DE2017837A1 - Antibioticum AM 374 und seine Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibioticum, auf seine Herstellung durch Fermentation, auf seine Gewinnung und Anreicherung aus rohen Lösungen, auf seine Reinigung und auf die Herstellung seiner Salze.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein verbessertes Tierfuttermittel, besonders zur Anv/endung bei jungen Haustieren, darunter Geflügel, wie Hühner-., Sruthühner- und Entenküken« Es ist ferner für junge Hinder, Pferde, Schweine, Hunde und Schafe vorteilhaft. ' .

Die Beschleunigung des Wachstums von jungen Haustieren' « und auch der Schutz gegen Krankheiten ist eine wichtige

Aufgabe. Die wirtschaftliche Bedeutung einer raschen

Waehstunisgeschwindigkeit ist sehr groß, besonders bei so

rasch wachsenden Haustieren wie Geflügel, zum Beispiel Hühner, Iruthtihnern* und Entenküken. Je rascher das Wachstum ist, desto größer let der Putteranteil, der

in Fleisch umgewandelt wird. Es 1st ferner wünschenswert, Krankheiten bei Küken zu verhindern. Aus diesen Gründen wurde bereits vorgeschlagen, verschiedene Schmalband^a/fcibiptioa, zum Beispiel Penicillin, Bacitracin und Streptomycin, und

009842/198 4 original inspected

Breitbandantibiotica, sum Eeispiel Tetracyclin, Oxytetracycli oder Chlortetracyelin zu verwenden. \Ienn diese Verbindungen in geeigneten llengen mit Tierfuttermitteln vormischt v/erden, fördern sie tatsächlich ir, manchen Fällen die Gewichtszunahme und bieten ferner Unterstützung beim Schutz gegen Infektionen. Trotz der bereits erzielten Fprtschritte sind solche Mittel aber noch verbesserungsbedürftig.

Überraschenderweise wurde nun ein -Tierfuttermittel gefunden, das die üblichen nährstoffsaßig ausgeglichenen Putterbestand teile und eine wirksame Menge von Antibioticum AM 574 als neuen wachstumsfördernden Zusatz enthält.

Im Rahmen der Erfindung liegen verdünnte Formen, rohe Konzentrate und kristalline Formen des Antibiotieums. Diese neuen Produkte sind gegen zahlreiche Mikroorganismen, darunter grampositive Bakterien, wirksam. Das neue Antibioticum unterscheides sich aufgrund seiner Wirkung auf bestimmte Mikroorganismen in Verbindung mit seinen chemischen und physikalischen Eigenschaften von bisher beschriebenen Antibiotica. ■

Das neue Antibioticum, dem die Bezeichnung AM 374 gegeben wurde, bildet sich während der Züchtung eines neuen Streptomyceten, der aus einer aus Utah stammenden Bodenprobe isoliert wurde, unter gesteuerten Bedingungen. Eine lebensfähige Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei der Kulturensammelstelle Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Divison, United States Department of Agriculture, Peoria-Illinois hinterlegt und in deren ständige Kulturensammlung eingereiht.

2/1984 ^BAD

Sie ist von dieser Hinterlegungsstelle unter der Hinter-

3582 für jedermann erhältIieh..

Die -BGSchreibung und Identifizierung dieses neuen Mikroorganismus, der auch in der Kulturensanimlung der Lederle Laboratories, Pearl Eiver, Uew York gehalten wird, wurde von Dr. H. D. Iresner, dem Experten dieser Laboratorien, durchgeführt.

Die Kulturmerlanale, physiologischen Merlanale und morphologischen Merkmals der Kultur wurden nach den Methoden ermittelt, die von Shirling et al., ^/""Methods for Characterisation of Streptomyces Species", Internat. Journ. of. Syst. ^ Bacteriol. 16: 313-340,(1966)J beschrieben vnirden. Die für die Untersuchung verwendeten Medien wurden aus den Medien gewählt, die von Pridham et al., ^f¹¹A Selection of Media for Maintenance and' Taxonomic Study of Streptomyces", · Antibiotics Annual (1956 - 1957), S. 947 - 953 J für die Züchtung von Streptomyceten empfohlen werden. Einzelheiten sind in den Tabellen I bis IV enthalten, und eine aligemeine Beschreibung der Kultur ist nachstehend angegeben. Unterstrichene Parbbezeichnungen wurden aus Jacobson et al,, /""Color Harmony Manual" 3· Aufl. (T948) J entnommen.

: Wachstum

Auf den meisten Medien mäßig, auf Kartoffel-Dextrose-Agar gut; auf Czapek-Iiösung-Agar schwach. ■*-"'.

IiUftraycel-und/oder Sporenfarbe en Masse

Luftmycel auf den meisten Medien weißlich; wirft in Sporulationsgebieten elfenbeinfarben Ivory (2 dt) bis hellelfenbeinfarben Lt. Ivory (2 ca).

009842/1984

BAD ORIGINAL.

Lößl.iehe P1.rrraente

Auf verschiedenen Medien gelblich.-; keine piginenfb.ildung auf Czapek-Lösung-, Asparagin-Oextrose- und anorganische Salze-Stärke-Agar.

?ar"be der Literseite

Auf den meisten Medien in gelblichen Tönungen. I) Verschiedene physiologische Reaktionen

Nitrate werden in organischer Kitratbrühe nicht zu Nitriten reduziert; vollständige Verflüssigung von Gelatine in 7 Tagen; keine Melaninbildung auf Pepton-Eisen-Ägar. Verwertung von Kohlenstoffquellen nach der Methode von • Pridham et al., /*J. Baot. 56: 107-TU, (1948) Vi mittlere biö gute Verwertung von 1-Arabinose, d-Fructose, i7lnosit, Lactose, d-Mannit, d-Melibiöse, Salicin, d-Trehalose, d-Xylooe; schlechte bis keine Verwertung von 1-Rhamnose, Adonit, d-Mclezitose, d-Raffinose und Saccharose.'

ι Kikromorpholigie

Luftmycel spärlich, zeigt lange verschlungene und gev^ellte Ketten von elliptischen bis länglichen Sporen mit Abmessungen von 0,5 bis 0,6ii . χ 1,0 bis 1,3 αι.. Sporenoberfläche • glatt (durch Elektronenmikroskopie bestimmt).

Aufgrund der beobachteten allgemeinen Charakteristica ist der Mikroorganismus ein Vertreter des Genus Streptomyces. Die Kultur WRRL 3582 wurde mit allen zugänglichen Kulturen anderer Streptomyceten verglichen, die ähnliche grundlegende taxonomisohe Merkmale aufweisen.« Zwei Species

009842/1984

BAD OBIGiNAL

hatten mehrere Merlanale mit HEEL. 3532 gemeinsam. Als jedoch die LiteraturbesQhreibungen dieser verwandten Species untersucht wurden, wurden einige grundlegende Unterschiede gefunden. Diese sind in Tabelle Y angegeben.Außer diesen Unterschieden zeigt UEPJj 3582 allgemein ein deutlich begrenzteres Wachstum auf den meisten Medien und seine Sporualtlcnist gewöhnlich spärlich.

