DE1232914B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Threonin - Google Patents

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Threonin

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DE1232914B DEK43835A DEK0043835A DE1232914B DE 1232914 B DE1232914 B DE 1232914B DE K43835 A DEK43835 A DE K43835A DE K0043835 A DEK0043835 A DE K0043835A DE 1232914 B DE1232914 B DE 1232914B
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Shukuo Kinoshita
Hirotoshi Samejima
Chuzo Fujita
Takashi Nara
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. CL:
C12d
Deutsche Kl.: 6b-16/02
Nummer: 1232914
Aktenzeichen: K 43835IV a/6 b
Anmeldetag: 27. Mai 1961
Auslegetag: 26. Januar 1967
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1-Threonin, bei dem 1-Threonin durch Züchtung bestimmter Mikroorganismen erzeugt und angereichert wird.
1-Threonin ist für die tierische Ernährung unentbehrlich. Seit 1-Threonin als intermediäres Stoffwechselprodukt von Isoleucin biochemisch bekannt ist, wird es im allgemeinen verwendet zur erneuten Biosynthese von Isoleucin oder zum Aufbau von Eiweiß, wenn 1-Threonin einmal im Medium produziert worden ist. Folglich ist es schwierig, eine große Menge 1-Threonin aus Mycel durch Züchtung von Mikroorganismen anzusammeln.
Es ist auch bekannt, daß das enzymatische System, das mit der Biosynthese von 1-Threonin aus 1-Homoserin im Zusammenhang steht, durch die Gegenwart verschiedener Aminosäuren gestört wird (Archives Biochemica, Biophysica, 78, S. 416; 1958). Die Methoden zur Gewinnung vieler Aminosäuren durch Fermentation sind in jüngster Zeit weitgehend untersucht worden, jedoch wurde über kein Verfahren zur Herstellung von 1-Threonin aus 1-Homoserin durch direkte Züchtung von Mikroorganismen außer der Verwendung einer Mutanten von Bacillus subtilis (»Amino Acids«, Symposium on Amino Acid Fermentation, Nr. I5 S. 74 bis 78; 1959) berichtet. Diese letztere Arbeitsweise ergibt jedoch wesentlich geringere 1-Threoninausbeuten als das erfindungsgemäße Verfahren. Aus der USA.-Patentschrift 2 937122 ist Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
1-Threonin
Anmelder:
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio
Vertreter:
Dr.-Ing. H. Ruschke, Patentanwalt,
München 27, Pienzenauer Str. 2
Als Erfinder benannt:
Shukuo Kinoshita,
Hirotoshi Samejima, Tokio;
Chuzo Fujita, Sagamihara-shi;
Takashi Nara, Tokio (Japan)
Beanspruchte Priorität:
Japan vom 27. Mai 1960 (25 421)
sichtlich des enzymatischen Systems für die 1-Threonin-Anreicherung in den Zellen, und zwar bezüglich der Wachstumsdauer als auch der Anreicherungsfähigkeit für 1-Threonin nach dem Zeitpunkt der Zugabe des 1-Homoserins zum Medium. Dementsprechend ergab es sich, daß eine große Menge an 1-Threonin in Abhängigkeit von den verwendeten Mikroorganismen in dem Medium angereichert wer-
den kann durch geeignete Auswahl des Zugabezeitferner ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstel- 3° punktes von 1-Homoserin.
lung von 1-Threonin bekannt, bei dem durch aerobe Die vorliegende Erfindung beruht auf den oben-
Züchtung von Escherichia coli in einem üblichen Nährmedium, das als Kohlenstoffquellen Hexite, wie Mannit und Sorbit, und als biochemisches Substrat Diaminopimelinsäure und 1-Methionin enthält, 1-Threonin gewonnen wird. Demgegenüber kann das fidäß Vfh i
g gg
erfindungsgemäße Verfahren mit wesentlich wirtschaftlicheren Kohlenstoffquellen durchgeführt werden, wobei je nach der Art der Züchtungsführung it d fidäß hl
erwähnten gefundenen Tatsachen. Aufgabe der Erfindung ist es, 1-Threonin mit geringem Aufwand durch Fermentation herzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen unter Anwendung von hierfür üblichen pH-Werten und Temperaturen sowie 1-Homoserin enthaltenden Nährmedien, das
mit den erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikro- 40 dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikro
organismen Ausbeuten an 1-Threonin erhalten werden können, die über den in der obigen USA.-Patentschrift aufgezeigten liegen.
