DE1231653B - Verfahren zur Herstellung von 1-Homoserin auf fermentativem Wege - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 1-Homoserin auf fermentativem Wege

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DE1231653B
DE1231653B DEK44456A DEK0044456A DE1231653B DE 1231653 B DE1231653 B DE 1231653B DE K44456 A DEK44456 A DE K44456A DE K0044456 A DEK0044456 A DE K0044456A DE 1231653 B DE1231653 B DE 1231653B
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Shukuo Konoshita
Hirotoshi Samejima
Chuzo Fujita
Takashi Nara
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. CL:
C12d
Deutsche Kl.: 6b-16/02
Nummer: 1231653
Aktenzeichen: K 44456IV a/6 b
Anmeldetag: 8. August 1961
Auslegetag: 5. Januar 1967
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1-Homoserin auf fermentativem Wege durch Züchtung von Mikroorganismen in Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedien.
Erfindungsgemäß werden für die Herstellung von 1-Homoserin Mikrokokkus glutamicus (Nr. 534-185) ATCC Nr. 14297 oder (Nr. 534-Co-147) ATCC Nr. 14 296 eingesetzt.
Die Stämme (534-185) ATCC 14 297 und (534-Co-147) ATCC 14 296, die von M. glutamicus Nr. 534 durch künstliche Mutation gebildet wurden, unterscheiden sich von M. glutamicus 534 dadurch, daß sie 1-Threonin zu ihrem Wachstum benötigen.
Als Fermentationsmedium können sowohl natürliehe als auch synthetische Medien zur leistungsfähigen Erzeugung von 1-Homoserin verwendet werden. Es ist nur notwendig, daß das Medium in geeigneten Mengen Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und Mineralsalze sowie 1-Threonin enthält. Jede Art von Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff, die von dem verwendeten Organismus assimiliert wird, kann für das Kulturmedium verwendet werden. Beispielsweise können als Quelle für Kohlenstoff verwendet werden Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Rohrzucker, Maltose, Glycerin, Mannit, Stärkehydrolysate oder Melasse. Auch organische Säuren, wie Gluconsäure, Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Zitronensäure, Aconitsäure, «-Ketoglutarsäure, Fumarsäure, Apfelsäure und Oxalessigsäure, können entweder allein oder zusammen mit den genannten Quellen für Kohlenstoff verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen in Frage, z. B. anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und Ammoniumcarbonat, oder organische Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff, organische Ammoniumsalze, Nitratsalze, Pepton, Caseinhydrolysate, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fischmehl, Casein, Sojabohnenpaste, Chrysaliden sowie Gärrückstände. Als anorganische Salze, die dem Nährmedium zugesetzt werden, seien K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, 7 H2O und CaCO3 genannt.
Im allgemeinen liefert ein synthetisches Medium, in welchem geeignete Mengen an Biotin und 1-Threonin als Wuchsstoffe vorliegen, bessere Ausbeuten an 1-Homoserin als ein komplexes Medium. Bei Verwendung eines synthetischen Mediums erhält man Ausbeuten an 1-Homoserin von 12 mg/ml, während die Ausbeute bei einem komplexen Medium 7 mg/ml beträgt.
Die Vergärungen werden im allgemeinen unter Verfahren zur Herstellung von 1-Homoserin auf fermentativem Wege
Anmelder:
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio
Vertreter:
Dr.-Ing. H. Ruschke, Patentanwalt,
München 27, Pienzenauer Str. 2
Als Erfinder benannt:
Shukuo Konoshita,
Hirotoshi Samejima, Tokio;
Chuzo Fujita, Sagamihara-shi;
Takashi Nara, Tokio (Japan)
Beanspruchte Priorität:
Japan vom 12. September 1960 (37 659)
aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. durch Schütteln oder Submerskultur. Die Vergärung kann bei Temperaturen zwischen etwa 24 und 37° C durchgeführt werden, doch wird eine Temperatur zwischen und 30° C bevorzugt. Während der Vergärung neigt der pH-Wert des Mediums dazu, auf unter 7,0 abzusinken. Durch Verwendung einer geeigneten Base kann man zu Beginn oder während der Vergärung den pH-Wert des Kulturmediums auf einen Bereich zwischen 5,0 und 8,0 einstellen. Als Basen können wäßriges Ammoniak, Kalilauge, Calciumhydroxyd, Ammoniumcarbonat, Calciumcarbonat und Harnstoff verwendet werden. Man erzielt hierdurch bessere Ergebnisse. Im allgemeinen erhält man bei Vergärungszeiten von 70 bis 120 Stunden die besten Ergebnisse. Längere Zeiten ergeben keine wesentlichen Vorteile.
Nach Beendigung der Vergärung kann 1-Homoserin in üblicher Weise, beispielsweise durch Behandlung mit einem Harzaustauscher isoliert werden.
Weiterhin wurde gefunden, daß die Anreicherung von 1-Homoserin durch Zugabe einer der beiden
609 750/65
Aminosäuren dl-a-Äminobuttersäure und dl-Isoleucin zu einem Kulturmedium beträchtlich erhöht werden kann. Diese Zugabe kann auf einmal zu Beginn der Vergärung oder in Zeitabständen während der Vergärung erfolgen, etwa 20 bis 48 Stunden nach Beginn der Vergärung und in Mengen von 1 bis 10 mg/ml Nährmedium.
