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Verfahren zur Herstellung einer neuartigen stickstoffhaltigen organischen Base und ihrer Säureadditionssalze
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuartigen stickstoffhaltigen Base und ihrer Säureadditionssalze.
Im einzelnen schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Capreomycin vor, das darin besteht, dass man einen Capreomycin bildenden Stamm von Streptomyces capreolus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, eingetaucht unter aeroben Bedingungen züchtet, bis von dem Organismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge Capreomycin gebildet worden ist.
Die hier beschriebene neuartige Base wird als Capreomycin bezeichnet und ist eine weisse feste Substanz mit den folgenden Eigenschaften : Sie ist leicht löslich in Wasser. Dagegen ist sie in den meisten organischen Lösungsmitteln verhältnismässig unlöslich. Sie ist z. B. verhältnismässig unlöslich in niederen Ketonen, wie Aceton und Methylisobutylketon, in Alkoholen, wie Methanol, Äthanol und Butanol, in Estern, wie Amylacetat, und in Äthern, wie Diäthyläther. Ferner ist sie verhältnismässig unlöslich in Lösungsmitteln, wie Pyridin, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Benzol und Kohlenwasserstoffen.
Die freie Base Capreomycin ist verhältnismässig beständig in wässerigen Lösungen innerhalb eines pH-Bereiches von etwa 4 bis 8, ist aber unbeständig in stark basischen und stark sauren Lösungen. Im allgemeinen ist Capreomycin in sauren Lösungen beständiger als in basischen Lösungen.
Die elektrometrische Titration von Capreomycin in Dimethylformamid-Wasser (Volumsverhältnis2 : 1) zeigt die Anwesenheit von titrierbaren Gruppen mit den folgenden pK'a-Werten : 6, 5 ; 8, 0 ; 10,0 und 13,0.
Das durch elektrometrische Titration bestimmte Molekulargewicht von Capeomycin ist etwa 740.
Das Tetrahydrochlorid von Capreomycin ist in wasserfreiem Methanol zu etwa 6, 6 mg je ml bei 260C löslich.
Die Analyse von Capreomycin, das im Vakuum bei Raumtemperatur über wasserfreiem Calciumsulfat 16 h getrocknet wurde, ergab, dass es als freie Base vorlag und ungefähr die folgende Zusammensetzung hatte :
EMI1.1
<tb>
<tb> Kohlenstoff <SEP> 44, <SEP> 08%
<tb> Wasserstoff <SEP> 6, <SEP> 94% <SEP>
<tb> Stickstoff <SEP> 26, <SEP> 23% <SEP>
<tb> Sauerstoff <SEP> (direkt) <SEP> 22, <SEP> 18%
<tb>
Diese Werte ergeben die empirische Formel C Hsos3N1401, doch stellt diese Formel natürlich nur eine Annäherung dar, die sich bei der genauen Aufklärung der Struktur der Verbindung noch etwas ändern kann.
Die Infrarotabsorptionskurve des Capreomycindihydrochlorids als von Mineralöl bedecktes Pulver ist in der Zeichnung veranschaulicht. Die erkennbaren Banden des Infrarotabsorptionsspektrums im Bereich
EMI1.2
Capreomycin zeigt intensive Absorptionsmaxima von etwa 268 mll in 0, 03 n-Salzsäure bei einem Absorptionswert von El : 269 und von etwa 283 mllln 0, 05 n - Kalilauge bei einem Absorptionswert von
EMI1.3
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Wasser).
Die Substanz wurde nach bekannten Verfahren zur Analyse von Aminosäuren untersucht, z. B. nach dem von Moore und Stein in J. Biol. Chem. 192 [1951], S. 663, angegebenen Verfahren, wobei die Analyse der Hydrolysate von Capreomycin, die durch Hydrolyse mit 5,7n-Salzsäure bei 1000C er. halten wurde, die Anwesenheit von mehreren Aminosäureresten anzeigte. Die quantitative Bestimmbarkeit der in derartigen Säurehydrolysaten enthaltenen Aminosäurereste ist begrenzt, weil die Beständigkeit der Peptidbindungen gegenüber Spaltung und die Beständigkeit der Aminosäurereste in den Säurehydrolysaten sehr unterschiedlich ist.
Unter dieser Voraussetzung und unter Annahme eines Mol. -Gewichts von etwa 740 ergibt die vorläufige Aminosäureanalyse mindestens je einen Rest der folgenden Aminosäuren im Molekül des Capreomycins : Alanin, Serin, 2, 3-Diaminopropionsäure und zwei basische Aminosäuren, von denen die eine sich wahrscheinlich von Ornithin herleitet und die andere wahrscheinlich bisher unbekannt ist.
Die bisherigen Analysen haben noch keinen Aufschluss über die Anwesenheit von "sauren" (mehrere Carboxylgruppen enthaltenden), aromatischen oder Schwefel enthaltenden Aminosäuren gegeben. mit Capreomycin ausgeführte chemische Untersuchungen brachten die folgenden Ergebnisse : Die Ninhydrinprobe auf Anwesenheit von Cl-Aminogruppen war positiv. Die Lowry'sche Proteinprobe (J. Biol.
