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Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Tylosin Die Erfindung
betrifft die Herstellung von Tylosin durch Züchten eines Tylosin erzeugenden Stammes
von Streptomyces fradiae in einem Nährmedium mit assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff,
Stickstoff und anorganischen Salzen unter submersen aeroben Bedingungen, bis eine
größere Menge Tylosin erzeugt worden ist, Gewinnung des Tylosins aus dem Nährmedium
und gegebenenfalls Umwandlung in seine Säureanlagerungssalze.
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Diese Erfindung liefert eine neue organische Base, die hier willkürlich
Tylosin genannt wurde. Die Säurehydrolyse von Tylosin führt durch Entfernung eines
Mycarose-Zuckerteils zu der Bildung von Desmycosin. Dieses Verfahren ist nicht Gegenstand
dieser Erfindung. Chemische, physikalische und andere Eigenschaften der neuen organischen
Base, auf die an späterer Stelle eingegangen wird, dienen zur Identifizierung der
Verbindungen und unterscheiden sie von bereits bekannten oder beschriebenen Verbindungen.
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Die freie Basenform von Tylosin hat folgende charakteristische Eigenschaften:
Sie ist ein weißer fester Stoff und läßt sich leicht aus einer Anzahl von Kristallisationslösungen,
z. B. wäßrigem Aceton, wäßrigen niederen Alkoholen, wie wäßrigem Äthanol und Wasser,
als kleine Plättchen auskristallisieren. Die freie Base, die inverse Löslichkeit
zeigt, kann aus Wasser auskristallisiert werden, indem man sie bei etwa 2°C in Wasser
löst und die Lösung langsam auf Zimmertemperatur oder etwas darüber erwärmt, wodurch
sich das Tylosin in Kristallform abscheidet. Die getrockneten Kristalle von Tylosin
schmelzen bei etwa 127 bis 132°C.
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Die freie Base von Tylosin ist in leicht angesäuerten wäßrigen Lösungen,
z. B. 5%iger wäßriger Essigsäure, löslich. Außerdem ist sie in den meisten polaren
organischen Lösungsmitteln löslich; gute Beispiele dafür sind niedere Ketone wie
Aceton, Methyläthylketon und Methylisobutylketon, niedere Alkohole wie Methanol
und Äthanol, niedere Ester wie Athylacetat und Äthylformiat, halogenierte Kohlenwasserstoffe
wie Methylenchlorid und Chloroform, Äther wie Diäthyläther, stickstoffhaltige organische
Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Pyridin und Triäthylamin und heterozyklische
oganische Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran und Thiophen. Sie ist in Benzol löslich,
doch relativ unlöslich in nichtpolaren Lösungsmitteln aus der Gruppe der aliphatischen
Kohlenwasserstoffe wie Hexan und Heptan. Schwach löslich ist sie in Wasser und in
leicht alkalischen wäßrigen Lösungen.
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Die freie Base von Tylosin ist in Lösung in einem pH-Bereich zwischen
pH 4 und 9 relativ beständig, ist jedoch unbeständig in stark sauren oder basischen
Lösungen. Wird Tylosin mit einer sauren Lösung von einem pH-Wert etwa unter 4 behandelt,
so tritt bald Zerfall der freien Base ein, wobei Desmycosin sowie ein Kohlehydratfragment
Mycarose entsteht, das schon früher erwähnt wurde.
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Eine elektrometrische Titration des Tylosins in einer Lösung von Dimethylformamid
in Wasser (2:1 Volumteile) weist auf die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe pK'a
= 7,0 hin.
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Das mit Hilfe der Titrationsergebnisse ermittelte Molekulargewicht
liegt bei etwa 931 ± 30.
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Eine Löslichkeitsanalyse der kristallinen Base in Wasser ergab, daß
Tylosin einen Löslichkeitsgrad von 6,0 mg/cma bei 26°C hat.
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Das Mittel aus mehreren Elementaranalysen der kristallinen Base, die
im Vakuum bei etwa 80°C über Phosphorpentoxyd getrocknet wurde, ergab folgende Werte:
Kohlenstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59,680/0 Wasserstoff . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . 8,530/,
Stickstoff ......................
1,55% Sauerstoff (aus Differenz) . . . . . . . . 30,240/0 Obige Ergebnisse deuten
auf eine empirische Formel C48H"N01$ hin, doch, wie man sich vorstellen kann, ist
diese Formel notwendigerweise nur eine Annäherung,
und sie muß vielleicht
etwas berichtigt werden, falls und wenn der Molekülbau der Verbindung lückenlos
festgestellt wird.
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Die IR-Absorptionskurve der kristallinen freien Base in Chloroform
ist in der Abbildung der Zeichnungen dargestellt. Die erkennbaren Linien im Infrarotspektrum
im Bereich von 2,0 bis 15,0 #t sind die folgenden: 2,85, 3,36, 3,41 (Absätze bei
3,47, 3,52 und 3,58), 3,68, 5,80, 5,94, 6,27, 6,88, 7,09, 7,27, 7,36, 7,61 7,90,
8,45, 8,62, 8,75, 8,95, 9,28, 9,53, 9,85, 10,04, 10,13, 10,40, 10,80, 11,10, 11,53,
11,91.
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Das ultraviolette Absorptionsspektrum von Tylosin in Wasser zeigt
ein starkes Absorptionsmaximum bei etwa 288 m#t bei einer molaren Extinktion von
--241.
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Die spezifische optische Drehung einer Probe der kristallinen freien
Base von Tylosin, die bei Zimmertemperatur im Vakuum über wasserfreiem Kalziumchlorid
etwa 15 Stunden lang getrocknet wurde, erwies sich als: c = 2°/o in Methanol (Gewicht/Volumen).
