DE2213674A1 - Verfahren zur Herstellung neuer Pepstatine mit Antipepstatinaktivitat - Google Patents

Description

ZAIDAN HOIJN BISEIBUTSU K.K.K., TOKYO - Japan

Verfahren zur Herstellung neuer Pepstatine mit Antipepstatinaktivität.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Substanzen der Pepstatingruppe, die durch pepstatinbildende Organismen erzeugt werden.

Es ist bekannt, daß Pepstatin ein wirksames Mittel gegen Magengeschwüre ist. Es konnte festgestellt werden, daß Pepstatin durch die Mikroorganismen Streptomyces testaceus Hamada und Okami und Streptomyces argenteolus var, toyonakensis erzeugt wird. Pepstatin ist ein Pentapeptid, das N-endständig eine N-acylierte Isovalerian-

209844/1158

säure und G-endständig eine freie Karbonsäure enthält (J. Antibiotics, 23, 259-262, 197o, ibid, 23, 263-265, 197o). Pepstatin kann erhalten werden, indem ein pepstatinerzeugender Stamm in einem Peptol oder andere Stickstoffquellen enthaltendem Nährmedium kultiviert wird und das Pepstatin aus dem Zuchtmedium extrahiert und dann gereinigt wird. Das Pepstatin kann ebenfalls in Form seiner Metallsalze, Amide oder Ester erhalten werden, wie dies in der japanischen Patentanmeldung Nr. 46166/69 beschrieben wird. Im Zuchtmedium der oben angegebenen pepstatinerzeugenden Stämme wurden unter verschiedenen Bedingungen Pepsininhibitoren untersucht und man konnte mehr als zwei pepstatinähnliche Substanzen feststellen, die Antipepsinaktivität wie das Pepstatin selbst besitzen, sich jedoch vom Pepstatin bei Siliziumoxydgel-Dünnschicht-Chromatographie unterscheiden und bei Gaschromatographie einen anderen Fettsäureanteil des Pepstatins der Säurehydrolysate zeigen.

Eines der neuen Pepstatine, das als Pepstatin B bezeichnet wird, kann in Form von feinen Nadeln eines Methylesters aus methanolischer Lösung auskristallisiert werden. Es schmilzt bei etwa 254 - 255 C und die Elementaranalyse ergibt C 6o,4%, N 9,74%, H 9,38%. Es wurde ausgerechnet, daß es sich dabei um die Verbindung C_ H

3d 67

N O„ handelt (C 6o,6 %, H 9,4 %, N 9,82 %.) Die optische Drehung 5 9

Hegt bei[ptn? = -95,5° (C = 0,5, Essigsäure). Man erhält eine blaue Farbe bei Durchführung der Rydon-Smith Reaktion als Pepstatin und eine rote Farbe bei der Hydroxylamin-Eisen-III-Chlorid-Reaktion. Der Methylester des Pepstatins B ist leicht löslich in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Essigsäure, jedoch schwer löslich in Wasser, Chloroform, Benzol, Äthylacetat und Äther. Er ist löslicher in Methanol als der Pepstatinmethylester (S- 1o mg/ml).

2098U/1158

j ■ 221367A

Ein 16 Stunden bei 1o5 C mit 2o %iger Salzsäure extrahiertes Säurehydrolysat von Pepstatin - B - methylester wurde mit Äther extrahiert und einer gaschromatographischen Analyse und einer zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie unterworfen. In dem Ätherextrakt konnte man n-Kapronsäure feststellen. In der wässrigen Schicht wurden Valin und Alanin (2 : 1) zusätzlich zu 3-Hydroxy- 4 -amino-6-methylheptansäure festgestellt. Daraus konnte gefolgert werden, daß die Struktur von Pepstatin B eine Pepstatinstruktur ist, die im Fettsäureanteil mit Kapronsäure substituiert ist. Das Pepstatin hat folgende Struktur:

CH CH CH

^{3 3}

CH CH CH

ι ν* / ^ö ^ / I

CH CH CH CH_nOH CH

I²I I I²I · I ³

CO-NH - CH -CO-NH-CH -CO-NH-CH-CH-CH -CO-NH-CH (L) (L) (L)

