DE2146400C3 - Neuer biosynthetischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung und diesen Wirkstoff enthaltende Arzneimittelpräparate - Google Patents
Neuer biosynthetischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung und diesen Wirkstoff enthaltende ArzneimittelpräparateInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einen neuen biosynthetischen Wirkstoff (MM 4550) mit den nachstehenden Parametern:
(a) Säurefunktion,
(b) Hemmung der Penicilline und Cephalosporine abbauenden Wirkung von /)-Lactamase-Enzymen,
(c) Wasserlöslichkeit,
(d) Hemmung des Wachstums von Staphylococcus aureus- und Klebsiella aerogenes-Stämmen,
(e) bei der Elektrophorese Wanderung von 18 cm gegen die Anode auf einem 40 cm langen
Papierstreifen aus Whatman-3-MM-Papier unter Verwendung von mit Zellglas abgedeckten Papierdochten einer Gesamtlänge von 10 cm bej
25mmütigem Anlegen einer Spannung von 3000 V und unter Verwendung eines Pyridin-Essigsäure-Puffers beim pH-Wert 53,
(f) bei der Dünnschichtchromatographie auf Zellglas-(Cellulose)-Blättern und Entwicklung mit einem
Gemisch aus Aceton und Pyridin-Aceta'-Puffer im
ι ο Verhältnis 2 :1 einen Rf-Wert von etwa 0,85,
(g) Blaufärbung mit Ehrlich'schen Reagens,
(h) synergistische Wirkung im Gemisch mit Ampicillin gegenüber Mikroorganismen von Stämmen von
Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis und Staphyr5 lococcus aureus,
(i) kein allgemein wirksames Enzymgift und
(j) in Form des Bariumsalzes ein Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß der beigefügten Zeichnung,
herstellbar
durch aerobes Züchten eines einen ß-Lactamasehemmstoff erzeugenden Stammes von Streptomyces oltvaceus ATCC 21379 oder einer Mutante des Stammes.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen biosynthetischen Wirkstoffes, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Stamm von
Streptomyces olivqceus ATCC 21379 oder eine Mutante desselben in einem Nährmedium gezüchtet wird,
welches assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff liefernde Verbindungen sowie Mineralsalze enthält, und anschließend der Wirkstoff aus dem
Medium abgetrennt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird mittels des Stammes von Streptomyces olivaceus ATCC 21379
durchgeführt. Dieser hinterlegte Stamm wird aus einer Erdprobe isoliert und als zur Gattung Streptomyces
olivaceus gehörig identifiziert.
Vorzugsweise wird die Züchtung des Mikroorganismus aerobisch bei Temperaturen zwischen 20 und 35° C
und insbesondere bei Temperatuie/i von 30 bis 31°C in
einem Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 7 durchgeführt Die Züchtung dauert zweckmäßig bis zu
etwa 7 Tagen und insbesondere bis zu etwa 2 Tagen.
Der Wirkstoff MM 4550 kann dann aus dem Fermentationsmedium durch Ionenaustauschverfahren,
durch Chromatographie, durch Gelfiltration oder andere bekannte Abtrennungsmethoden isoliert werden.
Der vorstehend genannte hinterlegte Stamm mit der Kennummer ATCC 21379 wurde in den verschiedensten
Nährmedien bezüglich seiner Wachstumseigenschaften, bezüglich der Melaninerzeugung, bezüglich seiner
Sporenmorphologie und auch mittels physiologischer Teste geprüft, beispielsweise im Bezug auf die
v, Stärkehydrolyse, die Gelatineverflüssigung und die Nitratreduktion. Auf Grund der dabei erzielten
Ergebnisse wurde er einwandfrei als zur Gattung Streptomyces olivaceus zugehörig bestimmt.
Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des neuen Wirkstof
fes MM 4550 wird zunächst eine Kultur des Mikroorganismus auf einem geeigneten Nährmedium zwecks
Sporenbildung gezüchtet. Für Mikroorganismen der Spezies Streptomyces olivaceus hat sich insbesondere
eine Hefeextrakt-Glucose-Agarmischung für diesen
Zweck als geeignet erwiesen. Nach der Beimpfung wird diese Kultur etwa 1 bis 2 Wochen lang bei 28° C
bebrütet. Die gebildeten Sporen werden dann mittels
sterilen Wassers von dem Nährmedium abgespült und
diese Sporensuspension wird zum Beimpfen eines wäßrigen Nährmediums verwendet, in welchem der
Mikroorganismus weiter wächst und dabei den neuen biosynthetischen Wirkstoff MM 4550 erzeugt Das so
erhaltene Mycel kann außerdem dazu benutzt werden, um eine zweite Menge eines flüssigen Fermentationsmediums zu beimpfen, wodurch erneut der biosynthetische Wirkstoff erzeugt wird.
