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Verfahren zur Herstellung eines neuen Biotikums
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Biotikums Lincomycin. Lincomycin wurde zum Zeitpunkt der Erstanmeldung Lincolnensin genannt. Lincolnensin und Lincomycin sind identische Verbindungen.
Lincomycin ist ein von Lincomycin erzeugenden Aktinomyceten erzeugtes Bioprodukt und besitzt die Eigenschaft das Wachstum verschiedener Mikroorganismen, insbesondere grampositive Bakterien, nachteilig zu beeinflussen und kann entweder in Form der freien Base oder in Form eines Säureadditionssalzes allein oder zusammen mit andern bakteriziden Stoffen zur Bekämpfung des Wachstums oder zur Verringerung der Zahl der an verschiedensten Stellen vorhandenen Mikroorganismen verwendet werden. Lincomycin kann beispielsweise in zu sanitären Zwecken bestimmten Waschflüssigkeiten, beispielsweise in zum Waschen der Hände, zur Reinigung verschiedenster Teile, von Fussböden, von Möbeln, von verschmutzten Räumen oder Laboratorien bestimmten Lösungen enthalten sein.
Lincomycin kann auch als industriell anwendbares Konservierungsmittel verwendet werden, wobei es beispielsweise für eine bakteriostatische Spülung gewaschener Stoffe oder zur Imprägnierung von Papier und Geweben verwendet werden kann. Lincomycin ist weiters auch brauchbar zur Unterdrückung des Wachstums empfindlicher Organismen in Nährböden und andern biologischen Medien. Als Zusatz zu Nahrungsmitteln ist Lincomycin entweder allein oder zusammen mit Antibiotika geeignet, das Wachstum von Säugetieren und Vögeln zu fördern.
Die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens für die Herstellung von Lincomycin verwendete Aktinomycete wurde mit Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis bezeichnet. Eine der Eigenschaften dieses Aktinomycetenstammes ist die Erzeugung von Lincomycin. Eine Unterkultur dieses Stammes kann aus der Sammlung der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U. S.
Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U. S. A. unter der Nummer NRRL 2936 erhalten werden.
Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis zeigt an der Luft zusammenhängendes Wachstum von rosa Cremefarbe, gelbbraunes vegetatives Wachstum und ist melaninpositiv. Die Sporenketten sind beweglich und die Sporen sind glatt. Die Wachstumseigenschaften auf standardisierten Nährmedien und die Kohlenstoffassimilation werden in den folgenden Tabellen angegeben.
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EMI2.2
<tb>
<tb> Agar-Nährmedium <SEP> Oberseite <SEP> Unterseite
<tb> 1. <SEP> Benett's <SEP> cremerosa <SEP> braun
<tb> 2. <SEP> Czapek's <SEP> Sucrose <SEP> cremerosa <SEP> gelbbraun
<tb> 3. <SEP> Maltose-Trypton <SEP> cremerosa <SEP> braun
<tb> 4. <SEP> Pepton-Eisen <SEP> leicht <SEP> cremerosa <SEP> braun
<tb> 5. <SEP> 0, <SEP> ils <SEP> Tyrosin <SEP> leicht <SEP> cremerosa <SEP> leicht <SEP> braun
<tb> 6.
<SEP> Casein-Stärke <SEP> cremerosa <SEP> gelbbraun <SEP>
<tb>
* A. Dietz,Ektachrome-Diapositive als Hilfsmittel zur Klassifizierung von Actinomyceten, Annals of the N. Y. Academy of Science 60 : [1954], S.. 152-154.
Tabelle II
Assimilierung kohlenstoffhaltiger Verbindungen aus synthetischen Nährmedien *
EMI2.3
<tb>
<tb> d-Xylose <SEP> + <SEP> Cellobiose <SEP> + <SEP> Salicin <SEP> (+) <SEP>
<tb> d-Arabinose <SEP> Raffinose <SEP> + <SEP> Na-Formiat <SEP> (-) <SEP>
<tb> Rhamnose <SEP> + <SEP> Dextrin <SEP> + <SEP> Na-Oxalat <SEP> (-) <SEP>
<tb> d-Fructose, <SEP> + <SEP> Inulin <SEP> + <SEP> Na-Tartrat <SEP> (-) <SEP>
<tb> d-Galactose <SEP> + <SEP> lösliche <SEP> Stärke <SEP> + <SEP> Na-Salicylat
<tb> d-Glucose <SEP> Glycerin <SEP> + <SEP> Na-Acetat <SEP> (+) <SEP>
<tb> d-Mannose <SEP> + <SEP> Dulcit <SEP> Na-Citrät
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> d-Mannit <SEP> + <SEP> Na-Citrat <SEP> (+) <SEP>
<tb> Sucrose <SEP> + <SEP> d-Sorbit <SEP> (-) <SEP>
<tb> Lactose <SEP> + <SEP> Inosit <SEP> + <SEP> Blindversuch <SEP> (-)
<tb>
+ gutes Wachstum, positive Assimilation (+)
mässiges Wachstum, positive Assimilation (-) geringes Wachstum, keine Assimilation - kein Wachstum * Pridham, T. G. and Gottlieb, D., "Assimilation of Carbon Compounds in Synthetic Medium",