Aus Tabelle Y ist zu ersehen, daß die Sporenmorpholögie von ÜBEL 3582 zum Rectus-3?lexibils-Iyp nach Pridham et al., /"Appl. Microbiol. 6: 52-79, (1958)J/ gehört, während die Sporenmorphologie der beiden anderen Species zum Spira-Typ gehört. Dies ist ein grundsätzlicher Unterschied, der schon allein zur Unterscheidung zwischen den Organismen genügt. Wenn man dazu noch die anderen angegebenen Unterschiede berücksichtigt, ist der Abstand des Organismus NRRl 3582 von. den anderen Organismen so groß, daß er als eigene Species anzusehen ist.

Aufgrund der Elfenbeinfarbe der Sporen, die von dem neuen Mikroorganismus erzeugt werden, wird der Name Streptomyces eburosporeus n.s. als geeigneter beschreibender Beiname vorgeschlagen. .

009842/1984 b_{ad 0R(G1NAL}

Tabelle I Kultureharakteristika von Streptomyces eburosporeus n.s. NRRL 55S2

Inkubation: 14 Tage

Temperatur: 28

Medium

Wachstum

Luftmycel und/oder Sporen

lösliches
Pigment

Farbe der
Unterseite

Bemerkungen

Czapek*s Uosung-Agar

(O

s chwaeh

Luftmycel weii31ich, wird elfenbeinfarben (Ivory (2 db)) .' bis hell elfenbeinfarben (Lt. Ivory(2 ca)) in Sporiiationszonen. Sporulation schwach

keines

hellmelonengelb
(Lt. Melon
Yellow
(3 ea))

Wachstum begrenzt

*^ Asparagin-Eex-

_* trose-Agar ■CD

mäßig

Luftmycel
spärlichj
rulatj on

weißlich, keine Spo-

keines

■bambusfar-

ben

(Bamboo

Wachstum begrenzt, Kolonienrän der gezackt

Hickey und Tresner's Agar

. mäßig

Luftmycel weißlich, wird elfenbeinfarben (Ivory (2 db)) bis .hellelfenbeinfarben (Lt. Ivory (2 ca)) in Sporulationszonen. Sporulation schv/ach

gelblich;
schv/ach

hellborn- i Oberflächen-

s't einfärben wachs turn

. (Lt.Amor > wargenför-(3 ic)) j

'OO Ca»

Tabelle I (Forts.)

Medium

Wachstum

Luftmyeel und/oder

Sporen

lösliches
Pigment

Farbe der Unterseite

Bemerkungen

Hefeextrakt-Agar

mäßig

LuftEycel weißlieh, spjurenvreise Sporulatiön

gelblich;
schwach

hellbern— steinfärben (Lt, Arnber

Oberfläche

.runzelig

Küsters Hafer- mäßig
flocken-Agar

Luftmycel weißlich, wird elfenbeinfarben (Ivory (2 db))bia
hellelfenbeinfarben (It.Ivory (2 ca)) in Sporulationszonen
Spnrulation s chwach gelblichbraun;
schv;ach

helliaelonengclb. (Lt. Melon Yellov/ (3 ea))

^ Stärkehydrolyse

Tomatenpaste-Eafermehl-.
Agar

mäßig

Lyftmyeel weißlich, wird elfenbeinfarben (Ivory (2 db)) bis hellelfenbeinfarben (Lt. Ivory (2 ca)) in Sporulationszonen Sporulatiön chwach orangegelb;

mäßig

hellbernsteinfarben (Lt. Amber (3 ic))

Oberfläche vfarsig

Kar-tof f el-Dextrose-

Agar ■■.■:■■",·■..

gut

Luftmycel weißlich,spärlich, wird elfenbeinfarben (Ivory < 2 db).) bis hellelfenbein- j farben (Lt. Ivory(,2 ca)) in j Spor.ulatiönszon.en. Sporn- j !ation s chvrach f

orangegelb;

mäßig

hellbernsteinfarben (Lt. Amber (5 Ic))

Stärkehydrolyse schv/ach.

Kolonienoberfläche gerunzelt bis rissig

Tabelle (Ports.)

Medium	Wachstum Luftmycel und/oder ] Sporen	Luftmycel weißlich, spär lich, spurenweise Sporu- lation	lösliches Pigment	„„... — . Farbe der Unterseite	Bemerkungen
Bennett'S- Ag ar	1 mäßig	• Luftmycel weißlich, wird elfenbeinfarben (Ivory (2 db)) bis hellelfenbein- . farben (Lt. Ivory (2 ca)) in Sporulationszonen. Sporulation schwach	gelblich; ischwach	hellbern- steinfarben (Lt., Amber (3 ic))	Oberfläche gerunzelt bi.s rissig . ■
anorgani sche Salze- Stärke -Agar	mäßig	keines 1 1 ■	hellmelonen- gelb (Lto Melon Yellow (3ea))	C

Tabelle II

Kicromorpliologie von Streptomyces eburosporeus η. s. NRRL 3582

Medium

lAiftmycel und/oder Sporenketten« stcuktur

Sporenform

Sporengröße

Sporenoberfläciie

Küster'Eaferflocken-Agar

Iiuftmycel spärlich, bildet lange ▼erscblungene und gewellte Sporenketten

Elliptisch
bis länglich

Sporen
0,5-0,6/U

χ
1,0-1,3/1

glatt (durch

Ilektronen-

microslcopie

bestirnt) ·

Tabelle III

Yerschiedene physiologische Reaktionen von Streptomyces eburosporeus n.s. NERL 3582

iEeHperatur: .28 ⁰C

O CO OO

toc»

Kedium .	Inkubations dauer	Wachstum	Physiologische Reaktion
organische Ni- tratbrühe	7 Tage	gut	keine liitratreduk'; Lon
organische Ki- tratbrühe	14 Tage	gut	keine Nitratreduktion
Gelatine	7 Tage	gut	vollständige Verflüssigung
Pepton-Eisen- . Agar	24 Stunden	mäßig	kein Melanin erzeugt

O, I

κ: cd

OO

Tabelle IV

C-Quellen-Vorv/ertungsspektrum von Streptomyces

eburosporeus n.s. rTRRL 3582

C"-Quellen

Adonit

1-Arabinose · d—Fructose i-Inosit -.'.-■ Lactose

d-Mannlt d-Eelezitose d-Melibiose d-Raffinose 1-Thainnose Salicin

Saccharose d-Trehalose "■ d-Xylose Dextrose Negativkontrolle

5-gute Verwertung 2-mittlere Verwertung

Inkubation: 10 Tsge Temperatur; 28 Tage

Verwertung

3
2

.3 ■

0 .