Die betreffenden Fermentationsmedien müssen Verbindungen enthalten, welche assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie anorganische
Salze liefern. Geeignete Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff sind Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Baumwollsaatmehl, bei der Malzdestillation
anfallende getrocknete lösliche Rückstände, einzelne Aminosäuren, Proteinhydrolysate sowie Ammoniumverbindungen und Nitrate. Geeignete Kohlenstofflieferanten sind Glucose, Lactose, Maltose, Stärke und
Glycerin. Die Ausbeute an dem gewünschten neuen Wirkstoff kann durch Mitverwendung verschiedener
Metallsalze in dem Fermentationsmedium erhöht werden, beispielsweise Mangansalze oder Kobaltsalze
sowie Kalk (ausgefälltes Calciumcarbonate
Nachdem man die Fermentation bis zu etwa 7 Tagen hat fortschreiten lassen, wird das Fermentationsmedium
vom Mycei befreit und der neue Wirkstoff MM 4550 wird dann aus der Fermentationsflüssigkeit extrahiert
Die Fermentation kann selbstverständlich auch mittels eines kontinuierlichen Strömungsverfahrens durchgeführt werden.
Es hat sich gezeigt daß der neue Wirkstoff MM 4550 zur Hauptsache in der Fermentationsflüssigkeit enthalten ist und daß nur sehr wenig in dsn Zellen des
Mikroorganismus zurückgehalten wird. Nach Abtrennung des Mycels aus der Fermentationsflüssigkeit nach
Beendigung der eigentlichen Züchtungsperiode, beispielsweise durch Filtration, kann der Wirkstoff MM
4550 in einem wesentlichen Ausmaß dadurch gereinigt werden, daß man beispielsweise die den Wirkstoff
enthaltende Fermentationsflüssigkeit mit einem Anionenaustauschermaterial, beispielsweise einer ionenaustauschenden Cellulose, behandelt und anschließend die
absorbierte Wirkstoffsubstanz eluiert Die so erhaltene Lösung kann dann durch weitere lonenaustauscherbehandlungen auch entsalzt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, zunächst die Fermentationsflüssigkeit
an einer Säule aus Cellulose oder an einer Säule aus einem Kationenaustauscher, wie Amberlite CG 50,
chromatographisch zn behandeln, da der Wirkstoff MM 4550 schneller durch eine solche Trennsäule hindurchgeht als die Verunreinigungen. Ein gewisses Ausmaß an
Reinigung kann auch dadurch erzielt werden, daß man die Fermentationsflüssigkeit einer Gelfiltration mittels
beispielsweise Ssphadex G 15 oder G 25 unterwirft.
Nach Durchführung einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Reinigungsmaßnahmen kann
die dabei erhaltene wäßrige gereinigte Fraktion einer Gefriertrocknung unterworfen werden. Auf diese Weise
erhält man den neuen Wirkstoff MM 4550 in Form eines festen Präparates. Dieses Präparat sowie auch gereinigte und gegebenenfalls aufkonzentrierte Fermentationsfiüssigkeiten können mittels der verschiedensten Extraktionsmethoden noch weitergehenden Reinigungen
unterworfen werden. Es hat sich gezeigt daß der biosynthetische Wirkstoff MM 4550 bei saurem und
neutralem pH-Wert in der vom Mycel befreiten Fermentationsflüssigkeit relativ stabil ist. Bei den
teilweise gereinigten wäßrigen Fraktionen ist jedoch die Stabilität des Wirkstoffes wesentlich geringer und
darüber hinaus zersetzt sich der Wirkstoff während der Verdampfung bei vermindertem Druck oder bei der
Demzufolge sind die mittels solcher Maßnahmen erhaltenen festen Präparate mit Zersetzungsprodukten
des aktiven Wirkstoffes verunreinigt Durch Zusatz eines Borats läßt sich jedoch die Stabilität der
ίο Wirkstoffpräparate während ihrer Reinigung und
sonstigen Handhabung verbessern.