J. Bact. 56 : [1948], S. 107 - 114.
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Tabelle III Wachstumseigenschaften
EMI3.1
<tb>
<tb> Nährmedium <SEP> aerial <SEP> vegetativ <SEP> anderes
<tb> Reine <SEP> Gelatine <SEP> keine <SEP> farblos <SEP> braunes <SEP> Pigment,
<tb> abfallend <SEP> zur <SEP> vollkommene <SEP> VerBasis <SEP> flüssigung
<tb> Nähr-Gelatine <SEP> keine <SEP> farblos <SEP> braunes <SEP> Pigment,
<tb> abfallend <SEP> zur <SEP> vollkommene <SEP> VerBasis <SEP> flüssigung
<tb> Nitrathaltige <SEP> weiss <SEP> auf <SEP> Ring <SEP> gelbbraunes <SEP> Pigment,
<tb> Nährbrühe <SEP> Oberseite <SEP> farblos <SEP> keine <SEP> Reduktion
<tb> Synthetische <SEP> weiss <SEP> auf <SEP> farblos <SEP> durch-schwach <SEP> gelbes <SEP> PigNitratbrühe <SEP> Oberseite <SEP> wegs <SEP> leicht <SEP> ment, <SEP> keine <SEP> RedukHäutchen <SEP> flockig, <SEP> auch <SEP> an <SEP> tion
<tb> der <SEP> Basis
<tb> Lackmusmilch <SEP> weissrosa,
<SEP> auf <SEP> blau <SEP> Peptisation,
<tb> Oberfläche <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Ring
<tb> Pepton-Eisen-weissrosa <SEP> braun <SEP> H <SEP> S, <SEP> dunkel <SEP> werdend <SEP>
<tb> - <SEP> Agar <SEP>
<tb> Calciummalat- <SEP> cremerosa <SEP> cremefarben <SEP> Malat <SEP> geht <SEP> in
<tb> - <SEP> Agar <SEP> Lösung
<tb> Magermilch-weissrosa <SEP> gelb <SEP> gelbbraunes <SEP> Pigment
<tb> - <SEP> Agar <SEP> Kasein <SEP> wird <SEP> hydrolytisch <SEP> gespalten
<tb> Glykose-Aspara- <SEP> cremerosa <SEP> gelbbraun <SEP> schwach <SEP> gelbes
<tb> gin-Agar <SEP> Pigment
<tb> Kasein-Stärke-cremefarben <SEP> gelb <SEP> Stärke <SEP> wird <SEP> hydro-
<tb> - <SEP> Agar <SEP> lytisch <SEP> gespalten
<tb> Nährmittel-Stärke <SEP> cremefarben <SEP> gelb <SEP> Stärke <SEP> wird <SEP> hydro-
<tb> - <SEP> Agar <SEP> lytisch <SEP> gespalten
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> cremefarben
<SEP> braun <SEP> braungelbes <SEP> Pigment
<tb> Tyrosin <SEP> geht <SEP> in
<tb> Lösung
<tb> Xanthin-Agar <SEP> cremefarben <SEP> gelb <SEP> gelbes <SEP> Pigment,
<tb> Xanthin <SEP> geht <SEP> in
<tb> Lösung
<tb> Maltose-Trypton-olivgrün <SEP> braun <SEP> lederfarbiges
<tb> - <SEP> Aga <SEP> :
<SEP> Pigment
<tb> Bennett's-Agar <SEP> cremefarben <SEP> braun <SEP> lederfarbiges
<tb> Pigment, <SEP> gutes
<tb> Wachstum <SEP> und <SEP> Sporenbildung <SEP> bei <SEP> 18,24
<tb> und <SEP> 28 <SEP> C, <SEP> besonders
<tb> gut <SEP> bei <SEP> 37 C, <SEP> mässig
<tb> vegetativ <SEP> bei <SEP> 550C
<tb>
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EMI4.2
<tb>
<tb> III <SEP> (Fortsetzung)Nährmedium <SEP> aerial <SEP> vegetativ <SEP> anderes
<tb> Czapek's <SEP> Sucrose-cremefarben <SEP> olivfarbige <SEP> gelbes <SEP> Pigment,
<tb> -Agar <SEP> Lederfarbe <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> und
<tb> Sporenbildung <SEP> bei
<tb> 18,24 <SEP> und <SEP> 280C,
<tb> besonders <SEP> gut <SEP> bei
<tb> 37 C, <SEP> mässig <SEP> vegetativ <SEP> bei <SEP> 550C.
<tb>
Erfindungsgemäss wird Lincomycin dadurch hergestellt, dass die Actinomycete Streptomyces lincol- nensis var. lincolnensis NRRL 2936 in einem wässerigen, vorzugsweise n-Butanol, n-Butylacetat, Methyl- äthylketon, Methylenchlorid enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis das Nährmedium durch Lincomycin erzeugte wesentliche Aktivität zeigt, worauf gegebenenfalls das
Lincomycin aus dem Nährmedium abgetrennt wird. Vorzugsweise wird hiebei in einem eine Kohlenstoff- quelle, beispielsweise assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, beispielsweise eine assi- milierbaren Stickstoff enthaltende Verbindung oder einen Eiweissstoff, enthaltenden Nährmedium gear- beitet. Selbstverständlich kann für die Herstellung nur beschränkter Mengen von Lincomycin mit in Flaschen gezüchteten Oberflächenkulturen gearbeitet werden.
Als Kohlenstoffquelle werden vorzugsweise
Glukose, Zuckerkaramel, Sucrose, Glycerin, Stärke, Getreidestärke, Lactose, Dextrin, Melasse u. dgl., verwendet. Als Stickstoffquellen werden Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Getreidemehl, Milchfeststoffe, mit Pankreas aufgeschlossenes Kasein, lösliche Destillationsrückstände, animalische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle u. dgl. Stickstoffquellen vorgezogen. Auch Kombinationen dieser Kohlenstoff-Stickstoff-Quellen können mit Vorteil verwendet werden. Spurenelemente, wie beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen u. dgl. brauchen in Anbetracht des Umstandes, dass Leitungswasser und nicht gereinigte Bestandteile als Bestandteile des Nährmediums verwendet werden, dem Nährmedium nicht zugesetzt zu werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren. kann bei irgend einer Temperatur durchgeführt werden, welche ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus ergibt und die Arbeitstemperaturen können beispielsweise zwischen etwa 18 und 40 C, vorzugsweise zwischen etwa 26 und 30 C liegen. Im allgemeinen wird Lincomycin während zwei bis zehn Tagen in optimalen Mengen erzeugt. Das Nährmedium wird während der Fermentation etwa neutral oder schwach alkalisch eingestellt. Der am Ende der Wachstumsperiode sich einstellende pH-Wert hängt einerseits vom anfänglichen pH-Wert des Nährmediums, welcher von der Sterilisierung desselben vorteilhaft auf PH 6-8 eingestellt wird, und von den gegebenenfalls vorhandenen Pufferstoffen ab.
Wenn der Mikroorganismus in grossen Gefässen oder Tanks gezüchtet wird, so wird das Nährmedium vorzugsweise mit der vegetativen Form des Mikroorganismus geimpft, um eine zu grosse Zeitverzögerung und damit eine unzureichende Ausnützung der Produktionskapazität der Anlagen zu vermeiden. Dementsprechend ist es erwünscht ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe dadurch herzustellen, dass die Nährbrühe mit einer Menge einer Boden- oder Hängekultur geimpft wird. Wenn auf diese Art und Weise ein frisches, aktives vegetatives Inoculum hergestellt wurde, wird dieses aseptisch in grosse Fermentationsgefässe oder-tanks übergeführt.