: 1 . ■■■■.'-

3 ;

0 ·

i.-schleclite Verv/ertung 0-keine Verwertung

009842/1984

BAD ORlGJNAL

Tabelle V

Vergleich von Streptomyces NRRL 35&2 mit S. albidoflavus und S. odorifer

ca D O 3D Q

w—J*

Streptomyces ITRRL

S. albidoflavus

S. odorifer

Luftmycel und/oder j sporentragene Ver zweigungen	Sporophoren lang, gev;ellt und ver schlungen	Sporophoren kurz, ] bilden Spiralen \ :	Sporophoren lang, gerade, verzweigt, bilden Spiralen
Sporenform	elliptisch "bis länglich	sphärisch	sphärisch
Gelatinever flüssigung	vollständige Verflüs sigung	rasche Ver flüssigung	langsame Ver flüssigung
lösliche Pigmente	■ hauptsächlich gelblich	hauptsächlich gelblich	hauptsächlich bräunlich
Wachstum auf As- paragin-Dextrose- Agar	Wachstum gelblich; Luft- mycel weißlich, spär lich	Wachstum braun; Luftmycel wird weißlich-gelb	Wachstum cremefarben bis bräunlich. Luftmycel reichlich, cremefarben

OO CO

1 I I

- 13 -

Es wird hervorgehoben, daß die Erfindung zur Produktion des neuen Antibioticums nicht auf diesen bestimmten Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen beschränkt ist, die die vorstehenden zur Erläuterung angegebenen Wachsturnscharakteristica und mikroskopischen Charakteristica vollständig erfüllen.. Im Rahmen der Erfindung liegt vielmehr auch die Verwendung von Hutanten, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Maßnahmen wie Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstoff lost, Phageneinwirkung und dergleichen erhältlich sind,

Pas Permentationsverfahren

.Die Züchtung des Organismus S. eburosporeus kann, in einer Vielzahl von flüssigen Kulturmedien durchgeführt werden. Medien, die zur Produktion des neuen Antibioticums geeignet sind, enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffqueile, zum Beispiel Stärke, Zucker, Melasse, Glycerin und dergleichen, eine assimilierbare Stickstoffquelle, zum Beispiel Protein, Proteinhydrolysate Polypeptide, Aminosäuren, Maiaquellwaaser und dergleichen, und anorganische Anionen und Kationen, zum Beispiel Kalium, Natrium, Calcium, Sulfat, Phosphat, Chlorid und dergleichen. Spurenelemente wie Bor, Molybdän, Kupfer und dergleichen werden als Verunreinigungen anderer Beetandteile der Medien zugeführt. Für eine Belüftung in Tanks und Flaschen wird durch Durchieiten von steriler Luft durch das Fermentationsmedium oder auf dessen Oberfläche gesorgt. Sine weitere Durchiaiaohung in Tanke erfolgt mit Hilfe mechanischer Rühreinrichtungen. !lach Bedarf kann ein Entaohäumungemittel, zum Beispiel 1 ^ Octadecanol in SchmalzÖl, zugeeetzt werden.

- 14 Inokulurahe r s t el lung

Ein Schüttelflaschen-Inokulum von S. eburosporeus v/ird durch Beimpfen von 100 ml sterilen flüssigen Mediums in ml'-Kolben mit von einer Agarschrägkultur des Stamms abgeschabten .oder abgewaschenen Sporen bereitet. Gewöhnlich v/ird folgendes -Medium verwendet.

ι .

Melasse . .20 g

Glucose .....10 g

Bactopepton 5 g

Wasser ad 1 000 ml

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29 °C, vorzugsweise 28°C, inkubiert und auf einer Eotationsschüttelvorrichtung 30 bis 48 Stunden intensiv bewegt. Diese 100 ml Inokua werden zum Beimpfen von 1 1- und 12 1-Ansätzen des gleichen Mediums in 2 1- und 20 1-Glasfermentern verwendet. Das Inokulum wird 30 bis 48 Stunden wachsen gelassen und dabei mit steriler Luft belüftet. Diese Inokulumansätze werden zum Beimpfen von Tankfermentern verwendet.

' Tankfermentation

Pur die Produktion des Antibioticums in Tankfermentern . wird vorzugsweise das folgende Fermentationsmedium verwendet.

Soyabohnenmehl .........10g

Gerelose 10 g '

Natriumchlorid ................. 5g

Calciumcarbonate.*.. 1g

Distillers' Solubles aus Mais.** 5 g

Wasser ad 1000 ml

Jader Tank wird mit 3 bis 10 $ des wie oben be schrieb en hergestellten Inokulums beimpft. Die Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit'von 0,5 bis 1,0 1 steriler luft pro Liter Brühe und pro Minute, und die Fermentationsmischung wird durch einen Rührer, der mit 200 bis 400 Umdrehungen pro Minute betrieben wird, gerührt. Die Temperatur wird bei 25 bis 29°C, gewöhnlich bei 28°C, gehalten» Gewöhnlich wird die Fermentation 65 bis 90 Stunden lang durchgeführt, worauf die Maische geerntet wird.

Reinigungsverfahren

Nach beendeter Fermentation wird die fermentierte Maische, die das erfindungsgemäße Antibioticum enthält, zur Entfernung des Kyeels filtriert, vorzugsweise bei pH 6. Zur Unterstützung der Filtration kann Diatomeenerde oder eine andere übliche Filterhilfe verwendet werden. Normalerweise wird der Mycelkuchen mit Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Filtrat vereinigt. Die antibiotische Ak- ,-tivität wird an Aktivkohle Darco G-60 oder einer anderen geeigneten Adsorptionskohle adsorbiert, wofür etwa 0,5 $ (Gewicht/Volumen) des Adsorptionsmittels verwendet werden. Die an der Aktivkohle festgehaltene antibiotische Aktivittät kann eluiert werden, indem die Aktivkohle etwa eine halbe Stunde mit 40 %-igem wässrigem Aceton, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 2 eingestellt ist, gerührt wird, wobei eine Volumenmenge an Eluiermittel verwendet wird, die etwa einem Viertel des ursprünglichen Maischevolumens entspricht. Daa Eluat wird unter vermindertem Druck zu einer wässrigen Phase eingeengt, die etwa einem Zwanzigstel seines ur- · sprünglichen Volumens entspricht. Der pH-Wert dieser Phase wird mit Bariumhydroxid auf etwa 5»5 eingestellt, und der entstehende Bariumsulfatniederschlag wird abfiltriert. Die eingestellte Lösung (FiItrat) wird weiter bis auf

009842/198Λ

BADORiOiNAL

etwa 400 bis 800 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird dann mit augesäuertedi Aluminiumoxid, (unter Verwendung von etwa .1/5- der Menge an Aluminiumoxid in G-rasim im Vergleich au dem Volumen des Konzentrats) aufgeschlämmt, und die Aufschlämmung wird auf eine geeignete Kolonne mit angesäuertem Aluminiumoxid (mit etwa der zehnfachen Menge des in der Aufschlämmung verwendeten Aluminiumoxids) aufgegeben, das in Methanol naß- eingefüllt wurde. Die antibioticehe Aktivität wird aus der Säule mit wässrigem Methanol (gewöhnlich 25 bis 50 $-ig) eluiert, wobei geeignete aktive Fraktionen aufgefangen werden. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen (1 Liter oder weniger) eingeengt. Der pH-Wert dieses Konzentrats wird · mit Bariumhydroxid auf etwa 6,0 bis 6,5 eingestellt. Der ent- standene Bariumsulfatniederschlag wird erneut abfiltriert, und das klare Filtrat wird lyophilisiert, wodurch das {rohe Antibioticum AM 374 erhalten wird. Dieseslyophilisierte Produkt wird nun durch Säulenchromatographie an einem geeigneten Ionenaustauscherharz, aum Beispiel an CM Sephadex C-25 (H -Form), weiter gereinigt. Die Säule wird mit verdünnten Schwefelsäurelösungen eluiert werden. Das Eluat, das die antibiotische Aktivität enthält, welche sich durch Absorption bei 280 mn zeigt, wird mit Bariumhydroxid auf etwa pH 6,3 eingestellt. Der entstandene Bariumsulfatnieder schlag wird abfiltriert, und das Filtrat auf ein Volumen von etwa 30 bis 80 ml eingeengt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Ionenaustauscherharz IR45 (OH*") auf etwa 8,0 eingestellt. Das Harz wird abfiltriert, und'das Filtrat \^ird unter Rühren zu einer größeren Menge Aceton gegeben. Der entstehende Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und bei mäßiger Temperatur unter vermindertem Druck getrocknet, -wodurch Antibioticum AM 374 in der Basenform erhalten wird» ' . .

