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Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums Die vorliegende Erfindung
betrifft c in Verfahren zur Herstellung eines neuen und nützlichen Antibiotikums,
das unter dem Namen Terramycin (Warenzeichen) bekanntgeworden ist. Insbesondere
betrifft sie Herstellungsverfahren mittels Gärung,* weiterhin Verfahren zur Gewinnung
und Konzentrierung des Antibiotikums aus Rohlösungen einschließlich der Gärflüssigkeit,
seine Reinigung und die Herstellung seiner Salze. Die Erfindung umfaßt die Herstellung
des Antibioti-],ums und seiner Salze sowohl in Form verdünnter Lösungen als auch
in Form der rohen Konzentrate und in reiner kristalliner Form.
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Das neue Antibiotikum bildet sich bei der gelenkten Kultivierung einer
bisher nicht beschriebenen Mikroorganismenart, welche die Erfinder Streptomyces
rimosus genannt haben. Dieser Organismus wird in Anlehnung an die Bestimmungstafeln
des Werkes von Bergey »Manual of Determinative Bacteriology«, 6. Auflage,
S. 929 bis 933 im folgenden beschrieben.
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Die Kulturcharakteristiken dieser Mikroorganismenart, die denen von
Streptomyces albus nahestehen, in mehreren Einzelheiten jedoch verschieden sind,
werden auf Grund von Bestimmungen mit der Reinkultur
S 1279 unten
in Tabellenform wiedergegeben. (Farbenangaben, die mit R bezeichnet sind, beziehen
sich auf das Werk von Ridgway A, Color Standards and Nomenclature«.) Die Angaben
beruhen auf der Auswertung von
je sechs Röhren oder Platten,
| Farbe des |
| Nährboden Wachstumsgrad Luftmycel löslichen Bemerkungen |
| und der Sporen Pigments |
| Glukose- mäßig bis gut, zwischen Weiß sehr schwach Kolonie
flach; Rand unregelmäßig; |
| Asparagin- meist unter der und blassem gelblich Oberfläche
glatt; Sporenbüdung |
| Agar-Platten Oberfläche Quaker-Drab (R) schwach, Luftmycel
schwach, |
| Rückseite nahezu Gelb; Ocker (R) |
| in der Mitte; Colonialgelb (R) am |
| Rande; sehr zahlreiche Spiralen; |
| Conidiasporen in Ketten, o,6 bis |
| o,7 x o,8 bis:1,4, kurzzylindrisch. |
| Verdünnungsplatten. Kolonien |
| sämtlich im wesentlichen ähnlich; |
| einzelne Kolonien schorfig aus |
| verstreuten Systemen großer Spi- |
| ralbündel; Geruch erdig. |
| Gelatine mäßig Weiß keine mäßige Verflüssigung. |
| Lackmusmilch gut, dickes Grauweiß unterer Teil keine Hydrolyse
oder Peptonisie- |
| 9,8' C Häutchen der Röhre rang. pH-Wert unverändert. |
| heller als |
| Vergleichs- |
| wert |
| 370 C sehr gut Grauweiß oberer Teil der keine Hydrolyse
oder Peptonisie- |
| Flüssigkeit rung. pH-Wert wechselte von 6,1 |
| fast Schwarz nach 6,6 bis 7,o2. |
| Glukose-Agar mäßig, trocken, heller als blasses' Gelblichbraun
Rückseite fast Zinkorange (R) und |
| Oberfläche Mausgrau (R) Ockerorange (R). |
| rissig wegen |
| ständigen |
| Wachstums |
| vegetativer |
| Hypha: |
| Nähr-Agar gering kein Luftraycelium, sehr schwach Rückseite
fast Chamois und Honig- |
| wachsähnlich gelblich gelb (R). |
| Kartoffel- mäßig, runzelig Weißlich bis blaß leicht gelb- Mycel,
fast Ockergelb (R). |
| nährboden Quaker-Drab (R) lichbraun |
| apfelsaures gering flach kein Luftmycel; keine |
| Calcium Kolonie fast Mars- |
| gelb (R) |
| Stärke-Platten gering dünn sehr wenig Luft- keine leichte Hydrolyse |
| mycel; Kolonie |
| fast Hell-Zimt- |
| Drab (R) |
| Synthetischer kein |
| Agar |
| Cellulose. kein |
| Emersonscher mäßig bis gut, Weiß bis blasses blasses Gelb-
Rückseite nahezu Zinkorange |
| Nährboden rauh; Ober- Quaker-Drab (R); lichbraun(R) |
| fläche spaltet Kolonie in der |
| sich schließlich Masse nahezu |
| in viele kleine Honiggelb bis |
| Stücke Zinkorange oder |
| Ockerorange (R) |
| Dextrose- mäßig mit einem Gelb Nitratreduktion schwach bis
stark |
| nitratbrühe Häutchen in verschiedenen Röhren. |
| Diese Mikroorganismenart unterscheidet sich von Streptomyces
albus folgendermaßen: |
| S. albus (Rossi Doria emend. Krainsky) |
| Waksman und Henriei S. rimosus |
| i. Luftmycel reichlich I. Luftmycel knapp. |
| 2. LuftmyCel weiß 2. Luftmycel nicht Reinweiß, sondern nahezu
blasses |
| Quaker-Drab (R). |
| 3. kein nennenswertes Rissigwerden der Kolonie
3. Bei kräftigem Wachstum werden die Kolonien zu- |
| erst am Rande, dann auf der gesamten Oberfläche |
| rissig, so daß die Sporenschicht in kleine Stücke |
| zerreißt, die sich voneinander trennen, da sie dau- |
| ernd von den darunterliegenden Hyphae nach oben |
| wachsen. |
| 4. Milch wird peptonisiert nach Koagulation 4. Milch wird weder
hydrolysiert noch peptonisiert. |
| 5. Auf synthetischem Agar reichliches, ausgedehn-
5. Auf synthetischem Agar kein Wachstum. |
| tes Wachstum |
| 6. Kolonien auf Kartoffeln weiß 6. Mycel ist
nahezu Ockergelb (R). |
Der spezifische Name des Mikroorganismus, abgeleitet von rimosus, was rissig bedeutet,
wurde gewählt, um auf das zerspaltene, rissige Aussehen einiger Kolonien hinzuweisen.
