DE2213674B2 - Gemisch aus pepstatin b und pepstatin c, verfahren zu dessen herstellung und dieses gemisch enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

in der für Pepstatin B, R n-Hexanoyl und für Pepstatin C, R 4-Methylpentanoyl ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Pepstatin B und Pepstatin C, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces testaceus ATCC 21469 oder Streptomyces argenteolus var. toyonakensis ATCC 21468 unter aeroben Bedingungen in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium 3 bis 10 Tage züchtet, die Pepstatine durch Extraktion und Konzentrieren des Extrakts gewinnt und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise über ihre Natriumsalze oder Ester mit niederen Alkoholen reinigt.

3. Arzneimittel, bestehend aus einem Pepstatin-Gemisch nach Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft den in den vorstehenden Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Es ist bekannt, daß Pepstatin ein Wirkstoff gegen Magengeschwüre ist. Pepstatin wird durch die Mikroorganismen Streptomyces testaceus Hamada und Okami und Streptomyces argenteolus vair. toyonakensis erzeugt. Die Eigenschaften dieser Stämme und deren Hinterlegungsnummern ATCC 21469 sowie ATCC 21468 sind im einzelnen in der DT-OS 20 28 403, Seite 4, Zeile 8 von unten beziehungsweise Seite 9, Zeile 4 von unten offenbart.

Pepstatin ist ein Pentapeptid, in dem R in der in Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel die Bedeutung 3-Methylbutanoyl hat (]. Antibiotics 23, 259-262, 1970, ibid. 23, 263-265, 1970). Pepstatin kann erhalten werden, indem ein pepstatinerzeugender Stamm in einem Pepton oder andere Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium kultiviert wird und das Pepstatin aus dem Kulturfiltrat extrahiert und dann gereinigt wird. Das Pepstatin kann ebenfalls in Form seiner Metallsalze, Amide oder Ester erhalten werden, wie dies in der DT-OS 20 28 403 beschrieben wird. Das Kulturmedium der oben angegebenen pepstatinerzeu-

genden Stämme wurde auf weitere Pepsininhibitoren untersucht, und man konnte noch zwei pepstatinähnliche Substanzen feststellen, die Antipepsinaktivität wie das Pepstatin selbst besitzen, sich jedoch vom Pepstatin bei der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterscheiden und, wie durch Gaschromatographie der Säurehydrolysate des Pepstatins nachgewiesen wurde, einen anderen Fettsäureanteil enthalten.

Ein Gemisch der Methylester von Pepstatin B und C kann in Form von feinen Nadeln aus methanolischer Lösung auskristaliisiert werden. Es zersetzt sich bei etwa 254—255°C. Die Elementaranalyse ergibt C: 60,4%, H: 9,38%, N: 9,74%. Daraus wurde die Summenformel C36H67N5O9 errechnet (C: 60,6%, H :9,4%, N :9,82%). [«]: -95,5° (^c= 0,5, Essigsäure). Die Ryrion-Smith-Reaktion ergibt eine blaue Farbe (wie Pepstatin), die Hydroxylamin-Eisen(I I I)chlorid-Reaktion eine rote Farbe. Das Gemisch der Methylester von Pepstatin B und C ist leicht löslich in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Essigsäure, jedoch schwer löslich in Wasser, Chloroform, Benzol, Äthylacetat und Äther. Es ist löslicher in Methanol als Pepstatinmethylester (5—10 mg/ml). Ein durch Einwirkung von 20%iger Salzsäure (16 Stunden bei 105⁰C) erhaltenes Säurehydrolysat von Pepstatin B- und C-Methylester wurde mit Äther extrahiert und einer gaschromatographischen Analyse und einer zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie unterworfen. In dem Ätherextrakt konnte man n-Hexansäure feststellen. In der wäßrigen Schichi wurden Valin und Alanin (2 :1) zusätzlich zu 3-Hydroxy 4-amino-6-methylheptansäure festgestellt. Darau; konnte gefolgert werden, daß die Struktur vor Pepstatin B eine Pepstatinstruktur ist, deren Acylres sich von n-Hexansäure ableitet. Bei der Kieselge(-Dünn schichtchromatographie in dem Lösungsmittelsysten Chloroform : Methanol : Essigsäure 95 : 4 : 1 ergab Pep statin B- und C-Methylester nach Anfärbung gemäl Rydon-Smith einen Rf-Wert von 0,39, Pepstatinmethyl ester einen Rf-Wert von 0,35. Das Gemisch voi Pepstatin B- und C-Methylester zeigte ebenfall Antipepsinaktivität wie Pepsiatinmethylestcr.