Die Tatsache, daß sich der Wirkstoff MM 4550 einer
Gelfiltration unterwerfen läßt und daß er durch eine Dialysemembrane hindurchgeht weist daraufhin, daß
!5 der Wirkstoff ein relatiy niedriges Molekulargewicht
aufweist
Bei Durchführung einer Elektrophorese während 25 Minuten bei einer angelegten Spannung von 3000 Volt
(etwa 60 Volt/cm) und unter Verwendung eines
Pyridin- Essigsäurepuffers bei einem pH-Wert von 5,3
wandert der neue Wirkstoff aur Einern 40 cm langen
Papierstreifen aus Whatman 5 MM Papier unter Verwendung von, mit Zellglas abgedeckten Papierdochten einer Gesamtlänge von etwa 10 mm insgesamt etwa
18 cm in Richtung auf die Anode. Der dabei verwendete
Puffer besteht aus einer 0,067 molaren Essigsäurelösung, welche mittels Pyridin auf einen pH-Wert von 53
eingestellt worden ist Bei Durchführung einer Dünn-Schichtchromatographie auf aus Cellulose bestehenden
Chromatogrammblättern, welche mit einer Mischung
aus Aceton und dem bei der Elektrophorese verwendeten Pyridin-Acetatpuffer (Mengenverhältnis 2:1) entwickelt werden, zeigt der neue Wirkstoff WM 4550
einen Rf-Wert von etwa 0,85. Die Lage des neuen
si biosynthetischen Wirkstoffes auf den Chromatogrammen oder den Elektropherogrammen läßt sich mittels
biologischer Auswertung oder durch Besprühen mit dem Reagens nach Ehrlich bestimmen. Dieses Reagens
besteht aus einer Lösung von 300 mg 4-Dimeüiylamino
benzaldehyd in 9 ml konzentrierter Salzsäure, 9 ml
Äthanol und 54 ml n-Butanol. Der neue Wirkstoff ergibt klabei eine blaue Farbreaktion. Der neue Wirkstoff
MM 4550 kann auch während der Fermentation und während der Isolierungsmaßnahmen durch den Loch
platten-Diffusionstest bestimmt werden. Zu diesem
Zweck wird eine geschmolzene Nähr-Agarmasse bei 45° C mit einem geeigneten ß-Lactamase erzeugenden
Stamm von Klebsieila aerogenes beimpft und dann setzt man eine solche Menge einer sterilen Lösung von
Penicillin G hinzu, daß die Penicillinkonzentration in dem Agar 10 μg/ml beträgt Die Agarmasse wird dann
in eine Petrischale eingegossen und nach der Verfestigung werden unter Verwendung eines sterilen Metallsc.'in-iiders in gleichmäßigen Abständen zylindrische
Löcher in die Agarschicht eingestanzt. Die zu prüfende Lösung wird dann in die Löcher eingefli'jL Die Platte
wird bei einer konstanten Temperatur im Bereich von 27 bis 37° C bebrütet Während dieser Bebrütungszeit
diffundiert der Wirkstoff MM 4550, der in der
Testlösung entnalten ist in die Agarplatte hinein und
inhibiert damit die Wirkung der j3=Lactamase, welche
durch die in der Agarplatte vorhandenen KleJsiella-Zellen erzeugt wird. Das gleichfalls in der Agarplatte
vorhandene Penicillin G wird dadurch vor einer
Zerstörung durch die 0-Lactamase bewahrt und ist in
ausreichenden Konzentrationen vorhanden, um ein Weiterwachsen von Klebsiella zu verhindern. In
denjenigen Teilen der Agarplatte, in weiche der neue
Wirkstoff MM 4550 nicht eindiffundiert ist oder keine
ausreichende Konzentration aufweist, wird hingegen das Penicillin G durch die ß-Lactamase zerstört und
daher entwickelt sich an diesen Stellen der Agarplatte ein dichtes Wachstum von Klebsieila. Infolgedessen
bilden sich um diejenigen Löcher, welche den Wirkstoff MM 4550 enthalten, klare kreisförmige Zonen aus, in
denen das Wachstum von Klebsiella verhindert ist Die Größe einer jeden solchen Zone hängt von der
Konzentration des neuen Wirkstoffes in der zu prüfenden Lösung ab.
Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung der Menge und Aktivität des neuen Wirkstoffes MM 4550 in einer
zu prüfenden Lösung besteht darin, das Ausmaß der Inhibierung einer durch 0-Lactamase hervorgerufenen
Hydrolyse von Penicillin G festzustellen. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wird dabei sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des Prüfmalerials
gemessen. Die Hydrolysegeschwindigkeit von Penicillin G läßt sich dabei durch mikrojodometrische Messung
der gebildeten Penicilloinsäure ermitteln.
Die nachstehende Tabelle I belegt das breite Spektrum der antibiotischen Wirksamkeit des neuen
Wirkstoffes MM 4550 gegenüber den verschiedensten klinisch bedeutsamen Erzeugern von ß-Lactamase. Für
jedes Enzympräparat wird der Prozentsatz der Inhibierung einer Hydrolyse von Penicillin G angegeben, welche auf der Mitverwendung des neuen
Wirkstoffes in dem betreffenden Enzympräparat beruht
Die Enzymmengen in den betreffenden Präparaten sind so gewählt daß die Hydrolysegeschwindigkeit von
Penicillin G unter den Versuchsbedingungen im Bereich von 0,1 bis 02 μg/ml/min liegt Die Enzympräparate
werden unter Zusatz von insgesamt 10 μg/ml Penicillin
G bei einem pH-Wert von 7,0 in einem m/20-Phosphatpuffer bei einer Temperatur von 37"C sowohl in
Abwesenheit als auch in Anwesenheit des neuen Wirkstoffes bebrütet Die Konzentration des Wirkstoffes entspricht einer Verdünnung der geklärten Fermentationslösung im Verhältnis I : 625.
Inhibierung der Reaktionsgeschwindigkeit während der ersten 10 Minuten
/7-Lactamase erzeugender
Mikroorganismus
Mikroorganismus
Inhibierursg. '
unterschiedlicher Zeiträume durchgeführten Vorbebrütung des Enzyms mit dem Wirkstoff gemessen wird.