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Es wird betont, daß die vorliegende Erfindung sich bezüglich der Herstellung
des neuen Antibiotikums nicht auf die Verwendung dieses speziellen Organismus oder
von Organismen, die obiger Beschreibung entsprechen, beschränkt, da diese Beschreibung
nur beispielsweise gegeben ist. Die Erfindung umfaßt vielmehr auch die Verwendung
von Varianten dieser Organismen, die aus ihnen mittels mutierend wirkender Mittel,
wie z. B. Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen, Stickstoffsenfölen u. dgl., erhalten
werden. Das neue Antibiotikum besitzt, wie aus anderen Streptomyces hergestellte
Antibiotika, ein breites antibiotisches Spektrum, in' sbesondere bei den Gram-negativen
Bakterien. Zu den Organismen, deren Wachstum durch sehr niedrige Konzentrationen
des neuen Antibiotikums gehemmt wird, gehören die folgenden: Aerobacter aerogenes,
streptothricinresistenter Aerobacter aerogenes, Salmonella paratyphi
A, streptomycinresistenter
Salmonella paratyphi
A, Salmonella paratyphi B, chloramphenicolresistenter
Salmonella paratyphi B, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Straphylococcus
albus, Straphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Eberthella
typhosa, Shigella paradysenteriae, Klebsiella pneumoniae und Salmonella pullorum.
| Tafel I |
| Konzentrationen der antibiotischen Präparate je Kubikzentimeter
Nähr-Agar, die erforderlich sind, |
| um Bakterienwachstum auf der Oberfläche von Petrischalen zu
verhindern. |
| i. Antibiotikum 4- 5. |
| der vorliegenden Aureomycin Chloramphenicol Strepto- Strepto- |
| Erfindung thricin inycin |
| CVE ChiE CVE ChlE CVE ChlE CVE
C-VE |
| mg mg mg mg mg mg mg mg |
| 20 65 1 3840 7500 1 1000 1000 2200
4000 |
| C'#7E ChlE CVE Chm CVE ChlE CVE CVE |
| E. typhosa 344 .... 1--2 4-10 7,5 1-5
<# 5 ?-6 12-20 |
| Ps. aeruginosa 173 - 20--4o <6,65 192-384
375-750 100-1000 100 220-2200 200 |
| S.paradysenteriaeI31 1 4 4 715 < o,5
< 5 2-6 4 |
| X. pneuinoniae 1322 2 7 2 4 0,5-, 1 <
2 |
| S. paratyphi A 134 ?,-5 6-65 38-192
75-375 5--,#o <I 0, 2-6 20-40 |
| S. pullorum 136 ... 2-5 6-65 38 75 10 io 6 40-200 |
| S. paratyphi B. 139 2-5 6-65 38-192
75-375 5-10 5 22-110 20-40 |
| E. coli 21 ......... 2-5 6-65 19-38
37 10 io 6 20-40 |
| A. aerogenes 2 .... o,2-i 2 < 0,5
< 4 o,5 < 5 ?-6 2-4 |
| Proteus Sp. i ..... 20-40 130-190 384-3840
750-7500 10 10 6-11 4-12 |
| Monilia albicans 8.. > 6o > igo > I1000 >22000
> 3000 > 1000 22-100 > 12000 |
| S. aureus 3 ........ 1-2 4-5 0,5
4 5-10 10 6-11 2-4 |
| S. albus 5 ........ 1 4 38-192 75 5-10
io 6-11 2-2 |
| B. subtilis 7 ....... > 6o > 65 38-192
7,5-75 1-5 < 5 22-110 12 |
| B. mycoides 18 .... 0,2 o,6 < 0,5 <
4 1-5 < 5 110-220 12-20 |
| B. subtilis 2ig ..... 0,2-1 0,6-3 < 0,5 1 <
4 1-5 < 5 1-2 < 2 |
Die vorgehendeTafel zeigt die Vergleichsspektra von verschiedenen
Streptoniycin-, Streptothricin-, Chloramphenicol- und Aureomycinpräparaten und des
neuen Antibiotikums gemäß vorliegender Erfindung, Die Wirksamkeit der verwendeten
antibiotischen Präparate wird auf zweierlei Weise ausgedrückt: i. durch E. coli-Verdünnungseinheiten
und/oder 2. durch Chloramphenicoleinheiten
je Müligramm.
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Unter E. coli-Verdünnungseinheiten (CVE) je Milligramm
wird das maximale Volumen der Nährbrühe in Kubikzentimetern verstanden, mit dem
i Milligramm des antibiotischen Präparates (verschiedenen Reinheitsgrades) verdünnt
werden kann, ohne daß es nach der Impfung mit einer jo -6 Verdünnung emer
18stündigen und unter gleichen Bedingungen gewachsenen E. coli-Kultur ein
Bakterienwachstum nach 18stündiger Inkubation bei 37' C zeigt. Unter Chloramphenicoleinheiten
(Chl. E.) je Milligramm wird das Ergebnis einer Bestimmung verstanden, die
als Vergleichsorganismus Klebsiella pneumoniae, PCJ6o?" und als Vergleichsnährlösung
die antibiotische Bestimmungsbrühe des Biologischen Laboratoriums Baltimore verwendet,
die gemäß der Vorschrift für Brühen für turbidimetrische Streptomycinbestü-nmung
der »Food and Drug Administration« hergestellt ist. Das Prüfverfahren ist das von
M cM ah o n, j. R. in j. Biol. Chem., Bd. 153, S. 249 bis 258 (April
1944) beschriebene Verfahren, das als Norm kristallines Chloramphenicol in f iner
Menge von io mg je Liter verwendet.
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Chloramphenicol ist das auf biologischem oder synthetischem Wege darstellbare
i-(p-Nitrophenyl)-2-dichloracetamidopropan-i, 3#diol.
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i. Antibiotikum gemäß vorliegender Erfindung: nach Beispiel 2 dieser
Erfindung hergestelltes Rohmaterial, wobei das bei einem pil-Wert 9 gefällte
Produkt filtriert, wieder in Wasser suspendiert und aus gefrorenem Zustand getrocknet
wurde; g. Aureomycin: kristallines Hydrochlorid; 3. Chloramphenicol:
kristalän; 4. Streptothricin: Streptothricinsulfat (aus kristallinem Helianthat,
8oo g Streptomycineinheiten je
Milligramm; 5. Streptomycin:
Streptomycinsulfat, 75o Streptomycineinheiten je Milligramm.