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Ein Pulver-Röntgendiagramm unter Benutzung unfiltrierter Chromstrahlung
und einer oc-Wellenlänge von 2,2896 A zur Berechnung der interplanaren Zwischenräume
ergibt folgende Werte:
| a I r/rl |
| 7,72 0,40 |
| 6,50 1,00 |
| 6,12 0,40 |
| 5,74 0,40 |
| 5,18 0,40 |
| 4,71 0,08 |
| 4,54 0,16 |
| 4,37 0,60 |
| 4,23 0,02 |
| 4,12 0,08 |
| 3,84 0,12 |
| 3,68 0,12 |
| 3,63 0,12 |
| 3,47 0,12 |
| 3,31 0,08 |
| 3,19 0,12 |
| 3,05 0,02 |
| 2,97 0,20 |
| 2,84 0,02 |
| 2,74 0,04 |
| 2,68 0,04 |
| 2,47 0,02 |
| 2,39 0,04 |
| 2,33 0,04 |
| 2,25 0,04 |
| 2,14 0,02 |
| 2,032 0,02 |
| 1,908 0,02 |
Chemische Untersuchungen der kristallinen freien Base zeigten, daß Methoxy-, Oxy-,
N-Methyl- und C-Methyl-Gruppen vorhanden sind. Molisch- und Anthronprobe mit der
freien Base zur Untersuchung auf anwesenden Kohlenwasserstoff verliefen positiv.
Sie entfärbt Permanganatlösung. Negative Ergebnisse liefern Ninhydrin-, Biuret-
und Sakaguchi-Proteinprobe; negativ verläuft auch der Ferrichlorid-Test auf Phenolgruppen
sowie der Maltoltest.
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Die Chromatographie der kristallinen Tylosinbase auf Whatman-Papier
Nr. 1 ergibt folgende Werte für Rf: Rf = 0,36 in einem Lösungsmittel von Wasser
mit 7/() Magnesiumsulfat (Volumen/Gewicht) und 2,5°/o Methyläthylketon (Volumen/Volumen);
Rf = 0,86 in einem Lösungsmittel aus mit Wasser gesättigtem n-Butanol; Rf = 0,09
in einem Lösungsmittel von mit Wasser gesättigtem Methyl-isobutylketon mit 2°/o
p-Toluolsulfonsäurehydrat (Volumen/ Gewicht); Rf = 0,83 in einem Lösungsmittel aus
Methyläthylketon, das mit Wasser gesättigt ist. Zur Bestimmung der obigen Werte
wurde die Tylosinbase in acetonischer Lösung auf das Papier gebracht.
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Die freie Base von Tylosin wirkt wachstumshindernd auf Mikroorganismen,
sowohl auf grampositive als auch auf gramnegative Bakterien, von denen einige pflanzenpathogen
wirken. Doch die überwiegende Zahl der Organismen, auf die sie hemmend wirkt, sind
grampositiv. Der Grad, in dem Tylosin auf das Wachstum von beispielhaften Organismen
hindernd wirkt, ist für die einzelnen Organismen in Tabelle 1 zahlenmäßig angegeben.
Der Inhibitorgrad wurde durch den Agarverdünnungs-Test oder durch den Brühverdünnungs-Test
bestimmt (die beiden Arten sind in der Tabelle mit den Buchstaben »ad« bzw. »bd«
bezeichnet).
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Beim Agarverdünnungstest wird der zu untersuchende Organismus auf
verschiedene Agarplatten gestrichen oder verpflanzt, die Tylosin in verschiedener
Konzentration enthalten, um die Minimalkonzentradon an Tylosinbase in p.g/cm3 (Mikrogramm
pro Kubikzentimeter) im Agarsubstrat zu bestimmen, die ein Wachstum des Organismus
für die Dauer von 48 Stunden (oder 72 Stunden im Fall von pflanzenpathogenen Organismen)
verhindert.
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Beim Brühverdünnungstest wird eine Anzahl Röhrchen, die Nährbrühe
mit Tylosin in verschiedener Konzentration enthalten, mit dem zu untersuchenden
Organismus geimpft, um die Minimalkonzentration an Tylosinbase in #tg/cm3 in dem
Brühsubstrat zu bestimmen, die ein Wachstum des Organismus für die Dauer von etwa
20 Stunden verhindert.
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Die Säureanlagerungssalze von Tylosin zeigen etwa die gleiche Wirksamkeit
wie die in Tabelle I angegebenen.
