DD202452A5

DD202452A5 - Verfahren zur herstellung von makroliden

Info

Publication number: DD202452A5
Application number: DD81231807A
Authority: DD
Inventors: Richard H Baltz; Gene M Wild; Eugene T Seno
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-07-24
Filing date: 1981-07-15
Publication date: 1983-09-14
Also published as: RO81671B; DK313081A; ES8206622A1; KR840001193B1; HU189519B; IE811581L; EP0045157B1; EP0045157A1; IL63312A0; GR74509B; CS228512B2; PT73370B; GB2080798A; FI812209L; PT73370A; PL232190A1; PH18089A; IE51619B1; GB2080798B; RO81671A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen und antibiotisch wirksamen Makroliden, naemlich 2'''-O-Demethylmacrocin, 20-Dihydro-2'''-O-demethylmacrocin, 2'''-De-O-methylactenocin oder 20-Dihydro-2'''-de-O-methylactenocin sowie ihren Salzen oder Estern durch Zuechtung eines Stammes von Streptomyces fradiae, insbesondere von Streptomyces fradiae ATCC 31669, unter submersen aeroben Bedingungen unter Bildung des jeweils gewuenschten Antibiotikums, mit der Massgabe, dass man diese Zuechtung, falls eine in Stellung 4' hydroxylsubstituierte Verbindung hergestellt werden soll, naemlich 2'''-De-O-methylactenocin oder 20-Dihydro-2'''-de-O-methylactenocin, unter Anwendung schwach saurer Bedingungen durchfuehrt, und aus den jeweils erhaltenen Verbindungen dann die gewuenschten Salze oder Ester durch entsprechende Ansaeuerung oder Veresterung bildet. Die hierdurch erhaltenen Makrolide stellen wertvolle Antibiotika dar, und sie aehneln in ihrem Wirkungsspektrum dem als Therapeutikum bekannten Tylosin. Sie eignen sich daher in erster Linie zur Behandlung grampositiver Mikroorganismen sowie von Arten von Mycoplasma.

Description

Verfahren zur Herstellung von Makroliden Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makroliden, die wertvolle Arzneimittel sind und sich vor allem durch eine besonders interessante antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Die vorliegenden Makrolide ähneln in ihrer Struktur dem als therapeutisches Mittel bekannten Tylosin, das beispielsweise in Tetrahedron Letters 2339 (1970) beschrieben

wird. Tylosin stellt ein sehr bedeutendes Antibiotikum dar. Unabhängig davon besteht jedoch stets die Notwendigkeit zur Entwicklung neuer Antibiotika, und zwar unter anderem allein schon infolge der Möglichkeit der Bildung resistenter Stämme im Laufe der Zeit. Weiter können auch entsprechende Strukturabwandlungen zu Veränderungen im · Spektrum suszeptibler Mikroorganismen führen« Eine chemische Abwandlung der Struktur tylosinähnlicher Makrolide hat sich nun leider jedoch als äußerst schwierig·erwiesen. In J. Org. Chem. 44 (12), 2050 bis 2052 (1979) werden beispielsweise die Probleme angesprochen, die bei der Spaltung der Mycinosylglycosidbindung von Tylosin durch chemische Mittel auftreten. Das Hauptaugenmerk der entsprechenden Forschungsarbeiten,mit dem Ziel der,Schaffung und Untersuchung.neuer Strukturen ist daher auf neue, in der Natur: vorkommende oder synthetische· Mikroorganismen mit der Hoffnung gerichtet, daß sich'durch deren Züchtung mit Tylosin verwandte und. wirkungsmäßig interessante Strukturen ergeben.

Aufgabe der Erfindung:

Infolge der interessanten Wirksamkeit von Tylosin und des oben angesprochenen ständigen Bedarfs an neuen Antibiotika wegen der sich im Laufe der Zeit ergebenden Resistenzbildung hat sich die Erfindung nun die Aufgabe gestellt, antibiotisch wirksame und tylosinähnliche Mäkrolide zu schaffen, die sich durch eine besonders interessante pharmakologische Wirksamkeit, und vor allem eine wertvolle antibiotische Wirksamkeit, auszeichnen.

Darlegung" des' Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird, erfindungsgemäß nun gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirksamer Makrolide, die dem Tylosin ähnlich sind, dessen Mycinosylbau-

2 318 0 7

stein jedoch nicht enthalten, und die sich durch submerse aerobe Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces fradiae herstellen lassen.

Im einzelnen wir die obige Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren.zur Herstellung eines neuen Makrolids der allgemeinen Formel. I .

ho-*:*

worin Q für -CHO oder -GH₂OH steht und Y Hydroxyl oder eine Mycarosyloxygruppe bedeutet,

oder eines Salzes oder Esters hiervon. .

Zu den Verbindungen der obigen allgemeinen Formel I gehören 2'''-O-Demethylmacrocin, das im folgenden als Demethylmacrocin oder DOMM bezeichnet wird und die Strukturformel II hat

2 3 1 ö U

HsC

> CHa >.

ao (II)

:*-0-CHa-f >' ν

_a4_v · ³i-0H ? Y^r·

vlv ' ^[

VSv

das Dihydroderivat von DOMM, nämlich 20-Dihydro-2'''-0-demethylmacrocin, das im folgenden als Dihydro-DOMM bezeichnet wird und die Strukturformel III hat

- CHa-CHaOH

HaC. - ji ι

V—η Ji. CH₃ i (HD

HO-K ,•-O-CHaM Ψ \

ψ ψ

Ah Ah vjv αλ η . r

^e-N-CHs CHa · ^ ρ

das 2'·'-De-O-methylactenocin,. welches abgekürzt als DOML bezeichnet wird und die Strukturformel IV besitzt

I i I Ö U / ]

• 10 af—<-

Ii I

(IV)

und 20-Dihydro-2'''-de-O-methylactenocin, das im folgenden als Dihydro-DOML bezeichnet wird und die Strukturformel V aufweist

f-CHs

K0-<

Ii

ns

(V)

»-o-aw

Π VTv

y QH i I

OH

sowie Salze und Ester der obigen Verbindungen.