009842/1984

BAD ORIGINAL

Physikalische Eigenschaften

Eine Hikroanalysenprobe" kann durch lallen von AM 374-Base aus methanolisehern und/oder äthanolischem Aceton und 2 Tage langes Irocknen des Niederschlags im Hochvakuum (10 mm) "bei 1O0°C hergestellt werden· In dieser Weise hergestellte Antibioticum AM 374-Base enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Chlor in praktisch folgenden G-ewichtsprozentsätzeBi

Kohlenstoff 54,54

Wasserstof ....................6,10

• Sauerstoff... 29,01

Stickstoff 7,60

Chlor ......... 2,47

Das Produkt v/eist keinen definierten Schmelzpunkt auf und zersetzt sich langsam oberhalb 250°c. Der optische Drehwert beträgt /"a J^⁵ = 102° ( + 2,9°) (C= 1,045· in Waaser).

Ultraviolettmaxima treten auf bei

282 mn (E* cm « 42) in säuren Lösungen · 282 mu (e3 „„ = 42,5) in neutralen Lösung en

f Ί CIu

¹ -

305 mu (E, _ * 51 »5) in baaJsohen Lösungen 3h260 mn (^Ε]οη, ■ 92) " in basiohen Lösungen

Ein Infratorabsorptionsepektruni von AM 374-Base in einem wie üblich hergestellten KBr-PreßIing weist oharakteriotische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen, angegeben In Mikron auf: 3,0, 3,45, 6,0, 6,20, 6,30, 6,67, 6,88, 7,05, 7,22, 7,35eh, 7,52, 7,67, 8,2, 8,65sh, 8,85, 9,45, 9,75, 9,90, 10,45ih, 11/07, 11,5, 12,0, 12,35, 13,35,

Die Infrarotabsorptionskurve ist in Figur 1 der "beigefügten Zeichung dargestellt.

Antibioticum AM 374 weist in den nachstehend angegebenen Lösungsraittelsy3teinen folgende unter Verwendung von Bacillus subtilis pH 6,0 oder Corynebaeterium xerosis als Nachweisorganismeri ermittelten R^-Werte auf:

Rp-Wert . Iib'sungsEiittelsystem

0,90 5 #-ige wässrige-NE.Cl-Lösung

0,20 Pyridin 2 Teile,

s-Collidin 2 Teile, ' ' sec.-Butanol 1 Teil, Wasser 1 Teil.

Antibioticum AM 374-Base ist in Wasser und Dimethylsulfoxid leicht löslich, in Methanol mäßig löslich und in Äthanol in geringerem Maße löslich.

Antibioticum AM 374 unterscheidet sich von anderen Antibiotica deutlich durch die oben angegebenen Charakterisierungsdaten und durch seine antimikorbielle Aktivität. Die in-vitro-antimikrobielle Aktivität dieses neuen Antibioticums und seines Hydrolyseprodukts ist in der folgenden Tabelle angegeben, die die minimale Hemmkonzentration zeigt, die zur Inhibierung des Wachstums repräsentativer Mikroorganismen in einem Nährmedium erforderlich ist.

Q4i*4*/1M4

Tabο11ο VI

In Vitro antiraicrobielle Alctivit.üt von Antibioticum AM 374 und seinesHydrolyseprodukts *

Minimale Hemmkonzentratioiieii (mc.g/ml)

- . - -	Aa ΐ i b i ο 11cum M374	, Hydrolyse produkt	t
Staphylococcus aureus ] ATCC 6538Ϊ " 1 ■ ■ i	3,1 ■	6,2 .
Staphylococcus aureus STo. 69 I "'""·■ ■ " ι	3,1
Staphylococcus aureus ■ Hose ATCC H 1.54	■;. 6,2 j	6,2
. . i Staphylococcus aureus Smith ATCC 13709 ■ !	• 6,2	6,2
.-■■'■ ■ . ■ ■ '· Streptococcus pyogenes C2O3	0,62	1,25
- Streptococcus' faecalis ATCC 8043 -■-:■■-	3,1 ■	6,2.	A
■ Streptococcus sp,, nicht- hämolytisch No. 11	- ■ ■ 6,2	6,2
Streptococcus sp., ß-hämo- Iytisch JTo. 80	6,2 ■	6,2 ■
Mycobacterium smegmatis ATCC 607 ..■■■■-...	■ >250	'. .125
■ Salmonella thyphosa ATCC 6539	• > 250	> 250
Proteus vulgaris ATCC 9484	>250	> 250 ' .
Escherichiä coli TJ311 '	> 250	> 250■·
Escherichia coli DY	>250	>250"
Klebsieila pneumoniae , Stamm AD	>2,50	> 250 ·
Enterobacter aerogenes Ko. 75 PseudoBionas aeruginosa ATCC 10145	> 250 >250	>25O > 250

* mit Agar-Verdünnungsmethode ermittelt

0 0 9842/198A

BAD ORIGINAL

Auch in vivo ist 13. 374 gegen zahlreiche grampositive Mikroorganismen, zum Beispiel Staphylococcen, Pneumococeen und Streptococcen aktiv. Damit kommt das neue Antibioticum als therapeutisches Mittel zur Behandlung von Bakterien« Infektionen bei Säugetieren, die durch solche Mikroorganismen verursacht werden, in Betracht. Es kann erwartet \*erden, daß das neue Antibioticum mit Vorteil zur Behandlung oder ' Bekämpfung solcher Infektionen durch örtliche Anwendung oder parenteral©- Verabreichung verwendet werden kann.

ψ Die Brauchbarkeit des neuen Antibioticums läßt sich an seiner Fähigkeit, letale Systeminfektionen bei Mäusen zu bekämpfen, nachweisen, Das neue Antibioticum zeigt hohe antibakterielle Aktivität in vivo bei Mäusen gegen Staphylococcus aureus, Stamm.Smith; Staphylococcus aureus, Stamm Hose; Streptococcus pyogenes, 0203; und Diplococcus pneumoniae, SVl, wenn es als subkutane Einzeldosis an Gruppen von weiblichen Mäusen (Carworth Farms CF-1) mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht wird, die intraperitoneal ■ mit einer letalen Dosis dieser Bakterien in 10 , 10°, 10 bzw. 10" Trypticase-Soya-Br.ühe (TSP)-Verdünnungen einer 5 lage-TSP-Blutkultur infiziert wurden.