^CH3 °.^H3

I
CH OH

I ²I

CO-NH - CH -CH-CH-COOH

Bei der Siliziumoxydgel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem Chloroform : Methanol : Essigsäure = 95 : 4 : 1 ergab die Rydon- Smith Farbreaktion des Pepstatin- B-methylesters einen Rf-Wert von 0,39 und für Pepstatinmethylester einen Rf-Wert von 0,35. Der Pepstatin-B-methylester zeigte die gleiche Antipepsinaktivität wie der Pepstatinmethylester.

2098U/1158

Aus dem obigen ergibt sich, daß pepstatinerzeugende Stämme auch Pepstatin B erzeugen, wobei der Fettsäureanteil des Pepstatinmoleküls mit Kapronsäure substituiert ist. Aufgrund dieser Feststellung ist zu erwarten, daß weitere pepstatinähnliche Verbindungen, die sich im Fettsäureanteil unterscheiden, hergestellt werden können. Es konnte festgestellt werden, daß auch ein anderesFepstatin vorhanden ist, das als Pepstatin C bezeichnet wird und Isokapronsäure enthält. Der Pepstatin- C-methylester zeigt den gleichen Rf-Wert von 0,39 wie das Pepstatin B. Es konnte eine weitere Pepstatingruppe festgestellt werden, deren Methylester einen Rf-Wert von 0,42 besitzt. Diese Anti— pepsinaktivität zeigende Verbindung wurde in Form feiner nadelartiger Kristalle erhalten und das saure Hydrolysat ergab bei der Gaschro·^ matographieanalyse die gleichen Aminosäuren und fünf Fettsäuren

Die neuartigen Pepstatine nach der vorliegenden Erfindung können als Pepstatine definiert werden, die C -C -Fettsäure enthalten wie bei-

5 ίο

spielsweise n- Kapronsäüre oder Isokapronsäure im Unterschied zu der Isovaleriansäure des Pepstatins.

Nach dem Verfahren der Erfindung können die neuartigen Pepstatine durch folgende Verfahrensweise erhalten werden:

Ein pepstatinerzeugender Stammwurde in ein Nährmedium inokuliert bzw. eingeimpft, das Kasein, entrahmte Milch und / oder Sojabohnenmehl als Stickstoffquelle enthält, und 3 - 1o Tage unter normalen aeroben Bedingungen inkubiert, bis die Antipepsinaktivität des Nährmediums ihr Maximum erreicht. Der aktive Bestandteil kann mit n-Butanol aus der kultivierten Nährbrühe oder dem Filtrat extrahiert werden oder mit Methanol aus der Mycelmasse. Der so erhaltene Extrakt wurce zu einem Syrup konzentriert. Dann wurde der Syrup zu fünf bis zwanzig Volumen Wasser tropfenweise zugesetzt und es ent-

209844/1158

stand gelber Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wodurch die neuartigen Pepstatine im rohren Zustand erhalten wurden. Das Rohpepstatin wurde in niedere Alkohole aufgelöst und verestert, indem mehrere Stunden bei Raumtemperatur oder bei höherer Temperatur erhitzt oder stehengelassen wurde mit einer geringen Menge eines Veresterungskatalysators· wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Para-Toluolsäure, Thionylchlorid, Phosphorpentachlorid oder Phosphoroxytrichlorid etc. Der Methylester der Rohpepstatine, der aus der Methylveresterung entsteht, ist eine Mischung, und ein Hauptteil des Pepstatinmethylesters kann aus einer Methanollösung auskristallisiert werden. Diese kristalline Fraktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie untersuchend man konnte den Methylester des ursprünglichen Pepstatins und der neuen Pepstatine in einem Verhältnis 1 : 1 feststellen. Von dem letzteren ist eine weitere Menge inder Mutterlösung bzw. Mutterlauge enthalten, die konzentriert werden kann.