Fortschreitende Inhibierung von ji-Lactamase-Enzymen durch den Wirkstoff MM 4550 (in Prozent)
jS-Lactamase erzeugender
Mikroorganismus
In jedem Fall ist die Inhibierung fortschreitender Art,
d. h. sie nimmt mit der Zeitdauer der Einwirkung des
Inhibitors auf das Enzym zu, wie sich insbesondere aus der nachstehenden Tabelle Ii ergibt, in welcher der
Prozentsatz der Inhibierung der anfänglichen Hydroly
«geschwindigkeit von Penicillin G nach einer während
Dauer der Vorbebrütung (Min.)
30
60
Escheria coli, Stamm BII 19 92 92
Escheria coli, Stamm HS 21 43 44
Klebsiella aerogenes,
Stamm Al
9 36 39
Proteus vulgaris. Stamm A 0 12 12
'" Stamm B569/1I
Stamm A
2ϊ Stamm H
Es hat sich auch gezeigt, daß diese Inhibitorwirkung weder Hurch Zusatz von überschüssigem Substrat noch
durch Dialyse umgekehrt wird. Diese irreversible und «ι fortschreitende Wirkung der Inhibierung von /?-Lactamase, welche schon bei niedrigen Konzentrationen des
Wirkstoffes MM 4550 auftritt, ist vollständig neuartig und unterscheidet sich ganz wesentlich von der
Inhibitorwirkung, welche bei bestimmten Penicillinen zu η beobachten ist. Weitere Prüfungen haben bestätigt, daß
der Wirkstoff MM 4550 nicht ein allgemein wirksames Enzymgift ist
gereinigten Bariumsalzes hat außer der Inhibitorwir-
4Ii kung gegenüber /)-Lactamase auch antibakterielle
4550 zeigen eine gewisse antibakterielle Aktivität doch
ist diese wesentlich schwächer als die Aktivität des
gereinigten Bariumsalzes. Diese antibakterielle Aktivi
tat konnte gegenüber Staphylococcus aureus Oxford
und Klebsiella aerogenes gemessen werden.
Weiterhin zeigte sich ganz überraschend, daß ein antibakterieller Synergismus zwischen dem neuen
Wirkstoff MM 4550 und Penicillinen besteht
v< Demgemäß betrifft die Erfindung auch Arzneipräparate, welche durch einen Gehalt an dem Werkstoff MM
4550 sowie an einem Penicillin gekennzeichnet sind. Der Wirkstoff kann in diesen Arzneipräparaten auch in
Form eines nicht-toxischen Salzes und gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch zulässigen Träger- und
Verdünnungsmitteln vorliegen.
Bei dem in den Arzneipräparaten mitverwendeten Penicillin handelt es sich insbesondere um «-Aminobenzylpenirillin, a-Phenoxyäthylpenicillin und «-Phenoxybo propylpeniciilin.
Falls die Arzneipräparate in Form von Tabletten oder
als Kindermedizin in Form von Sirupen vorliegen, so können sie inerte Füllstoffe, Bindemittel und Schmiermittel enthalten. Für parenteral Präparate enthalten
κ, die Arzneipräparate steriles Wasser und außerdem
können sie auch in Form von Gelatinekapseln vorliegen.
Der antibakterielle Synergismus zwischen dem erfindungsgemäßen neuen Wirkstoff und einem Penicil-
lin ergibt sich aus den in der nachstehenden Tabelle III
angegebenen Versuchsdaten, welche die minimale Hemmkonzentration von Ampicillin allein und von
Ampicillin in Kombination mit dem neuen Wirkstoff gegenüber den verschiedensten klinisch bedeutsamen
paihogenen Bakterienarten zeigt.
Komponente
Hefeextrakt
Glucose
Malzextrakt
Menge (g/Liter)
4,0
20,0
10,0
20,0
10,0
TaLrile III
Minimale Hemmkonzentration (ug/ml) von Ampicillin
(ff-Aminobenzylpenicillin)
H;ikterienst;imm | Ampicillin | Ampicillin |
allein | mit Wirk | |
stoff | ||
MM 455OM | ||
K Ichsieila aemgenes Λ | 100 | 2.5 |
Klebsiella aerogenes Fi70 | 250 | 10.0 |
Proteus mirabilis 8 | 1000 | 5.0 |
Proteus mirabilis H | 1000 | 2.5 |
Proteus mirabilis 889 | 1000 | 2.5 |
Staphylococcus aureus | 5(K) | 2.5 |
Rüssel | ||
Staphylococcus aureus Il | 500 | 2.5 |
Staphylococcus aureus 1517 | 1000 | 25 |
Komponente
Menge (g/Liter)
Hefeextrakt
Glucose
10.0
10.0
15,0
10.0
15,0
Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Nährmediums auf 6,8 eingestellt Durch Abspülen der
Schrägkulturen mit 35 ml sterilem Wasser, welches 0,02 Prozent eines oberflächenaktiven Mittels enthält, wird
eine Sporensuspension des genannten Bakterienstammes hergestellt Es werden 0,5 ml jeder Sporensuspension dafür verwendet, 20 ml eines sterilen Fermentationsmediums zu beimpfen, welches sich in einem
Erlenmeyer-Kolben von 100 ml Fassungsvermögen befindet, der mit Gaze und Wattebäuschen verschlossen
ist Dieses Fermentationsinediuni hat die feigende
Zusammensetzung:
Der pH-Wert dieses Fermentationsmediums wird auf in 8,0 eingestellt und dann wird es 15 Minuten lang im
Autoklaven bei 120s C sterilisiert Nach der Beimpfung wird der Fermentationskolben 4 Tage lang bei einer
Temperatur von 28°C auf einem rotierenden Rüttler bebrütet, welcher eine Umdrehungszahl von 240 UpM
und eine Hubhöhe von 32 mm hat. Anschließend wird die Fermentationsflüssigkeit des Kolbens durch Zentrifugieren
vom Mycel befreit und dadurch geklärt und die überstehende Flüssigkeit wird mittels der vorstehend
beschriebenen Lochplatten-Diffusionsmethode bezüg-
biosynthetischen Wirkstoffes MM 4550 geprüft. Man erhält folgendes Ergebnis:
Mikroorganismus
Der Wirkstoff MM 4550 wird dabei in einer Konzentration 1 jnvendet, welche einem Zehntel der Konzentration de«,
für den Versuch verwendeten geklarten Fermentationsmediums entspricht. Dieses termentationsmedium selbst
zeigt keine antihiotische Aktivität, wenn es in der gleichen
Konzentration gegenüber den acht untersuchten Bakterienstämmen allein geprüft wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Beispiel 1
Der Stamm Streptomyces olivaceus mit der Hinterlegungsnummer
ATCC 21379 wird 7 Tage lang bei 28°C in flachen Medizinflaschen von 250 ml Fassungsvermögen
auf einer schräg geneigten Agarfläche gezüchtet. Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Durchmesser der Inhibie
rungszone (mm)
rungszone (mm)
ATCC 21379
17.0
Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird eine Sporensuspension des Stammes ATCC 21379 von
Streptomyces olivaceus hergestellt. Mit der Sporensus-
ü pension werden wiederum 20 ml eines Fermentationsmediums beimpft, welches sich in Erlenmeyer-Kolben
von 100 ml Fassungsvermögen befindet, wobei die Kolben durch Gaze und Wattepfropfen verschlossen
sind. Dieses Fermentationsmedium A hat die folgende
4i) Zusammensetzung:
Fermentationsmedium A
Komponente | Menge (g/Liter) |
L-Arginin-Monohydrochlorid | 2.5 |
Lactose | 20.0 |
K1HPO4 | 1.5 |
NaCl | 3.0 |
MgSO4 in o | 1.0 |
Fc(SO4), | 0.05 |
CuSO4 · 5H2O | 0.003 |
ZnSO4 7H2O | 0.003 |
MnSO4 · 4H2O | 0,002 |
Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,0 eingestellt und dann wird dieses 15 Minuten lang im Autoklaven bei
einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert
Außerdem werden weitere Fermentationsmedien B, C und D hergestellt, bei denen jedoch an Stelle von
L-Arginin-Monohydrochlorid die nachstehenden assimilierbaren Stickstoff liefernden Substanzen verwendet
werden:
Medium B — L-Tyrosin
Medium C — Natriumnitrat
Medium D — Ammoniumsulphat
Die Bebrütung der Fermentationskolben wird 4 Tage lang bei einer Temperatur von 280C auf einem
rotierenden Schüttler (Umdrehungszahl 240 UpM, Hubhöhe 32 mm) durchgeführt Anschließend werden
die Fermentationsmedien vom Mycel befreit und geklärt und rtann wird jedes Fermentationsmedium
bezüglich des Vorliegens und der Aktivität des neuen biosynthetisoien Wirkstoffes mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode geprüft:
Medium
Durchmesser der Inhibierungs/.one (mm)
Λ
B C D
B C D
22,1
21.6
13,7
12,9
21.6
13,7
12,9
Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird eine Sporensuspension des hinterlegten Stammes ATCC
21379 von Streptomyces olivaceus hergestellt. Mit dieser Sporensuspension werden 20 ml eines sterilen
Fermentationsmediums in Erlenmeyer-Kolben von 100 ml Fassungsvermögen beimpft. Das Fermentationsmedium
hat die folgende Zusammensetzung:
Komponente
Menge (g/Liter)
L -Tyrosin
Glucose
K ,HPO4
Fe2(SO4K
CuSO4 · 511,0
MnSO4 ■ 4H,0
Glucose
K ,HPO4
Fe2(SO4K
CuSO4 · 511,0
MnSO4 ■ 4H,0
1,0
1,0
2,0
0,05
0.003
0,004
Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird auf 7,0 eingestellt und dann wird dieses Medium 15 Minuten
lang im Autoklaven b»i einem Druck von 1,05 kg/cm2
sterilisiert Die Fermentationskolben werden bei einer Temperatur von 28°C auf einem rotierenden Schüttler
(Umdrehungszahl 240 UpM, Hubhöhe 32 mm) bebrütet. Nach Bebrütungszeiten von 20 Stunden bzw. 44 Stunden
bzw. 68 Stunden werden jeweils zwei Fermentationskolben entnommen, vom Mycel befreit und dann wird das
Fermentationsmedium bezüglich der Menge und Aktivität des neuen Wirkstoffes MM 4550 mittels der
Lochplatten-Diffusionsmethode untersucht Es werden die folgenden Ergebnisse erzielt:
Bebrütungsdauer (Std.)