> ■■■"--.■

Die folgende Tabelle VII erläutert die in vivo-anti-

bakterielle Aktivität von AM 374» während die anschließende Tabelle VIII die in-vivo-ahtibakterielle Aktivität des Hydrolyseprodukts zeigt.

0098 42/198 4 bad

Tabelle VII

φ co

=5 g

co

rn

in vivo antibacterielle Aktivität von Antibioticum AH374 lebende Mäuse/ sämtliche Mäuse: 14 Tage nach Infektion

Dosis	Staphylopoccus	Staphylococcus	Streptococcus	Diplococcus	■. .	20/20
Körpergewicht	aureus Stamm Smith	aureus Stamm Hose	pyogenes C203	pneumoniae SVl		• 20/20 - 1
320		20/20		15/20
80		18/20		0/20
20	20/20	4/20	20/20
5	20/20	0/20	20/20
t,25	1/20		3/20
0,32	2/20		0/20

▼on. den infizierten, unbehandelten Kontrollmäusen starben 95-100$ innerhalb von 5 Tagen nach Infektion.

ax co

	Dosis	Tabelle VIII
in vivo		antibakterielle Aktivität von AM 374
	20	Hydrolyseprodukt
	5	lebende Mäuse/sämtliche Mäuse
	1,25	14 Tage nach Infektion
0,32	Staphylococcus aureus
0,08	Stamm Smith
5/5
. 3/5 -
0/5
1/5
. 0/5

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

I · ■

Inokulumherateilung

Ein typisches Medium zur Vermehrung des ersten Inokulums wird nach folgendem Rezept bereitet:

Melasse 20 g

Glucose 10g

Bactopepton 5 g Wasser ..............ad 1000 ml

00

39 8 4 27 1 S U , °«ginal /nspected :

Die von einer Agarsehrägkultur yon S. eburosporeus abgewaschenen oder abgeschabten Sporen werden zum Beimpfen-von •zwei 500 ml Kolben verwendet, die je 100 ml des vorstehend angegebenen Mediums enthalten. Die Kolben werden auf eine Rotationssehüttelvorrichtung gestellt und 48 Stunden bei 28°C intensiv bewegt. Das erhaltene Kolbeninokulum wird in einen 19 1(5 gallon)-Glasfermenter überführt, der 12 steriles Medium enthält. Der Glasfsrmenter wird während einer Züchtungsdauer von etwa 48 Stunden mit steriler Mift belüftet, worauf sein Inhalt zum Beimpfen eines 300 1 Tankfermenters verwendet wird. . ■

B e i s ρ i e 1 2

Fermentation

Ein Fermentationsmedium wird nach folgendem Rezept bereitet: ·

Soyabohnenmehl 10 g

Gerelose 10g

Natriumchlorid ...................... 5g

Galciumcarbonat 1g

Distillers' S,olubles aus Mais, ..5 g

Wa.sser ........ ................ ad 1000 ml

Das Permentationsmedium wird bei 120°C 45 bis 60 Minuten lang mit Wasserdampf mit einem Druck von 1 atu (15 psi) süerilisiert. Nach dem Sterilisieren beträgt der pH-Wert des Mediums 6,6. 300 1 steriles Medium in einem 400 1-Tankfermenter werden mit 12 1 des in Beispiel 1 beschriebenen Inokulums be-· impft, und-die Permentation.--wird bei 28°C unter Verwendung von Hodag LG—8-Ö1 als Entschäumungsmittel durchgeführt. Die Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0,5

009842/198 A

ί "

sterilier luft pro Liter Medium und pro Minute. Das Medium wird' mit einem Rührer gerührt, der. mit 500 Umdrehungen pro Minute betrieben wird. Nach einer Fermentationsdauer von etwa 70 Stunden wird die Maisehe geerntet.

B e i s ρ i e 1 3 Isolierung und Reinigung

fc 300 1 fermentierte Maische werden mit etwa 2 <fo (Gewicht/Volumen) Filterhilfe (Diatomeenerde) filtriert, und der Filterkuchen wird mit etwa 30 1 Wasser gewaschen. Die fermentierte Maische wird vorher mit Natriumhydroxid auf pH 6,0 eingestellt. Die antibio.tische Aktivität in dem vereinigten Filtrat und Waschwasser wird an 900 g Aktivkohle (D,arco G-60) adsorbiert, und gefärbte Verunreinigungen werden aus der Aktivkohlesuspension durch Rühren mit etwa 30 1 40 fo-igem wässrigem Aceton entfernt. Die Aktivität wird aus der Aktivkohle durch Rühren mit 75 1 40 $-igem wässrigem Aceton, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 2,0 eingestellt ist, eluiert. Die Suspension wird filtriert, das Eluat wird unter vermindertem Druck auf

* etwa 4 1 wässrige Phase eingeengt und der pH-Wert wird mit Bariumhydroxid auf 5,2 eingestellt. Der Bariumsulfatniederschlag wird abfiltriert,und das Filtrat wird weiter auf etwa 700 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird mit ■ 100 g säurebehandeltem Aluminiumoxid aufgeschlämmt und auf eine Säule aufgegeben die mit 1 kg säurebehandeltem Aluminiumoxid in Methanol gefüllt wurde* Daa' säurebehandelte Aluminiumoxid wird durch Ansäuern einer wässrigen Aufschlämmung von Aluminiumoxid (Farbikat Merck) mit konzentrierter Schwefelsäure bis zu einem konstantem pH-Wert von 3,0, Filtrieren, Waschen mit Wasser und Methanol und Trocknen an der IiUft bereitet. Dann wird

009842M984 _BAD original

die Kolonne mit 5 1 Methanol, darm, mit 60 1 50 $-igem ■ ■wässrigem Methanol und hierauf mit 10 1 25 ^-igera wässrigem Methanol eluiert» Geeignete Fraktionen., die Antibioticum AM 374 enthalten, wie durch Biotests gegen C. xerosis festgestellt wird, werden vereinigt, unter vermindertem Druck auf etwa 500 ml eingeengt und mit Bariumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt.. Der Bariumsulfatniederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird lyophilisiert, wodurch 5,1 g rohes AM 374 (Reinheit etwa 30 bis 50 $>) erhalten werden.

Das auf diese Weise in einer Menge von 5,1 g erhaltene rohe AM 374 wird in 30 ml Wasser gelöst und auf eine Kolonne mit Ionenaustauscherharz CM Sephadex C-25 (H -Form) aufgegeben. Zur Zubereitung des Sephadex-Harze3 für den Ge-" brauch werden 250 g davon in etwa 3 1 Wasser aufgeschlämmt, und die Aufschlämmung wird mit konzentrierter H₂SO. auf pH 2,0 eingestellt. Das überschüssige Wasser wird abdekan- diert, und das Harz wird mehrmals mit Wasser gewaschen. Die Aufschlämmung wird in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 7,6 cm gegossen und zur Entfernung der überschüssigen Säure mit weiteren 5 I Wasser gewaschen.

Die Kolonne wird mit einem Gradienten zwischen 4 1 Wasser und 4 1 Wasser das mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 1 ,4 eingestellt ist, und anschließend mit weiteren 4 1 auf pH 1,4 eingestelltem Wasser eluiert; Es werden Fraktionen von jeweils etwa 100 ml aufgefangen, und die Bioaktivität (C.xerosis) und die Ultraviolettabsorption (290 mu) werden an 1- bis 100-fachen Verdünnungen dieser Fraktionen gemessen.