Aus vorstehendem ergibt sich, daß pepstatinerzeu gende Stämme auch Pepstatin B erzeugen. Aufgrutii dieser Feststellung ist zu erwarten, daß weiter pepstaünähnliche Verbindungen, die sich im Fettsäure

anteil unterscheiden, gewonnen werden können. Es konnte festgestellt werden, daß im Kulturmedium noch ein anderes Pepstatin vorhanden ist, das als Pepstatin C bezeichnet wird und den 4-Methylpentanoylrest enthält. Pepstatin C-Methylester zeigt den gleichen Rf-Wert von 0,39 wie Pepstatin B-Methylester.

Nach dem Verfahren der Erfindung können die neuen Pepstatine durch folgende Verfahrensweise erhalten werden:

Ein pepstatinerzeugender Stamm wurde in ein Nährmedium inokuliert bzw. eingeimpft, das Kasein, entrahmte Milch und/oder Sojabohnenmehl als Stickstoffquelle enthält, und 3—10 Tage unter normalen aeroben Bedingungen inkubiert, bis die Antipepsinaktivität des Nährmediums ihr Maximum erreicht. Der aktive Bestandteil kann mit n-Butanol aus der kultivierten Nährbrühe oder dem Filtrat extrahiert werden oder mit Methanol aus der Mycelmasse. Der so erhaltene Extrakt wurde zu einem Syrup konzentriert. Dann wurde der Syrup zu fünf bis zwanzig Volumen Wasser tropfenweise zugesetzt. Es entstand ein gelber Niederschlag.

Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wodurch ein Gemisch von Pepstatin B und C als Rohprodukt erhalten wurde. Das Rohpepstatin wurde in einem niederen Alkohol aufgelöst und verestert, indem mehrere Stunden bei Raumtemperatur mit einer geringen Menge eines Veresterungskatalysators, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Thionylchlorid, Phosphorpentachlorid oder Phosphoroxitrichlorid stehengelassen oder erhitzt wurde. Der Methylester der Rohpepstatine, der bei Einwirkung von Methanol entsteht, ist ein Substanzgemisch. Die Hauptmenge des Pepstatinmethylesters kann aus einer Methanollösung auskristallisiert werden. Diese kristalline Fraktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie untersucht, und man konnte die Methylester des bekannten Pepstatins und der Pepstatine B und C in einem Verhältnis 1 :1 feststellen. Von letzteren ist eine weitere Menge in der Mutterlauge enthalten, die konzentriert werden kann.

Die Kristalle werden aus Methanol umkristallisiert. Die Mutterlauge wird von den Kristallen abgetrennt. In dieser Mutterlauge kann dann fast kein Methylester des bekannten Pepstatins nachgewiesen werden. Der Methylester der Pepstatine B und C kann aus dieser Mutterlauge in Form feiner Nadeln gewonnen werden.

Das Verfahren nach der Erfindung schließt auch die Herstellung von Natrium-Salzen des Gemisches von Pepstatin B und C mittels alkalischer Hydrolyse der betreffenden Pepstatinester ein, die durch Neutralisation in das Gemisch von Pepstatin B und C übergeführt werden können. Die alkalische Hydrolyse kann nach dem Verfahren gemäß DT-OS 20 28 403 durchgeführt werden. Das in dieser Weise erhaltene Gemisch der Natriumsalze von Pepstatin B und C ist ein weißes amorphes Pulver, das einen Zersetzungspunkt von 250 bis 255°C aufweist. Die Antipepsinaktivität (ID50) des Gemisches von Pepstatin B und C in Form der Natriumsalze ist 0,055 μg. Das Pepstatin B- und C-Gemisch mit freier Carboxylgruppe ist ein amorphes weißes Pulver, das durch Umkristallisieren aus Methanol/HjO (2 : 1) erhalten wurde. Es zersetzt sich bei etwa 210-220°C. [λ] -85° (c= 1,0, Methanol); lD„,0,05 (ig. Das Infrarotspektrum wird in F i g. 2 dargestellt.