Mittlerer Durchmesser der
Inhibierungszone (mm)
Inhibierungszone (mm)
20
44
68
15,6
28,0
30,5
Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 stellt man von
dem hinterlegten Stamm ATCC 21379 von Streptomyces oüvacens eine Schrägkuirur auf einem Hefeextrakt-Glucose-Agar-Nährmedhim her. Zu jeder Schrägkultur
werden dann 30 ml steriles entionisiertes Wasser mit
0,02 Prozent eines oberflächenaktiven Mittels zugesetzt und die gebildeten Sporen werden durch Schütteln
suspendiert. Diese Sporensuspension wird als Inoculum zu 75 Liter eines sterilisierten Fermentationsmediums in
ϊ einem Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl von 100 Liter Fassungsvermögen zugesetzt. Dieses Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Komponente
Menge (g/Liter)
Soyabohnenmehl
Glucosc-Monnhvdnii
Glucosc-Monnhvdnii
I0.C
20.0
20.0
ii Als Schaumbremse werden vor dem Sterilisieren 50
ml einer lOvolumenprozentigen Lösung eines Polyoxyalkylenglykols in Soyabohnenöl zugesetzt. Der Fermentationsbehälter
wird 20 Minuten lang bei 1200C mit Dampf sterilisiert. Man rührt dieses Kulturmedium
:n mittels eines mit Leitschaufeln besetzten Scheibenrührers
von 19,05 cm Durchmesser mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 140 UpM. Dabei wird sterile Luft
durch einen Verteiler mit offenem Verteilerkopf in einer Menge von 75 Liter/Minute zugeführt. Der Fermenta-
2) tionsbehälter selbst ist mjt Prallplatten ausgestattet. Die
Bebrütung wird bei einer Temperatur von 28°C während 45 Stunden durchgeführt Anschließend setzt
man 2,5 Liter dieses Fermentationsmediums als Inoculum zu 50 Litern eines weiteren sterilen Fermenta-
jn tionsmediums in einem anderen Fermentationsbehälter
aus rostfreiem Stahl von 90 Liter Fassungsvermögen hinzu.
Dieses weitere Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Komponente
Menge (g/Liter)
L-Tyrosin
Glucose-Monohydrat
Glucose-Monohydrat
K;HPO4
Fc(SO4)-,
CuSO4 ■ 5H,0
MnSO4-4H,O
CuSO4 ■ 5H,0
MnSO4-4H,O
1.0
1.0
2.0
0.v5
0.003
0.05
Man stellt den pH-Wert des Mediums mittels einer verdünnten Salzsäurelösung auf 7,0 ein. Als Schaumbremse
werden 100 ml einer lOvolumenprozentigen Lösungeines oberflächenaktiven Mittels in Soyabohnenöl
zugesetzt Dieses Fermentationsmedium wird 20 Minuten lang bei 120° C mittels Dampf in dem
Fermentationsbehälter sterilisiert. Man rührt unter Verwendung eines mit Leitschaufeln ausgestatteten
Scheibenrührers von 12,7 cm Durchmesser mit einer Geschwindigkeit von 430 UpM, wobei der FermentationsbehäJter selbst mit Prallplatten ausgestattet ist
Ober einen Verteiler mit offenem Kopf wird sterile Luft
mit einer Geschwindigkeit von 50 Liter/Minute eingeleitet und die Fermentationstemperatur wird auf
ω 300C gehalten. Unter diesen Bedingungen wird die
Bebrütung des Fermentationsmediums 48 Stunden lang durchgeführt Zu verschiedenen Zeiten werden Proben
des Fermentationsmedhims abgezogen, das Mycel wird daraus entfernt und die geklärte Fermentationslösung
<o wird bezüglich der Menge und der Aktivität des
gebildeten biosynthetischen Wirkstoffes mitteis der Lochplatten-Diffusionsmethode geprüft Es werden
dabei die folgenden Ergebnisse erzielt:
Durchmesser der Inhibierungszone (mm)
14,9
23,5
24,5
26,7
23,5
24,5
26,7
Nach Beendigung der Bebrütung wird das Mycel aus
der gesamten Fermentationslösung abgetrennt und zwar mittels Zentrifugieren. Die dabei erhaltene klare
überstehende Flüssigkeit wird bei 5° C gelagert.