Das für die Herstellung des vegetativen Inoculums verwendete Nährmedium kann dasselbe sein wie es für die Herstellung des Lincomycins verwendet wird, solange es nur ein gutes Wachstum des Mikroorganismus ermöglicht ; das Nährmedium kann aber auch verschieden sein von dem für die Herstellung des Lincomycins verwendeten Nährmedium.
Das erfindungsgemäss hergestellte Lincomycin ist eine Stickstoffbase der empirischen Formel CHN0 S, ist einbasisch, besitzt ein pK'von 7, 6 und ist unter normalen Bedingungen in der protonisierten Form, d. i. in der Salzform, stabiler. Lincomycin ist in niederen Alkanolen, beispielsweise Methanol, Äthanol, Isopropanol, den verschiedenen Butanole u. dgl., in niederen Alkylester niederer Alkansäuren, beispielsweise Äthylacrylat, n-Butylacetat, Amylacetat u. dgl., in niederen Alkanonen, beispielsweise Aceton, Methyläthylketon, Isopropyl- (n-butyl)-keton u. dgl. und in niederen Chloralkanen, beispielsweise in Methylenchlorid, Chloroform, Äthylendichlorid u. dgl., löslich.
Lincomycin ist zwar auch in Wasser etwas löslich, kann jedoch aus wässerigen Lösungen mittels mit Wasser nicht misch-
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Patentschrift Nr. 2, 702. 263).
Lincomycin kann durch abwechselndes Überführen in seine protonisierte und nicht-protonisierte Formen, und umgekehrt, insbesondere dann weiter gereinigt werden, wenn zwischen den einzelnen Überführungen weitere Behandlungsgänge, wie beispielsweise Lösungsmittelextraktionen, Waschungen, Umkristallisierungen und fraktionierte Flüssig-Flüssig-Extraktionen vorgenommen werden. Lincomycin kann auch dadurch gereinigt werden, dass die protonisierte oder nicht-protonisierte Form desselben, beispielsweise durch Behandlung mit Helianthinsäure, Reineckesäure, Azobenzolsulfosäure, Pikrinsäure u. dgl., in ein weniger lösliches Salz übergeführt wird.
Die so erhaltenen Salze können denselben Zwecken dienen wie die freie Base selbst ; diese Salze können jedoch auch wieder in die freie Base zurückverwandelt werden, worauf die freie Base in ein anderes Salz, beispielsweise in das Hydrochlorid, Phosphat oder Sulfat, übergeführt wird.
Fraktionierte Flüssig-Flüssig-Extraktion wird in Chromatographierkolonnen oder in Gegenstromverteilungsgeräten unter Verwendung eines beispielsweise von von Cyc1ohexan-Methyläthylketon- (PH=10-Puf- fer) (7 : 3g2 : Volumsteile) und (2-Butanol)-Wasser (1 : 1 Volumsteile) gebildeten Lösungsmittelsystems vorge- nommen.
Umkristallisierung des Lincomycins wird durch Auflösung eines kristallinen Salzes desselben in Wasser, Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, beispielsweise Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol und anschliessendes Kühlen zwecks Einleitung oder Vervollständigung der Kristallisation vorgenommen. Die erhaltenen Kristalle werden sodann abfiltriert, mit einer Wasser-Lösungsmittel-Lösung und gegebenenfalls einem wasserfreien Lösungsmittel, gewaschen und sodann im Vakuum getrocknet.
Die Salze des Lincomycins können durch Neutralisation mittels Alkali oder durch Behandlung mit einem Ionenaustauschharz, vorteilhafterweise bis zu einem pH-Wert von 9 bis 11, in die freie Base übergeführt werden. Bestimmte Salze des Lincomycins können sodann durch Neutralisation der freien Base mit der entsprechenden Säure bis zu einem pH-Wert unterhalb etwa 7, 5, vorteilhafterweise etwa PH = 2 bis PH = 6 hergestellt werden. Hiefür brauchbare Säuren sind beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Phos-
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zolsulfonsäure, Helianthinsäure, Reineckesäure, Azobenzolsulfonsäure, Pikrinsäure u. dgl. Säuren.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestelltes Lincomycin ist bakterizid und ist beispielsweise gegen den das Sauerwerden der Milch bewirkenden Streptococcus lactis wirksam und kann deshalb zur Hintanhaltung oder zur Verzögerung des Sauenverdens von Molkereiprodukten, beispielsweise Milch und Käse, verwendet werden. Hiebei können Konzentrationen von nur 1, 6 Jlg/cms verwendet werden. Lincomycin ist oral verabreicht, von nur geringer Toxizität. LD des Lincomycins, d. i. die für 50% der Versuchstiere tödliche Dosis, übersteigt bei Ratten 3000 mg/kg. Lincomycin kann auch zur Inhibierung grampositiver Sporenbildner auf Agarschichten dienen, wenn es sich darum handelt, Schimmel, Hefe, Streptomyceten und. gramnegative Organismen zu isolieren.
Lincomycin kann beispielsweise auch zur Isolierung von Mikroorganismen aus Bodenproben, aber auch zur Isolierung gramnegativer Organismen, beispielsweise Pseudomonas, Proteus, und Escherichia coli, aus vermischten Beständen von Mikroorganis- men, in welchen Staphylococci und Streptococci vorhanden sind, verwendet werden.
In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Lincomycin näher erläutert.
Beispiel l ; A. Eine auf geneigtem Boden gezüchtete Kultur von Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis, NRRL 2936, wurde zur Impfung von in 500 cm -Erlenmeyerkolben befindlichen Nährmedien folgender Zusammensetzung verwendet :
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<tb>
<tb> Yeastolac <SEP> Mg
<tb> Glucose <SEP> Monohydrat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> N-Z-Amin <SEP> B+ <SEP> 5g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> qs, <SEP> 11.
<tb>
+ Yeastolac ist ein aus Hefezellen gewonnenes Proteinhydrolysat, während N-Z-Amin B Sheffield's enzymatisches Abbauprodukt von Kasein darstellt.
Der pH-Wert des Nährmediums betrug vor der Sterilisierung desselben PH = 7,3. Die Kultur wurde zwei Tage bei 280C auf einem mit 250 Umdr/min betriebenen Gump-Rotationsschüttler gezüchtet.