| Tabelle I |
| Konzentration |
| Testorganismus mit verhütender |
| Wirkung |
| (fL/ern 3) |
| Bakterien |
| Staphylococcus aureus . . ....... 1,56 ad |
| Staphylococcus albus . . . . . . . . . . 3,13 ad |
| Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . 1,56 ad |
| Mycobacterium phlei . . . . . . . . . . 0,78 ad |
| Mycobacterium tuberculosis (607) 0,78 ad |
| Mycobacterium avium . . . . . . . . . 0,78 ad |
| Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . > 100 ad |
| Proteus vulgaris............... 50 ad |
| Pseudomonas aeroginosa ....... >100 ad |
| Aerobacter aerogenes . . . . . . . . . . >l00 ad |
| Klebsiella pheumoniae . . . . . . . . . 12,5 ad |
| Salmonella enteritides . . . . . . . . . >100 ad |
| Shigella paradysenteriae . . . . . . . . 100 ad |
| Brucella bronchiseptica . . . . . . . . 25 ad |
| Vibro metschnikovii . . . . . . . . . . . 50 ad |
| Streptococcus pyogenes . . . . . . . . 0,195 bd |
| Konzentration |
| Testorganismus mit verhütender |
| Wirkung |
| qt/Crn 3) |
| Corynebacterium diphtheriae . . . 0,0975 bd |
| Diplococcus pneumoniae ....... 0,195 bd |
| Pflanzenpathogene Bakterien |
| Erwinia amylovora . . . . . . . . . . . . 100 ad |
| Agrobacterium tumefaciens ..... >100 ad |
| Xanthomonas campestris ....... 25 ad |
| Xanthomonas malvacearum .... 12,5 ad |
| Xanthomonas phaseoli . . . . . . . . . 6,25 ad |
| Pseudomonas syringae ... . . . . . . 25 ad |
| Corynebacterium insidiosum .... 100 ad |
| Corynebacterium sepodonicum .. - |
Obiger Tabelle ist zu entnehmen, daß Tylosin eine relativ breite antibakterielle
Wirksamkeit besitzt. Diese Wirksamkeit wird nicht nur in vitro, sondern auch in
vivo demonstriert. Sk führt die Behandlung von Mäusen, die von verschiedenen pathogenen
Organismen befallen sind, sofort zur Beseitigung der Infektion, ob nun das Mittel
subkutan, intraperitoneal oder peroral verabreicht wird. Der EDSO-Wert von Tylosin
(Dosis, die in ihrer Wirkung ausreicht, um
5001, der als Versuchstiere benutzten
Mäuse zu schützen) für einige beispielhafte Infektionen ist aus Tabelle II ersichtlich.
| Tabelle II |
| Verab- ED6o |
| Organismus, der die reichungs- mg Tylosin |
| Infektion verursachte weise des kg Körper- |
| Tylosin gewicht |
| Staphylococcus aureus.... subkutan 3,8 (x2) |
| Staphylococcus aureus.... peroral 42 (X2) |
| Diplococcus pneumoniae subkutan 4,8 (x2) |
| Meningopneumonitis virus intraperi- 41,5 (x 5) |
| toneal |
| Streptococcus Pyogenes |
| C 203 . . . . . . . . . . . . . . . . subkutan 2,6 (x 2) |
| Streptococcus haemolyticus peroral 65 (x2) |
Bei Mäusen bewirkt die Verabreichung von Tylosin die Überwindung von Infektionen
durch Spirochaeta vovyi, wobei die wirksame Dosis bei peroraler Verabreichung bei
31 mg/kg Körpergewicht liegt; verabreicht man das Medikament intraperitoneal, so
ist eine Dosierung von etwa 2 mg/kg Körpergewicht wirksam.
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Tylosin kann hergestellt werden durch Züchten neu gefundener und bisher
nicht beschriebener Organismen-Stämme, die aus Bodenproben von Nongkhai, Thailand,
isoliert wurden. Die Organismen wurden durch Fermentation submerser Kulturen unter
aeroben Bedingungen in einem Nährmedium gezogen, der assimilierbare Kohlenstoff
und Stickstoffquellen sowie solche anorganischer Salze enthielt. Die Organismen
wurden aus den obenerwähnten Bodenproben isoliert, indem Teile dieser Bodenproben
in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und diese Suspensionen auf Nähragar
gestrichen wurden. Die geimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei 25 bis
30°C bebrütet. Nach dem Brüten wurden Kolonien dieser Tylosin erzeugenden Organismen
mit einer sterilen Platinöse zur Impfung auf Agar-Schrägnährböden übertragen. Die
geimpften Schrägnährböden wurden zur Erzeugung größerer Mengen Impfmaterial zur
Tylosinherstellung bebrütet.
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Die neuen Organismen mit der Eigenschaft der Tylosinherstellung sind
für dauernd bei »The Culture Collection of the Northern Utilization Research and
DevelopmentBranch oftheU. S. Department ofAgriculture« in Peoria, Illinois, mit
den Nummern NRRL 2702 und NRRL 2703 hinterlegt worden.
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In mancher Hinsicht ähneln die neu entdeckten Organismen sehr der
Art Streptomyces fradiae aus der Gruppe der Actinomycetales, bestimmt in »Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe, S.799. Die neuen Organismen NRRL
2702 und NRRL 2703 sind klassifiziert worden als neue Stämme der Art S. fradiae,
eines erstmals durch W a k s m a n bestimmten Organismus, den man jetzt von der
»American Type Culture Collection als ATCC 10745 (Waksman 3535) erhalten kann. Ein
deutlicher Unterschied zwischen den neuen Stämmen und dem Waksman-Stamm von S. fradiae
besteht darin, daß der Waksman-Stamm nicht fähig ist, Tylosin oder Desmycosin erzugen.
Der Waksman-Stamm wurde in den hier beschriebenen bevorzugten Medien gezüchtet,
doch niemals wurde eine feststellbare Menge Tylosin oder Desmycosin beobachtet.
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An dieser Stelle sei auch der tabellarische Vergleich der Eigenschaften
von Fradicin und Tylosin gegeben:
| Vergleich der Eigenschaften von Fradicin und Tylosin |
| Eigenschaft 1 Fradicin Tylosin |
| Farbe ................... grünlichgelb weiß |
| Molekulargewicht . . . . . . . . . . 514 904 |
| Formel .................. C3oH34N404 C4sH77NCi7 |
| Schmelzpunkt . . . . . . . . . . . . 180 bis 300°C (kein definiertes
Schmel- 128 bis 130°C |
| zen) |
| Optische Aktivität . . . . . . . . (a)DS = +65 [a]D5
= -45 |
| UV-Absorptionsmaxima .... 290 bis 295 m#t, Hexan 340,
356, 378m. 283 m#t, keine Absorption im Bereich |
| von 300 bis 400 m@c |
| Löslichkeit . . ..... . . . . .. .. . 0,05 mg/ml in Wasser
bei 25°C, sehr 5 mg/ml in Wasser bei 25°C, leicht |
| schwach löslich in Alkoholen löslich in Alkoholen |
| Toxizität . . . . . . . . . . . . . . . . LDbo = 4 mg/kg intraperitoneal
und LDso = 3000 mg/kg subkutan |
| oral |
| Biologische Wirksamkeit .... nur antifungal LDSO = >5000
mg/kg oral |
| Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . Proc. Soc. Exptl.