Dieses Verbindungsgemisch ist leicht löslich in Methanol (100 mg/ml), d. h. etwa lOmal so gut wie das PeDStatin. Es ist ebenfalls löslich in wäßrigem Butanol, Äthanol, Isopropylalkohol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Essigsäure und Pyridin und leicht löslich in wäßrigem Aceton, jedoch schwer löslich in wasserfreiem Aceton, wasserfreiem Butanol, Chloroform, Benzol, Äther und Wasser, Es weist anderen Pepstatinderivaten gegenüber ferner unerwartet eine erheblich verbesserte Antireninaktivität auf.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel I
A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

'S Streptomyces testaceus ATCC 21469 wurde in ein sterilisiertes Nährmedium eingeimpft, das 5,5% Glukose, 2,0% Sojabohnenöl, 4,5% entrahmte Milch, 5,0% Milchkasein, 0,15% K₂HPO₄, 0,35% NaCl und 0,15% MgSO₄ ■ 7H₂O (pH 6,45) in einem Volumen von 29001 enthielt und unter Belüftung und Rühren über einen Zeitraum von 112 Stunden bei 23—24°C inkubiert wurde. Die Konzentration aller Pepstatine (d. h. Pepstatin, Pepstatin B und C) in der Kulturbrühe wurde aus dem Analysenwert der Antipepsinaktivität zu 2260 Hg/ml berechnet. Der pH-Wert des Mediums wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 2,5 eingestellt. Dann wurden 36001 Methanol zugegeben. Anschließend wurde die Flüssigkeit 40 Minuten bei 15—20⁰C gerührt, 4% Filterhilfe zugesetzt, und dann filtriert und gewaschen. Das so hergestellte wäßrig-methanolische Filtrat von 63001 wurde mittels NaOH auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und das Methanol im Vakuum abgedampft. Man erhielt dabei einen wäßrigen Rückstand von 1900 1. Zu diesem wäßrigen Rückstand

.^ wurden 81)01 n-Butanol zugesetzt und der pH-Wert der Mischung: auf 7,0 eingestellt. Nach 30 Minuten langem Rühren bei 20°C trennte man einen Butanolextrakt von 9601 ab. Der pH-Wert dieses Butanolextraktes wurde auf 3,0 eingestellt, und es wurde im Vakuum konzentriert. Man erhielt 551 eines konzentrierten Syrups. Der so hergestellte Syrup wurde tropfenweise unter Rühren über einen Zeitraum von 60 Minuten in 8001 Wasser hineingegeben. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und lyophilisiert, wodurch 7990 g eines gelb gefärbten Rohpulvers der Pepstatine B und C erhalten wurden. Die Reinheit des Gemisches der Pepstatine B und C des so erhaltenen Pulvers betrug 64%.

B.) Veresterung des Rohprodukts mit Methanol

Das bei dem obigen Verfahren erhaltene pulverförmige Rohmaterial (6080 g) wurde in 33 1 Methanol gelöst und es wurde 1,25 kg Aktivkohle zwecks Entfärbung zugesetzt. Zu dieser entfärbten methanoiischen Lösung wurden 125 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt und bei 60°C über einen Zeitraum von 2,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von 0,63 1 Triethylamin neutralisiert und weitere 120 Minuten bei 50—60°C gerührt.

Man erhielt dabei ein weißes kristallines Pulver, das gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. Man erhielt 3230 g des Gemisches von Pepstatin-Methylestern mit einer Antipepsinaktivität (IDw) von 0,056 μg. Der Zersetzungspur.kt liegt bei 250—25) ⁰C. [<x] —90° (c= 1,0, Essigsäure). Das Pulver enthielt mehr als 80% des Gemisches von Pepstatin B- und C-Methylester (Rf 0,39, Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel).