B. 51a der wie oben beschrieben erhaltenen Kultur (5 cm3) wurden jedem der 30 verwendeten 500 cm3 -Erlenmeyerkolben. welche 100 cm3 eines Nährmediums enthielten, als Inoculum zugesetzt.
Das Nährmedium enthielt ;
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<tb>
<tb> Glucose <SEP> Monohydrat <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Melasse <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Wilson's <SEP> Pepton <SEP> Liquor <SEP> 159+ <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 4 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> qs <SEP> l <SEP> l. <SEP>
<tb>
+ Wilson's Pepton Liquor Nr. 159 stellt eine aus enzymatisch hydrolysierten Proteinen tierischen Ursprunges erhaltene Zubereitung dar.
Der pH-Weit dieses Nährmediums nach der Sterilisierung betrug PH = 7, 0. Die Schüttelflaschen wurden nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen, welche Fermentation bei 280C auf einem mit 250 Umdr/min betriebenen Gump-Rotationsschüttler vorgenommen wurde, entleert. Der pH-Wert der erhaltenen Fermentationsbrühe betrug PH = 8,6.
C. Die insgesamt 2430 cm* betragende Menge an Fermentationsbrühe wurde bei gegebenenfalls erforderlicher Verwendung von Filterhilfe noch beim nach der Fermentation bestehenden pH-Wert von PH = 8, 6 filtriert. Der erhaltene Filterkuchen wurde mit 1/5 des gesamten Volumens der Fermentationsbrühen, u. zw. mit 490 cm, Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde der filtrierten Fermentationsbrühe zugesetzt und der Filterkuchen wurde verworfen. Die nach dem Filtrieren klare Fermentationsbrühe wurde mit 50% figer wässeriger Natronlauge auf PH = 10 eingestellt, worauf zweimal mit 1/3 des Volumens des Filtrates an 1-Butanol extrahiert wurde. Die erhaltenen Extrakte wurden miteinander vereinigt und die extrahierte Fermentationsbrühe wurde verworfen.
Der Butanolextrakt wurde mit der Hälfte seines Volumens an Wasser versetzt, worauf das erhaltene Wasser-Butanol-Gemisch unter dauerndem Rühren mit 95% tiger konzentrierter Schwefelsäure auf PH = 2,0 eingestellt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde nun abstehen gelassen, worauf die beiden entstandenen Flüssigkeitsphasen voneinander getrennt wurden und die aus der Extraktion stammende Phase verworfen wurde. Die wässerige Phase (Raffinatphase) wurde nun mit piger wässeriger Natronlauge auf PH = 10 eingestellt und zweimal mit 1/3 ihres Volumens an l-Bu-
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bei ein Rückstand (RES-30) erhalten wurde, der das in Fig. l dargestellte typische Pap'erchromatogramm ergab.
Die für die Chromatographierung verwendeten Lösungsmittelsysteme waren folgende :
I (l-Butanol)-Wasser (84 : 16 Vol.-Teile) 17h
II (1-Butanol) -Wasser (84 : 16Vol. -Teile) plus 0, 25% p-Tuluolsulfonsäure (Vol.-Teile/Gew.-Teile)
16h
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5h
Das langgezogene Chromatogramm bei Verwendung des Lösungsmittelsystems V ist für reines Lincomycin typisch, tritt jedoch bei Chromatographierung von Fermentationsbrühen oder unreinen Zubereitungen nicht immer auf.
Die Materialbilanz wird in der folgenden Tabelle angegeben.
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Volumen <SEP> Bioversuch+ <SEP> insgesamt <SEP> vorin <SEP> cm3 <SEP> Bioeinheiten <SEP> handene <SEP> Biopro <SEP> cm3 <SEP> einheiten
<tb> Gesamte <SEP> Fermentationsbrühe <SEP> 2430 <SEP> 28, <SEP> 5 <SEP> 61255
<tb> Filtrierte <SEP> Fermentationsbrühe <SEP> plus <SEP> Waschflüssigkeit <SEP> 2020 <SEP> 20 <SEP> 40400
<tb> Erster <SEP> Butanolextrakt <SEP> 1380 <SEP> 40 <SEP> 55200
<tb> Extrahierte <SEP> Fermentationsbrühe <SEP> 1890 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 1134
<tb> Wässeriger <SEP> Extrakt <SEP> 770 <SEP> 50 <SEP> 38500
<tb> Extrahiertes <SEP> Butanol <SEP> 1360 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 1768
<tb> Zweiter <SEP> Butanolextrakt <SEP> 635 <SEP> 62 <SEP> 39370
<tb> Extrahierter <SEP> wässeriger
<tb> Extrakt <SEP> 640 <SEP> 1,
2 <SEP> 768
<tb> Trockenrückstand
<tb> (RES <SEP> = <SEP> 30) <SEP> 268, <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> 140 <SEP> Bioein- <SEP> 37590 <SEP>
<tb> heiten/mg
<tb>
+ Der Bioversuch wurde gegenüber Sarcina lutea vorgenommen, welche auf einem mit einem Phosphatpuffer von PH = 7 (0, 1 M) auf PH = 6 - 8 gepufferten Agar-Nährboden gezüchtet wurde. Eine bestimmte Volumsmenge (0, 08 cm) einer den zu untersuchenden Stoff enthaltenden Lösung wird hiebei auf eine
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sung enthalten, einen Inhibitionsbezirk von 20 mm ergibt, wenn eine Volumseinheit der Lösung wie oben angegeben unter standardisierten mikrobiologischen Bedingungen geprüft wird.
Der trockene Rückstand (RES-30) ergab subcutan in einer Menge von 5 mg/kg Mäusen verabreicht nahezu vollständigen Schutz gegen Streptococcus haemolyticus.. Dies war die niedrigste verabreichte Dosis. In mit Staphyloccocus aureus infizierten Mäusen ergab Lincomycin subcutan verabreicht ein CD50 von 23, 8 (17, 0-30, 6 mg/kg).
Der trockene Rückstand zeigte in vitro folgendes Wirkungsspektrum :
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<tb>
<tb> Testorganismus <SEP> MIK <SEP> (tLg/ml)
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> < <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1000 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 500
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 8
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 1000
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> > <SEP> 1000
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> > <SEP> 1000
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 250
<tb> Salmonella <SEP> typhi <SEP> 500
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> < <SEP> 1
<tb> Staphylcoccus <SEP> albus <SEP> < <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> < <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> hemolyticus <SEP> < <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> < <SEP> 1
<tb> B.