Biol. grampositiv, gramnegativ, T. B., |
| Med., 73, S. 376 (1950), 113, 361 Spirochäten, PPLO |
| (1951) |
Die Erfindung wird unter besonderer Bezugnahme auf den neu gefundenen
Organismus, NRRL 2702, genau behandelt. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die
Herstellung des Antibiotikums durch Züchtung anderer Tylosinorganismen, z. B. anderer
Tylosin erzeugender Stämme inklusive NRRL 2703 oder Varianten von NRRL 2702 und
NRRL 2703 auch unter diese Erfindung fallen. Solche anderen Organismen, Stämme oder
Mutanten kann man nach bekannten Verfahren gewinnen, z. B. indem man einen Tylosin
erzeugenden Organismus Röntgen- oder ultravioletter Strahlung unterwirft oder ihn
mit chemischen Mitteln, beispielsweise mit Senfölen, behandelt.
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In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse gründlicher Klassifizierungsuntersuchungen
mit dem oben beschriebenen Tylosin erzeugenden Stamm S. fradiae NRRL 2702 aufgeführt.
Die bei der Darstellung benutzten Farben stimmen mit den bei R i d g w a y : »Culture
Standards and Nomenclature« (1912), gebrauchten Definitionen überein.
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Mikroskopische Morphologie Tomatenmark-Hafermehl-Agar (14 Tage bei
30°C). Die Sporenketten bilden Haken, Schlingen und unregelmäßige Knäuel. Typische
Spiralen kommen selten vor. Die Sporen haben fast kugelfömige Gestalt und sind etwa
0,8 bis 1,5 #t groß.
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Agar mit anorganischen Salzen und Stärke (14 Tage bei 30°C). Gleiche
mikroskopische Morphologie, wie sie bei dem Tomatenmark-Hafermehl-Agar beobachtet
wurde.
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Agar mit anorganischen Salzen und Ribose (14 Tage bei 30°C). Gleiche
mikroskopische Morphologie, wie sei bei dem Tomatenmark-Hafermehl-Agar beobachtet
wurde.
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Charakteristische Kulturenmerkmale Czapeks Agar (14 Tage bei 30°C).
Mittleres Wachstum. Kein Luftmyzel. Unterseite fast cremefarben. Kalziumaleat-Agar
(14 Tage bei 30°C). Mäßiges Wachstum. An der Luft cremeglänzend. Unterseite neapelgelb.
Glucose-Asparagin-Agar (14 Tage bei 30°C). Sehr geringes Wachstum. Agar mit anorganischen
Salzen und Stärke (14 Tage bei 30°C). Starkes Wachstum. Leichtes Luftmyzel, weiß
bis fahl ockerlachsfarben. Unterseite fast cremeglänzend. Tomaten-Hafermehl-Agar
(14 Tage bei 30°C). Starkes Wachstum. Leichtes Luftmyzel, weiß bis weinfarbigglänzend.
Emersons' Agar (14 Tage bei 30°C). Mäßiges Wachstum. Schwaches Luftmyzel, weiß.
Unterseite fast ockerglänzend.
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Hefeextrakt-Agar (14 Tage bei 30°C). Mäßiges Wachstum. Schwaches Luftmyzel,
weiß. Unterseite antimongelb. Kartoffelpflock-Agar (14 Tage bei 30°C). Kein erkennbares
Wachstum. Physiologie Gelatineverflüssigung . . . . . . . . . . . . langsam Nitratreduktion
...... . . . . . . . . . . reduzierte Nitrate Nitratreduktion . . . .. .
. .. .. . . . . . keine HZS-Bildung ..... ............. keine Stärkehydrolyse
. . . .. . . . . . . . . . . . reichlich Temperatur 26 bis 30°C ... . .........
. .. optimales Wachstum 32 bis 37°C . . . . . . . . . . . . . . . . optimale Sporenbildung
Keine Bildung von Luftmyzel bei 26°C.
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In Tabelle III sind die Ergebnisse von Kohlenstoffbrauchbarkeitstests
aufgeführt, die an dem Organismus NRRL 2702 durchgeführt wurden. Es werden folgende
Symbole benutzt: + = Wachstum und Brauchbarkeit, -= kein Wachstum, keine Brauchbarkeit,
= beschränktes Wachstum, wahrscheinlich geringe Brauchbarkeit.