Chem. 193 [1951), S. 265) und die Folin-Ciocalteau'sche Proteinprobe waren positiv. Die Anthron-, Bial'sche und Tauber'sche Saccharidprobe waren negativ sowie auch die Ehrlich'sche Indolprobe. Die Hydroxamsäureprobe auf Estergruppen, wie sie in J. Biol. Chem 159 [1945], S. 21, beschrieben ist, war
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negativ.Capreomycin hat eine Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum bestimmter Mikroorganismen, einschliesslich grampositiver und gramnegativer Bakterien. Die Mengen, die eine Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum einer Reihe von Organismen hervorrufen, sind in Tabelle I angegeben. Die Hemmkon- zentrationen wurden durch Agarverdünnungsprobe oder durch Nährlösungsverdünnungsprobe bestimmt (in der Tabelle mit "ad" bzw. "bd" bezeichnet).
Bei der Agarverdünnungsprobe wird der Testorganismus auf eine Reihe von Agarplatten, die verschiedene Konzentrationen an Cap : eomycin in dem Agar enthalten, ausgestrichen oder in diese eingeimpft, um die Mindestkonzentration an Capreomycin in y/ml zu ermitteln, die das Wachstum des. Organismus 48 h lang hemmt.
Bei der Nährlösungsverdünnungsprobe wird eine Reihe von Röhrchen, die eine Nährlösung mit verschiedenen Konzentrationen an Capreomycin enthalten, mit dem Testorganismus beimpft, um die Mindestkonzentration an Capreomycin in y/ml in der Nährlösung zu ermitteln, die das Wachstum des Organismus etwa 24 h lang hemmt.
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Tabelle I !
EMI3.1
<tb>
<tb> Untersuchter <SEP> Organismus <SEP> : <SEP> Hemmkonzentration <SEP>
<tb> 07mil) <SEP> : <SEP>
<tb> Bakterien <SEP> :
<SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 25,0 <SEP> ad
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> > <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> (607) <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> (607,
<tb> streptomy <SEP> cinresistent) <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium
<tb> (streptomycinresistent) <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> ad
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> > <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 100,0 <SEP> ad
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100,
<SEP> 0 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> > <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 100,0 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 62, <SEP> 5 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> berta <SEP> 125, <SEP> 0 <SEP> bd
<tb>
Wie oben erwähnt, können Capreomycin und seine Säureadditionssalze zur Behandlung von Bakterieninfektionen in der Veterinärmedizin verwendet werden. Die Verbindungen sind z. B. wirksam zur Behandlung von Krankheiten, die von Salmonellen hervorgerufen werden. Im einzelnen reichen etwa 400 mg je kg Körpergewicht, subcutan gegeben, aus, um eine Infektion durch Salmonella typhimurium bei Mäu- sen zu bekämpfen.
Ferner reichen etwa 1-5 mg Capreomycin bei intramuskulärer Injektion je Eintagsküken zur Bekämpfung einer Infektion von Salmonella pullorum aus.
Die Verbindungen sind ferner wirksame Kontaktgifte für Hausfliegen. Ein geeignetes Präparat für diesen Zweck ist eine wässerige Lösung von 0, 4 Gew.-% Capreomycin, entweder als freie Base oder als wasserlösliches Säureadditionssalz.
Die Verbindungen haben blutdrucksenkende Wirkung, wie die pharmakologische Standardprüfung an anästhesierten Hunden zeigt.
Capreomycin und seine Säureadditionssalze haben in vivo eine antibakterielle Wirkung gegenüber infizierenden Organismen bei subcutaner Injektion bei Mäusen, wobei der EDso-Wert (wirksame Menge, um 50% der Versuchstiere zu schützen) bei einigen Beispielen wie folgt liegt : Streptomycetes pyogenes, 250 mg (x 2) ; Proteus vulgaris, 84 mg (x 2) ; Salmonella typhosa, 90 mg (x 2) und Klebsiella pneumoniae, 30 mg (x 2). (Die Werte bedeuten die Menge Capreomycin je kg Körpergewicht des Versuchstieres ;"x 2" bedeutet zwei Gaben.)
Ferner ist Capreomycin in vivo bei Mäusen wirksam gegen experimentell verursachte Tuberkulosein-
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fektionen. Es ist z.
B. wirksam gegenüber Mycobacterium tuberculosis var. hominis (Stamm H37RV) bei
Infektionen an Mäusen, wenn es subcutan oder oral gegeben wird. Bel subcutaner Injektion ist es wirksam bei einer Dosierung in dem allgemeinen Bereich, in dem die gegenwärtig angewendeten antituberkulösen
Antibiotika, wie Streptomycin, wirksam sind.