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Von besonderem Interesse ist die Wirksamkeit, die sich gegenüber einer
Reihe von Ivlikroorganismen zeigt, wenn die kristalline Form des Antibiotikums zur
Verwendung kommt. Aus der folgenden Tafel sind die Ergebnisse zu ersehen. Möglicherweise
sind Unterschiede in den Ergebnissen mit dem Rohmaterial und dem kristallinen Produkt
den Verunreinigungen zuzuschreiben, die sich in dem Rohmaterial befinden.
| Tafel II |
| Gewichtsmengen des neuen Antibiotikums in kristal- |
| liner Form, die vollständige Wachstumsbehinderung |
| der Versuchsorganismen bewirken. |
| Art ßg/CCM |
| A. aerogenes ...................... I |
| Klebsiella pneumoniae ............. 3 |
| E. Coli ........................... 5 |
| Art ug,'Ccni |
| E. typhosa ........................ 3 |
| S. paratyphii A ................... I |
| S. paratyphii B ................... I |
| S. paradysenteriae ................. i |
| S. pullorum ....................... 10 |
| B. subtilis (FDA --ig) .............. 3 |
| S. albus .......................... I |
| S. aureus . «'«**»'*«*«****'** .... ** I |
| M. albicans iooo |
| Proleus sp. ''*"* ....... > iooo |
| Ps. aeruginosa ..................... 100 |
| Br. bronchisepticus ................. 3 |
Eine andere Methode zur Unterscheidung des neuen Antibiotikums von anderen Antibiotika
beruht auf seiner Wirkung auf Bakterienstämme, die gegenüber verschiedenen Antibiotika
durch reihenweise Übertragung in Brühen mit zunehmend größeren Konzentrationen der
Antibiotika resistent gemacht worden sind, und zwar der Wirkung im Vergleich mit
dem ursprünglichen Stamm, der gegenüber sämtlichen Antibiotika empfindlich ist.
In dem folgenden Versuch wurde eine sterile i2-mm-Filtrierpapierschcibe in eine
Kulturbrühe des Antibiotikum getaucht und auf die Mitte einer Nähr-Agar-Platte gelegt.
Von dieser Scheibe aus wurden Kulturen von
A. aerogenes aufgestrichen, und
zwar solche, die i. empfindlich gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin und Streptothricin,
2. resistent gegenüber Streptomycin,
3. resistent gegenüber Streptothricin
und 4. resistent gegenüber Chloramphenicol waren. Nach einer Inkubation von 18 Stunden
bei
37' C zeigten sich Behinderungszonen gegenüber allen Kulturen mit Ausnahme
der chloramphenicolresistenten Kultur, woraus sich ein Unterscheidungsmerkmal des
neuen Antibiotikums gegenüber Streptomycin und Streptothricin ergibt. Für die Unterscheidung
des neuen Antibiotikums gegenüber Chloramphenicol wurde die polarographische Analyse
verwendet, nach welcher sich die für Chloramphenicol charakteristische Halbwelle
(bei pH
= 4,5; etwa
- o,85 Volt gegenüber der Quecksilberoberfläche,
in sich standardisiert) nicht zeigt.
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Die Giftigkeit des neuen Antibiotikums im Vergleich zu anderen Antibiotika
kann aus den folgenden Überlegungen beurteilt werden: Ein Präparat des neuen Antibiotikums,
das 255 Chloramphenicoleinheiten je
Milligranun und 2ooo Streptomycineinheiten
je Milligramm aufwies, zeigte bei intravenöser Injektion in eine Maus von
2o g einen LI),-Wert (letale Dosis, kein Tier bleibt leben) 3,5 mg,
entsprechend 0,893 mg Chloramphenicol und 7 mg Streptomycin. Diese
Antibiotika haben einen LDO7Wert je 2o g Maus von o,6 mg bzw.
2,5 mg. Das neue Antibiotikum in kristalliner Form zeigt bei intravenöser
Anwendung einen LDü-Wert von 3 mg je 20 9 Maus und einen LD"o-Wert
(5o"/, der Tiere bleiben leben) von 4 mg je 2o g Maus. In anderen
Versuchen wurde gefunden, daß der intravenöse LD,-Wert für das Hydrochlorid des
neuen Antibiotikums 103 mg der kristallinen amphoteren Verbindung je Kilogramm
Körpergewicht in Mäusen
entspricht, während der LD"-Wert 102
Mg je Kilogramm entspricht. Offenbar besitzen die in dem oben verwendeten
Rohantibiotikum anwesenden Verunreinigungen die gleiche Giftigkeit wie das Antibiotikum
selbst.
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Das neue Antibiotikum kann von Aureomycin durch sein Lösungsmittelextraktionsbild
unterschieden werden. Eine Lösung von Aureomycin verliert bei pH-Werten von 2,
6,5 oder
9 durch die Extraktion mittels Äther, n-Butanol, Äthylacetat,
Methylisobutylketon, Benzol oder Chloroform ihre Wirksamkeit, während eine Lösung
des neuen Antibiotikum sich nur durch n-Butanol extrahieren läßt. Ebenso unterscheiden
sich die Wärmebeständigkeiten der beiden Antibiotika voneinander.
| Tafel III |
| Prozentwerte der ursprünglichen Wirksamkeit |
| nach Erhitzen auf |
| PH ioo' C für 15 Minuten 25'C für i Stunde |
| Antibiotikum Antibiotikum |
| der vorliegenden Aureomycin der vorliegenden |
| Erfindung Erfindung |
| 40 80 100 |
| 6 50 < 25 ioo |
| 9 8o < 25 ioo |
Das Verhalten mehrerer Antibiotika auf Papier-Chromatogrammen unterVerwendung von
zwei verschiedenen Lösungsmittelsystemen wurde nach einer Laufzeit von 24 Stunden
bei
28' C verglichen, wobei Baeillus subtilis als Vergleichsorganismus verwendet:
wurde.
| Tafel IV |
| RF-Werte |
| Systeme |
| n-Butanol- Mt# IV- 1 |
| tes Wasser ' o n-Butanol-gesättgi- |
| p-Toluolsulfosäure tes Wasser |
| +2% pi |
| Antibiotikum Ausdehnung Ausdehnung |
| gemäß vor- |
| liegender |
| Erfindung.. 0-0,5 0-0,1 |
| Aureomycin 0-1: 0-015 |
| Chlor- |
| amphenicol. I |
| Strepto- |
| mycin A ... 0,2 0 |
| Streptothricin 0,03 0 |
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Züchten einer neuen, bisher
unbeschriebenen Mikroorganismenart, nämlich Streptomyces rimosus, das vorteilhaft
bei 24 bis
30' unter Rühren und Belüftung im Innern,
d. h. unterhalb
der Oberfläche eines Nährbodens durchgeführt wird, der eine Kohlehydratquelle, wie
z. B. Zucker, Stärke oder
Gly-
cerin enthält; weiterhin eine organische Stickstoffquelle,
wie z. B. Soj abohnenmehl, Weizenkleber, Baumwollsamenmehl', Laktalbumin, ein enzymatisches
Ab-
bauprodukt von Kasein oder Trypton; eine Wachstumsstoffquelle, wie z.