| Tabelle IIl |
| Kohlenstoffbrauchbarkeitssehema für NRRL 2702 |
| Verbindung I Wachstumsreaktion |
| L (+) Arabinose . . . . . . . . . . . . . + |
| L (-@-) Rhamnose . . . . . . . . . . . . . + |
| D (+) Ribose................. - |
| D (+) Xylose . . . . . . . . . . . . . . . . + |
| D (-) Fructose . . . . . . . . . . . . . . + |
| D (+) Glucose................ + |
| D (-@) Melibiose . . . . . . . . . . . . . . - |
| Sucrose...................... + |
| D (+) Trehalose . . . . . . . . . . . . . . + |
| D (+) MelizitWe . . . . . . . . . . . . . - |
| D (+) Raffinose . .. .. . .. . . . . .. - |
| Cellulose..................... - |
| Inulin ............... « ....... - |
| Adonit ...... . ............... - |
| i-Inosit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. - |
| Mannit ..................... |
| Natriumacetat ............... + |
| Salicin ...................... - |
Wie erwähnt, kann Tylosin durch Züchtung von NRRL 2702 gewonnen werden. Eine ganze
Anzahl Medien können als Kulturmedium Verwendung finden, da sich der Organismus
viele Energiequellen zunutze machen kann, wie aus den oben beschriebenen Brauchbarkeitstests
ersichtlich ist. Zwecks rationeller Herstellung, Maximalausbeute an Antibiotikum
und aus Gründen der Isolierung des Antibiotikums sind jedoch bestimmte Kulturmedien
vorzuziehen. Zur Herstellung von Tylosin geeignete Medien sind assimilierbare Kohlenstoffquellen,
z. B. Glucose, Saccharose, Fruktose, Stärke, Glycerin, Melasse, Dextrin, brauner
Zucker, Maisquellmasse u. ä. Die bevorzugten Kohlenstoffquellen sind Glucose und
Stärke. Außerdem enthalten geeignete Medien eine assimilierbare Stickstoffquelle,
z. B. Leinsamenmehl, Klärschlamm,
Fischmehl, Baumwollsamenmehl,
Hafermehl, gemahlener Weizen, Sojabohnenmehl, Rindfleischextrakt, Peptone (Fleisch
oder Sojabohne), Kasein, Aminosäuregemische. Bevorzugte Stickstoffquellen: Sojabohnenmehl,
Kasein und feste Maisquellmasse.
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Mineralsalze, die z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium-, Magnesium-,
Kobalt-, Sulfat-, Chlor-, Phosphat-, Karbonat-, Acetat- und Nitrationen liefern,
und eine Quelle von Wachstumsfaktoren, z. B. Brennereirückstände und Hefeextrakt,
kann man mit guten Ergebnissen in die Medien einarbeiten.
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Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen
nötig ist, sollte auch das Kulturmedium zur Züchtung der erfindungsgemäßen Aktinomyceten
wirksame Spurenelemente enthalten. Diese Spurenelemente werden normalerweise als
Verunreinigung gleichzeitig mit den anderen Bestandteilen des Mediums zugegeben.
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Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann stark variieren. Es wurde
jedoch gefunden, daß der erwünschte Anfangs-pH-Wert des Mediums zwischen 5,5 und
8,0 liegt, vorzugsweise zwischen etwa 6,5 und 7,0. Wie bei anderen Aktinomyces beobachtet
wurde, steigt der pH-Wert des Mediums während der gesamten Wachstumsperiode des
Organismus, während also Tylosin erzeugt wird, langsam an und kann einen Wert bis
zu 7,2 bis 8,0 oder mehr erreichen; der endgültige pH-Wert hängt zumindest teilweise
von dem Anfangs-pH-Wert, den im Medium vorhandenen Puffern und der Zeitspanne, während
welcher sich der Organismus im Wachstum befindet, ab.
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Submerse aerobe Züchtungsbedingungen sind zur Erzielung guter Ausbeuten
an Tylosin am günstigsten. Zur Herstellung verhältnismäßig kleiner Mengen genügen
Schwenkkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen, doch zur Erzeugung großer Mengen
bevorzugt man submerse aerobe Kulturen in sterilen Behältern. Das Medium in dem
sterilen Behälter kann man mit einer sporenhaltigen Suspension impfen, doch da erfahrungsgemäß
bei Verwendung von sporenhaltigen Suspensionen eine Wachstumsverzögerung eintritt,
zieht man Kulturen in vegetativer Form vor. Man vermeidet dadurch diese Wachstumsverzögerung
und nutzt das zur Fermentation verwendete Material besser aus. Daher ist es erwünscht,
zuerst ein vegetatives Inokulum von dem Organismus herzustellen, indem man eine
verhältnismäßig geringe Menge Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus impft
und das vegetative Inokulum unter aseptischen Bedingungen auf den großen Behälter
überträgt, sobald es sich kräftig genug entwickelt hat, jedoch noch jung ist. Das
Medium, in dem das vegetative Inokulum gezüchtet wird, kann das gleiche oder anders
sein als das für die Tylosinproduktion verwendete.
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Die Organismen wachsen am besten bei Temperaturen von etwa 25 bis
etwa 32°C. Optimale Tylosinproduktion scheint bei einer Temperatur von etwa 26 bis
30°C zu erfolgen.
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Wie bei Verfahren mit submersen Kulturen üblich, wird sterile Luft
durch das Kulturmedium geblasen. Um günstiges Wachstum der Organismen und hohe Tylosinproduktion
zu gewährleisten, benutzt man bei der Behälterproduktion von Tylosin vorzugsweise
eine Luftmenge von einem Zehntel des Volumens des Kulturmediums pro Minute an aufwärts.
Gutes Wachstum und eine Optimalausbeute an Tylosin erzielt man, wenn man mindestens
1 Volumen Luft in der Minute pro Volumen Kulturmedium verwendet.
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Während der Fermentationsperiode kann man die Tylosinwirksamkeit in
dem Züchtungsmedium leicht verfolgen, indem man Proben des Kulturmediums darauf
untersuch, wie sie hindernd auf das Wachstum eines Organismus wirken, von dem man
weiß, daß er bei Vorhandensein von Tylosin inhibiert wird. Als sehr zufriedenstellend
erwies es sich zu diesem Zweck, wenn man den Organismus Staphylococcus aureus benutzte.