Capreomycin kann durch Züchten eines bisher unbekannten Organismus unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium hergestellt werden, das asslmilierbare Quellen tür Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält. Der Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension auf Nähragar ausgestrichen wurden. Die beimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 25-350C bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit wurden Kolonien der Capreomycin bildenden Organismen mit einer sterilen Platinöse auf Schräg- agar übertragen. Die beimpften Schrägagarböden wurden bebrütet, um grössere Mengen Inoculum für die Herstellung von Capreomycin zu erhalten.
Der zur Bildung von Capreomycin befähigte neuartige Organismus wurde zur ständigen Aufbewahrung an The Culture Collection of the Northern Utilization Research and Development Branch des United States Department of Agriculture in Paoria, Illinois. gegeben und erhielt die Kulturbezeichnung NRRL 2773 und den Namen Streptomyces capreolus.
Die folgende ausführliche Beschreibung nimmt im einzelnen Bezug auf diesen neu gefundenen Organismus NRRL 2773. Selbstverständlich gehört aber auch die Herstellung von Capreomycin durch Züchten von andern Capreomycin bildenden Organismen oder Mutanten von Capreomycin bildenden Organismen, einschliesslich Mutanten von NRRL 2773, in den Bereich der Erfindung. Derartige andere Organismen, Rassen oder Mutanten können durch bekannte Verfahren, z. B. durch Behandeln eines Capreomycin bildenden Organismus mit Röntgenstrahlen oder ultravioletter Strahlung oder mit chemischen Mitteln, z. B. den Stickstoffsenfölen (nitrogen musards), hergestellt werden.
Es folgen nun die Ergebnisse einer eingehenden systematischen Untersuchung des neuen Organismus S. capreolus NRRL 2773. Die in der Beschreibung angegebenen Farben entsprechen den von Maerz und Paul, Dictionary of Color [1950], angegebenen Definitionen.
Mikroskopische Morphologie.
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 30 C) :
Die Kolonien bilden gerade oder gekrümmte Sporophoren und zylindrische Konidien. Die Konidien haben l, 0-1,2 u Durchmesser und 3,0-4, 8 jLt Länge.
Agar nach Hickey und Tresner (14 Tage bei 300C) :
Mikroskopische Morphologie wie vorstehend beschrieben.
Salz-Stärke-Agar (14 Tage bei 300C) : Mikroskopische Morphologie wie vorstehend beschrieben.
Kennzeichen der Kultur.
Czapek'scher Agar (14 Tage bei 300C) : Mässig gutes Wachstum. Grössere Mengen an Luftmycel, weisse und sehr geringe Sporenbildung. Rückseite orangebraun bis rotbraun. Keine löslichen Pigmente.
Glucose-Asparagin-Agar (14 Tage bei 300C) : Mässiges Wachstum. Geringes, schwach gelbbraunes (Pl. 10-2B) Luftmycel. Geringe Sporenbildung, Rückseite rotbraun. Hellbraunes lösliches Pigment.
Anorganische Salze-Stärke-Agar (14 Tage bei SOOC) : Mässiges Wachstum. Ziemlich starkes, fast weisses Luftmycel, Rückseite rotbraun. Hell rotbraunes lösliches Pigment.
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lösliches Pigment.
Emerson'scher Agar (14 Tage bei 30 C) : Mässiges Wachstum. Geringes, weisses Luftmycel. Keine Sporenbildung. Rückseite rotbraun. Hellbraunes lösliches Pigment.
Kartoffelpfropfen-Agar (14 Tage bei 300C) : Kein Wachstum bis ausgezeichnetes Wachstum von vegetativem Mycel je nach der Kartoffelsorte. Kein sichtbares Luftmycel. Durch die hellorange Rückseite und vegetatives Wachstum wird der Kartoffelpfropfen etwas gedunkelt.
Tyrosinagar (14 Tage bei 300C) : Ziemlich gutes Wachstum. Luftmycel fast weiss. Rückseite henbraun. Hellbraunes lösliches Pigment.
Physiologie.
HS-BiIdung : Auf Pepton-Eisen-Agar unter Zusatz von Hefeextrakt nicht beobachtet.
Gelatineverflüssigung : Mässig unter Bildung eines rotbraunen löslichen Pigments.
Nitratreduktion : Keine Reduktion in organischer Nährlösung, geringe Reduktion in synthetischer Nähr- lösung.
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Stärkehydrolyse : Nur teilweise Hydrolyse nach 14 Tagen.
Magermilch : Weder Koagulation noch Peptonisation in 14 Tagen. Orangebrauner Ring, kein Häut- chen. Geringer pH-Anstieg.
In Tabelle II sind die Ergebnisse angegeben, die bei Versuchen zur Kohlenstoffverwertung mit dem Organismus NRRL 2773 erhalten wurden. In der Tabelle werden die folgenden Symbole verwendet : + = Wachstum und Verwertung ;-= kein erkennbares Wachstum bzw. keine Verwertung.