Wie sich zeigt, enthalten die Fraktionen 58 bis 80 die Hauptmenge des gewünschten Antibioticuma, und diese Fraktionen werden vereinigt, Der pH-Wert dieser vereinigten Erektionen wird mit Bariumhydroxid auf 6,3 eingestellt, und

-" 26 -

das abgeschiedene Bariumsulfat wird mit EiIfe von Diatomeenerde abfiltriert. Das Piltrat wird auf etwa 200 ml eingeengt und. lyophilisiert, wodurch etwa 1,5 g rohes Antibioticum erhalten werden. Das rohe Antibioticum wird in 50 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert der lösung wird mit Ionenaustauscherharz IR45 (OH~-Form) auf etwa 8,2 eingestellt. Die Suspension wird filtriert, und das Filtrat wird lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird in 40 ml Wasser gelöst, und das Antibioticum wird durch Zusatz'von 400 ml Aceton ausgefällt. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert und in einer kleinen Menge Methanol gelöst. Durch Zusatz von Aceton scheidet sich das gereinigte Antibioticum AM 374 ab und wird abfiltriert. Die Ausbeute beträgt 1,18 g. '

Eine Mikroanalysenprobe wird durch Ausfällung von wie oben erhaltenem AM 374 aus äthanolischem Aceton und 2 Tage langes Trocknen des Niederschlags im Hochvakuum (10 mm) bei 100⁰G hergestellt. Die Ergebnisse der chemischen Analyse dieses Produkts und die anderen physikalischen und biologischen Eigenschaften des neuen Antibioticums wurden bereits angegeben.

' . Bei- spie" 1" 4.

Umwandlung von AM 374-Base in AM 374-Sulfat

150 mg AM 374-Base werden in 60 ml warmem Methanol gelöst, worauf 1 Tropfen einer 1;1-Lösung von Methanol und konzentrierter Schwefelsäure zugesetzt wird. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und mit etwas Methanol und Aceton gewaschen, wodurch 98 mg AM 374-Sulfat erhalten werden.

Alternativ wird AM 374-Sulfat durch Einstellen einer wässrigen Lösung von AM 374-Base mit Schwefelsäure auf etwa pH 6,3

und anschließende Fällung mit Aceton hergestellt.

Eine Mikroanalysenprobe wird durch Abscheidung,aus wässrigem Aceton und 2 Tage langes Trocknen des Niederschlags im Hochvakuum (10 mm.): bei 10Q⁰C erhalten, In.dieser Weise hergestelttes AM 374-Sulfat enthält die Eemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Chlor in · praktisch folgenden G-ewichtsproze.ntsätzen: .

■ Kohlenstoff 51 ,68

Wasserstoff ................ 5,85

Sauerstoff 30,25

Stickstoff .7,02

Schwefel 1,36

Der optische Drehwert beträgt £ & J ^ = 104° (- 1,8°) . (C?s-1.1075 in Wasser). Ultraviolettmaxima treten auf bei

282 mn (E₁ =44) in sauren Lösungen 282 mn (E₁ ■„. = 43) in neutralen Lösungen

305 mn (E₁'⁰ - = 48) in basischen Lösungen

/ · CHi . _t

sh260 mu (E₁ _ = 85) in basichen Lösungen

j · CHI ·

Ein Infrarotabsorptionsspektrum von AM 374-Sulfat in einein.wie üblich hergestelltenKBr-Preßling weist charakteristisehe· . Absorptionen bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron auf: 3,0, 3,45, 5,75sh, 5,9Osh, 5,99, 6,03, 6,20, · 6,32, 6,67, 6,78sh, 6,87, 7,05, 7,20, 7,53, 7,65, 8,25, 8,65sh, 8,87, 9,45, 9,73, 9*88sh, 1O,45sh, 11,05,· 12,0, 12,35, 13,3, H,4. ^

009842/198 4 ^{BAD oRSGli4AL} |

- 28 Beispiels ......

Umwandlung von AM 574-Base in AK 574-Chlorid

200 mg AM 374-Base werden in 10 ml 0,1 η Salzsäure gelöst, und die Lösung wird unter vermindertem Druck auf etwa 2 ml eingeengt, wodurch sich ein zum Teil mikrokristalliner Niederschlag bildet. Dieser Niederschlag wird abfiltriert, in inöglist wenig Wasser wieder gelöst und mit Aceton wieder gefällt. Nach Abfiltrieren und Y/aschen mit etwas weiterem Aceton werden 116 mg AM 374-Chlorid erhalten.

Eine Mikroanalysenprobe wird durch Abscheidung aus wässrigem Aceton und 2 Tage langes Trocknen des Niederschlags im Hochvakuum (10 mm) bei 100^uC erhalten. Auf diese Weise hergestelltes AM 374-Chlorid enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Chlor in praktisch folgenden Gewichtsprozentsätzen:

Kohlenstoff 52,20

Wasserstoff 6,22

Sauerstoff , 28,03

Stickstoff . 7,26

Chlor 6,34

Der optische Drehwert beträgt £&J jp = 106° (+ 2,8) (G = 1,057: in Wasser). Ultraviolettmaxima traten auf

bei w

282 mu (E./ = 42) in sauren Lösungen
/ ι cm

282 mu (E^_m = 39t5) in neutralen Lösungen. 305 mu (E₁^_n = 52 ) in basischen Lösungen

sh260 mu (E₁^_1n » 92) in basischen Lösungen

00 9 842/1984

; -■- BAD

Ein Infrarotabsorptionsspektrum von AK 574-Clilorid in einem wie üblich hergestellten KBr-Preßling weist charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron, auf: 3,0, 3,27, 3,40, 5,75sh,· 5,9Osh, 5,98, 6,15, 6,28, 6,65, 6,82sh, 7,03, 7,15, 7,50i 7,65, 8,25, 8,60, 8,83, 9,42, 9,70, 9,88, 10,45sh, ".11,05, 11,9, 12,3, 13,3, U,37.

Beispiele Säurehydrolyseprodukt von AM 374-Base

1 g Antibioticum AM 374-Base wird in 7,5 ml siedendem V/asser gelöst. Nach Zugabe von 1,25 ml 5 η Salzsäure wird die erhaltene Lösung 2 bis 3 Minuten lang gekocht. Die Lösung wird mit weiteren 2 ml 5n Salzsäure versetzt, abgekühlt und filtriert. Der Niederschlag wird mit insgesamt 3 ml 5 η Salzsäure gewaschen, in Wasser wieder gelöst und zu einem Rückstand eingeengt. Diese Arbeitsweise wird noch zweimal wiederholt, worauf der Rückstand aus wässrigem Aceton abgeschieden wird. Es werden 516 mg Säurehydrolyseprodukt erhalten.

