibt man zu der Indikatormischung anstelle einer 2%igen Lösung von p-Aminosalicylsäure eine Lösung von (i-Aminonaphthol-8)-2,4-disulfonsäure, so erhält ij man eine grüne Farbreaktion; setzt n'an Naphthylamin(I)-suifonsäure(6) oder m-Aminopheno) zu, so färbt sich der Reagenzfilm bei der Einwirkung von glucosehaltigem Blut je nach der Konzentration rosa bis rotbraun.

Beispiel la

Zu einer gemäß Beispiel 1 bereiteten Mischung von Vinylpropionat/Vinylacetat-Kopolymerisat, Polymannuronsäurenatriumsalz, Puffer, Fettalkoholsulfat/Alkylbenzolsulfat-Lösung, Wasser, Peroxidase und Glucoseoxidase gibt man 8 ml einer konzentrierten methanolischen Lösung von l-[l-Methyl-benzo(f)-chinolinon(2)]-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azin sowie 4 ml einer 2%igen Lösung von p-Aminosalicylsäure, und beschichtet mit der so hergestellten Mischung eine Folie in einer Schichtdicke von 300 μ. Auf den getrockneten Reagenzstreifen gibt man glucosehaltiges Blut, läßt dieses einwirken und erhält, nachdem man das Blut wieder entfernt hat, eine rosa Farbreaktion. -\$

Beispiel 4
Nachweis von Glucose im Harn

Ein Filterpapier wird mil einer Lösung von 75 mg Peroxidase, 143 mg Glucoseoxidase und 0,25 ml eines Gemisches aus Fettalkoholsulfaten und Alkylbenzolsulfaten (ca. 2O°/oige wäßrige Lösung) in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,6 imprägniert und getrocknet. Dieses so hergestellte Enzym-Puffcrpapier wird anschließend mit einer 0,01%igen Lösung von 1 -[I -Methyl-benzo(f)-chinolinon(2)]-2-[3-äthylbenzoxazolon(2)]-azin in Chloroform und einer 0,01%igen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylsäure imprägniert und getrocknet. Taucht man ein so hergestelltes Reagenzpapier in einen Harn mit pathologischer Glucose-Konzentration, so färbt sich das Reagenzpapier rotbraun.

Beispiel 5

Nachweis von Glucose mit und ohne
Modifier-Substanzen der Formel II

100 mg der nachstehend aufgeführten Indikatoren werden in 10 ml Methanol auf geschlämmt, welches gewünschtenfalls 0,1% p-Aminosalicylsäure als Modifier-Substanz enthält. 2 ml einer Lösung von 150 mg Glucoseoxidase und 75 mg Peroxidase in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,6 und 1 ml Glucoselösung werden mit 1 ml der Indikatoraufschlämmung versetzt und umgerührt. Man erhält die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Farbreaktionen.

Indikator !

Beispiel 2
Nachweis von Wasserstoffperoxid in Flüssigkeiten

3 ml einer 0,005%igen methanolischen Lösung von l-[l-Methyl-benzo(f)-chinolinon(2)]-2-[3-äthylbenzoxazolon(2)]-azin, 0,05 ml einer l%igen Lösung von Peroxidase in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 5,7 und 0,0d ml einer Lösung voii Wasserstoffperoxid werden zusammen pipettiert, umgerührt und nach 45 _azj_n dem Abzentrifugieren des gegebenenfalls entstandenen Niederschlags bei einer Wellenlänge von 443 nm gemessen. Die Wasserstoffperoxid-Konzentration wird anschließend mit Hilfe einer vorher aufgestellten Eichkurve bestimmt.

Beispiel 3
Nachweis von Blut in Körperflüssigkeiten

Ein Filterpapier wird mit einer Lösung von 0,25 ml eines Gemisches von Fettalkoholsulfaten und Alkylbenzolsulfaten (20%ige wäßrige Lösung) und 100 mg Natriumalginat in 100 ml eines O.lmolaren Phosphatpuffers vom pH 5,7 imprägniert und getrocknet. Das so hergestellte Pufferpapier wird mit einer 0,01%igen methanolischen Lösung von l-[l-Methyl-benzo(f)chinolinon(2)]-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azin und einer 0,01%igen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylsäure nachimprägniert und getrocknet Bringt man auf einen so hergestellten Streifen einen Tropfen einer Körperflüssigkeit, die Blut enthält, und einen Tropfen einer 3%igen Wasserstoffperoxidlösung, so färbt sich das PaDier blauviolett.

Fp. C Farbreaktion

ohne mil Modifier

1-[1-Methyl-

benzo(f)chino-

linon(2)]-

2-[3-äthylbenz-

thiazolon(2)]-

1-[1-Methyl-

benzo(f)chino-

linon(2)]-

2-[l-äthylchino-

linon(2)]-azin

230

er u η

rot

250—251 blaugrau rot

296

grün

rot

benzo(f)chino-

linon(2)]-

2-[3-äthylbenz-

oxazolon(2)]-

1-[1-Methyl-

benzo(f)chino-

linon(2)]-

2-[l,3-diäthyl-

benzimid-

azo'.on(2)]-azin

2,2'-Azino-di-[1-methylbenzo(f)-chinolinon]

354—355 blaugrün violett

339-340 grün

rotviolett

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung in an sich bekanntsr Weise, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I