Tabelle II :
Kohlenstoffverwertung von NRRL 2773
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<tb>
<tb> Verbindung <SEP> : <SEP> Wachstumsverhalten <SEP> : <SEP>
<tb> L <SEP> (+)-Arabinose <SEP> +
<tb> D <SEP> (+)-Glucose <SEP> +
<tb> D <SEP> (-)-Fructose <SEP> +
<tb> i-Inosit <SEP> +
<tb> Maltose <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> +
<tb> D <SEP> (+)-XyloseL <SEP> (+)-RhamnoseSaccharoseLactoseD <SEP> -Raffinose
<tb> Inulin <SEP> - <SEP>
<tb> MannitSalicinSorbitCelluloseD-RiboseD <SEP> (+)-Trehalose-
<tb>
Das zur Herstellung von Capreomycin durch Züchten von NRRL 2773 verwendbare Kulturmedium kann verschiedenartig gewählt werden, wie aus den obigen Verwertungsversuchen hervorgeht ; der Organismus vermag verschiedene Energiequellen zu nutzen.
Wegen der billigen Herstellung, der grossen Ausbeute an Antibioticum und der leichten Isolierung des Antibioticums werden bestimmte Kulturmedien bevorzugt, die verhältnismässig einfache Nährquellen enthalten. So enthalten z. B. die Medien, die zur Herstellung von Capreomycin verwendbar sind, eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, wie Glucose, Fructose, Maltose, Mannose, lösliche Stärke, Melassen, Dextrin, braunen Zucker, Maisquellflüssigkeiten od. dgl. Die bevorzugte Quelle für Kohlenstoff ist Glucose. Ferner enthalten die verwendbaren Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie Hafermehl, Rindfleischextrakt, Peptone (aus Fleisch oder Soja), hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäurengemische od. dgl. Gegenwärtig werden als Stickstoffquellen Peptone, hydrolysiertes Casein und Rindfleischextrakt bevorzugt.
Mineralsalze, z. B. Salze mit Calcium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat- und Carbonationen, und eine Quelle für Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder Hefeextrakt, können den Medien vorteilhaft zugesetzt werden.
Wie es auch für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, müssen dem Kulturmedium ferner wesentliche Spurenelemente zugesetzt werden, um den erfindungsgemäss verwendeten Actinomyceten zu züchten. Solche Spurenelemente gelangen gewöhnlich als Verunreinigungen beim Zusatz der andern Bestandteile in das Medium.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann stark schwanken. Es hat sich jedoch als zweckmässig erwiesen, dass der anfängliche PH-Wert des Mediums zwischen etwa 5, 5 und 8, 0, vorzugsweise zwischen etwa 6, 5 und 7,0, liegt. Wie auch bei andern Actinomyceten beobachtet wurde, steigt der PH-Wert des Mediums während des Wachstums des Organismus allmählich an, während das Capreomycin gebildet wird und kann Werte von etwa 7, 2 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der Endwert mindestens teilweise von dem anfänglichen PH-Wert des Mediums, den in dem Medium enthaltenen Puffern und der Zeit abhängt, die der Organismus wachsen kann.
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Eingetauchte aerobe Kulturen sind wählbare Bedingungen bei der Herstellung von Capreomycin. Zur
Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden, doch werden für die Herstellung grosser Mengen submerse aerobe Kulturen in sterilen
Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension beimpft werden, aber wegen der bei Verwendung einer Sporensuspension als Inoculum zu beobachtenden Wachstumsverzö- gerung wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Wenn die Wachstumsverzögerung hiedurch vermie- den wird, ist auch eine wirksamere Ausnutzung der Gärvorrichtung möglich.
Es ist also zweckmässig, zu- erst ein vegetatives Inoculum der Organismen herzustellen, indem eine verhältnismässig kleine Menge
Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus beimpft wird, und wenn ein junges, aktives vegetati- ves Inoculum erhalten worden ist, dieses Inoculum aseptisch in den grossen Tank überzuführen. Das Me- dium, in dem das vegetative Inoculum gebildet wird, kann das gleiche oder ein anderes sein, wie es zur
Herstellung von Capreomycin im grossen Massstab verwendet wird.
Die Organismen wachsen am besten bei Temperaturen im Bereich von etwa 28 bis 370C. Die beste
Capreomycinbildung scheint bei etwa 29-330C zu erfolgen.
Wie es bei Submerskulturverfahren üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Die wirksamste Förderung des Wachstums des Organismus und der Bildung von Capreomycin wird dann erreicht, wenn das bei dem Tankverfahren verwendete Luftvolumen mehr als 0, 1 Vol. -Teil Luft je Minute je Vol. -Teil Kulturmedium beträgt. Wirksames Wachstum und beste Ausbeuten an Capreomycin werden erzielt, wenn das verwendete Luftvolumen mindestens 1 Vol.-Teil Luft je Minute je Vol.-Teil Kulturmedium beträgt.
Die Konzentration anCapreomycinaktivität in dem Kulturmedium kann leicht während der Gärungszeit durch Untersuchung von Proben des Kulturmediums auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum eines Organismus verfolgt werden, der durch Capreomycin gehemmt wird. Der Organismus Klebsiella pneumoniae hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Untersuchung kann in bekannter Weise durch Trübungsmessung oder in Schalen erfolgen.