Die Untersuchungen kann man nach der bekannten Ausflockungs- oder Plattenmethode
durchführen.
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Im allgemeinen tritt Maximalproduktion 2 bis 5 Tage nach der Impfung
des Zuchtmediums ein, wenn submerse aerobe Kulturen oder Schwenkkolbenkulturen Verwendung
finden, und 5 bis 10 Tage nach der Impfung, wenn man Oberflächenkulturen benutzt.
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Myzel und nicht gelöste Feststoffe werden auf bekannte Weise, z. B.
Filtrieren oder Zentrifugieren, aus der Fermentationsbrühe entfernt. Das Antibiotikum
entfernt man aus der filtrierten bzw. zentrifugierten Brühe durch Adsorptions- oder
Extraktionsmethoden. Extraktionsverfahren werden bei der Gewinnung des Antibiotikums
aus der filtrierten Brühe bevorzugt, da diese Extraktionsverfahren normalerweise
eine schnellere, gründlichere und rationellere Gewinnung des Antibiotikums ermöglichen.
Zur Extraktion des Antibiotikums aus der filtrierten Brühe werden mit Wasser nicht
mischbare polare organische Lösungsmittel bevorzugt, z. B. Fettsäureester wie Äthylacetat
und Amylacetat, chlorierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform, Äthylendichlorid
und Trichloräthylen, nicht mit Wasser mischbare Alkohole, z. B. Butyl- und Amylalkohole,
nicht mit Wasser mischbare Ketone, z. B. Methylisobutylketon und Methylamylketon
und Äther, z. B. Diäthyläther und Methylpropyläther. Andere Lösungsmittel ähnlicher
Art kann man ebenfalls benutzen. Chloroform und Amylacetat sind gegenwärtig die
bevorzugten Lösungsmittel.
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Bei Adsorptionsverfahren können vielerlei Adsorbtionsmittel und Ionenaustauschharze
benutzt werden, z. B. Kohle, Silicagel, Aluminiumoxyd sowie Ionenaustauschharze
mit saurem Charakter, z. B. »XE« 64 und »IRC« 50 (schwach saure kationische Austauschharze),
Carboxymethylcelluloseharz und »Dowex« 50 (ein stark saures kationisches Austauschharz).
Die Verbindung Tylosin kann von einem der obengenannten Adsorptionsmittel aus Chloroform-,
Aceton- oder Benzollösung adsorbiert werden. Das adsorbierte Tylosin kann dann aus
dem Adsorptionsmittel eluiert werden, z. B. indem man das Adsorptionsmittel, das
das Tylosin aufgenommen hat, mit einem niederen Alkohol, beispielsweise Methanol
oder Äthanol, bzw. mit einem niederen Alkohol; der bis zu etwa 50 °/o eines niederen
Ketons, beispielsweise Aceton, enthält, wäscht.
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Die organischen Lösungsmittelextrakte, die man durch das bevorzugte
Extraktionsverfahren erhält, kann man ohne weiteres verdampfen, bis man trokkenes,
rohes Tylosin erhält. Doch aus den Extrakten der organischen Lösungsmittel gewinnt
man normalerweise gereinigte Tylosinpräparate. Man gewinnt z. B. gereinigtes Tylosin,
indem man den Extrakt des organischen Lösungsmittels, der Tylosin enthält, im Vakuum
bis auf ein geringes Volumen konzentriert, das Tylosinkonzentrat mit Kohle entfärbt
und das
Tylosin durch Zugabe eines nichtpolaren Lösungsmittels,
beispielsweise eines 2- bis 10fachen Petrolätherüberschusses, ausfällt. Der so gebildete
Niederschlag besteht aus festem, gereinigtem Tylosin und ist normalerweise amorph.
Den amorphen Niederschlag kann man mit Hilfe eines obenerwähnten Kristallisationsmittels
auskristallisieren. Andererseits kann man Tylosin aus einem tylosinhaltigen organischen
Extrakt gewinnen, indem man die Adsorptionsehromatographie anwendet und das adsorbierte
Tylosin aus dem Adsorptionsmittel eluiert.
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Die Säureanlagerungssalze von Tylosin können mit Hilfe einer Mineralsäure,
beispielsweise Schwefel-, Salz- oder Salpetersäure, oder einer organischen Säure,
bei spielsweise Wein-, Glucon-, Oxal- oder I`.ssigsäuregebildet werden- Die Salze
kann man herstellen, indem man die freie Base von Tylosin in einem entsprechenden
Lösungsmittel wie Aceton oder Äther auflöst und die Lösung mit etwa einer äquimolaren
Menge der gewünschten Säure ansäuert; dabei fällt das Salz normalerweise aus der
Lösung aus. Gesetzt den Fall, das Salz scheidet sich nicht ohne weiteres ab, kann
man es ausfällen, indem man die Lösung auf ein kleineres Volumen eindampft oder
ein mischbares Lösungsmittel, in welchem sich jedoch das Salz nicht löst, zugibt.
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Wegen ihres breiten antibakteriellen Spektrums und ihrer äußerst wirksamen
Aktivität gegen Mikroben eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen in mannigfaltiger
Weise als Mittel für die Sterilisierung sowohl von Laboratoriums- und Haushaltsgeräten
als auch von Nahrungsmitteln.
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Außerdem eignen sich die Verbindungen auf veterinärem Gebiet zur Behandlung
von Infektionen wie Truthahn-Sinusitis. Wirksam bekämpfen kann man die Sinusitis
durch direkte Injektion einer Lösung von 5 bis 20 mg Tylosin oder einem seiner kationischen
Salze in beide unterhalb der Augen gelegenen Nebenhöhlen des erkrankten Tieres.