Erfindungsgemäß wurde als Ergebnis verschiedener Untersuchungen über die Gewinnung von 1-Threonin durch alle Arten von Mikroorganismen die Tatsache festgestellt, daß spezifische Mikroorganismen, die nachfolgend beschrieben werden, eine große Menge von 1-Threonin anreichern, wenn sie in Organismen Brevibacterium linens ATCC 9175, Brevibacterium vitarumen ATCC 10 234, Brevibacterium liticum ATCC 15 921, Micrococcus rubens ATCC 186, Micrococcus varians ATCC 399, Xanthomonas pruni ATCC 15 924 oder Corynebacterium rathayi ATCC 13 656 verwendet und hierbei das 1-Homoserin oder die 1-Homoserin enthaltende Substanz nach 6- bis 48stündiger Züchtung zusetzt bzw. Micrococcus glutamicus ATCC 14 296, Vibrio per-
einem 1-Homoserin enthaltenden Medium gewachsen 50 colans ATCC 15 922, Xanthomonas citri ATCC waren. Es wurde außerdem gefunden, daß diese 15 923 oder Corynebacterium simplex ATCC 6946 Mikroorganismen sich unterschiedlich verhalten hin- einsetzt, wobei der Zusatz von 1-Homoserin oder der
609 759/70
l-Homoserin enthaltenden Substanz nach 6- bis 60stündiger Züchtung erfolgt.
Die Microorganismen Brevibacterium linens ATCC 9175, Brevibacterium vitarumen ATCC 10 234, Brevibacterium liticum ATCC 15 921, Micrococcus rubens ATCC 186, Micrococcus varians ATCC 399, Xanthomonas pruni ATCC 15 924, Corynebacterium rathayi ATCC 13 656 sollen als die erste Gruppe bezeichnet werden und Micrococcus glutamicus ATCC 14296, Vibrio percolans ATCC 15 922, Xanthomonas citri ATCC 15 923 und Corynebacterium simplex ATCC 6946 als zweite Gruppe. Der wirksamste Zeitpunkt für die Zugabe von l-Homoserin im Fall von Mikroorganismen der ersten Gruppe ist sofort nachdem die Mikroorganismen begonnen haben, sich logarithmisch zu vermehren, und das tritt im allgemeinen innerhalb von 6 bis 48 Stunden nach Beginn der Züchtung ein. Wenn 1-Homoserin oder darin enthaltene Baustoffe während dieser Zeitspanne zugegeben werden, werden sieinl-Threonin umgewandelt, und es können hohe Ausbeuten erzielt werden. Wenn l-Homoserin im Medium zu Beginn der Züchtung vorliegt oder zu frühzeitig zugegeben wird, dann ist die Anreicherung von 1-Threonin gering.
Andererseits wird im Fall der zweiten Gruppe von Mikroorganismen bereits eine beträchtliche Menge von 1-Threonin selbst dann angereichert, wenn l-Homoserin im Medium enthalten ist oder zu Beginn der Züchtung zugegeben wird. Jedoch ist es, um höhere Ausbeuten zu erzielen, vorzuziehen, 1-Homoserin oder dieses enthaltende Stoffe langsam innerhalb von 6 bis 60 Stunden nach Beginn der Züchtung zuzugeben. In diesem Fall ist es wirksamer, die Kohlenstoffquelle zusammen mit l-Homoserin zuzugeben. Als Züchtungsmedium zum Züchten dieser Mikroorganismen zwecks Anreicherung einer großen Menge an 1-Threonin aus l-Homoserin ist jedes natürliche oder synthetische Medium geeignet, soweit es die geeigneten notwendigen Nährstoffe enthält, wie sie allgemein für Mikroorganismen notwendig sind und eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganischen Substanzen usw. enthalten.
Als Kohlenstoffquelle sind verschiedene Arten von Kohlehydrat-Materialien wie Glukose, Fruktose, Saccharose, Maltose, Glyzerin, Mannit, Sorbit, Stärkehydrolysate, Abfallmelassen u. dgl. geeignet. Diese Kohlenstoffquellen können dem Medium insgesamt zu Beginn der Züchtung zugegeben werden oder während der Züchtung in Anteilen. Auch organische Säuren wie Gluconsäure, 2-Ketogluconsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Itaconsäure, Aconitsäure, Bernsteinsäure und Brenztraubensäure u. dgl. können allein oder zusammen mit den Kohlehydraten verwendet werden.
StickstoffqueUen können sein: Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Nitrat, Harnstoff und andere stickstoffhaltige organische Substanzen sowie Peptone, NZ-Amine, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Käsern, Fischmehl, Sojabohnen, Gärungsrückstände u. dgl. oder Hydrolysate davon.