Die Kristalle werden aus methanolischer Lösung rekristallisiert und die Mutterlauge wird von den Kristallen abgetrennt. In dieser Mutterlauge kann dann fast kein Methylester des ursprünglichen Pepstatins festgestellt werden und der gereinigte Methlester der neuen Pepstatine kann aus dieser Mutterlauge in Form feiner Nadeln rekristallisiert werden.

Das Verfahren nach der Erfindung betrifft auchd e Herstellung von alkalischen Salzen der neuen Pepstatine mittels alkalischer Hydrolyse der neuartigen Pepstatinalkoholester. Das Verfahren nach der Erfindung betrifft ebenfalls die Herstellung der freien Form der neuen Pepstatine mittels Neutralisation der oben genannten alkalischen l-lydrolysate. Die alkalische Hydrolyse kann nach dem gleichen Verfahren durchgeführt werden wie es in der japanischen Patentanmeldung

209844/1 158

- 6-

2 2 13 6 7 A

Nr. 46166/69 beschrieben wird. Das in dieser Weise erhaltene Natriumsalz des Pepstatins B ist ein weißes amorphes Pulver, das einen Zersetzungspunkt von Pepsin (ID ) bei O,O55 und ID bei O,O5 zeigt. Im Gegensatz zum Pepstatin befand sich die freie Form des Pepstatins B in einer amorphen Form eines weißen Pulvers, das durch Rekristallisation aus Methanol HO (2:1) erhalten wurde. Es zersetzt sich bei etwa 21 ο - 22o C. Die spezifische Drehung liegt bei fcM _n ^De^ -85 C (C = 1,0 Methanol). Das Infrarotspektrum wird in Figur 2 dargestellt.

Diese Verbindung ist leicht löslich in Methanol (1oo mg/ml) d.h. etwa 1o mal so gut wie das normale Pepstatin. Die Verbindung ist ebenfalls löslich in wässrigem Butanol, Äthanol, Isopropylalkohol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Essigsäure oder Pyridin und leicht löslich in wässrigem Aceton, jedoch schwer löslich in wässerfreiem Aceton, wasserfreiem Butanol , Chloroform, Benzol, Äther und Wasser.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele im einzelnen erläutert:

Beispiel 1

Ein pepstatinerzeugender Streptomyces testaceus-Stamm wurde in ein stabilisiertes Medium eingeimpft, das 5,5 % Glukose, 2,ο % Sojabohnenöl, 4,5 % entrahmte Milch, 5, ο % Milchkasein, o, 15 % K HPO , 0,35 % NaCl, O, 15% MgSo 7HO (pH 6,45) in einem Volumen von 29oo I enthielt und unter Belüftung und Rühren über einen Zeitraum von 112 Stunden bei 23-24 C inkubiert wurde. Die Kulturbrühe enthielt die Antipepsin-Hauptform (anti-pepsin principle), die 226o ecm äquivalent war. Der pH-Wert des Mediums wurde auf 2,5 mittels verdünnter Schwefelsäure eingestellt und es wurden 36oo I zugegeben. Anschließend wurde

ο ι lang bei 15 - 2o

209844/1 158

die Flüssigkeit 4o Minuten lang bei 15 - 2o C gerührt, 4 % Filterhilfe

zugesetzt, und dann filtriert und gewaschen. Das so hergestellte methanolische Eluat von 63oo I wurde mittels Alkali auf einen pH-Wert von 1o eingestellt und das Methanol im Vakuum abgedampft. Man erhielt dabei einen wässrigen Rückstand von 19oo I. Zu diesem wässrigen Rückstand wurden 800 I n-Butanol zugesetzt und der pH-Wert der Mischung auf 7,O eingestellt. Nach 3o Minuten langem Rühren bei 2o C trennte man einen Butanolextrakt von 96o I ab. Der pH-Wert dieses MutanoWxtraktes wurde auf 3, O eingestellt und es wurde in Vakuum konzentriert. Man erhielt 55 I eines konzentrierten Syrups. Der so hergestellte Syrup wurde tropfenweise unter Rühren über einen Zeitraum von 60 Minuten in 800 I Wasser hineingegeben. Der dabei hergestellte Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und lyophilisiert, wodurch 799o g eines gelb gefärbten Rohpulvers der neuen Pepstatine erhalten wurden. Die antipepsinaktive Hauptform, die dem Pepstatin äquivalent war, war in 64 % des Pulvers enthalten.