300 ml dieser geklärten Fermentationslösung werden mittels eines Drehverdampfers im Vakuum auf 30 ml
eingeengt. Mit diesem Konzentrat beschickt man eine Kationenaustauschersäule von 5.08 cm Durchmesser
und 2,44 m höhe, welche mit dem Kationenaustauscherharz Art'!«rute IRC 50 gefüllt ist, das mit einem
Natriumboratpuffer ins Gleichgewicht gesetzt worden ist (0,1 Prozent (Gewicht/Volumen) Na2B4O7 · 10 H2O,
pH-Wert: 8). Diese Austauschersäule wird mittels des Boratpuffers eluiert und das Eluat wird in Fraktionen
von jeweils 25 ml gesammelt. Die gesamten aktiven Fraktionen werden vereinigt und die dabei erhaltenen
250 ml Flüssigkeit werden im Vakuum mittels eines Drehverdampfers bis auf 20 ml eingeengt. Dieses
Konzentrat wird an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-I) von 2,54 cm Durchmesser und 45,7 cm
Höhe entsalzt. Beim Eluieren mit entionisiertem Wasser werden Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt und die
aktiven Fraktionen werden vereinigt. Man erhält so 80 ml Flüssigkeit. Diese Flüssigkeit wird einer Gefriertrocknung
unterworfen, wobei man 56 mg eines weißen Pulvers erhält. Durch die vorstehend angegebenen
Maßnahmen wird eine Reinigungswirkung erzielt, welche bezogen auf die Aktivität, dem Fünffachen der
Gesamtmenge an Feststoffen in der vom Mycel befreiten Fermentationslösung entspricht.
Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 4 züchtet man den hinterlegten Stamm ATCC 21379 von Streptomyces
olivaceus unter Verwendung eines Fermentationsmediums der nachstehenden Zusammensetzung:
Drehverdampfers bis auf 80 ml eingeengt, wobei eine große Menge des Natriumsulfats ausfällt Das so
erhaltene Konzentrat wird filtriert und dann an einer Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-2) von 2,54 cm
Durchmesser und 1,52 m Höhe behandelt Man eluiert mit entionisiertem Wasser und sammeit das Eluat in
Fraktionen von jeweils 20 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und die dabei erhaltenen 500 ml
Flüssigkeit werden durch Ultrafiltration bis auf 30 v\
in aufkonzentriert. Dieses Konzentrat ergibt beim Gefriertrocknen 100 mg eines weißen Pulvers, welches den
Wirkstoff MM 4550 enthält, wobei die Aktivität etwa das 33fache derjenigen der gesamten in der geklärten
Fermentationslösung enthaltenen gelösten Feststoffe
ii beträgt.
Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 4 wird der hinterlegte Stamm ATCC 21379 vom Streptomyces
olivaceus gezüchtet. Das verwendete Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Komponente
Menge (g/Liter)
Soyabohnenmehl
Glucose-Monohydrat
MnSO4-4H2O
Glucose-Monohydrat
MnSO4-4H2O
10.0
20.0
0,05
20.0
0,05
Nach 48 Stunden entfernt man das Mycel aus der Fermentationslösung und klärt diese durch Zentrifugieren. Bei Durchführung des Lochplatten-Diffusionstestes
mit der geklärten Flüssigkeit erhält man eine Inhibierungszone von 28,6 mm. 10 Liter der geklärten
Fermentationslösung werden mit 3 kg (Naßgewicht) einer ionenaustauschenden Cellulose in Acetatform
verrührt Die gebildete Aufschlämmung wird filtriert und der Wirkstoff MM 4550 wird aus dem Ionenaustauscherharz unter Verwendung von 3 Liter einer 0,5 m
Natriumsuifatiösung eiuien. Man erhält se einen Extrakt des Wirkstoffes in einer Ausbeute von 80
Prozent Dieser Extrakt wird im Vakuum mittels eines
Komponente
Menge (g/Liter)
Soyabohnenmehl 10,0
Glucose-Monohydat 20.0
Füllung von Calciumcarbonat 0.2
m Kobaltchlorid (CoCl, ·6ΙΙ,Ο) 0.001
Als Schaumbremse werden 300 ml einer lOvolumenprozentigen
Lösung eines oberflächenaktiven Mittels in Soyabohnenöl zugesetzt. Die Bebriitungsdauer beträgt
48 Stunden. Anschließend trennt man das Mycel ab und klärt die Fermentationslösung durch Zentrifugieren. Die
geklärte Lösung wird mittels der Lochplatten-Diffusionsmethode untersucht und man erhält eine Inhibierungszone
von 33,0 mm. 100 Liter der geklärten Fermentationslösung werden mit 12 kg (Naßgewicht)
einer ionenaustauschenden Cellulose in der Acetatform verrührt Die gebildete Aufschlämmung w*rd filtriert
und der neue Wirkstoff wird aus der Ceftuiose unter
Verwendung von 12 Liter einer 0,5 m-Kaliumsulfatlösung
eluiert Der dabei gewonnene Extrakt wird bei einer Temperatur unterhalb 30° C im Vakuum mittels
eines steigenden Filmverdampfers bis auf 6 Liter aufkonzentriert Durch Zusatz von 12 Liter Aceton fällt
der größte Anteil des Kaliumsulfats aus. Die Lösung wird dann filtriert und im Vakuum bei einer Temperatur
unterhalb 30° C durch Verdampfen bis auf 200 ml aufkonzentriert Dieses Konzentrat wird an einer