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Die Erfindung wird weiter erläutert durch die folgenden speziellen
Beispiele: Beispiel 1 Herstellung des Tylosins Eine Sporenkultur von NRRL 2702 wird
erzeugt, indem man den Organismus auf einem Schräg-Nähragar folgender Zusammensetzung
züchtet: Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g Rindfleischextrakt
. . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g Hydrolysiertes Kasein (»N-Z-AMINE-Type Aa)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g Dextrin ..........................
10,0 g Kobaltchlorid-Heptahydrat . . . . . . . . 20 mg Agar ...........:................
20 g Wasser .......................... 11 Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe
von Natriumhydroxyd auf 7,3 gebracht.
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Der Schrägnährboden wird mit Sporen von NRRL 2702 geimpft und 5 Tage
lang bei etwa 30°C bebrütet. Das Sporenwachstum auf dem Schrägnährboden wird mit
Wasser bedeckt und die Sporen vorsichtig von dem Schrägnährboden abgekratzt, um
so eine Sporensuspension herzustellen.
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1 cm3 Sporensuspension wird benutzt, um 100 cm3 sterilen vegetativen
Kulturmediums mit der folgenden Zusammensetzung unter aseptischen Bedingungen zu
impfen Glucose ........................... 15 g Sojabohnenmehl
.................... 15 g Feste Maisquellmasse . . . . . . . . . . . . .
. . 15 g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g Kalziumkarbonat
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g Leitungswasser zur Auffüllung auf ein
Gesamtvolumen von . . . . . . . . . . . . . . 11 Das geimpfte vegetative Medium
wird 48 Stunden lang bei etwa 30°C bebrütet und während dieser Zeit in einem reziproken
Schüttelapparat mit einem Kolbenhub von 50,8 mm mit 114 Perioden pro Minute geschüttelt.
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5 cms vegetatives Impfmaterial benutzt man zur aseptischen Impfung
von Teilmengen zu 100 cm3 eines sterilisierten Produktionsmaterials, das in 500-cm3-Erlenmeyerkolben
enthalten ist und folgende Zusammensetzung hat: Sojabohnenmehl .................
15 g Kasein ......................... 1 g Roher Glukose-Syrup . . . . . . . . .
. . . 20 cm3 Kalziumkarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . 2,59
Natriumnitrat
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g Wasser zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen
von . . . . . . . . . . . 11 Die geimpfte Kultur wird 100 Stunden lang bei etwa
26 bis 28°C bebrütet. Während dieser Zeit wird sie in einem reziproken Schüttelapparat
mit einem Kolbenhub von 50,8 mm bei 114 Perioden pro Minute geschüttelt. Der Anfangs-pH-Wert
des Mediums beträgt etwa 6,5. Am Ende der Bebrütungszeit erhöht sich der pH-Wert
des Mediums auf etwa 7,5.
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Die erhaltene Nährbrühe wird zur Entfernung des Myzels und anderer
nicht gelöster Feststoffe filtriert. Die filtrierte Brühe enthält Tylosin in einer
Konzentration von etwa 250Ag pro Kubikzentimeter Brühe. Beispiel 2 Herstellung von
Tylosin Eine Sporenkultur von NRRL 2702 wird hergestellt, indem man den Organismus
auf einem Agar-Schrägnährboden mit der folgenden Zusammensetzung züchtet: Tomatenmark-Hafermehl-Agar
Tomatenmark . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g Vorher gekochtes Hafermehl
. . . . . . . . . 20 g Agar .............................. 15 g Wasser zur
Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von ..................... 11 Der Schrägnährboden
wird mit Sporen von NRRL 2702 geimpft und 9 Tage lang bei einer Temperatur von etwa
30°C bebrütet. Danach wird die Sporenkultur auf dem Nährboden mit Wasser bedeckt,
und die Oberschicht wird zur Entfernung der Sporen vorsichtig abgeschabt, um eine
wäßrige Sporensuspension herzustellen.
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Die Hälfte des von einem Agar-Schrägnährboden gewonnenen Inokulums
wird zur aseptischen Impfung
von 500 cm3 sterilisiertem vegetativem
Kulturmedium mit der folgenden Zusammensetzung in einem 2-1-Erlenmeyerkolben benutzt:
Maisquellhefe I Glukose ........................... 15 g Feste Maisquellmasse
..... : . . . . . . . . . 5 g Hefe .............................. 5 g Kalziumkarbonat
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g Wasser zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen
von . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Die Bebrütung wird 48 Stunden lang
bei 28°C unter Schütteln mit einem reziproken Schüttelapparat mit einem Kolbenhub
von 50,8 mm bei 110 Perioden pro Minute durchgeführt.
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0,951 vegetatives Impfmaterial aus dem Kolben wird als Impfstoff aseptisch
zu 9501 sterilen Mediums aus Maisquellhefe 1, wie es oben beschrieben ist, in einem
Fermentationsbehälter aus Eisen mit einem Fassungsvermögen von 13251 zugegeben.
0,11 Antifoam A (ein Produkt gegen Schaumbildung) wird dem Kulturmedium zur Verhütung
übermäßigen Schäumens zugegeben, und im Verlauf der Fermentation kommt nach Bedarf
noch mehr hinzu. Das geimpfte Medium wird 24 Stunden lang bei 28°C der Fermentation
überlassen. Während dieser Zeit wird es mit steriler Luft, 0,765 m3/min, behandelt
und mit zwei 406-mm-Flügelrädern mit 160 U/min gerührt.