Das bei dem obigen Verfahren erhaltene pulverförmige Rohmaterial (6080 g) wurde in 33 I Methanol aufgelöst und es wurde 1,25 kg Aktivkohle zwecks Entfärbung zugesetzt. Zu dieser entfärbten methanolischen Lösung wurde η 125 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt und bei 60 C über einen Zeitraum von 2, 5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Zusatz von o,63 I Triäthylamin neutralisiert und weitere 12o Minuten bei 5o - 60 C gerührt. Man erhielt dabei ein weißes kristallines Pulver. Dieses weiße kristalline Pulver wurde gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 323o g des neuen Pepstatinmethylesters, der eine Anti peps inaktivi tat (ID ) bei O,O56

ο besitzt. Der Zersetzungspunkt liegt bei 25o - 251 C und die Drehung bei [cClr) ⁼ ~⁹° (^{c = 1})°> Essigsäure). Das Pulver enthielt mehr als θο % des Pepstatin - B - methylester (Rf = 0,39 bei Dünnschichtchromatographie).

2098U/115S

"■ t> "■

Beispiel 2

31 oo g des nach Beispiel 1 erhaltenen Pepstatinmethylesters wurden in 13o I einer Mischung aus 0,02 normalen NaOH und 9o %igem Methanol bei 6o C aufgelöst und über einen Zeitraum von 2 Stunden verseift. Die Reaktionsmischung wurde in Vakuum konzentriert, um das Methanol zu entfernen und man erhielt ein trübes Konzentrat . Das Konzentrat wurde in 2o n-Butanol aufgelöst das mit Wasser gesättigt war. Dann wurden 15 1 Wasser zugegeben und der pH-Wert wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 3, O eingestellt. Anschließend wurde 2o Minuten lang gerührt und die obere Butanolschicht von 18 I wurde tropfenweise in 27o I Wasser hineingegeben. Der so erhaltene Niederschlag wurde 6o Minuten lang gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wurde dann im Vakuum getrocknet und ergab 25oo g eines weißen Pulvers. Dieses Pulver besaß einen Zersetzungspunkt von 2o5 - 21 ο C, und eine Drehung

von fool ^°=-84°(C« 1,0 Methanol). Der ID_ Wert (5o % Inhibie-1--'D 5O

rung gegen Pepsin) lag bei O,O55 Jf . Die Titrationskurve zeigte, daß 7oo mg der Probe 9,7 ml einer 0,1 normalen NaOH verbrauchten.

Beispiel 3

1oo g der in Beispiel 1 erhaltenen neuen Pepstatinmethylester wurden in 4 I absolutem Methanol aufgelöst und mit 2o g Aktivkohle entfärbt. Man ließ die Methanollösung über Nach stehen und erhielt zunächst 24 g , weißer Kristalle. 4,2 I der methanolischen Mutterlauge wurden auf 1,3 1 konzentriert und es fiel ein Niederschlag aus. Dieser Niederschlag wurde nach 6o Minuten langem Rühren bei 6o C auskristallisiert. Die zweite Auskristallisation ergab über Nach 5, 5 g einer zweiten Ausbeute an weißen Kristallen. Diese zweiten Kristalle wurden in 1, 5 1 heißem Methanol aufgelöst und mit Aktivkohle be-

OWCHNAL «iete

handelt. Die methanolische Lösung ließ man über Nach stehen und erhielt 12,Og weiße Kristalle als dritte Ausbeute.