Im allgemeinen wird die grösste Menge nach dem Beimpfen des Kulturmediums innerhalb von etwa 4 bis 7 Tagen gebildet, wenn eine aerobe Submerskultur oder eine Schüttelkolbenkultur verwendet wird, und innerhalb von etwa 5 bis 10 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur verwendet wird.
Das Mycel und ungelöste Feststoffe werden aus der Gärlösung in üblicher Weise, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, entfernt. Das Antibioticum ist in der filtrierten Lösung enthalten und kann daraus z. B. durch Adsorption entfernt werden. Zu den verschiedenen hiefür verwendbaren Adsorptionsmit- tellr gehören Adsorptionskohlen und Ionenaustauschharze mit saurem Charakter ; ein geeignetes Harz dieser Art ist"Dowex"50 (ein sulfoniertes Polystyrolharz der Dow Chemical Company).-
Bei Verwendung von Kohle als Adsorptionsmittel kann Capreomycin dadurch gewonnen werden, dass man als Adsorptionsmittel Aktivkohle, z. B."Darco"G-60 (von der Atlas Powder Company) der filtrierten Lösung unter Rühren zusetzt. Das Gemisch wird lange genug gerührt, dass das Capreomycin wirksam an der Kohle adsorbiert wird.
Gewöhnlich wird, wenn etwa 2-5 Teile Kohle je 1 Teil Feststoffgehalt der Lösung zugesetzt werden, eine befriedigende Entfernung des Cap : eomycins aus der Lösung innerhalb von etwa 1 bis 2 h erreicht. Die Kohle, an der das Antibioticum adsorbiert ist, wird von dem Gemisch abfiltriert und zur Entfernung nicht adsorbierter Verunreinigungen gründlich gewaschen. Das Antibioticum wird dann aus der gewaschenen Kohle eluiert. Es wurde gefunden, dass eine Kombination einer verdünnten wässerigen Säure mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wirksam zur Entfernung des Antibioticums aus der Kohle dienen kann. Beispielsweise hat sich ein Gemisch von 80 Vol. -Teilen 0, 05n-Salzsäure und 20 Vol. -Teilen Aceton zum Eluieren von Capreomycin als wirksam erwiesen.
Nach einem andern Verfahren kann Capreomycin aus der filtrierten Lösung durch Inberührungbringen mit einem sauren Harz entfernt werden. Das Harz wird normalerweise in Salzform, z. B. als Natriumsalz, angewendet. Das adsorbierte Capreomycin kann aus dem Harz beispielsweise mit einer wässerigen Lösung eines löslichen Salzes, z. B. eines Sulfats, eines Chlorids oder eines Citrats, eluiert werden. Das
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Die Capreomycineluate können gegebenenfalls durch Behandeln mit Kohle entfärbt werden.
Wenn ein verhältnismässig unreines Präparat von Capreomycin erhalten werden soll, brauchen die genannten Eluate nur zur Trockne eingedampft zu werden. Die Eluate oder der trockene Rückstand derselben können jedoch zur weiteren Reinigung von Capreomycin verwendet werden.. So kann z. B. das durch Adsorption mit Kohle erhaltene Eluat auf etwa 1/5-1/10 seines Volumens eingedampft werden, wobei das Aceton entfernt wird, worauf das Capreomycin aus dem wässerigen Konzentrat ausgefällt werden kann.
Die Fällung kann durch Zusatz eines geeigneten Salzes unter Rühren erfolgen, z. B. eines üblicherweise
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zum Ausfällen von Proteinen verwendeten Salzes, wie Ammoniumsulfat, durch Ansäuern mit einer Säu- re, die ein Anion für das Capreomycinsalz liefert, oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Caton, erfolgen. Ein bevorzugtes Fällungsmittel ist Schwefelsäure.
Zur Ausfällung wird dem konzentrierten Eluat gewöhnlich 10n-Schwefelsäure in einer Menge von et- wa 1 Vol.-Teil Säure je 100 Vol.-Teile Capreomycinkonzentrat zugesetzt. Das als Schwefelsäureadditionssalz ausgefällte Capreomycin wird abfiltriert oder abzentrifugiert, gewaschen und gegebenenfalls getrocknet. Das Capreomycin kann durch wiederholtes Ausfällen mit Schwefelsäure weiter gereinigt werden. Der Niederschlag von Capreomycin kann weiter zu einer weissen festen Substanz gereinigt werden, indem er in der gerade nötigen Menge Wasser gelöst und die Lösung unter Rühren in ein grosses Volumen eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B. indiel0-30fache Menge Methanol, gegeben wird, worauf das Capreomycin ausfällt.
Der weisse feste Niederschlag von Capreomycin wird abgetrennt und gegebenenfalls getrocknet.