C.) Verseifung des Gemisches der Methylester

3100 g des gemäß Verfahrensstufe B erhaltenen Pepstatin-Methylesters wurden in 1301 90prozentigmethanolischcr, 0,2 N-Natronlauge bei 60⁰C gelöst und über einen Zeitraum von 2 Stunden verseift. Das Reaktionsgemiseh wurde im Vakuum konzentriert, um das Methanol zu entfernen. Man erhielt ein trübes Konzentrat. Das Konzentrat wurde in 20 1 n-Butanol gelöst, das mit Wasser gesättigt war. Dann wurden 15 I Wasser zugegeben, und der pH-Wert wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt. Anschließend wurde 20 Minuten lang gerührt, und die obere Butanolschicht von 18 1 wurde tropfenweise in 2701 Wasser hineingegeben. Der so erhaltene Niederschlag wurde 60 Minuten lang gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wurde dann im Vakuum getrocknet und ergab 2500 g eines weißen Pulvers. Dieses Pulver zersetzt sich bei 205—210°C, [α] ff_84° (C=I₁O, Methanol). Der IDso-Wert (50% Inhibierung gegen Pepsin) lag bei 0,055 μg. Die Titrationskurve zeigte, daß 700 mg einer Probe 9.7 ml einer 0,1 N-NaOH verbrauchten.

D.) Umkristallisieren des Gemisches der Methylesier gemäß Verfahrensstufc B

100 g der erhaltenen Pepstatin-Methylester wurden in 41 absolutem Methanol gelöst und mit 20 g Aktivkohle entfärbt. Man ließ die Methanollösung über Nacht stehen und erhielt so 24 g weiße Kristalle. Die methanolisch·: Mutterlauge wurde auf 1,3 I konzentriert. Es fiel ein Niederschlag aus. Dieser Niederschlag kristallisierte nach 60minütigem Rühren bei 60"C aus. Eine zweite Kristallfraktion ergab über Nacht weitere 55,0 g an weißen Kristallen (Fraktion D₂), welche in 1,51 heißem Methanol gelöst und mit Aktivkohle behandelt wurden. Die methanolische Lösung ließ man über Nacht stehen und erhielt 12,0 g weiße Kristalle (Fraktion Dj).

Die nach der obigen Verfahrensweise erhaltenen drei kristallinen Substanzen zeigten folgende physikalischchemischen Eigenschaften:

D₁ D₂

Dj

Zersetzungstemperatur, ⁰C
[α],',", Grad (c = 0,5, Essigsäure)

ID₅O-Wert (gamma)
Rf-Werte^a)

250-251 -90,5

0,05

0,35 und

0,39

Mengen-Verhältnis:

1 : 1 bis 1 : 253-254
-91,5

0,05

0,39

Hauptmenge

0,42

Spuren

^a) Dünnschichtchromatographic

Adsorbens: Kicselgel

Laufrnitielsyssern: Chloroform/Methanol/Essigsäurc 95 :4 : ^h) Gemisch aus Pepstatin B- und C-Methylesier. 254-255 -95,5

0,05

0,39^h)

Hauptmenge

0,42

Spuren

Das Infrarotspekirum der Kristallfraktion Dj ist in F i g. 1 dargestellt.

Beispiel 2
A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

Streptomyces argcnteolus var. toyonakensis ATCC 21468 wurde in 1301 eines sterilisierten Mediums eingeimpft, das 6,0% Glukose, 2,0% Glyzerin, 4,0% abgerahmte Milch, 4,5% Milchkascin, 0,1% K₂HPO₄, 0,3% NaCl und 0.1% MgSO₄ · 7 H₂O (pH 6,8) enthielt und unter den gleichen Bedingungen wie bei Beispiel I 137 Stunden inkubiert. Die 1251 KulturbrÜhc wiesen Antipepsinaktivität auf, die 170 g Pepstatin äquivalent war. Es wurden 601 n-Bulanol zugesetzt und 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die Butanolschicht, die Wasserschicht und die feste Schicht (Mycclmasse) durch Zentrifugieren getrennt. Die Butanolschichl wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum auf 1,5 I Syrup konzentriert. Der pH-Wert des Sirups wurde auf 3,0 eingesteht >.<nd es wurden 7,S 1 η-Hexan zugesetzt, wobei unter Rühren ein gelbbrauner Niederschlag entstand. Es wurde weiterhin 60 Minuten gerührt, der Niederschlag wurde abfiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 164 g eines Rohpcpstutins mit einer Antipepsinaktiviiät ID_M, 0,075 ng.