B. das unter der Bezeichnung Distillers solubles bekannte, bei der alkoholischen
Vergärung von Weizen oder vorwiegend Weizen enthaltenden Körnerfruchtgemischen anfallende
Nebenprodukt (erhältlich durch Eindicken der nach Abtreiben des Alkohols verbleibenden
Rückstände bis zu sirupartiger Konsistenz) oder Hefeextrakt; ferner Mineralsalze,
wie z. B. Natriumehlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat oder Natriumnitrat, fernerhin
eine Puffersubstanz, wie z. B. Caleiumcarbonat, und schließlich ein vegetabilisches
01. Nach beendetem Wachstum wird das Mycel von der nunmehr das Antibiotikum
enthaltenden Nährbrühe abgetrennt. Das Antibiotikum wird aus der Nährflüssigkeit
durch Extraktion mittels organischer Lösungsmittel bei einem geeigneten pH-Wert
gewonnen, oder dadurch, daß es aus der Nährflüssigkeit mit Aktivkohle adsorbiert
und aus der Kohle mittels organischer Lösungsmittel oder Wasser bei einem geeigneten
pH-Wert wieder herausgelöst wird oder nach irgendeinem in der Literatur bekannten
Verfahren. Das neue, so hergestellte Antibiotikum besitzt einzigartige und wertvolle
Eigenschaften, durch welche es sich von allen bekannten und bisher beschriebenen
Antibiotika unterscheidet.
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Impfstoff kann man erhalten, wenn man ein Wachstum aus Schrägnährböden
oder Rouxflaschen, die mit Streptomyces rimosus geimpft sind, verwendet. Feste Nährmittel,
die sich für dieses Anfangswachstum eignen, sind Agar-Nährboden aus Fleischextrakt,
Agar, Pepton und Wasser mit Zusatz von 10/, Lactose oder Emersonscher Agar.
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Dieses Wachstum verwendet man, um entweder geschüttelte Kolben oder
andere Behälter für im Innern des Nährbodens erfolgende Züchtungen (Unterwasserzüchtungstanks)
zu impfen; man kann auch diese Behälter aus den geschüttelten Kolben impfen. jedes
Wachstum in einem geschüttelten Kolben erreicht im allgemeinen seinen Höchstwert
in 4 Tagen, während Impfstoff in Unterwasserzüchtungstanks gewöhnlich den günstigsten
Wert in 2 Tagen erreicht. Aus dem Züchtungstank treibt man die den Mikroorganismus
enthaltende Kulturflüssigkeit unter völlig aseptischen Bedingungen in das Gärgefäß,
worin das Züchten 2 weitere Tage lang fortgesetzt wird. Die Tanks werden ständig
in der Weise belüftet, daß sterile Luft durch eine Verteilungsvorrichtung im Verhältnis
von 1/2 bis 2 Volumteile Luft zu i Volumteil Brühe je Minute eingeblasen
wird. Wenn es sich als schwierig erweist, das Aufsteigen von Schaum im Tank zu vermeiden,
können Antischaummittel, wie z. B. pflanzliche oder tierische Öle, oder andere ähnliche
Mittel zur Schaumzerstörung zugesetzt werden. Das Rühren, das je nach der
Rührerart verschieden stark sein kann, wird unter völlig aseptischen Bedingungen
durchgeführt, wobei die Temperatur der gerührten Kulturflüssigkeit zwischen 24 und
30' C gehalten wird.
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Das Antibiotikum kann aus der Gärflüssigkeit, in der es sich gebildet
hat, nach verschiedenen Verfahren gewonnen werden. Das Mvcel in der Gärflüssigkeit
muß zunächst entfernt werden, und es hat sich gezeigt,
-daß dies
am besten so geschieht, daß die Mischung sauer, zweckmäßig unterhalb Pii
= 4, gestellt und dann das Mytel abfiltriert wird. Wird dieser pil-Wert nicht
eingehalten, so verbleibt ein Teil des Antibiotikums beim. Mycel.
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Das Antibiotikum kann in gereinigter Form dadurch gewonnen werden,
daß man die filtrierte Gärflüssigkeit mit Aktivkohle bei einem nahe der Neutralität
gelegenen pn-Wert behandelt. Das Antibiotikum kann dann aus dem Adsorbierungsmittel
herausgelöst werden, und zwar mittels Wasser, das mit einem teilweise wassermischbaren
Alkohol, wie z. B. Butanol, gesättigt und mit einer Säure, z. B. Salzsäure, auf
den pH-Wert # 1,5 eingestellt ist. Nach dem Abfiltrieren des ausgewaschenen Adsorbierungsmittels
wird der pH-Wert des Filtrats auf 6 bis 9 eingestellt und das Antibiotikum
im Vakuum durch Eintrocknen im gefrorenen Zustand gewonnen. Besser, als das Filtrat
einzutrocknen, ist es unter Umständen, das Antibiotikum bei einem pir-Wert von etwa
9 mit Butanol herauszulösen. Der Butanolextrakt kann dann zu einem gereinigten
Antibiotikuin konzentriert oder auch mit einer wäßrigen Säure, wie z. B. verdünnter
Salzsäure, extrahiert werden. Nach Abtrennung der wäßrigen Schicht wird deren pa7Wert
durch Zusatz einer.Base- auf 6 bis 9
eingestellt, oaer die wäßrige
Schicht wird mit einem Anionenaustauscher, wie z. B. einem Harzprodukt, -behandelt,
- Besser als das Adsorbieren des Antibiotikums aus der filtrierten Brühe
in ein festes Adsorbierungsmittel ist unter Umständen das Verfahren, das Antibiotikum
bei einem basisthen pH-Wert, vorzugsweise etwa 9,
mit gewissen Lösungsmitteln
zu extrahieren. Als Lösungsmittel können z. B. verwendet werden Butanol, Amylalkohol
und Äthylenglykohnonophenyläther. Es wurde gefunden, daß das Antibiotikum auch bei
einem sauren pH7Wert, zweckmäßig unter 3,5, extrahiert werden kann. Für diesen
Zweck kann Äthylenglykolmonophenyläther verwendet werden. Nach der Extraktion des
Antibiotikums mittels Butanol aus der filtrierten Brühe bei dem pH-Wert
9
wird das Lösungsmittel im Vakuum auf einen Bruchteil 'seines ursprünglichen
Volumens konzentriert. Nach der Extraktion dieses Butanolkonzentrats mittels verdünnter
Säure, Trennung der Phasenschichten und Einstellung der wäßrigen Schicht auf den
pH7-Wert 6 bis 7'scheidet sich das feste Antibiotikum ab. Es wird filtriert
und getrocknet und zeigt dann je Milligramm eine Wirksamkeit von etwa 6oo,ug
des reinen Antibiotikums.