<SEP> Subtilis <SEP> 64
<tb>
MIK = Minimale Inhibitionskonzentration bei zweifachen Verdünnungen in Hirn-Herz-Brühen.
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Beispiel 2 : A. Fermentation.
Zwei 250 1 Fermentationsansätze wurden wie folgt verarbeitet : a) Herstellung des Inoculums Ein 40 1 fassender Fermentationsbehälter enthielt folgendes auf pH = 7, 2 eingestelltes steriles Nähr-
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EMI9.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> Monohydrat <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Wilson's <SEP> Pepton <SEP> Liquor <SEP> Nr. <SEP> 159 <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Pharmamedia <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Schmalzöl <SEP> 2 <SEP> cm*/l <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 20 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
+ Pharmamedia ist ein von Traders Oil Mill Co. Fort Worth, Texas, hergestelltes Baumwollsamenmehl technischer Qualität.
Dieses Nährmedium wurde mit 100 cm* eines gemäss Beispiel 1, Teil A bei 28 C innerhalb 2 Tagen i unter Rühren mit einem Rührer mit einer Umdrehungszahl von 400 Umdr/min und Belüftung mit einer Ge- schwindigkeit von 10 Normlitem Luft/min, erhalten. b) Fermentation.
Jeder der zwei verwendeten 380 1 Inhalt besitzenden Fermentationsbehälter enthielt 250 1 des fol- genden sterilen Nährmediums, welches auf PH = 6, 45 eingestellt war.
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<tb>
<tb>
Stärke-'-20 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Melasse <SEP> (black <SEP> strap <SEP> molasses) <SEP> 20 <SEP> g/l
<tb> Maisquellwasser <SEP> 20 <SEP> g/l
<tb> Wilson's <SEP> Pepton <SEP> Liquor <SEP> Nr. <SEP> 159 <SEP> 10 <SEP> g/1
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 4 <SEP> g/l
<tb> Schmalzöl <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> Leitungswasser <SEP> Rest
<tb>
+ Die Stärke kann zum Teil oder zur Gänze durch Glucosemonohydrat ersetzt werden.
Das in den Fermentationsbehältern befindliche Nährmedium wurde mit 12 l des Inoculums geimpft und 5 Tage unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 280 Umdr/min und Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 100 Normlitern Luft/min bei 280C fermentiert. Während der Fermentation wurden in einen der Fermentationsbehälter 700 cm3 und in den andern der Fermentationsbehälter 900 cm3 sterile Schmalzole zur Schaumbekampfung zugesetzt. Gegen Ende der Fermentation (114h) wurden aus dem ersten Fermentationsbehälter 250 1 einer Würze mit einem pH-Wert von 7, 9 und einer Wirksamkeit von 24 Bioeinheiten/cm3 und aus dem zweiten Fermentationsbehälter 210 1 einer Würze mit einem pH-Wert von 7, 9 und einer Wirksamkeit von 43 Bioeinheiten/cm erhalten.
B. Extraktion.
Die gesamte aus dem ersten Fermentationsbehälter abgezogene Würze, welche einen pH-Wert von 7, 9 besass wurde mit 70 cm konz. Schwefelsäure auf PH = 6, 7 eingestellt und unter Verwendung von 4% Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 1/10 des Volumens der gesamten Würze Wasser gewaschen und das Waschwasser wurde mit der filtrierten Würze vereint. Die nunmehr in einer Menge von 250 l vorliegende und eine Wirksamkeit von 20 Bioeinheiten/cm3 besitzende klare Würze wurde mit' 300 cm3 obiger wässeriger Natriumhydroxydlösung auf PH = 10 eingestellt und zweimal mit 1/3 ihres Volumens an 1-Butanol extrahiert.
Die vereinigten 1-Butanol-Extrakte (160 1, 28 Bioeinheiten/cm3) wurden mit der Hälfte ihres Volumens an Wasser (80 l) vermischt, worauf mit 50 cm* konz. Schwefelsäure auf PH = 2 eingestellt wurde. Der wässerige Extrakt (110 l, 36 Bioeinheiten/cm3) wurde abgetrennt, mit 120 cm* 50 iger wässeriger Natriumhydroxydlösung auf pH = 10, 1 eingestellt und zweimal mit 1/3 seines Volumens an 1-Butanol extrahiert. Die Menge der erhaltenen Butanol-Extrakte, welche eine Wirksamkeit von 48 Bioeinheiten/cm3 aufwiesen, betrug 80 1 und die vereinigten Butanol-Extrakte wurden mit 1/10 ihres Volumens an Wasser gewaschen. Der gewaschene Butanol-Extrakt wurde gefriergetrocknet und lieferte 21 g eines trockenen Präparates (DEG-54-11) mit einer Wirksamkeit von 145-Bioeinheiten/mg.
Die oben angegebene Arbeitsweise wurde an der aus dem zweiten Fermentationsbehälter stammenden Würze wiederholt und es wurden so 105 g eines trockenen Präparates (HRV-134-11) mit einer Wirksamkeit von 125 Bioeinheiten/mg erhalten.
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C. Reinigung.
Das Präparat DEG-54-11 und 24, 31 g des Präparates HRV-134-11 wurden miteinander vereinigt (Ge- samtgewicht 45, 48 g, Wirksamkeit 177 Bioeinheiten/mg) und in 252 cm* Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit konz. Schwefelsäure auf PH = 2 eingestellt und ein entstandener brauner Niederschlag wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde zwecks Abtrennung von Verunreinigungen einmal mit 250 cm'Methylenchlorid extrahiert. Die raffinierte wässerige Schicht wurde mit 50%igem wässerigem Natriumhydroxyd auf PH = 5, 0 eingestellt und einmal mit 250 cm Methylenchlorid extrahiert. In den Methylenchlorid-Extrakten waren 3,6 g Verunreinigungen enthalten, die eine Wirksamkeit von 12 Bio- einheiten/mg'besassen.
Die raffinierte wässerige Schicht wurde nun mit wässeriger piger Natriumhydroxydlösung auf PH = 10,2 eingestellt und fünfmal mit je 250 cm'Methylenchlorid extrahiert. Zu den vereinigten Extrakten wurden 100 cm'Wasser gegeben, worauf das Methylenchlorid im Vakuum abgetrieben wurde. Die erhaltene wässerige Lösung wurde gefriergetrocknet und lieferte 32 g eines trockenen Präparates (MEB-2), das. eine Wirksamkeit von 232 Bioeinheiten/mg besass.