Die anorganischen Substanzen können sein: KaIiumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Calciumcarbonat u. dgl.
Das l-Homoserin kann in Form von Stoffen zu dem Medium zugegeben werden, welche l-Homoserin enthalten, z.B. 1-homoserinhaltige Kulturlösungen, die durch Kultur von Mikroorganismen erhalten wurden oder daraus hergestellte Konzentrate. Selbstverständlich kann auch chemisch reines !-Homoserin verwendet werden. Die zuzugebende Menge beträgt vorzugsweise 5 bis 20 mg !-Homoserin pro 1 ml Medium. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durch Schütteln oder durch Belüftung unter Rühren durchgeführt. Die Züchtungstemperatur beträgt 24 bis 37° C, vorzugsweise etwa 30° C. Während der Züchtung neigt der pH des Mediums dazu, auf über
ίο 7 anzusteigen. Es ist jedoch im Hinblick auf hohe Ausbeuten an 1-Threonin zweckmäßig, auf einen pH-Bereich von 4 bis 7 einzustellen, durch Verwendung eines geeigneten Neutralisationsmittels, z. B. Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure, organische Säuren oder Calciumcarbonat u. dgl. Steigt das pH des Mediums über 7, so wird bereits gebildetes 1-Threonin wieder zerstört.
Nach Beendigung der Züchtung wird 1-Threonin aus der Gärungslösung nach der im Beispiel 2 angegebenen Methode oder anderen bekannten Methoden gewonnen.
Beispiel 1
Nachdem ein Züchtungsmedium (pH 8,0), welches 10% Glukose, 2% Ammoniumsulfat, 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Pepton, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,03 % Magnesiumphosphat enthält, sterilisiert worden ist, wird in trockner Hitze getrennt sterilisiertes Calciumcarbonat so zugegeben, daß es 2% ausmacht. Alle in Tabelle 1 aufgeführten Mikro-Organismen wurden jeweils in dieses Medium eingeimpft und unter aeroben Bedingungen bei 30° C gezüchtet. l-Homoserin wurde zu dem Medium zu Beginn und nach 24stündiger Züchtung hinzugegeben, so daß seine Konzentration im Medium 5 mg/ml beträgt. Dann wurde 48 Stunden weitergezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wird die in der Lösung angereicherte Menge an 1-Threonin durch ein mikrobiologisches Prüfverfahren bestimmt, dessen Ergebnis in Tabelle I gezeigt wird.
*u Tabelle I 45 Brevibacterium linens 1-Threonin im Medium Nach
Angereicherte Menge an ATCC 9175 Zeitpunkt der Zugabe 24 Stunden
Brevibacterium vitarumen
Verwendete Mikroorganismen 5o ATCC 10234 Zu Beginn 1,8
Brevibacterium liticum
ATCC 15921 0,2 1,6
Micrococcus glutamicus
ATCC 14296 0,3 1,0
55 Micrococcus rubens
ATCC 186 0,56 2,4
Micrococcus varians
ATCC 399 1,2 1,1
Vibrio percolans
6o ATCC 15922 0,2 1,3
Xanthomonas citri
ATCC 15923 0,18 2,0
Xanthomonas pruni 5
ATCC 15924 1,0 2,8
65 Corynebacterium rathayi
ATCC 13656 0,9 2,4
Corynebacterium simplex
ATCC 6946 0,2 1,1
0,2 1,8
1,5
Beispiel 2
Vibrio percolans ATCC 15 922 wird in dasselbe Nährmedium wie im Beispiel 1 eingeimpft und unter aeroben Bedingungen gezüchtet. 1-Homoserin wird dem Medium nach 24 Stunden zugegeben, so daß seine Konzentration 5 ml/mg beträgt, und dann wird 48 Stunden weitergezüchtet.
Nach Beendigung der Züchtung wird das Medium zum Entfernen des Mycels filtriert. 11 des erhaltenen Filtrates (Gehalt an 1-Threonin 4,6 mg/ml) wird durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH von 2 eingestellt. Diese wurde auf eine Austauscherharz-Säule gegeben, die mit stark saurem Sulfonsäure-Austauscherharz (Kationentyp) befüllt war (Diaion ig SK H1 [Name eines Produktes der Mitsubishi Chemical Industry Co., Japan]), welche vorher durch Waschen mit 2n-Salzsäure in die Η-Form verwandelt worden war; 1-Threonin wurde von dem Austauscherharz absorbiert. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde mit 3,5 %iger wäßriger Ammoniaklösung eluiert und die ninhydrinpositiven Fraktionen gesammelt.