Eine Mikroanalysenprobe wird durch Abscheidung aus wässrigem Aceton und 2 lage langes Trocknen des Niederschlags im Hochvakuum (10"*^ mm) bei IQO⁰C erhalten. Das auf diese Weiee hergestellte AM 374-Hydrolyseprodukt enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, und Chlor in praktisch folgenden Gewichtsprozentsätzen:

Kohlenstoff 52,54*

Wasserstoff 5,81

Sauerstoff -25,52

Stickstoff 8,32

Chlor 7,11

Der optische Drehwert beträgt /~a_/ ^-' = -69° (1 3,6°) (C = 0,839 in Wasser)

Ultraviolettmaxima treten auf bei:

mu (E₁^ = 46) in sauren Lösungen

280 lu (eJ"_ = 51,5) in neutralen Lösungen

/ f CIu

mu (E₁^V =86) in basiehen Lösungen j ι cm

sh260 nm (E₁. = H3) in basischen Lösungen

Ein Infrarotabsorptionsspektrum von AM 374-Hydrolyseprodukt in einem wie üblich hergestellten KBr-Preßling weist charakteristische Absorptionen bei folgenden
Wellenlängen, angegeben in Mikron, auf: 3,0, 3,3Osh, 3,43, 5,75sh, 5,92sh, 6,0, 6,15sh, 6,25, 6,48sh, 6,68, 6,85, 7,03, 7,18, 7,5, 7,67, 7,95sh, 8,30, 8,55sh, 8,86, 9,15, 9,45, 9,9, TQ,45sii_r 11,1, 11,55sh, 11,9, 13,3, 14,4. ...

INSPECTED

JIIIIiIIMlI

B e i s ρ i e 1 7

Bestandteil g/kg

gemahlener gelber Mais 514

Soyabohnenölinehl (44 fi) 300

Kaisglutenmehl . 50

Menhaden-PischEehl (60fo) " 50

Pett ■ 40

entwässertes Alfalfamehl (17$) 20

gemahlener Kalkstein 5

Dicalciumphosphat 12

Natriumchlorid 3

Spurenmirierale - 1

Vitamxnvormischung 5

Spurenminerale sind Mangan (6,CfO ,Jod (0,12$),

Eisen (2,Of₉), Kupfer (0,2%), Zink (2,0/0. Cobalt (0,02^c/o)

und Calcium

2
Vitaminvormischung pro kg Putter enthält 125 mg butyliertes Hydroxytoluol, 500 mlDL-Methionin, 3300 I.U. Vitamin A, 1100 I. U. Vitamin D₅, 2,2 I.U. Vitamin E, 11 meg. Vitamin B-p» 4,4 mg Riboflavin, 27,5 mg Niacin, 8,8 mg Pantothensäure, 500 mg Cholinchlorid, 1,43 mg Polsäure und 1,1 mg MenadionnatriumbisulfIt auf 5 g gemahlenen gelben Mais. ·

Von einem Händler bezogene Eintagsküken (6 männliche und 6 weibliche Tiere pro Gruppe) werden in beheizten Brutkästen untergebracht und in einem Kükenraum gehalten, der bei etwa 24⁰C gehalten wird. Alle Kükengruppen werden zu Beginn der Tests und an ihrem Ende nach 20 Tagen gewogen. Putter und Wasser werden ad libitum zur Verfiging

0098Ä2/198A

BAD ORIGINAL

gestellt. Für sämtliche Tests wird das oben beschriebene Grundfutter verwendet. Die Ergebnisse werden ermittelt für (a) unbehandelte Kontrollen, (b) 10 ppm AM 374, (c) 2 ppm AM 374. Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt, aus der zu ersehen ist, daß mit beiden Behandlungskonzentrationen von AM 374 das Wachstum der behandelten Tiere beträchtlich verbessert wird.

009842,198*

Tabelle IX

Wachstum und Putterverwertung von Küken bei Verabreichung von AM 374H enthaltendem Futter

Futterzusatz

Gewichts- Putter/ Verhältnis

Menge Ver- zunähme (g), Gewichtssu- Überlebende (ppm) such 0-20 «Tag nähme

Verbesserung % Gewichts- Futter/Gezunahme wichtszunähme

keiner

AM 374H keiner AM 374H

40

266	1,70	29/30
284	1,62	30/30
288	1,75	39/40
302 .	1,63	18/20

6,8

4,9

4,9

7,4

2.

CO

ι Ο

- 34 -'
Beispiele

Zusammensetzung des Putter

Bestandteil Konzentration (°/o)

gemahlener gelber -Mais ' "51,4

' Soyabohnenölmehl (44$) 30,0 >

Maisglutenmehl 5,0

Menhaden-Fischmehl (60%) 5,0

Fett (NRG-50) " 4,0

■ entwässertes ilfalfamehl (17$) .' 2,0

gemahlener Kalkstein (33 $ Ca) 0,5

Dicalciumphosphat ' 1,2

Natriumchlorid ' · .0,3

Spurenminerale ^ 0,1

ρ
Vitaminvormischung 0,5

!Lime Crest Z-2 Delamix; enthält 25,5 $ Calcium, 6,0 $ Mangan, 2,0 $ Eisen, 2,0 $ Zink* 0,12 $ Jod und 0,02 $ Cobalt.

^Liefert 3300 I.U.Vitamin A, 1100 I.U.Vitamin D₃₁ 2,2 I,U.Vitamin B, 500 mg Cholinchlorid, 500 mg ; DI-Methionin, 125 mg Äthoxyquin, 27,5 mg Niacin, 8,8 mg Panto.the'nsäure, 4,4 mg Riboflavin, 1,43 mg Fola^ure, 1,1 mg Menadion, 0,011 mg Vitamin B₁₂ P¹¹O kg futter.

009342/1984

	Wachstum	1 Putter···	•	2 Menge	10	10	und Futterverwertung_	-	1563	4 Gewichts-	Tabelle X	6 Verhältnis	29/30	Futter mit verschiedenen	8 erung	NJ O
		zusatz	(ppm)	10	2				, zunähme (g) 0-2O.Tag		wichtszunahme Überlebende	28/30		Futter/Ge wichtszunahme
	keiner	...	ίο	2	3 Ver			266	von Küken bei Verabreichung von	1,70	30/30	.7 ia_ Verbess	I1)L u ,...,
	Penicillin 200	.,—.		such			315	Zusätzen	1 ,50	30/30	: Gev;ichtszu nähme	13,3
	Payzone	Penicillin 200		1559		298	5 / Futter/Ge	1,58	28/30		7,6
	AK374H	Payzone			284		1,62	39/40	18,4	4,9 ·
	AV290D	AM374H		282	1,59	20/20· .	12,0	6,9
	keiner	AV29OD	288	1,75	20/20	6,8	■—-
O		317	1,70	18/20	6,0
Φ OO	289	1,75	20/20		0,0
S	302	1,63		10,0	7,4
	312	. 1,70		0,3	2,9
CQ	■			4,9
03	8,3

Fußnoten zu Tabelle X;

Spalte 4: "Gewichtszunahme" (g), 0. bis 20. Tag, gibt die gesamte Gewichtszunahme während der Testdauer von 20 Tagen an.

Spalte 5i "Futter/Gewichtszunahme" gibt das Verhältnis von verbrauchtem Futter in g zu Zunahme des Körpergewichts in g an.

Spalte 7: "Prozent Verbesserung (Gewichtszunahme)" gibt die Verbesserung der Gewichtszunahme in Prozent .

an, zum Beispiel

315 x 100

Oj-

100 = 18,4..