B.) Reinigung des Kohpepslutitis durch Umfüllen

150 g des gemllH Verfnhrensslufc A erhaltenen Rohpcpstalins wurden in 1,51 W/oig. Methanol bei 40-50°C gelöst und mit 150 g Aktivkohle entfärbt. 1,6 I der entfärbten methanolischen Lösung wurden bei Raumtemperatur mit 1,0 I Wasser versetzt. Man erhielt einen gclartigen Niederschlag, der abfiltriert, mit 50%ig. Methanol gewaschen und lyophilisiert wurde. Man erhielt 94 g eines leicht gelblichen Pulvers mit einem ID₅₀-WeH von 0,062 ng. Dieses Pulver wurde in 90%ig.

-is Methanol gelöst und zweimal wie vorher mit Aktivkohle behandelt. Man erhielt 45 g eines weißen Pepstatinpulvers. Der IDw-Wcrt lag bei 0,055 ng, die Zcrsctzungstemperatur bei 198-205⁰C, [«] -79" Cf=I₁O, Methanol). Bei Dünnschichtchromatographie zeigte

so dieses Pulver Rf-Wcrte von 0,35 (Pcpstatin-Methylester), von 0,39 (Pepstatin B- und C-Methylester) um! von 0,42.

Ci) Herstellung des Äthylesters

4,0 g des gemUß Verfahrensstufe B erhaltenen Pepslatins wurden in 100 ml absolutem Äthanol unter F.rwHnnon grlttst. und r><; wurrlpn 0,9 ml krin/entricrtc Schwefelsaure zugesetzt. Diese Mischung wurde t

(«ι Stunden unter Rückfluß erhitzt und im Vakuum aul 50 ml konzentriert. Der dabei gebildete Niederschlag wurde abfiltricrt, mit Äthanol gewaschen, getrock'nc und ergab 1,6 g eines Pulvers. Dieses Pulver wurde otu i00 ml absolutem Methanol umkristailisiert. Man erhiel

<>s 1,15g eines weißen Pulvers des Pepstatin B- um C-Athylestcrs mit ID₅O 0,054 μg, einem Zcrsctzungs punkt von 250-25I⁰C und einer Drehung von \(* -90" Cc=0,5, Essigsäure).

C₂) Herstellung des n-Propylesters

0,3 g des gemäß Verfahrensstufe B erhaltenen Pepstatins wurden in 100 ml absolutem n-Propylalkohol unter Erhitzen gelöst. Dann wurden 0,2 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, und es wurde 6 Stunden bei 8O⁰C verestert. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum auf 20 ml konzentriert, und es entstand ein Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit n-Propylalkohol gewaschen und getrocknet. Man erhielt 900 mg eines weißen Pulvers, das aus 40,0 ml absolutem Propylalkohol umkristallisiert wurde und 480 mg Pepstatin-B und C-n-Propylester ergab. Dieses zeigte ID50 0,073 μg₎ einen Zersetzungspunkt bei 218-22O⁰C und [α] 'S -89,5° ^c= 0,5, Essigsäure).

Beispiel 3
A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

Streptomyces testaceus ATCC 21469 wurde in 1301 eines sterilisierten Mediums eingeimpft, das 6,0% Glukose, 2,0% Glyzerin, 1,5% abgerahmte Milch, 1,5% Kasein, 5,7% Sojabohnenmehl, 0,1% K₂HPO₄, 0,3% NaCI und 0,1% MgSO₄ ■ 7 H₂O(pH 5,5) enthielt und 137 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 inkubiert. HOl der Kulturbrühe mit einem Wirkstoffgehalt, der 132 g Pepstatin äquivalent war, wurde unter Zusatz von 7 kg Filterhilfe filtriert, und der pH-Wert wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt. Dann wurden 33 kg eines Mycelkuchens (Naßgewicht) und 75 I Filtrat abgetrennt. Der Mycelkuchen wurde zu 83 I absolutem Methanol zugegeben, und man erhielt nach 40 Minuten langem Rühren eine Aufschlämmung. Die Aufschlämmung wurde filtriert, und der Kuchen wurde zweimal mit 401 eines 70%ig. Methanols gewaschen. Man erhielt 1401 eines wäßrigmethanolischen Extrakts. Zu 75 1 der obigen filtrierten Brühe wurden 35 I n-Butanol zugesetzt, und es wurde 15 Minuten lang gerührt. 37 I einer Butanol-Schicht wurden von 731 einer wäßrigen Schicht abgetrennt. 1401 des obigen wäßrig-methanolischen Extrakts, der von dem Mycelkuchen erhalten worden war, wurde im Vakuum zu 27 I einer wäßrigen Lösung konzentriert und mit 37 I des oben angegebenen Butanolextrakts vermischt. Diese Mischung wurde zentrifugiert, um db wäßrige Schicht zu entfernen, und man erhielt 351 eines Butanolextrakts. Der Butanolextrakt wurde auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und im Vakuum auf 1 I Syrup konzentriert. Dieser Syrup wurde tropfenweise in 151 Wasser hineingegcbcben und 60 Minuten lang gerührt. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei 60-7O⁰C getrocknet. Man erhielt 158 g eines gelblichen Pulvers von Pepstatin B und C. Die 50%ige Inhibierung gegen Pepsin (ID₅₀) lag bei 0.072 μg.