Freies Ammoniak wurde entfernt durch Konzentrieren unter vermindertem Druck bei Temperaturen unterhalb von 50° C. Dann wird nach Entfärben mit Aktivkohle weiterkonzentriert. Wenn Äthylalkohol zu der erhaltenen konzentrierten Lösung gegeben wird, kristallisiert weißes pulvriges 1-Threonin aus, welches durch Filtrieren abgetrennt und dann getrocknet wird. 4 g der ersten Fraktion roher Kristalle von 1-Threonin werden erhalten. Die Reinheit dieser Kristalle betrug 91%, wie durch mikrobiologische Prüfung bestimmt wurde.
Beispiel 3
Dasselbe Nährmedium, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde mit Xanthomonas citri ATCC 15 923 beimpft und die Züchtung unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Das 1-Homoserin wurde nach 0, 6, 12, 18, 24, 32 und 48 Züchtungsstunden zugegeben, bzw. in der Art, daß die Konzentration 4 ml/mg betrug, und dann wurde weitere 48 Stunden lang gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurde die Menge des angereicherten 1-Threonins, durch mikrobiologische Prüfung bestimmt, wie in Tabelle II angegeben.
Tabelle II
35
40
45
Zeitpunkt Angereicherte
der Zugabe 1-Threoninmenge
(Stunden) (mg/ml)
0 0,2
6 1,5
12 2,0
18 2,0
24 2,8
32 3,1
48 0,9
50
55
60
Aus Tabelle II geht klar hervor, daß der Zeitpunkt der Zugabe des 1-Homoserins vorzugsweise zwischen 6 und 48 Stunden liegt.
Beispiel 4
Dasselbe Nährmedium, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde mit Xanthomonas citri ATCC 15 923 beimpft. Nach 24stündiger Züchtung wurde 1-Homoserin viermal zu dem Medium zugegeben, und zwar in Intervallen von jeweils 12 Stunden, so daß sich die Konzentration auf 2,5 mg/ml belief. Die Menge des angereicherten 1-Threonins betrug 96 Stunden nach Ansetzen der Kultur 6 mg/ml, bestimmt durch mikrobiologische Prüfung. Andererseits wurden 2°/o Glukose gleichzeitig mit dem 1-Homoserin bei der obigen Arbeitsweise zugegeben und 8,5 mg/ml 1-Threonin im Nährmedium erhalten.
Beispiel 5
Ein 1-Homoserin enthaltendes Material wurde hergestellt durch Konzentrieren einer 1-Homoserin enthaltenden Kulturlösung (50 mg/ml 1-Homoserin), welche durch Züchtung von Micrococcus glutamicus Nr. 534 — 147-Stämmen (1-Threonin erfordernde Stämme) ATCC14 296 erhalten worden war.
Dasselbe Nährmedium, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde mit Xanthomonas citri ATCC 15 923 beimpft und unter aeroben Bedingungen bei 30° C gezüchtet. Nach 24 Stunden wurde das erwähnte 1-homoserinhaltige Material zu dem Medium zugegeben, so daß die Konzentration an 1-Homoserin 5 mg/ml betrug. Dann wurde weitere 48 Stunden lang gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung betrug die angereicherte Menge an 1-Threonin 3 mg/ml, wie durch mikrobiologische Prüfung festgestellt wurde.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen unter Anwendung von hierfür üblichen pH-Werten und Temperaturen sowie 1-Homoserin enthaltenden Nährmedien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Brevibacterium linens ATCC 9175, Brevibacterium vitarumen ATCC 10 234, Brevibacterium liticum ATCC 15 921, Micrococcus rubens ATCC 186, Micrococcus varians ATCC 399, Xanthomonas pruni ATCC 15 924 oder Corynebacterium rathayi ATCC 13 656 verwendet und hierbei das 1-Homoserin oder die 1-Homoserin enthaltende Substanz nach 6- bis 48stündiger Züchtung zusetzt bzw. Micrococcus glutamicus ATCC 14 296, Vibrio percolans ATCC 15 922, Xanthomonas citri ATCC 15 923 oder Corynebacterium simplex ATCC 6946 einsetzt, wobei der Zusatz von 1-Homoserin oder der 1-Homoserin enthaltenden Substanz nach 6- bis 60stündiger Züchtung erfolgt.
    In Betracht gezogene Druckschriften:
    USA.-Patentschrift Nr. 2 937122;
    O. Hoffmann-Ostenhof, »Enzymologie«,
    1954, S. 124;
    »Amino Acids«, 1959, Nr. 1, S. 74 bis 78.
    609 759/70 1.67 © Bundesdruckerei Berlin
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