D. Kristallisation.
Die weitere Reinigung des Präparates MEB-2 wurde unter Verwendung einer Verteilungskolonne vorgenommen. Die Kolonne wurde wie folgt gefüllt und es wurde wie folgt entwickelt : Ein aus Cyclohexan, Methyläthylketon und (PH = 10)-Puffer'im Volumsverhältnis 70 : 30 : 20 bestehendes Lösungsmittelsystem wurde gründlich durchgemischt und ins Gleichgewicht gebracht. Der verwendete (pH = 10)-Puffer wurde dadurch hergestellt, dass zu einer 0,2 molaren Na. Cl-Lösung so viel Natriumbikarbonat gegeben wurde, bis der pH-Wert PH = 10 betrug.
In der oberen Phase des oben angegebenen Lösungsmittelsystems wurden 100 g Diatomeenerde aufgeschlämmt, worauf der Aufschlämmung 40 cm'der unteren Phase des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems zugefügt wurden und die ganze Aufschlämmung homogenisiert wurde. Das so erhaltene Lösungsmittel-Diatomeenerde-Gemisch wurde in eine einen Innendurchmesser von 3, 18 cm aufweisende Glassäule gegossen und unter einem Luftdruck von 0, 17 Atmosphären bis zu einer konstanten Höhe gepackt. 2, 5 g des Präparates MEB-2 wurden in 2 cm'der unteren Phase des oben angegebenen Lösungsmittelsystems gelöst und dann mit einem Teil der oberen Phase desselben Lösungsmittelsystems homogen vermischt, worauf das Ganze auf die Kolonne aufgegeben wurde. Durch Aufgeben von
EMI10.1
wässerigen Lösung mit konz.
Salzsäure auf PH = 2, 0 eingestellt wurde. Die wässerige Lösung wurde sodann zweimal mit je 10 ces 1-Butanol extrahiert, worauf die raffinierte wässerige Lösung bei weniger als 50 C im Vakuum destilliert wurde, wobei 10 cm'gelöstes 1-Butanol abgetrieben wurden. Der eingeengten wässerigen Lösung wurden langsam zwischen 50 und 60 cm'Aceton zugegeben, worauf Kristallisation einsetzte. Die Aceton enthaltende wässerige Lösung wurde 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf die Kristalle abfiltriert und im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurden.
Es wurden so 388 mg kristallinesLincomycin-Hydrochlorid (MEB-12) erhalten, das eine Wirksamkeit. von 138 Bioeinheiten/mg besass, dessen Schmelzpunkt 145 - 1470C betrug, das eine optische Drehung [a] D= + 1330 (Wasser) aufwies und bei Wellenlängen von 220 bis 400 mll keine UV-Absorptionsmaxima zeigte und fol- gendes Infrarotabsorptionszentrum zeigte :
EMI10.2
<tb>
<tb> Gruppe <SEP> Absorptionsbanden <SEP> (cm <SEP> -1) <SEP>
<tb> OH/NH <SEP> 3500 <SEP> (Schulter), <SEP> 3400,3340, <SEP> 3240,
<tb> 3150,3060
<tb> 6 <SEP> bi <SEP> Bereich <SEP> 1690,1675, <SEP> 1600,1590
<tb> Andere <SEP> Banden <SEP> :
<SEP> 1315,1305, <SEP> 1276,
<tb> 1265,1233, <SEP> 1155,1140, <SEP> 1115,1100,
<tb> 1093,1078, <SEP> 1042,990, <SEP> 985, <SEP> 970,
<tb> 875,793.
<tb>
EMI10.3
<Desc/Clms Page number 11>
Der eingeengten Lösung wurden sodann 400 ems Aceton zugesetzt, worauf das erhaltene Gemisch auf - 21 C abgekühlt wurde, wobei Kristallisation einsetzte. Die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert, mit
Aceton gewaschen und im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet, wobei 3, 46 g kristallines Lin- comycin-Hydrochlorid (MEB-13) erhalten wurden.
Das erhaltene Lincomycin-Hydrochlorid besass eine
Wirksamkeit von 129 Bioeinheiten/mg, einen Schmelzpunkt von 138-145 C, eine optische Drehung von [ < xJ= + 1140 (Wasser) und zeigte keine Ultraviolettabsorptionsmaximat
Beispiel 4 : Eine Lösung von 23 g des amorphen Präparates MEB-2 in 100 cm Wasser wurde mit 4,1 cm konz. Salzsäure auf PH = I, 8-2, 0 eingestellt, worauf die angesäuerte Lösung zweimal mit je 100 cm 1-Butanol extrahiert wurde. Die raffinierte Schicht wurde sodann bei weniger als 50 C im Vakuum auf ein Volumen von 50 cm* eingeengt. Der eingeengten Lösung wurden 750 cm Aceton zuge- setzt, worauf das Gemisch auf-21 C abgekühlt wurde.
Es setzte Kristallisation ein und die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Es wurde so kristallines Lincomycin-Hydrochlorid (MEB-14) in einer Menge von 14, 0 g erhalten, das eine Wirksamkeit von 20 Bioeinheiten/mg, einen Schmelzpunkt von 145-146 C und eine optische Drehung von [a] r) = + 1390 (Wasser) besass und keine UV-Absorptionsmaxima zeigte.
Beispiel 5: Nach der in Beispiel 2 angegebenen Arbeitsweise, u. zw. Teil A, B und C, wurden 12, 7 g des Präparates MEB-147 erhalten, das eine Wirksamkeit von 270 Bioeinheiten/mg besass. Nach einem ergebnislosen Versuch dieses Präparat in einem Craig-Gegenstromverteilungsapparat, der mit einem aus gleichen Volumsmengen Butylacetat und Wasser bestehenden und im Gleichgewicht bestehenden Lösungsmittelgemisch gefüllt war, weiter zu reinigen, wurden die in diesem Craig-Apparat erhaltenen Fraktionen gesammelt und auf 100 cm'einer wässerigen Lösung eingeengt, die einen pH-Wert von 9, 1 und eine Wirksamkeit von 180 Bioeinheiten/mg besass und 82,57 mg/cm* Feststoffe, insgesamt 8, 26 g Feststoffe, enthielt. Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit 1, 9 cms konz. Salzsäure auf PH = 2, 3 eingestellt.