B.) Veresterung des Rohprodukts mit Methanol

Das so hergestellte Pulver wurde wie in Beispiel I, Verfahrensstufe B, mit Methanol verestert und ergab 62 g eines weißen kristallinen Pulvers von Pepstatin B- und C Methylester mit einem IDw-Wert von 0,05 ng. Zersetzungspunkt 250-252⁰C. [α] -90,6° (o=0,5, Essigsäure). Bei der Dünnschichtchromatographie wurde festgestellt, daß das so hergestellte weiße kristalline Pulver hauptsächlich aus Pepstatin B- und C-Methylester (Rf = 0,39) besteht und Spuren von Pepstatinmethylester enthalten sind.

C.) Verseifung des Gemisches der Methylester

30 g des so erhaltenen Pepstatinmethylesters wurden in 450 ml 0,2 N-NaOH in 90%igern Methanol zwei Stunden bei 6O⁰C verseift. Die Reaktionsmischung

:o wurde mittels verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und auf 150 ml konzentriert, wobei ein weißer Niederschlag entstand. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet und ergab 17,9 g eines weißen Natriumsalz-Pepstatinpulvers mit ID₅₀ 0,05 μg, einem Zersetzungspunkt von 245—249°C und einer Drehung von [öl] i' —84° (c= 1,0, Methanol). Bei der Tiiration verbrauchten 700 mg dieses Materials 10,1 ml einer 0,1 N-HCI.

Beispiel 4

A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

Streptomyces argenteolus var. toyonakensis ATCC

.VS 21468 wurde in 1301 eines sterilisierten Mediums eingeimpft, das 6,0% Glukose, 2,0% Glyzerin, 4,2% Milchkasein, 1,0% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,3% NaCI und 0,1% MgSO,. · 7 H₂O (pH 7,0) enthielt und zu den gleichen Bedingungen wie in Beispiel I über einen

ac Zeitraum von 132,5 Stunden inkubiert. 1301 des Kulturmediums, mit einem Wirkstoffgchalt, der IHg Pepstatin äquivalent war, wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel I beschrieben, aufgearbeitet und ergab 133 g Rohpcpstatin mit einem \D_W gegen Pepsin

-IS 0,076 μ^

B.) Veresterung des Rohprodukts mit Methanol

Das so erhaltene gelbe Pulver wurde wie in Beispiel 1 B behandelt, und man erhielt 58,5 g Pcpstatinmethylso ester mit IDw 0,051 μ^, einem Zersetzungspunkl bei 255-256"C und einer Drehung [«],.-95,5" (c0,5 Essigsäure). Bei der Dunnschichtchromatogruphie erhielt man einen Rf-0,35 und einen Rf-0,39 (I : 1) jedoch wurde ein Rf-Wert von 0,42 nicht festgestellt.

I lieivii 1 lihilt ΛίιΊιιηιμικίι

709 536/1

Claims (1)

1. Patentansprüche:
   1. Gemisch aus Pepstatin B und Pepstatin C der allgemeinen Formel

   CHj
   CHj CHj CH-CHj

   CH-CHj CH-CHj CH₂ OH CH₃

   R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH CH-CH₂-CO-NH-CH-Co

   CH₃

   CH-CH₃ CH₂ OH NH -CH -— CH — CH₂ — COOH