Die nach der obigen Verfeh rensweise erhaltenen drei kristallinen Substanzen zeigten folgende physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Erste K ristall-Aus beute:

Zersetzungspunkt: 25o - 251 C

r τ 2o ο

OU r^ ⁼ -9o,5 (C = O, 5 , Essigsäure) LJD

ID = O,O5

5o

Rf-0,35 Substanz: Rf -0,39 Substanz = 1:1 -1:2

(Dünnschichtchromatographie: Chloroform : Methanol : Essigsäure = 95 : 4 : 1)

Zweite Kristall-Ausbeute:

Zersetzungspunkt: 253 — 254 C

l2o

ja] ° = - 91,5° (C = 0,5, Essigsäure) = O,O5

oo

Hauptsächlich Rf 0,35-Substanz und Spuren von Rf 0,42- Substanz (Dünnschichtchromatographie : Chloroform: Methanol : Essigsäure = 95 : 4 : 1)

Dritte Kristall-Aus beute:

Zersetzungspunkt: 254- 255 C

jgJJ ^ = -95,5 (C = 0,5 Essigsäure)

ID = O,O5

öo

Hauptsächlich Rf 0,39 -Substanz (Pepstatin B) und Spuren von Rf 0,42-Substanz 2098 4 A/1158

ORIGINAL INSPECTED

40 2213S74

(Dünnschichtchromatographie : Chloroform : Methanol : Essigsäure = 95 : 4 : 1)

Das Infrarotspektrum ist in Fig. 1 dargestellt Elementaranalyse(gefunden):

C 6o, 14 %, H 9, 38 %, N 9, 74 %

Schwach löslich in Dimethylsulfoxid, Demethylformamid und Essigsäure, schlecht löslich in Methanol (5 - 1o mg/ ml), jedoch löslicher als Pepstatinmethylester.

Beispiel A

Pepstatinerzeugende Stämme wurden in 13o I eines sterilisierten Medium* eingeimpft, das 6,0 % Glukose , 2,0 % Glyzerin, 4,0 % abgerahmte Milch 4, 5 % Milchkasein, 0,1 % K HPO 0,3 %NaCl,O,1 % MgSO ' 7HO (pH 6, 8) enthielt und unter den gleichen Bedingungen wie bei Beispiel 1, 137 Stunden lang inkubiert. Die 125 I Zuchtmedium enthielten eine Hauptform mit Antipepsinaktivität (anti-pepsin principle) die 1 7o g Pepstatin äquivalent war. Es wurden 6o I n-Butanol zugesetzt und 4o Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die Butanolschicht, die Wasserschicht und die feste Schicht (MYcelmasse) mittels Zentrifugierung getrennt. Die Butanolschicht wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum auf 1,5 1 Syrup konzentriert. Der pH-Wert des Syrups wurde auf 3, O eingestellt und es wurden 7,5 I η-Hexan zugesetzt, wobei unter Rühren ein gelbbrauner Niederschlag entstand. Es wurde weiterhin 6o Minuten lang gerührt, der Niederschlag wurde aofiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet, Man erhielt 164 g eines neuen Rohpepstatins mit einer Antipepsinaktivität ID-^ = O,O75.
5o

15o g des neuen Pepstatins wurden in 1,5 1 eines 9o %igen Methanols

ORIGINAL INSPECTED 209844/1 1 58 _ ₁₂~

-¹H-

bei 4o - 5o C aufgelöst und mit 15o g Aktivkohle entfärbt. 1,6 1 der entfärbten methanolischen Lösung wurden bei Raumtemperatur mit 1,Ol Wasser versetzt und man erhielt einen gelartigen Niederschlag. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert, mit 5o%igem Methanol gewaschen und lyophisiert. Man erhielt 94 g eines leicht'gelblichen Pulvers. Sein ID gegen pepsin lag bei O,O62. Dieses PuI-

oo

ver wurde in 9o %igem Methanol aufgelöst und zweimal wie vorher mit Aktivkohle behandelt. Man erhielt 45g eines weißen Pepstatinpulvers. Der ID -Wert lag bei O,O55 , der Zersetzungspunkt bei 198 - 2o5° C und die Drehung bei L^J ° =-79° (C = 1,O, Methanol). Bei Dünnschichtchromatographie zeigte diese Verbindung einen Rf-Wert von 0,35 (Pepstatin), einen Rf-Wert von 0,39 (Pepstatin B und Pepstatin C ) und einen Rf-Wert von 0,42.