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Um die Wirksamkeit der gereinigten Produkte zu messen, wird das reine,
kristalline Antibiotikum, wie es nach dem später beschriebenen Verfahren erhalten
wird, als Standard verWiendet und diesem eine Wirksamkeit von iooo Mg je
Milligramm (1-ig/mg) zuerteilt. Bei der Bestimmung wird als Prüforganismus Klebsiella
pneumoniae PCI 6o2 und als Prüfnährboden die Antibiotikumbestimmungsbrühe des Baltimore
Biological Laboratory verwendet, die nach der'Vorschrift für Gärflüssigkeiten für
turbidünetrische Streptomycinbestimmungen der »Food- and Drug Administration« hergestellt
ist. Das Prüfverfahren ist das von McMahon,* I. R. in j. Biol. Chem. Bd. :153 S.
249 bis 258 (April 1944) beschriebene Verfahren. Man kann auch reines kristallines'Chloramphenicol
als Standard bei den Vergleichen verwenden, wobei, wie gefunden wurde, jedes Milligramm
des kristallinen Antibiotikums gemäß Erfindung in .seiner Wirksamkeit 3J5 nig des
kristallinen Chloramphenicols entspricht.
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Das kristalline Antibiotikum kann z. B. aus dem nach dem obigen Verfahren
erhaltenen amorphen Stoff, dessen Wirksamkeit etwa 6oo bis 650M9/Ing beträgt, hergestellt
werden. Hierbei wird so verfahren, daß man das Rohmaterial in Wasser mittels einer
Säure, z. B. Salzsäure, auf den pH-Wert 2,8 einstellt, die erhaltene Lösung
filtriert und teilweise im Vakuum eindampft. Die sich abscheidenden Kristalle werden
filtriert, gewaschen und getrocknet. Sie zeigen eine Wirksamkeit von 85o bis goo
Aglmg.
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Ein anderes Verfahren, das kristalline Antibiotikum zu erhalten, besteht
darin, daß man das rohe Antibiotikum mit der Wirksamkeit 670 ßg/mg in verdünnter
Salzsäure bei dem pH-Wert 2,5 löst, die wäßrige Lösung filtriert und das
Filtrat mit Natriumchlorid und etwas mehr als der Hälfte ihres Volumens Butylalkohol
behandelt. Nach ausgiebigem Schütteln der Mischung werden die sich abscheidenden
festen Bestandteile abfiltriert. Diese werden in Methanol erneut gelöst, worauf
man eine greinge Menge Wasser zu der Lösung hinzufügt. Nachdem die Lösung über Nacht
in einem Kühlschrank gestanden hat, werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert,
gewaschen und getrocknet. Der so erhaltene kristalline Stoff zeigt eine Wirksamkeit
von etwa 86o yg/mg und besteht aus einer Kombination der antibiotischen Base mit
Calciumchlorid.
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Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung des kristaUffien Antibiotikums
besteht darin, daß man den amorphen Stoff mit der Wirksamkeit von etwa
650 pg/mg einer Gegenstromverteilung nach dem Verfahren von Craig (j. Biol.
Chem. 155, S. 519 [1946]) unterwirft. Das verwendete Lösungsmittelsystem
besteht aus Wasser, das mit Salzsäure auf den pli-Wert 3 eingestellt ist,
und Butylalkohol. Die wäßrige Phase aus bestimmten ausgewählten Röhren wurde
im Vakuum eingedampft, wobei weiße, prismatische Kristalle des Antibiotikums mit
der Wirksamkeit von etwa 950 jug/mg erhalten wurden.
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Verschiedene Salze des Antibiotikums können-in einfacher Weise dadurch
erhalten werden, daß man die entsprechende Mineral- oder organische Säure zu dem
Antibiotikum in Wasser hinzugibt, bis eine klare Lösung erhalten wird. Die festen
Salze können daraus so hergestellt werden, daß man die Lösung des Antibiotikumsalzes
auf einen pH-Wert einstellt, der etwas unter demjenigen liegt, wo die Abscheidung
des Antibiotikums beginnen würde (etwa 2,5). Man läßt dann die Lösung eintrocknen,
z. B. dadurch, daß die gefrorene Lösung unter Vakuum gesetzt wird.
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Kristalline Säuresalze des Antibiotikums kann man durch Eindampfen
der wäßrigen Salzlösung bei niedrigem pH-Wert erhalten. Als Mineralsäuren können
Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure verwendet werden. Als organische Säuren
kommen z. B. in Frage Citronensäure, Wehisäure, Gluconsäure u. a. Da das Antibiotikum
amphoteren. Charakter hat,
können auch verschiedene Metallsalze
des Antibiotikums hergestellt werden, insbesondere die Alkalimetallsalze, die durch
Behandlung einer wäßrigen Suspension des Antibiotikums mit einem Alkalihydroxyd.
entstehen. Die festen Metallsalze des Antibiotiku;ns erhält man durch Eindampfen
einer wäßrigen Lösung des Antibiotikums bei einein7 geeigneten pH-Wert.