Die freie Base Capreomycin kann aus dem nach dem obigen Verfahren erhaltenen Säureadditionssalz durch Auflösen einer Menge des Salzes in Wasser, Neutralisieren der Lösung und Klären der neutralisierten Lösung durch Filtrieren erhalten werden. Die filtrierte Lösung von Capreomycin kann über eine Säule eines basischen Harzes geschickt werden, z. B. Dowex-1 in der OH-Form (ein stark basisches Anionenaustauschharz vom Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisattyp mit quaternären Ammoniumgruppen von der DowChemical Company), wodurch das Salz aus der Lösung entfernt wird, aber das Capreomycin als freie Base durch die Säule läuft. Die freie Base kann als trockene weisse feste Substanz erhalten werden, indem die abfliessende Lösung der Gefriertrocknung unterworfen wird.
Es können auch weitere Säureadditionssalze des Capreomycins ausser den oben genannten anorganischen Säureadditionssalzen hergestellt werden. Neben anorganischen Säuren können auch organische Säuren zur Herstellung von Salzen von Capreomycin verwendet werden, z. B. Pikrinsäure, p- (2-Hydroxy- - l-naphthylazo)-benzolsulfonsäure, Essigsäure od. dgl. Das gewünschte Salz kann gewöhnlich erhalten werden, indem zu einer wässerigen Lösung der freien Base Capreomycin mindestens die äquivalente Menge der entsprechenden Säure je Mol Capreomycin gegeben wird. Wenn ein Überschuss an Säure verwendet wird, werden gewöhnlich 4 Äquivalente Säure zur Herstellung des Salzes verbraucht, z. B. wird das Tetrahydrochlorid mit einem Überschuss an Salzsäure gebildet.
Selbstverständlich können Salze, die 1, 2 oder 3 Äquivalente Säure enthalten, durch entsprechend bemessenen Säurezusatz erhalten werden. Wenn das gewünschte Säureadditionssalz nicht leicht ausfällt, kann die Ausfällung z. B. durch Eindampfen der Lösung auf ein kleineres Volumen oder durch Zusetzen eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B.
Methanol oder Aceton, gefördert werden.
Die Erfindung wird eingehender durch die folgenden Beispiele erläutert : Beispiel l : Herstellung von Capreomycin. Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird hergestellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar der folgenden Zusammensetzung gezüchtet wird.
Hafermehl- Tomatenpaste - Ag ar :
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<tb>
<tb> Tomatenpaste <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> vorgekochtes <SEP> Hafermehl <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser, <SEP> zur <SEP> Auffüllung
<tb> auf <SEP> ein <SEP> Endvolumen <SEP> von <SEP> 11
<tb>
Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und 10 Tage bei etwa 300C bebrütet. Die auf dem Schrägagar gewachsene Kultur wird mit 6 ml Nährlösung bedeckt, und der Agar wird vorsichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wässerige Sporensuspension zu erhalten.
2 ml der Sporensuspension werden unter aseptischen Bedingungen zum Beimpfen von 80 ml eines sterilen vegetativen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet : Hefe-I-Medium :
EMI7.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefe <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
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Das beimpfte vegetative Medium wird 48 h bei etwa 280C bebrütet, wobei das Incubat mit einer Geschwindigkeit von 250 Perioden je Minute auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Hub von 2, 5 cm geschüttelt wird.
EMI8.1
Mediums in 500 ml-Erlenmeyerkolben aseptisch zu beimpfen :
EMI8.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Peptone <SEP> 45 <SEP> g <SEP>
<tb> hydrolysiertes <SEP> Casein <SEP> 4g <SEP>
<tb> Rummelassen <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
Die beimpfte Kultur wird B Tage bei etwa 300C bebrütet. Während der Bebrütungszeit wird das Incubat 250mal je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2, 5 cm Hub geschüttelt. Der pH-Wert des Ausgangsmediums ist etwa 6,5. Nach Ablauf der Incubationszeit steigt der PH-Wert des Mediums auf etwa 7, 0.
Die erhaltene Kulturlösung wird filtriert, um das Mycel und andere ungelöste Feststoffe zu entfernen.
Die filtrierte Lösung enthält das Capreomycin, das durch den Organismus gebildet worden ist.
Beispiel 2 : Herstellung von Capreomycindisulfat. Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird hergestellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar aus Hafermehl-Tomatenpaste-Agar wie in Beispiel 1 gezüchtet wird. Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und der beimpfte Nährboden 9 Tage bei etwa 300C bebrütet. Nach dem Bebrüten wird die auf dem Schrägagar gewachsene Sporenkultur mit 5 ml Nährlösung bedeckt, und die Oberfläche des Agars wird vorsichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wässerige Sporensuspension zu erhalten.
Auf aseptischem Wege werden mit dem von einem 2,5 cm Schrägagar erhaltenen Inoculum 500 ml eines sterilisierten vegetativen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 2 1-Erlenmeyerkolben beimpft :
EMI8.3
<tb>
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Rindfleis- <SEP> : <SEP> hextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 2,5g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1100 <SEP> ml
<tb>
Die Bebrütung erfolgt 48 h lang bei 28 C unter Schütteln mit 250 Hüben je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2, 5 cm Hub.