Beispiel 5

Ein pepstatinerzeugender Stamm wurde in 13o I eines sterilisierten Mediums eingeimpft, das 6, O % Glucose, 2,0 % Glyzerin, 1,5 % abgerahmte Milch, 1,5 % Kasein, 5,7 % Sojabohnenmehl, 0,1 % K HPO , 0,3 % NaCl und 0,1 % MgSO * 7 H (pH 5,5) enthielt und 137 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 inkubiert. 11o 1 des Kulturmediums bzw. der Kulturbrühe, die eine Hauptform mit anti-Pepsinaktivität enthielt, die 132 g Pepstatin äquivalent war, wurde unter Zusatz von 7kg Filterhilfe filtriert und der pH-Wert wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt. Dann wurden 33 kg eines Mycelkuchens (Naßgewicht) und 75 I Filtrat- abgetrennt. Der Mycelkuchen wurde zu 831 absolutem Methanol zugegeben und man erhielt nach 4o Minuten langem Rühren eine Aufschlemmung. Die Aufschlemmung wurde dann filtriert und der Kuchen wurde zweimal mit 4o I eines 7o%igen Methanols gewaschen und man erhielt 14o I eines wässrigen, methanolischen Eluats.

209844/ 1158

- 13 - .

Zu 75 I der obigen filtrierten Brühe wurden 35 I n-Butanol zugesetzt und es wurde 15 Minuten lang gerührt. 37 I einer Butanol-Schicht wurden von 73 I einer wässrigen Schicht abgetrennt. 14o I des obigen wässrigen, methanolischen Eluats, das von dem Mycelkuchen erhalten worden war, wurde im Vakuum auf 27 I einer wässrigen Lösung konzentriert und mit 37 I des oben angegebenen Butanolextrakts vermischt, das von dem Kulturmedium bzw. Kulturbrühe erhalten worden war. Diese Mischung wurde zentrifugiert, um die wässrige Schicht zu entfernen und man erhielt 35 I eines Butanolextrakts. Der Butanolextrakt wurde auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und im Vakuum auf 11 Syrup konzentriert. Dieser Syrup wurde tropfenweise in 15 I Wasser hineingege ben und 6o Minuten lang gerührt. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei 6o - 7o C getrocknet. Man erhielt 158 g eines gelblichen Pulvers des neuen Pepstatins.Die 5o %ige Inhibierung gegen Pepsin (ID ) lag bei O,O72

oo

Das so hergestellte Pulver wurde wie in Beispiel 1 in Methanol verestert und ergab 62 g eines weißen kristallinen Pulvers des neuen Pepstatinm ethyl esters. Sein ID_ -Wert lag bei O,O5 , der Zersetzungspunkt

5o

bei 25o- 252° C und die Drehung £ <M ° = -9o,6° (C = 0,5) Essigsäure). Bei der Dünnschichtchromatographie wurde festgestellt, daß das so hergestellte weiße kristalline Pulver hauptsächlich aus dem neuen Pepstatinmethylester (Rf = 0,39) besteht und Spuren von Pepstatinmethylester enthalten sind.

3o g des dabei erhaltenen Pepstatinmethylesters wurden in 45o ml von einer 0,2 normalen NaOH - 9o% Methanollösung zwei Stunden lang bei 6o C verseift. Die Reaktionsmischung wurde mittels verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 8. 5 eingestellt und auf 15o ml konzentriert

- 14 -

09844/1158

Αό

wobei ein weißer Niederschlag entstand. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet und ergab 17,9 g eines weißen Natriumsalz-Pepstatinpulvers mit ID = O,O5 ,