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Es lassen sich verschiedene andere Methoden zur Reinigung des Antibiotikums
verwenden. So kann das Antibiotikum aus der filtrierten Gärflüssigkeit als Salz
einer organischen Sulfonsäure extrahiert werden. Es kann auch aus sauren wäßrigen
Lösungen des Rohmaterials mit Pikrinsäure gefällt werden. Das Antibiotikum kann
auch aus der verdünnten Lösung des Rohmaterials mit einer Arylazosulfonsäure bei
niederem PH-Wert, z. B. mit Orange II bei p,1 # 2 gefällt werden. Das Antibiotikum
kann dann aus dem Farbstoffsalz durch Reagentien, wie z. B. Bariumchlorid, gewonnen
werden. Nach Ausfällung des Farbstoffbariumsalzes hinterbleibt eine Lösung des Antibiotikums,
die eingetrocknet werden kann. Selbstverständlich sind andere Metallsalze ähnlich
verwendbar. Die Wirksamkeit und Farbe des unreinen Antibiotikums kann dadurch verbessert
werden, daß man es in einer verdünnten Mineralsäure löst und gelöstes ß-naphthalinsulfonsaures
Ammonium hinzugibt. Die dunkel gefärbte Fällung wird abfiltriert und der p11-Wert
des Filtrats erhöht, worauf das Antibiotikum mit verbesserter Farbe und Wirksamkeit
ausfällt.
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Das Antibiotikum kristallisiert in mehreren Formen je nach
dem zu seiner Herstellung verwendeten Verfahren. Eine dieser Formen besteht aus
dicken hexagonalen Platten und eine andere aus dicken Nadeln, Die Brechungsindices
der erstgenannten Form sind folgende a = 1,636 ± 0,004,
ß = 1,648 ± 0,004, y = größer als i,7oo. Die optische Drehung
einer Lösung der reinen kristallinen Verbindung in Methanol verringert sich schnell
beim Stehen der Lösung bei Zimmertemperatur. Kurz nach Herstellung der Lösung zeigt
diese den spezifischen Drehungswert La] Is = + ?6'
(0,5) in Methanol). Der Zusatz von D -/0 Calciumchlorid zu
der Methanollösung bewirkt, daß die spezifische Drehung sich deutlich ändert und
einen hohen negativen Wert annimmt. Auch die kristalline Kombination des Antibiotikums
mit Calciumchlorid zeigt eine stark negative spezifische Rotation in Methanol. Die
spezifische Rotation in verdünnter Salzsäure beträgt [a] 1-1 = - 196' #(0,5
0/, in n/io-Salz-D säure). Bei der Bestimmung des Ultraviolettabsorptionsspektrums
(mit dem Beckmann-Quartz-Spectrophotometer-Model DU), einer Probe des kristallinen
Antibiotikums in verdünnter wäßriger Lösung (m/io in prim. Kaliumphosphat; P,
= 4,5) in i-cm-Zellen, werden folgende Maxima gefunden: E ",' bei
353,2 mß = 277
2-7510 m[# = 299
247,5 Mß = 236
Wird das
Ultraviolettabsorptionsspektrum des Antibiotikums in verdünnter Phosphorsäure bei
pH = 1,7 bestimmt, so ergeben sich folgende Maxima: E'1%,. bei 352,5 mu
= 277
- - 267,5 Inp = 379
Das Antibiotikum ist eine amphotere
Verbindung, die sowohl schwach basische als auch schwach saure Gruppen enthält.
Es setzt sich zusammen aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und
Sauerstoff. Chemische Analysen derkristallinen Verbindung zeigten im Durchschnitt
53,05 0/, Kohlenstoff, 5,9, 0 ' /, Wasserstoff, 5,64 0,/, Stickstoff
und (aus der Differenz) 35,4 0,". Sauerstoff. Die Verbindung ist aschenfrci. Sie
hat einen Schmelzpunkt von etwa 183' C und zersetzt sich b(i dieser Temperatur
etwas. Sie ist löslich in Methanol, Äthanol, Aceton und Propylenglykol. In Wasser
lösen sich bei 25' C
0,25 mg je Kubikzentimeter. Sie ist unlöslich
in Äther und PetroläthEr.
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Das.in Mineralöl suspendierte kristalline Antibiotikum zeigt viele
charakteristische Absorptionsbanden im Infraroten. Unter diesen befinden sich die
folgenden Frequenzen (in reziproken Zentimeter): 3460, 336o, 1590, 1318,
1280, 1242, 1122, iogo" io76, 1054, 1031, 1012, 938, 863, 839, 772,
7o5, 679. Diese Bestimmung wurde mit einem in Mineralöl verriebenen Material
durchgeführt.
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Aus den obigen Eigenschaften ergibt sich, daß das neue Antibiotikum
der vorliegenden Erfindung sich deutlichvon allenbekanntenAntibiotikaunterscheidet.
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Die folgenden Beispiele sollen die Verfahren erläutern, nach denen
das neue Antibiotikum sich bildet und-gewonnen, konzentriert, gereinigt und schließlich
in die reine kristalline Verbindung übergeführt werden kann. Das kristalline Antibiotikuit
und seine kristallinen Salze sind wegen ihrer hohen Reinheit und Wirksamkeit von
besonderem Wert. Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollen die
Erfindung in keiner Weise einschränken. In allen Beispielen wurde ein Stamm Streptomyces
rimosus unter der Bezeichnung Reinkultur S 3279- verwendet. Beispiele i.
Bildung und Gewinnung des Antibiotikums Nährflüssigkeit: Sojabohnenmehl io
g, festes Glukosehydrat io g, ein unter dem Namen Distillers Solubles
bekanntes Handelsprodukt o,5 g, Natriumchlorid 5 g mit destilliertem
Wasser aufgefüllt zu iooo ccm. Der prWert wurde mit Natriumhydroxyd auf
7 eingestellt. Calciumcarbonat wurde im Verhältnis von i g je Liter
hinzugegeben.
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5oo-ccm-Mengen der obigen Nährflüssigkeit wurden in Fernbachkolben
gegeben, die dann bei 121' C
3o Minuten lang sterilisiert wurden. Nach dem
Ab-
kühlen wurden die Kolben mit einer Suspension des S. rimosus-Wachstums,
das von der Oberfläche eines Agar-Nährbodens am Fleischextrakt, Agar, Pepton und
Wasser mit Zusatz von 1 1),1, Lactose gewonnen wordenwar, geimpftund 4Tage lang
bei 7,8'C aufeiner Rotationsschüttelmaschine mit etwa 5 cm Versetzung bei
2oo Umdrehungen je Minute geschüttelt. Nach dieser Zeit enthielt die Flüssigkeit
640 Coli-Verdünnungseinheiten je Kubikzentimeter und 400 Chloramphenicoleinheiten
je Kubikzentimeter. Das Myccl wurde von der Brühe durch Filtrieren getrennt,
und
das Filtrat wurde auf den p,-Wert = 9 eingestellt, Das
Antibiotikum wurde aus der Brühe mit n-Butanol extrahiert. Bei der Beobachtung des
Ultraviolett-* absorptionsspektrums der Butanollösung des Antibiotikums wurden,
Maxima in der Absorptionskurve bei 385 und 27o raß gefunden.