Spalte 8 "Prozent Verbesserung (Futter/Gewichtszunahme)" gibt die prozentuale Verbesserung des Verhältnisses von Gramm Futter pro Gramm Gewichtszunahme an, zum Beispiel

1,7 x 100 -100 = 13,3.

1,5

009842/1984

ORlGiNAL INSPECTED

• · Be i s ρ i e. 1 9 Herstellung von AM 374 enthaltenden !Tabletten

Antibioticum AM 374 wird zu üblichen pharmazeutischen Tabletten entsprechend folgender Rezeptur verarbeitet:

Bestandteil	mff pro Tablette
AM 374 '■■■'■·.	50
Lactose	225
Maisstärke (zum Mischen)	50
Maisstärke (für Paste)	25-
Magnesiumstearat	5 -

355

Der Wirkstoff AM 374, die Lactose und die Maisstärke zum Mischen werden miteinander vermischt. Die Maisstärke für Paste wird in Wasser in. einem Verhältnis von 100 g Maisstärke pro 800 ml Wasser suspendiert und durch Erwärmen unter Bühren in eine Paste übergeführt". Dann wird die erhaltene Paste zum Granulieren des vermischten Pulvers verwendet. Falls nötig, wird weiteres Wasser verwendet. Das feuchte Granulat wird durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 2,38 mm (Sieb Nr, 8) geführt und bei 49°C (120⁰P) getrocknet · Das trockene Granulat wird durch ein. Sieb mit einer lichten Maeohenweite von 1,19 mm (Sieb Nr. 16) geführt und mit dem; Magnesiumstearat'gleitfähig gemacht. Dann wird das Granulat in.einer geeigneten Tablettierinaechine zu Tabletten verpreßt (Tablettengewicht 355 ng)t Jede Tablette enthält 50. mg Wirkstoff.

ι 1

Beispiel 10 Γ

"'V Herstellung von AM 3-74 enthaltenden hart-

• Der Wirkstoff AM 374 kann in hartachaligen Kapseln verab-' reicht werden. Folgende Rezeptur ist zur Herstellung solcher

·

ia

\- ■ /^ ■^■..iiJ.y^

Kapseln geeignet:

Bestandteil pro Kapsel für 1000 Kapseln,

mg g

AM 374 50 50

Lactose 90 90

Magnesiums te ar at . 1 ' 1

141 · 141

-ν

" Der Wirkstoff, die Lactose und das Magnesiumstearat

werden miteinander vermischt. Mit der Mischung werden hart-.' schalige Kapseln geeigneter Größe mit einem Füllgewicht von 141· mg pro Kapsel gefüllt.

Beispiel 11 \

Herstellung einer oralen Lösung von AM 374

Bestandteil	Menge, % CGew.-/WoI)
AM 374	1,00
Magnesiumaluminiumsilicatgel	0,50
Saccharose	60,00
Methylparaben	0,08 ^
Polyparaben	' ' . 0,02 .
Aromamittel	nach Bedarf
destilliertes Wasser	ad - 100,00

Die Parabene und die Saccharose werden in etwa 2/3 des Endvolumens von destilliertem Wasser bei 80⁰G gerührt» und daa Gel (Veegum) wird unter Rühren zugesetzt. Nach Abkühlen der Lösung auf 4Ο^υΟ werden der Wirkstoff und daa Aromamittel unter Rühren zugegeben. Die abgekühlte Lösung wird mit destilliertem Wasser auf das Endyolumen eingestellt.

Die Lösung liefert 50 mg Wirkatoff pro 5 ml Lösung als Doöiö.

0Q9842/1984

-.39 -Beispiel 12

Mit dem Wirkstoff AM 374 kann eine Injektionslösung nach folgender Rezeptur "bereitet werden:

Bestandteil Menge fo (Gew./YoI.)

AM 574 ■ V ' 5,0

Polyäthylenglycol 4000 U.S.P. 4,0

Natriumchlorid π.S.P. 0,90

Benzylalkohol, reagensrein 0,90

Wasser für Injektionszwecke . ad 100,00

Der Träger wird durch Vermischen aller vorstehend genannten Bestandteile mit Ausnahme von AM 574 "bereitet. Der Träger und der feinstgemahlene Wirkstoff werden durch ,geeignete Maßnahmen sterilisiert. Eine Losung des Wirkstoffs in dem Träger wird durch Aufschlämmen ' des Wirkstoffs mit einem Teil des Trägers und anschließende Zugabe des übrigen Teils des Trägers unter Rühren hergestellt.

,Eine Dosis dieser Lösung von T ml liefert 50 mg Wirkstoff.

ORIGINAL

Claims (7)

1. Patentansprüche Antibioticum AM 374, dadurch gekennzeichnet, daß es

   (a) in praktisch reiner kristalliner Form oder in Farmen eines Salzes das Wachstum von grampositiven Bakterien inhibiert,

   (b) in V/asser und Dimethylsulfoxid leicht löslich, in Methanol und Äthanol mäßig löslich und in anderen üblichen organischen Lösungsmitteln verhältnismäßig

   ^ unlöslich ist,

   (c) folgende Werte der Elementaranalyse aufweist: C 54,54; H 6,10; 0.29,01; N 7,60; Cl 2,47;

   (d) tlltraviolettmaxima bei

   282 DIu(E₁^ = 42) in sauren Lösungen,

   282 mu(El^ =42,5) in neutralen Lösungen,, / 1 cm

   • 315 wül(t^^° = 51 ,5) in basischen Lösungen / 1 cm

   sh260 ¹^-(E₁Q_1n = 92) in basischen Lösungen

   aufweist;

   (e) einen optischen Drehwert von /~a _7jj = -102°

   C ²»9°) (C = 1,045 in Wasser) hat und

   (f) sich durch ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum auszeichnet, wie es in Figur 1 dargestellt ist.
2. 2. Verfahren zur Erzeugung von Antibioticum AM 374, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antibioticum AM 374 produzierenden Stamm von Streptomyces eburo-

   009842/1984

   sporeus nov. sp. in einem wässrigen Uährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, bis das Medium infolge · Produktion von Antibioticum AM 374 eine beträchtliche antibakteriell Aktivität aufweist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das erzeugte Antibioticum AM 374 aus dem Medium isoliert und gegebenenfalls in ein Salz oder Hydrolysat überführt. ·
4. 4. Tierfutter- oder -tränkmittel , dadurch gekennzeichnet, daß es als Inhibitor für das Wachstum von grampositiven Bakterien, die wie in Anspruch 1 identifizierte Verbindung AM 374 oder Derivate davon enthält.
5. 5· Hährstoffmäßig ausgeglichenes Tierfutter, dadurch gekennzeichnet, daß es wie in Anspruch 1 identifiziertes Antibioticum AM 374 öder Derivate davon enthält.
6. 6· Tierfutter- oder —tränkmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Inhibitor für das Wachstum von grampositiven Bakterien das nach dem Verfahren von Anspruch 2 und/oder 3 hergestellte Antibioticum enthält.
7. 7. Nährstoffmäßig ausgeglichenes Tierfutter, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von An spruch 2 und/oder 3 hergestelltes Antibioticum AM 374 oder ein Derivat davon enthält.

   ORIGINAL

   «Λ

   Leerseite