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In einen eisernen Fermentationsbehälter mit einem Fassungsvermögen
von 64351 wurden 45401 Medium folgender Zusammensetzung gebracht: Maisquellsoja
XII Glukose ........................ 30 kg Sojaölmehl...................... 15 kg
Feste Maisquellmasse . . . . . . . . . . . . 5 kg Roh-Sojaöl .....................
10 kg Kalziumkarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . 2 kg Natriumchlorid . . .
. . . . . . . . . . . . . . . 5 kg Wasser zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von
. . . . . . . . . . . 10001 Das Medium wird mit 3631 des in dem Fermentationsbehälter
gezüchteten Inokulums geimpft. Man läßt den Stoff 4 Tage lang bei 28°C fermentieren.
Der Schaum wird durch Zugabe von z. B. »Larex« Nr. 1 (Mittel gegen Schaumbildung)
nach Bedarf reduziert. Das Fermentationsmedium wird durch Zugabe steriler Luft,
3,625 m3/min, gelüftet und durch zwei 610-mm-Flügelräder mit 130 U/min gerührt.
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272 kg »Silflo«, einer Diatomeenerde-Filterhilfe, werden zu 37851
dieser Brühe zugegeben, und das Gemisch wird filtriert. Das Filtrat wird auf einen
pH-Wert von 8,5 gebracht, indem man 20°/@ges Natriumhydroxyd zugibt, es kommen noch
19001 Chloroform hinzu, das Gemisch wird 30 Minuten lang gerührt und die in Form
einer Emulsion vorhandene Chloroformschicht abgegossen. Die Chloroformextraktion
wird zweimal unter Benutzung von 1900 I Chloroform je Extraktion wiederholt. Die
Chloroformemulsionen, die das Tylosin enthalten, werden vereinigt und zur Brechung
der Emulsion durch einen De-Laval-Separator geleitet. Die abgetrennte Chloroformlösung,
die man erhält, wird im Vakuum konzentriert auf ein Volumen von 251, und Verunreinigungen
werden in der Hauptsache durch Durchleiten des Konzentrats durch eine Säule mit
152 mm Durchmesser entfernt, die 10 kg Aktivkohle enthält. Die Kohlenstoffsäule
wird mit 161 Chloroform gewaschen. Die vereinigten abfließenden Chloroformauszüge
mit dem Tylosin werden im Vakuum auf 21 konzentriert, und das Chloroformkonzentrat
wird unter Umrühren langsam zu 201 Petroläther gegeben, wodurch das Tylosin ausgefällt
wird. Nach 15 Minuten Rühren des Gemisches wird dieses zwecks Entfernung des weißen,
amorphen Tylosinniederschlags filtriert; dieser wird im Vakuum getrocknet und wiegt
danach etwa 1070 g.
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Das amorphe Tylosin wird kristallisiert, indem man es in 355 cm3 Aceton
löst, das Acetongemisch zur Entfernung eines leichten Schleiers filtriert und das
filtrierte Acetongemisch unter vorsichtigem Rühren zu 201 Wasser mit einer Temperatur
von 5'C gießt. Die entstandene wäßrige Acetonlösung von Tylosin läßt man bei Zimmertemperatur
stehen und sorgt für leichtes Umrühren, damit das Aceton langsam verdunsten kann,
wobei Tylosin auskristallisiert. Die Tylosinkristalle werden durch Filtrieren abgetrennt
und bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Der Schmelzpunkt liegt bei etwa 127
bis 132°C.
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Beispiel 3 Herstellung von Tylosintartrat 5 g kristallines Tylosin
werden in 100 cm3 Aceton gelöst, und 1,5 g d-Weinsäure, gelöst in 20 cm3 Aceton,
werden unter Rühren zugegossen. Die Lösung läßt man bei Zimmertemperatur stehen,
wodurch das Tartrat von Tylosin aus der Lösung auskristallisiert. Die Tartratkristalle
des Tylosins werden durch Filtrieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen und an der
Luft getrocknet. Man erhält eine Ausbeute von 5,5 g. Das kristalline Salz schmilzt
bei etwa 140 bis 146°C. Beispiel 4 Herstellung von Tylosingluconat 1,03 g Glucon-B-Lakton
werden in 10 cm3 Wasser gelöst, und die wäßrige Lösung wird 2 Stunden lang auf 85°C
erhitzt; dies bewirkt Hydrolyse des Laktons zu Gluconsäure. Zu der wäßrigen Lösung
werden 15 cm3 warmes Methanol gegeben. In 10 cm3 Methanol werden 5 g Tylosinkristalle
gelöst und unter Rühren dem Methanol-Wasser-Gemisch zugegeben. Das Tylosin-Methanol-Gemisch
läßt man über Nacht bei Zimmertemperatur stehen. Durch Verdunsten im Vakuum wird
Methanol aus dem Gemisch entfernt. Danach werden 40 cm3 Wasser zu dem wäßrigen Tylosingemisch
zugegossen. Das verdünnte Gemisch wird filtriert und das Filtrat mit dem aktiven
Tylosin gefriergetrocknet; man erhält 5,3 g weißen Feststoff, der aus dem Gluconat
des Tylosins besteht. Das Tylosingluconat schmilzt bei etwa 114 bis 117°C.
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Beispiel s Herstellung von Tylosinhydrochlorid 890 mg Tylosin werden
in 200 cm3 Äther gelöst. Das Äthergemisch wird durch Zugabe von 0,082 cm3 12 n-Salzsäure
angesäuert. Der Niederschlag des entstehenden Tylosinhydrochlorids wird abfiltriert,
mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Tylosinhydrochlorid wird aus einem
Äthanol-Äther-Gemisch umkristallisiert. Tylosinhydrochlorid schmilzt bei etwa 141
bis 145'C.