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:z. Bildung und Gewinnung des rohen Antibiotikums Nährflüssigkeit:
Sojabohnenmehl 30 9, Maisstärke 5 g, Enzymatisches Abbauprodukt des
Kaseins mit mindestens 12,925 0/, Stickstoff- und 4,3 0/, Aminstickstoffgehalt
i g, Natriumnitrat 3 9 mit Leitungswasser auf iooo ccm aufgefüllt.
Der p,-Wert wurde auf 7 eingestellt. i g Calciumcarbonat wurde
je Liter hinzugefügt.
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2-Liter-Mengen dieser Nährflüssigkeit wurden in mehrere Glaskolben
von etwa 41 Inhalt gegeben, die Rührer und Verteilerköpfe zur Einleitung steriler
Luft enthielten. Die Apparate mit der Nährflüssigkeit wurden i Stunde lang bei im'
C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurden sie mit 5o ccm einer Suspension
von S. rimosus geimpft. Nach 40stündigem Rühren (18oo Umdrehungen
je Minute) enthielt die Flüssigkeit i6oo Chloramphenicoleinheiten
je Kubikzentimeter und i28o bis --56o. Coli-Verdünnungseinheiten
je Kubikzentimeter.
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71 der so hergestellten Brühe wurden von dem Mycel durch Filtrieren
getrennt und auf P, = 7
eingestellt. 7o g Aktivkohle wurden hinzugegeben,
und das Ganze wurde bei Raumtemperatur i Stunde lang gerührt. Die das Antibiotikum
enthaltende Kohle wurde #,on der 'verbrauchten Brühe abfiltriert, und der erhaltene
Kohlekuchen wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Antibiotikum wurde aus
der Kohle mit i Liter einer Lösung herausgelöst, die aus mit n-Butanol gesättigtem,
destilliertem Wasser, das mit Salzsäure auf p, # 1,5 eingestellt war, bestand.
Nach dem Auswaschen wurde die Lösung auf pH = 9 eingestellt und mit 11
n-Butanol extrahiert. Die Butanolschicht- wurde von der wäßrigen Schicht getrennt
und mit o,i n-Salzsäure extrahiert. Die saure, wäßrige Schicht wurde von der Butanolschicht
getrennt und durch Verrühren mit einem ionenaustauschenden Harz wieder auf P,
= 5 gebracht. Das Harz wurde von der antibiotischen Lösung abfiltriert, und`die
Lösung wurde in gefrorenem Zustand eingetrocknet, wodurch 2 g eines gelblichbraunen
amorphen Pulvers gewonnen wurden. Dieses Präparat zeigte 255 Chloramphenicoleinheiten
je Milligramm und 2ooo Streptoraycineinheiten je
Müligramm.
3. Bildung des Antibiotikums Impfflüssigkeit: Enzymatisches Abbauprodukt
des Kaseins i "/" festes Glukosehydrat 1 0/(" Hefeextrakt o,5 0/" Natriumchlorid
o,5 0/" Calciumcarbonat o,i 0/, in Leitungswasser und mit KOH auf p.-Wert
6,7
eingestellt. %
95o 1 dieser Impfflüssigkeit *wurden in einen
i5oo-Liter-Impftank gebracht und i Stunde lang bei i2i'C gehalten. NachdemAbkühlenauf
28'Cwurde die Flüssigkeit mit 11 einer S. rimosus-Suspension geimpft.
Der Tank wurde 25 Stunden lang belüftet und gerührt, worauf er zum Impfen
des Gärgefäßes verwendet wurde. Die Gärflüssigkeit war folgendermaßen zusammengesetzt:
Sojabohnenmehl 3 OM, Maisstärke 0,5 0/" N-Z-Amün B o,i 0/,), Natriumnitrat
0,3 "/" Calciumcarbonat 0,5 "/" vegetabilisches Öl 0,4 0/,
in Leitungswasser mit einem auf 7 eingestellten p,-Wert i Stunde lang bei
12:1' C sterilisiert.
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Nach dem Abkühlen auf 28' C wurde die Gärflüssigkeit mit dem
Inhalt des oben beschriebenen Impftanks geimpft. Nach 47 Stunden hatte sich der
p,rWert auf 8 erhöht, und die Brühe zeigte eine Wirksamkeit von
335 Chloramphenicoleinheiten oder 280 Coli-Verdünnungseinheiten
je Kubikzentimeter. 4. Gewinnung des Antibiotikums aus der Kulturflüssigkeit
durch Adsorption 7 1 einer Gärflüssigkeit des Antibiotikums, die von dem
Gärmycel #ei einem p,-Wert kleiner als 4 abfiltriert war und eine Wirksamkeit von
igo ßg je
Kubikzentimeter zeigte, wurden auf p, = 7 eingestellt, worauf
7o g Aktivkohle,- eine von der American Norit Company hergestellte Aktivkohle,
hinzugegeben wurden. Nach i stündigem Rühren wurde die Kohle abfiltriert und mit
Wasser gewaschen. Das Antibiotikumwurde aus der Kohle mit butanolgesättigtem und
mittels Salzsäure auf p" = 1,5 eingestelltem Wasser herausgelöst. Die so erhaltene
Lösung wurde auf PH = 9 eingestellt, und das Antibiotikum wurde dann mit
Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wurde erneut mit einer kleinen Menge o,i
n-Salzsäure extrahiert, und der p,-Wert- der so erhaltenen wäßrigen Lösung wurde
mittels eines synthetischen Anionenaustauscherharzes auf p, = 5 gebracht.
Das Antibiotikum wurde dann durch Eintrocknen der wäßrigen Lösung in gefrorenem
Zustand als fester Stoff gewonnen. Es wurden erhalten 1,5 g, die eine Wirksamkeit
von etwa 8o pg je Milligramm zeigten. 5. Gewinnung des Antibiotikums
aus der Kulturflüssigkeit durch Extraktion 8 1 einer Gärflüssigkeit des Antibiotikums
wurden mit Schwefelsäure auf p, = 2,5 eingestellt, und das Mycel wurde abfiltriert.
Das Filtrat enthielt 2 4oo oooug Antibiotikum. Es wurde auf p.. = 9
eingestellt
und mit 3 1 Butanol in mehreren Portionen extrahiert. Die vereinigten Extrakte
enthielten i 6oo ooo pg Antibiotikum. Die Butanolextrakte wurden im Vakuum auf 65o
ccm eingeengt. Die erhaltene Lösung enthielt ?,400,ug Antibiotikum je
Kubikzentimeter.