Die angesäuerte wässerige Lösung wurde zweimal mit je 100 cm Methyläthylketon extrahiert, wobei durch diese Methyläthylketon-Extrakte 471 mg Verunreinigungen entfernt wurden, die eine Wirksamkeit von 41 Bioeinheiten/mg besassen. Die raffinierte wässerige Schicht wurde durch Einengen im Vakuum von Methyläthylketon befreit. Dem wässerigen Konzentrat (40 cm3) wurden 600 cm Aceton zugesetzt, worauf auf-21 C abgekühlt wurde. Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration isoliert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Es wurde so kristallines Lincomycin-Hydrochlorid (MEB-19-1) in einer Menge von 7, 4 g erhalten, das einen Schmelzpunkt von 139 - 1520e und eine optische Drehung von [a] D= + 1380e (Wasser) besass und keine Ultraviolettabsorptionsmaxima zeigte.
Beispiel 6 : Die Präparate MEB-13, MEB-14 und MEB-19-1 wurden miteinander vereinigt. Die vereinigten Präparate wogen 24, 86 g und wurden aus wasserhaltigem Aceton dadurch umkristallisiert, dass sie in 125 cm Wasser gelöst wurden, worauf zwecks Erzwingung der Kristallisation 1000 cm* Aceton zugesetzt wurden.
Es wurde so kristallines Lincomycin-Hydrochlorid (MEB-20) in einer Menge von 19,2 g erhalten, das eine optische Drehung von [a] D= + 1220 (Wasser) und ein Äquivalentgewicht von 455 besass und die folgende Elementaranalyse ergab :
EMI11.1
<tb>
<tb> Analyse <SEP> : <SEP> Berechnet <SEP> für <SEP> ClsHMNzOsS. <SEP> HCl <SEP> (1/2 <SEP> HzO) <SEP>
<tb> 47, <SEP> 83% <SEP> C <SEP> ; <SEP> 8, <SEP> 03% <SEP> H <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 20% <SEP> N <SEP> ; <SEP> 23, <SEP> 01% <SEP> 0 <SEP>
<tb> 7, <SEP> 09% <SEP> S <SEP> ; <SEP> 7, <SEP> 84% <SEP> Cl <SEP> ; <SEP>
<tb> gefunden <SEP> ; <SEP> 47,95% <SEP> C; <SEP> 7,81% <SEP> H; <SEP> 6,07% <SEP> N; <SEP> 22,93% <SEP> O
<tb> (Differenz) <SEP> : <SEP> 7, <SEP> 21% <SEP> S <SEP> ; <SEP> 7, <SEP> 97% <SEP> Cl <SEP> ; <SEP> 0,06% <SEP> Asche.
<tb>
Das Präparat MEB-20 zeigte in vivo folgende Wirksamkeit in mit den angegebenen Organismen infizierten Mäusen :
EMI11.2
<tb>
<tb> Organismus <SEP> CD50 <SEP> (mg/kg <SEP> CD50 <SEP> (mg/kg)
<tb> Subcutan <SEP> Oral <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> hemolyticus <SEP> 0, <SEP> 81 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 20 <SEP> 145
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 7,1 <SEP> 16
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Unter CD50 ist jene Dosis zu verstehen, bei welcher 50% der infizierten Mäuse überleben.
In vitro zeigt das Präparat MEB 20 folgende Wirksamkeitsspektren :
EMI12.1
<tb>
<tb> Testorganismus <SEP> MIK <SEP> (jug/ml) <SEP> +
<tb> BHI <SEP> PYE <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> NG
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 50
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Salmonella <SEP> typhi <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 0,2 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 0,
<SEP> 1 <SEP> 0,4
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0,8
<tb> Streptococcus <SEP> hemolyticus <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> lactis <SEP> 0, <SEP> 4
<tb> Clostridium <SEP> perfringeus <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> tetani <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 25 <SEP> 50
<tb>
+ Unter MIK (minimale Inhibitionskonzentration) sind zweimalige Verdünnungen in Hirn-Herz-Infusionsbrühen (BHI) und'in Pepton-Hefe-Extrakten (PYE) zu verstehen.
Endpunkt nach 20h, 37 C, NG = kein Wachstum-bei Blindversuch.
2 g des Präparates MEB-20 wurden in 100 cm'Wasser und 100 cmS 2-Butanol gelöst. Die Ausgangsverbindung wurde in Röhren der Type 0-19 eines Craig-Gegenstromverteilungsapparates eingebracht und durch fünfhundertmalige Überführungen verteilt. Die Verteilung wurde durch Bestimmung der Feststoffgehalte der einzelnen Fraktionen analytisch erfasst und es konnte ausgezeichnete Übereinstimmung mit der
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- 140p. a. wurden sodann dem schliesslich erhaltenen Konzentrat zugegeben, worauf Kristallisation einsetzte.
Das Gemisch wurde während der Kristallisation auf -210C gekühlt, worauf die angefallenen Kristalle gesammelt, mit Aceton gewaschen und im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurden. Es wurde so kristallines Lincomycin-Hydrochlorid (MEB-30) in einer Menge von 1, 42 g erhalten, das einen Schmelzpunkt von 135-140 C, eine optische Drehung von [ < x] D= + 1370 (Wasser) besass und keine UVAbsorption zeigte. Das Äquivalentgewicht desselben beträgt 454, 7. Das pK'betrug 7,6. Ein typisches Papierchromatogramm des Lincomycins ist in Fig. 2 dargestellt. Ein typisches Infrarot-Absorptionsdiagramm des Lincomycins ist in Fig. 3 dargestellt und es wurden Absorptionsbanden bei folgenden Wellenzahlen (CM-') festgestellt.