5o

einem Zersetzungspunkt von 245 - 249 C und einer Drehung von L^

2o ο

= -84 (C = 1,0 Methanol). Bei der Titration verbrauchten 7oo mg

dieses Materials 1o,1 cc einer 0,1 N HCl. Beispiel 6

Ein pepstatinerzeugender Stamm wurde in 13o I eines sterilisierten· Mediums eingeimpft, das 6,0 % Glukose, 2,0 % Glyzerin, 4,2 % Milchkasein, 1,O % Pepton, 0,1 % K HPO , O,3 % NaCl und O,1 % MgSO · 7HO (pH= 7,O) enthielt und zu den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 über einen Zeitraum von 132,5 Stunden inkubiert. 13o I des Kulturmediums, das ein antipepsinaktives Material enthielt, das 111g Pepstatin äquivalent war, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und ergab 133 g eines rohen neuen Pepstatins

mit einem ID_ gegen Pepsin = O,O76
5o

Das so erhaltene gelbe Pulver wurde wie in Beispiel 1 behandelt und man erhielt 58,5 g eines neuartigen Pepstatinmethylesters mit ID_ = O, O51 , einem Zersetzungspunkt bei 255 - 256 C und einer

Drehung \j£} =-95,5 (C = 0,5, Essigsäure). Bei der Dünnschichtchromatographie erhielt man einen Rf« 0,35 und einen Rf = 0,39 (1 : 1), jedoch wurde ein Rf- Wert von 0,42 nicht festgestellt.

Beispiel 7

4,Og der freien Form des aus Beispiel 2 erhaltenen Pepstatins wurden in 1oo ml absolutem Methanol unter Erwärmen aufgelöst

209844/1158 ~¹⁵~

und es wurden 0,2 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt. Diese Mischung wurde 6 Stunden lang auf einem kochenden Wasserbad unter Rückfluß erhitzt und im Vakuum auf 5o ml konzentriert. Der dabei gebildete Niederschlag wurde abfiltrrert, mit Äthanol gewaschen, getrocknet und ergab 1,6 g eines Pulvers. Dieses Pulver wurde aus 1oo ml einer absoluten Methanollösung rekristallisiert und man erhielt 1,15 g eines weißen Pulvers des Pepstatins-B-äthylesters mit ID,_ = O,O54 , einem Zersetzungspunkt von 25o - 251 C und einer

OO -Io

Drehung von L^J ° = -9o ° (C = 0,5, Essigsäure). Beispiel 8

3,Og des nach Beispiel 2 erhaltenen neuartigen Pepstatins wurde in 1oo ml absolutem n-Propylakohol unter Erhitzen aufgelöst. Dann wurden 0,2 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt und es wurde 6 Stunden bei 8o C verestert. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum auf 2o ml konzentriert und es entstand ein Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit n-Propylalkohol gewaschen und getrocknet. Man erhielt 9oo mg eines weißen Pulvers, das aus 4o,o ml absolutem Propylalkohol rekristallisiert wurde und 48o mg eines weißen Pepstatin-B-n-propylesterpulvers ergab. Dieses zeigte ID = O,O73 , einen Zersetzungspunkt bei 218 - 22o° C und

° =-89,5° (C = 0,5, Essigsäure).
Beispiel 9

3,Og des nach Beispiel 2 erhaltenen neuartigen Pepstatins wurden in 1oo ml warmen, absoluten n-Butanol aufgelöst und o,2 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt. Die Umesterung wurde 6 Stunden lang bei 8o C durchgeführt und im Vakuum auf 2,0 ml konzentriert.

209844/1158

Der dabei erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit n-Butanol gewaschen und getrocknet. Man erhielt 800 mg eines weißen Pulvers, das aus 15,ο ml n-Butanol rekristallisiert wurde und 34o ml eines w eißen Pepstatin - B-n-butylesterpulvers ergab. Dieses zeigte einen '

ο ID -Wert von O,O84 , einen Zersetzungspunkt bei 2o5 - 2o7 C

⁵⁰ ΓλΙ 2o ο

und eine Drehung [F^j =-88 (C = 0,5, Essigsäure).

209844/1158

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   Verfahren zur Herstellung neuer Pepstatine, dadurch gd< ennzeichnet, daß ein pepstatinerzeugender Stamm in einem Nährmedium gezüchtet wird, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, und die neuen Pepstatine aus dem Zuchtmedium isoliert werden.
2. 2. Verfahren zur Herstellung neuer Pepstatine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ester, die Salze oder andere Derivate der neuen Pepstatine in herkömmlicher Weise hergestellt werden.

   209844/1158

   , 4t

   Leerseite