Die ButanoHösung wurde mit 11
o,i n-Salzsäure in mehreren Portionen extrahiert,
und die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden mit verdünnter Natronlauge auf
p, = 7,5 eingestellt. Das gefällte Produkt wurde abfiltriert und getrocknet.
Es wurden ifig g erhalten, die eine Wirksamkeit von 625 pg Antibiotikum
je Milfigramm zeigten. 6. Herstellung des kristallinen Antibiotikums
2o g amorphes Antibiotikum, das eine Wirksamkeit von 625 ßg
je Milligramm zeigte, wurde in 4oo ccm Wasser durch Zusatz von Salzsäure
bis zur Erreichung des pH7Wertes 2,5 gelöst. Die filtrierte Lösung hatte
ein Volumen von 48o ccm -und zeigte eine Wirksamkeit
von
26 400P9 je Kubikzentimeter. Nach Zusatz von 50 g Natriumchlorid
und 300 ccm feuchten Butanols wurde die Mischung kräftig geschüttelt. Der
ausgefällte Stoff wurde abfiltriert und in 150 ccm Methanol gelöst. Die Methanollösung
zeigte eine Wirksamkeit von 31 000 ug je Kubikzentimeter. Nach Zusatz
von 5 ccm Wasser begann das Antibiotikum auszukristallisieren. Es wurden
weitere 2o ccm Wasser hinzugegeben, worauf die Mischung über Nacht in einem Kühlschrank
aufbewahrt wurde. Das Produkt wurde abfiltriert und getrocknet. Ausbeute
5,8 g. Es zeigte eine Wirksamkeit von 86oug j e Milligramm.
7. Herstellung des kristallinen Antibiotikums durch Gegenstromverteilung
Amorphes Antibiotikum mit dem Wirksamkeitswert 640 ßg je Milligramm wurde
in Wasser, das mit Salzsäure auf den prWert von etwa 3 gebracht war, gelöst.
Die Lösung wurde mit Butanol gesättigt und dann einer Gegenstromverteilung mit neun
Scheidetrichtern unterworfen, wobei gleiche Volumen feuchten Butanols und verdünnter,
butanolgesättigter Salzsäure (P, = 3) verwendet wurden. Alle wäßrigen und
Butanolschichten wurden auf ihre Wirksamkeit geprüft, und die wäßrigen Schichten
der Trichter 6 und 7
herausgenommen. Sie wurden vereinigt und im Vakuum
auf ein kleines Volumen eingeengt. Die sich abscheidenden weißen Kristalle wurden
zentrifugiert und nacheinander mit Wasser, Aceton und Äther gewaschen. Das getrocknete
Produkt zeigte eine Wirksarrikeit von 954,ug je Milligramm. 8. Darstellung
des salzsauren Salzes des Antibiotikums Das Antibiotikum beliebigen Reinheitsgrades
kann dadurch in das salzsaure Salz umgewandelt werden, daß es in Wasser mit Salzsäure
so lange behandelt wird, bis eine klare Lösung entsteht. Darauf wird der p"-Wert
der Lösung auf annähernd 2,5 eingestellt. Die Lösung wird gefroren und im
Vakuum zu einem leichtlöslichen Pulver eingetrocknet.
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Das Röntgenstrahlenbeugungsbild des gepulverten kristallinen salzsauren
Antibiotikums wurde in einer Philipskamera mit 57,3 mm Radius unter Venvendung
von Kupfer K a-Strahlung bestimmt.
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Im folgenden sind die ungefähren Gitterkonstanten
(d in Ängströmeinheiten),
wie sie sich aus den stärkeren der auf einem photographischen Film aufgezeichneten
Linien errechnen, und deren ungefähre relative Intensität I wiedergegeben, wobei
die stärkste Linie mit i,oo bewertet wurde;
| I d in |
| A-Einheiten |
| 019 10,32 |
| 0,8 9139 |
| 0,6 8,30 |
| 0,2 5,26 |
| ]:,0 4J9 |
| 0,5 3,92 |
| 0,2 3,20 |
g. Herstellung des Natriumsalzes des Antibiotikums Das Antibiotikum beliebigen Reinheitsgrades
kann dadurch in sein Natriumsalz umgewandelt werden, daß es in Wasser mit Natriumhydroxyd
behandelt wird, bis sein PH-Wert
9,5 übersteigt. Die Lösung wird dann gefroren
und im Vakuum zu einem wasserlöslichen Pulver, dem trockenen Natriumsalz, eingetrocknet.
-
Es wird darauf hingewiesen, daß in den vorstehenden Beispielen die
Zusammensetzungen der Kulturflüssigkeiten nur zur Erläuterung dienen und in verhältnismäßig
weiten Grenzen geändert werden können. So kann z. B. das Sojabohnenmehl durch Milcheiweiß,
Leinsamenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Maisprotein, Weizenkleber u. a. ersetzt
werden. Gleicherweise können die Bedingungen des Gärverfahrens, wie z. B. Rühren,
Belüftungsgrad, Temperatur, in erheblichem Umfang variiert werden. Weiterhin können
viele andere, dem Fachmann geläufige Verfahren zur Gewinnung, Konzentrierung und
Reinigung des Antibiotikums und seiner Salze verwendet werden. Zum Beispiel könnte
ein anderes Gewirmungsverfahren darin bestehen, daß das Antibiotikum direkt aus
der Gärbrühe mittels eines Ionenaustauschharzes adsorbiert wird. Ebenso wie Aureomycin
und Chloramphenicol ist das neue Antibiotikum sowohl im Kolben als auch am lebenden
Objekt wirksära und zeigt deutliche chemotherapeutische Wirksamkeit gegen experimentelle
Infektion von Mäusen mittels Streptococcus hemolyticus, D. pneumoniae,
X. pneumoniae, S. typhosa und anderen Organismen. Das neue Antibiotikum
zeigt deutliche antirachitische Wirksamkeit irn embryohaltigen Rühnerei und verhindert
in hohen Konzentrationen die Infektion des Hühnerembryos mit dem PR-8-Stanun des
Influenza-A-Virus.
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Das neue Antibiotikum ist, wie aus obenstehendem ersichtlich, besonders
wertvoll in der Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten des Menschen und
der Tiere. Es kann durch parenterale Injektion, oral oder örtlich in den üblichen
Dosierungen verabfolgt werden.