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<tb>
<tb>
3340 <SEP> (S) <SEP> 1600 <SEP> (M) <SEP> 1185 <SEP> (W) <SEP> 990 <SEP> (M)
<tb> 3240 <SEP> (S) <SEP> 1590 <SEP> (M)-1155 <SEP> (M) <SEP> 985 <SEP> (M)
<tb> 3150 <SEP> (S) <SEP> 1450 <SEP> (S) <SEP> (Öl) <SEP> 1140 <SEP> (M) <SEP> 970 <SEP> (W)
<tb> 2080 <SEP> (S) <SEP> 1375 <SEP> (M) <SEP> (Öl) <SEP> 1155 <SEP> (M) <SEP> 924 <SEP> (W)
<tb> 2930 <SEP> (S) <SEP> (Öl) <SEP> 1315 <SEP> (M) <SEP> 1100 <SEP> (M) <SEP> 906 <SEP> (W)
<tb> 2850 <SEP> (S) <SEP> (Öl) <SEP> 1305 <SEP> (M) <SEP> 1093 <SEP> (S) <SEP> 875 <SEP> (M)
<tb> 2160 <SEP> (W) <SEP> 1276 <SEP> (M) <SEP> 1078 <SEP> (S) <SEP> 855 <SEP> (W)
<tb> 1690 <SEP> (S) <SEP> 1265 <SEP> (M) <SEP> 1042 <SEP> (S) <SEP> 827 <SEP> (W)
<tb> 1675 <SEP> (S) <SEP> 1233 <SEP> (W) <SEP> 1006 <SEP> (W) <SEP> 793 <SEP> (W) <SEP>
<tb> 717 <SEP> (W) <SEP> (Öl) <SEP>
<tb> 690 <SEP> (M)
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
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EMI13.2
<tb>
<tb> :Analyse <SEP> : <SEP> Berechnet <SEP> für <SEP> C18 <SEP> H34 <SEP> N2 <SEP> Os <SEP> S. <SEP> HC1 <SEP> (1/2 <SEP> H <SEP> 0)
<tb> 47, <SEP> 830/0 <SEP> C <SEP> ; <SEP> 8, <SEP> 03% <SEP> H; <SEP> 6,20% <SEP> N; <SEP> 23,01% <SEP> O
<tb> 7,09% <SEP> S <SEP> ; <SEP> 7,84% <SEP> Cl
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> 47,92% <SEP> C; <SEP> 7,96% <SEP> H; <SEP> 6,085 <SEP> N; <SEP> 23,22% <SEP> O
<tb> 7, <SEP> 34% <SEP> S <SEP> ; <SEP> 7, <SEP> 94% <SEP> C1. <SEP>
<tb>
Beispiel 7 : A. Die in Beispiel 2 Teil A, angegebene Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei die beiden erhaltenen Fermentationsbrühen vereinigt und insgesamt 490 1 Würze mit einem Gehalt von 11,2 Bioeinheiten/cms erhalten wurden. Diese Würze wurde nach der in Beispiel 2, Teil B, angegebenen Arbeitsweise extrahiert, wobei 62, 3 g eines festen Präparates (EAK-137-11) erhalten wurden, das eine Wirksamkeit von 70 Bioeinheiten/mg besass.
Die gemäss Beispiel 2, Teil A erhaltene Fermentationsbrühe wurde in einem 2560 1 fassenden Fermentationsbehälter auf insgesamt 4900 1 gesamte Würze gebracht, welche 22 Bioeinheiten/cm'enthielt und nach der Extraktion in der bereits angegebenen Weise, wobei der schliesslich erhaltene Butanol-Extrakt nicht zur Trockene eingedampft wurde, insgesamt 40 1 einer wässerigen Lösung (WTP-123-11) mit einem Gehalt von 1000 Bioeinheiten/cm3 lieferte.
B. Das Präparat EAK-137-11 und die wässerige Lösung WTP-123-11 wurden miteinander vereinigt,
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cmpiger wässeriger Natriumhydroxydlösung wieder auf PH = 10 eingestellt und sodann fünfmal mit je ungefähr 5 1 Methylenchlorid extrahiert. Die so erhaltenen letzten fünf Methylenchlorid-Extrakte wurden miteinander vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von 700 cm3 eingeengt, worauf 1, 11 entionisierten Wassers zugegeben wurden. Nun wurde das Einengen noch so lange fortgesetzt, bis etwa 1500 cm einer wässerigen Lösung vorlagen. Das so erhaltene wässerige Konzentrat wurde mit 28, 5 cms konzentrierter Salzsäure auf PH = 2,2 eingestellt und zweimal mit je 1 11-Butanol extrahiert.
Das Raffinat wurde auf ein Volumen von 1, 1 l eingeengt, worauf um Kristallisation zu erzielen 15 1 Aceton zugegeben wurden. Die wässerige Acetonlösung wurde über Nacht auf 00C gehalten und die hiebei entstandenen Kristalle wurden abfiltriert, mit einem geringen Volumen an Aceton gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Es wurde so Lincomycin-Hydrochlorid (WTP-123-18) in einer Menge von 108 g erhalten, das im Durchschnitt eine Wirksamkeit von 215 Bioeinheiten/mg besass, welche Wirksamkeit einer Menge von 920 Mg der freien Base/mg äquivalent war. Das Äquivalentgewicht betrug 451, 3. Die optische Drehung betrug lct] D= + 1370 (Wasser).
Es konnten keine Ultraviolettabsorptionsmaxima festge-
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<tb>
<tb> :Analyse <SEP> : <SEP> Berechnet <SEP> für <SEP> Cl. <SEP> H34 <SEP> N2O6S.HCl <SEP> (1/2 <SEP> Hot <SEP> 0) <SEP>
<tb> 47, <SEP> 83% <SEP> C <SEP> ; <SEP> 8, <SEP> 030/ <SEP> H <SEP> ; <SEP> 6, <SEP> 20% <SEP> N <SEP> ; <SEP> 23, <SEP> 01 <SEP> 0
<tb> 7, <SEP> 09% <SEP> S <SEP> ; <SEP> 7, <SEP> 84% <SEP> CI
<tb> gefunden: <SEP> 47,61% <SEP> C; <SEP> 8, <SEP> 29% <SEP> H <SEP> ; <SEP> 6,40% <SEP> N <SEP> ; <SEP> 22, <SEP> 570/ <SEP> (1 <SEP> 0 <SEP> (Differenz)
<tb> 7, <SEP> 060/oS <SEP> ; <SEP> 8, <SEP> 021o <SEP> Cl.
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des neuen Biotikums Lincomycin, dadurch gekennzeichnet, dass die Actinomycete Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis NRRL 2936 in einem wässerigen, vorzugsweise assimilierbare Kohlehydrate und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis das Nährmedium durch Lincomycin erzeugte wesentliche Aktivität zeigt, worauf gegebenenfalls das Lincomycin aus dem Nährmedium abgetrennt wird.