Um eine grössere Menge an vegetativem Inoculum herzustellen, werden die 500 ml vegetatives Inoculum aseptisch in einen 1310 l fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl gegeben, der 940 1 eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthält (Gewicht/Volumen) :
EMI8.4
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> % <SEP>
<tb> Hefe <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Antischaummittel <SEP> (Polyglykol
<tb> Nr. <SEP> 2000 <SEP> der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> 0, <SEP> 02%
<tb>
Das Inoculum'wind 22 h bei 30 C wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird das Medium
EMI8.5
160 Umdr/min gerührt.
In einen 6350 1 fassenden Gärtank aus rostfreiem Stahl werden 4130 l eines Mediums der folgenden Zusammensetzung (Gewicht/Volumen) gegeben :
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Peptonmedium Nr. 159 :
EMI9.1
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 2, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Melasse <SEP> 1, <SEP> 00/0
<tb> Peptone <SEP> 4, <SEP> 0%
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> hydrolysiertes <SEP> Casein <SEP> 0, <SEP> 6%
<tb> Antischaummittel
<tb> ("Polyglykol"Nr. <SEP> 2000 <SEP>
<tb> der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> 0, <SEP> 0050/0
<tb>
Das Medium wird nach dem Sterilisieren mit 375 l des in dem Gärtank gezüchtete Inoculums be- impft. Die Gärung wird 5 Tage bei 300C ausgeführt.
Der Schaum wird nötigenfalls durch Zusatz von "Larex"Nr. 1 (Antischaummittel der Swift & Co.) beseitigt. Das Medium wird während der Gärung durch
Zuführen von steriler Luft in einer Menge von 2, 72 m3/min belüftet und mit den beiden 56 cm-Rührern mit 140 Umdr/min gerührt. 109 kg"Dicalite"476 (ein Perlit-Filtermittel der Great Lakes Carbon Cor- poration) werden zu 3750 l der Lösung des Antibiotikums gegeben. Das Gemisch wird gerührt und filtriert.
Der Filterkuchen wird mit Leitungswasser gewaschen. Das Waschwasser und das Filtrat werden zu einem Gesamtvolumen von 3750 l vereinigt. Zu 1875 l des vereinigten Filtrats werden 59,7 kg Aktivkohle "Darco"G-60 gegeben. Das Gemisch wird gründlich gerührt und filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der Kohlefilterkuchen wird mit 200 1 Leitungswasser gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen, an dem das Capreomycin adsorbiert ist, wird mit 200 l 0,05n-wässeriger Salzsäure gewaschen. Die Säure wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen wird 1 h lang mit 400 l eines wässerigen Gemisches, das l, 65 l 11, 7n-wässeriger Salzsäure und 80 l Aceton enthält, eluiert.
Der Filterkuchen wird weiter durch Waschen mit 200 l eines wässerigen Acetongemisches, das 825 ml 11, 7n-Salzsäure und 40 l Aceton enthält, innerhalb von 15 min eluiert. Die Eluate werden vereinigt. Die vereinigten Eluate haben ein Gesamtvolumen von 575 1 und werden im Vakuum auf 52, 5 l eingeengt. Der konzentrierte Extrakt wird unter Rühren zu 525 l Aceton gegeben. Das Acetongemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei sich ein öliger Niederschlag von Capreomycin ausscheidet. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und verworfen. Der ölige Niederschlag wird in 20 l destilliertem Wasser gelöst. Die wässerige Lösung wird im Vakuum auf 12 l eingedampft, um alles anhaftende Aceton zu entfernen.
Das wässerige Konzentrat von Capreomycin wird zur Entfernung eines geringen Niederschlags filtriert, worauf dieser verworfen wird. Das das Capreomycin enthaltende Filtrat wird unter Rühren zu 240 IMethanol gegeben. Die methanolische Lösung von Capreomycin wird durch Zusatz von 1110n-Schwe- felsäure angesäuert, worauf das Schwefelsäureadditionssalz ausfällt. Das Gemisch wird zur vollständigen Ausfällung über Nacht stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und abfiltriert. Der Niederschlag, der aus dem Additionssalz von Capreomycin mit 2 Mol Schwefelsäure besteht, wird mit 10 l Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute = 2510 g.
Soll das Tetrahydrochlorid von Capreomycin erhalten werden, so wird die methanolische Lösung von Capreomycin statt mit 10n-Schwefelsäure mit 11,7n-Salzsäure angesäuert.