Diese Befunde gehen aus den folgenden Beispielen hervor. Die Wahl des Zugabezeitpunktes und die zuzusetzende Menge, wie sie in den Beispielen angegeben ist, ermöglicht eine Steigerung der Anreicherung von !-Homoserin um das Zweifache gegenüber einer Vergärung ohne Zusatz dieser Aminosäuren. Hierdurch kann die technische Herstellung von !-Homoserin nach einem leistungsfähigen Verfahren durchgeführt werden.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1
Impfmaterial wurde hergestellt durch Züchten von Mikrokokkus glutamicus (Nr. 534-Co-147) ATCC 14 296 in Bouillon-Agar-Schrägröhrchen bei 28 0C für 24 Stunden. Jeweils 25-ml-Portionen eines Basalmediums wurden in 250 ml fassende Erlenmeyerkolben gegeben und vor der Verwendung sterilisiert. Das Basalmedium wurde wie folgt hergestellt:
20 g Ammoniumsulfat, 0,4 g !-Threonin, 7,5 γ Biotin, 1 g K2HPO4 und 0,3 g MgSO4 7 H2O wurden in Wasser zu 11 Lösung gelöst. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, sterilisiert und anschließend mit 20 g sterilem Calciumcarbonat und 0,41 einer wäßrigen Glucoselösung (100 g) versetzt. Zu jedem der auf diese Weise hergestellten Kulturmedien wird dl-a-Aminobuttersäure, in der in Tabelle I angegebenen Menge, vor der Züchtung gegeben.
Die Erlenmeyerkolben mit dem Kulturmedium werden mit den Bakterien beimpft und unter Schütteln bei 28° C bebrütet. In der Tabelle sind die Mengen an angereichertem 1-Homoserin nach Beendigung der Züchtung angegeben.
Tabelle I
Tabelle II
dl-a-Aminobuttersäure
Zugegebene Menge
an dl-oc-Aminobuttersäure
mg/ml
0
1
5
8
Gebildete Menge
an 1-Homoserin, mg/ml,
nach 125 Stunden Vergärung
10,3
10,6
15,8
14,9
Beispiel 2
Es wurden zwei Züchtungen unter Verwendung des gleichen Impfmaterials und des gleichen synthetischen Mediums wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch dl-a-Aminobuttersäure in Zeitabständen während der Vergärung zugegeben. Bei dem einen Medium wurde mit der dl-a-Aminobuttersäurezugabe in bestimmten Mengen 24 Stunden nach Beginn der Vergärung begonnen, bei dem anderen Medium 48 Stunden nach Beginn der Vergärung und hierauf in beiden Fällen gleiche Mengen der Aminosäure alle 24 Stunden zugesetzt.
Die Vergärungen wurden nach insgesamt 96 Stunden abgebrochen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle!! zusammengestellt:
** Zeitpunkt des Beginns
der Zugabe		 Zugegebene
Menge
mg/ml		 Gebildete Menge
an 1-Homoserin,
mg/ml,
nach 96 Stunden
Vergärung
IO
24 Stunden
nach Beginn
15 48 Stunden
nach Beginn		 0
0,5
1,2
2,3
3,5
0,5
1,2
2,3
3,5		 10,88
13,50
15,13
16,00
18,60
13,25
13,35
15,01
16,70
Beispiel 3
Unter Verwendung des gleichen Impfmaterials und des gleichen synthetischen Mediums wie im Beispiel 1 wurden zwei Gäransätze durchgeführt, denen bestimmte Mengen an dl-a-Aminobuttersäure bzw. dl-Isoleucin 24 Stunden nach Beginn der Vergärung zugegeben wurden. Die gleichen Mengen der Aminosäuren wurden hierauf alle 24 Stunden zugesetzt. Die Vergärungen wurden nach insgesamt 96 Stunden abgebrochen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III zusammengestellt.
Tabelle III
35 45 dl-Isoleucm Zugegebene Gebildete Menge
Menge an !-Homoserin,
Aminosäure mg/ml,
mg/ml nach 96 Stunden
40 dl-a-Amino 0 Vergärung
buttersäure 2 11,01
3 19,38
4 20,50
5 17,00
6 16,75
2 13,16
3 15,95
4 18,78
5 14,13
6 13,20
12,93
Beispiel 4
Unter Verwendung von Mikrokokkus glutamicus (Nr. 534-185) ATCC 14 297 und auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise wurden die Vergärungen durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Zugegebene Gebildete Menge
Menge an 1-Homoserin,
6o Aminosäure mg/ml,
mg/ml nach 96 Stunden
0
2		 Vergärung
dl-a-Amino- I 3 11,21
19 08
65 buttersäure j 2
3		 20,10
dl-Isoleucin \ 16,21
18,53

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von 1-Homoserin auf fermentativem Wege durch Züchtung von Mikroorganismen in Kohlehydraten, Stickstoff-Substanzen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Mikrokokkus glutamicus ATCC 14 296 oder ATCC 14 297 verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium noch dl-a-Aminobuttersäure bzw. dl-Isoleucin in einer Menge von 1 bis 10 mg/ml etwa 20 bis 48 Stunden nach Beginn der Vergärung oder bereits zu Beginn der Vergärung zusetzt.
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DE102006004063A1 (de) * 2006-01-28 2007-08-02 Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Methionin aus Homoserin
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