Ionenaustauschersäule (Amberlite XAD-2) von 76 mm Durchmesser und 2 m Höhe behandelt Man eluiert mit
entionisiertem Wasser und sammeit das Eluat in Fraktionen von jeweils 140 mL Die aktiven Fraktionen
(die Aktivität wird mittels der Lochplatten-Diffusions methode festgestellt) werden vereinigt und die so
erhaltenen IPl Liter Flüssigkeit werden unter Stickstoffdruck von 4,20 kg/cm2 mittels Ultrafiltration unter
Verwendung einer Membran von 150 mm Durchmesser bis auf 275 ml Flüssigkeit aufkonzentriert Beim
Gefriertrocknen dieses Konzentrats erhält man 22 g eines braunen Pulvers, 1 g dieses Pulvers (32 Aktivitätseinheiten/mg) werden in 1 Liter einer 0,2 m-Natriumsuifatlösung aufgelöst und dann mit 1 Liter einer
2prozentigen Lösung (Gewicht/Volumen) von Tetra-n-
butyl-ammonJum-hydrogensulfat in Djchlormethan vermischt
Unter der Einwirkung der Schwsrkraft trennt sich die Dichlormethanphase ab und wird bis auf 20 ml
aufkonzentriert Dann setzt man 400 m! eines Leichtbenzins (Siedebereich 40 bis 600C) hinzu und
trennt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren ab. Dieser Niederschlag wird in 10 ml Dichlormethan
aufgelöst und mit 10 ml Wasser extrahiert, welches
80 mg Bariumjodid und 70 mg Bariumcarbonat enthält. Die sich ausbildenden Phasen werden voneinander
getrennt und die wäßrige Phase wird filtriert und auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Durch Gefriertrocknen
dieser Lösung erhält man ein gelbes Pulver. Der so gewonnene Feststoff wird mit Aceton ausgewaschen,
um überschüssiges Bariumjodid aufzulösen. Durch Zentrifugieren wird ein schwach gelb gefärbter
Feststoff isoliert und im Vakuum getrocknet Man erhält
auf diese Weise 13 mg eines Feststoffes mit einei
Aktivität von 320 Aktivitätseinheiten/mg.
(a) Eine Mischung aus 125 mg AmpiciUin-trihydrat
und 125 mg des Wirkstoffes MM 4550 wird in Gelatinekapseln für orale Verabreichung eingefüllt
(b) Entsprechende Mischungen des neuen Wirkstoffes werden unter Verwendung von a-Phenoxyäthylpenicil-Iin
und ot-Phenoxypropylpenicillin in Form von Gelatinekapseln
hergestellt
(c) Eine Mischung aus 250 mg des Natriumsalzes vor Ampicillin und 125 mg des Wirkstoffes MM 4550 wird
unter sterilen Bedingungen in eine Ampulle abgefüllt und diese wird verschlossen. Durch Vermischen des
Ampulleninhalts mit sterilem Wasser erhält man eint Injektionsflüssigkeit für parenteral Verabreichung.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen.
Claims (1)
- Patentansprüche;1. Biosynthetischer Wirkstoff (MM 4550) mit den nachstehenden Parametern:(a) Säurefunktion,(b) Hemmung der Penicilline und Cephalosporine abbauenden Wirkung von /?-Lactamase-Enzymen,(c) Wasserlöslichkeit,(d) Hemmung des Wachstums von Staphylococcus aureus- und Klebsielila aerogenes-Stämmen,(e) bei der Elektrophorese Wanderung von 18 cm gegen die Anode auf einem 40 cm langen Papierstreifen aus Whatman-3-MM-Papier unter Verwendung von mit Zellglas abgedeckten Papierdochten einer Gesamtlänge von 10 cm bei 25minütigem Anlegen einer Spannung von 3000 V und unter Verwendung eines Pyridin-Essigsäüre-Puffers beim pH-Wert 53,(f) bei der Dünnschichtchromatographie auf ZeH-glas-(Cellulose)-Blättern und Entwicklung mit einem Gemisch aus Aceton und Pyridin-Acetat-Puffer im Verhältnis 2 :1 einen Rf-Wert von etwa 0,85,(g) Blaufärbung mit Ehrlicb'schem Reagens,(h) synergistische Wirkung im Gemisch mit Ampicillin gegenüber Mikroorganismen von Stämmen von Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis und Staphylococcus aureus, (i) kein allgemein wirksames Enzymgift und (j) in Form des Bariumsab.es ein Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß der beigefügten Zeichnung,erhältlich durch aerobes Züchten eines einem /7-Lactamasehemmstoff erzeugenden Stammes von Streptomyces olivaceus ATCC 2137 P oder einer Mutante des Stammes.•2. Verfahren zur Herstellung des biosynthetischen Wirkstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Streptomyces olivaceus ATCC 21379 oder eine Mutante desselben in eiwrn Nährmedium gezüchtet wird, welches assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff liefernde Verbindungen sowie Mineralsalze enthält, — und anschließend der Wirkstoff aus dem Medium abgetrennt wird.3. Arzneipräparate auf Basis von Penicillinen, insbesondere «-Aminobenzylpenicillin, «-Phenoxyäthylpenicillin und a-Phenoxypropylpenicillin, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem biosynthetischen Wirkstoff nach Anspruch 1.
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