Beispiel 3 : Herstellung von Capreomycindisulfat. Zu 360 l filtrierter Gärlösung, die nach dem Verfahren von Beispiel 2 erhalten worden ist, werden 585 g Oxalsäure und 260 g Natriumhydroxyd in 3 1 destilliertem Wasser gegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt und zur Entfernung eines etwaigen Niederschlags filtriert, der verworfen wird. Das Volumen des Capreomycin enthaltenden Filtrats beträgt 317 l. Das Filtrat wird über eine Säule von "Dowex" 50 (20/0 vernetzt, als Natriumsalz) geschickt. Die Säule hat einen Durchmesser von 10 cm und eine Höhe von 122 cm. Die Säule wird mit 2 l destilliertem Wasser gewaschen.
Das adsorbierte Capreomycin wird aus der Säule durch Waschen mit 25 l einer 2010gen wässerigen Lösung von Triäthylaminosulfat mit einer Geschwindigkeit von 75 ml/min eluiert. Dann werden 2, 5 kg Aktivkohle"Darco"G-60 zur Entfärbung des Eluats zugesetzt. Nachdem das Gemisch 15 min gerührt worden ist, wird 1 kg"Hyflo Supercel" (Diatomeenerde-Filtrierhilfsmittel der Johns-Manville Co.) unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen mit 11 destilliertem Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden zu einem Volumen von 21, 5 1 vereinigt.
Das vereinigte, Capreomycin enthaltende Filtrat wird unter Rühren zu 86 l Methanol gegeben, um das Capreomycfn auszufällen. Das Gemisch wird über Nacht stehen gelassen, wobei das Capreomycin als Schwefelsäureadditionssalz ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit 12 l Methanol gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird ferner mit 7 1 Chloroform gewaschen. Der gewaschene Niederschlag, der aus dem
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Additionssalz von 2 Mol Schwefelsäure an Capreomycin besteht, wird im Vakuum bei 350G getrocknet.
Ausbeute = 1, 09 kg.
Beispiel 4 : Herstellung der freien Base Capreomycin. 3 g Tetrahydrochlorid von Capreomycin werden in 15 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung von Capreomycin wird mit In-Natronlauge auf etwa 7,0 gebracht. Die Lösung wird zur Entfernung eines geringen Niederschlags filtriert. Der Nieder- schlag wird verworfen. Das das Capreomycin enthaltende Filtrat wird auf eine Säule gegeben, die aus
Dowex 1 in der Hydroxylform, mit 81oVernetzung und einer Teilchengrösse zwischen 1460 und 5840 Sieb- maschen je cm2 besteht. Die Säule hat 2 cm Durchmesser und ist 30 cm hoch. In der Säule wird das Salz aus der aufgegebenen Capreomycinlösung gespalten, so dass aus der aus der Säule ablaufenden Flüssigkeit Capreomycin als freie Base gewonnen werden kann. Die Säule wird mit 350 ml Wasser gewaschen.
Das
Waschwasser und die Reaktionslösung werden vereinigt und zu einer trockenen, weissen, festen Substanz gefriergetrocknet, die aus der freien Base Capreomycin besteht. Ausbeute = 2, 7 g.
Das Präparat hat bei der Prüfung mit Klebsiella pneumoniae Capreomycinaktivität.
Beispiel 5 : Herstellung des Pikrinsäureadditionssalzes von Capreomycin. 1 g der freien Base Ca- preomycin wird in 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Eine 5% ige Losung von Pikrinsäure (Gewicht/Volu- men) in 95% gem Äthanol wird tropfenweise unter Rühren zu der Capreomycinlösung gegeben, bis die
Ausfällung des Pikrinsäureadditionssalzes von Capreomycin beendet war. Der gelbe Niederschlag wird ab- filtriert, gewaschen und im Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat getrocknet. Das getrocknete Salz zeigt Aktivität gegenüber Klebsiella pneumoniae. Ausbeute = 1, 7 g.
EMI10.1
des p- (2-Hydroxy-1-naphthylazo)-benzoIsulfonsäureadditionssalzes vonCapreomycin. 3 g der freien Base Capreomycin werden in 8 ml Wasser gelöst.
Eine heiss gesättigte wässerige Lösung des Natriumsalzes von p- (2- Hydroxy-1-naphthylazo) -benzolsulfonsäure wird tropfenweise unter Rühren zu der Capreomycinlösung gegeben. Der Zusatz von p- (2-Hydroxy-l-naphthylazo)-benzolsul- fonsäurelösung wird fortgesetzt, bis das gelöste Capreomycin vollständig als p-(2-Hydroxy-1-naphthylazo)- -benzolsulfonsäureadditionssalz ausgefällt ist. Das p-(2-Hydroxy-1-naphthylazo)-benzolsulfonsäuresalz des Capreomycins fällt als hochviskoses, orange gefärbtes Öl an. Der Niederschlag des Capreomycinadditionssalzes wird durch Dekantieren der überstehenden Lösung abgetrennt, gewaschen und im Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat getrocknet.
Der getrocknete Rückstand des p- (2-Hydroxy-l-naphthyl- azo)-benzolsulfonsäureadditionssalzes von Capreomycin ist eine orange gefärbte, feste Substanz. Sie besitzt Aktivität gegenüber Klebsiella pneumoniae. Ausbeute = 4, 6 g.