Die Stereochemie der vorliegenden Verbindungen ist identisch mit der Stereochemie des bekannten Makrolids Tylosin, wozu beispielsweise auf Tetrahedron Letters 4737 (1970) verwiesen wird. Der Aminozucker ist Mycaminose, während der an der linken Seite befindliche Neutralzucker 6-Deoxy-D-allose ist und der Neutralzucker in den Strukturen (II) und (III) Mycarose bedeutet.

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Die Hydroxylgruppen von DOMM und Dihydro-DOMM, nämlich die in den Stellungen 2' , 4", 3", 2'", 3 ^r ' ' , 4' " und 3 befindlichen Hydroxylgruppen, lassen sich verestern, wodurch wertvolle Acylesterderivate gebildet werden. Ferner können auch die in den Stellungen 2 ^f, 4', 2' ' ·, 3 ' · ' , 4'" und 3 befindlichen Hydroxylgruppen von DOML und Dihydro-DOML verestert werden, wodurch ebenfalls wertvolle Acylesterderivate entstehen. Schließlich kann man auch Dihydro-DOMM und Dihydro-DOML an der in Stellung 20 vorhandenen Hydroxylgruppe verestern. Die in Stellung 2¹ befindliche Hydroxylgruppe von DOMM und Dihydro-DOMM kann leicht verestert werden- Ebenfalls lassen sich auch die in den Stellungen 2' und 4¹ befindlichen Hydroxylgruppen von DOML und Dihydro-DOML leicht verestern. Beispiele für derartige Ester sind die Ester von Monocarbonsäuren oder die Halbester von Dicarbonsäuren mit jeweils 2 bis 18 Kohlenstoff atomen.~

Bei DOMM, Dihydro-DOMM, DOML, Dihydro-DOML und ihren Acylesterderivaten handelt es sich um basische Verbindungen, die sich durch Behandlung mit Säuren in Säureadditionssalze überführen lassen. Solche Säureadditionssalze gehören ebenfalls zur Erfindung. Wird im folgenden daher von DOMM-Verbindungen gesprochen, dann versteht man hierunter DOMM, Dihydro-DOMM, DOML₇ Dihydro-DOML, ein bestimmtes Acylesterderivat dieser Verbindungen oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz von DOMM, Dihydro-DOMM, DOML, Dihydro-DOML oder einem Acylesterderivat hiervon.

Die vorliegenden neuen Makrolide der obenerwähnten allgemeinen Formel (I) lassen sich herstellen, indem man einen Stamm von Streptomyces fradiae unter submersen aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität und Erzeugung des gewünschten Makrolids züchtet, mit der Maßgabe, daß man die Züchtung zur Herstellung von

7 - £ O I O U /

Verbindungen der Formeln' (IV) oder' (V) vorzugsweise unter schwach sauren Bedingungen durchführt.

Der beim vorliegenden Verfahren bevorzugt zu verwendende Mikroorganismus ist Streptomyces fradiae ATCC 31669. Dieser Mikroorganismus ist in der ständigen Kulturensammlung von American Type Culture Collection hinterlegt und kann von'dort unter der Nummer ATCC 31669 frei bezogen werden.

DOMM i.st löslich in Wasser und den meisten polaren organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Methanol, Ethanol, Chloroform, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Die Säureadditionssalze von DOMM sind in Wasser besser löslich. als die. Base von DOMM.

DOMM läßt sich von Tylosin durch Papierchromatographie und durch Dünnschichtchromatographie unterscheiden. Die ungefähren Rf-Werte und Rx-Werte von DOMM sowie von TyIosin gehen aus den folgenden Tabellen I und II hervor, Der in Tabelle II angegebene Rx-Wert stellt das Verhältnis der Bewegung im Verhältnis zur Bewegung des Tylosins dar, welchem der Wert'1,0 zugeordnet wird. Die Detektion erfolgt bioautographisch unter Verwendung von Bacillus subtilis.

2 318 0

•Tabelle I

Dünnschichtchrömätögräphie'. von DOMM^a

	A^b	Rf-Wert	0	C
	,53'	B	0	,67
0	,05	0,53		,44
0	0,44

Verbindung

Tylosin DOMM

^aMedium: Silicagel 60 von Merck, Darmstadt

Lösungsmittel: A = Ethylacetat:Diethylamin (96:4)

B = Aceton:Ethanol (2:1) C = Chloroform:Methanol (3:1)

Tabelle II Papierchromatographie von DOMM^a

Rx-Wert

Verbindung D E

Tylosin 1,0 1,0

DOMM 0,17 0,88

^aPapier: Whatman No. 1, mit 0,75 m KH₃PO₄-PuIfer bei pH 4,0 behandelt und getrocknet

Lösungsmittel: D = Mit Wasser gesättigtes Ethylacetat

E = Mit Wasser gesättigtes n-Butanol

- 9 - £Ji ÖU/

Das Dihydroderivat von DOMM läßt sich durch chemische Reduktion oder durch Fermentation herstellen. Die Herstellung von Dihydro-DOMM durch chemische Reduktion erfolgt in bekannter Weise, beispielsweise durch Behandlung von DOMM mit einer etwa stöchiometrischen Menge Natriumborhydrid in einem alkoholischen Lösungsmittel. Dihydro-DOMM wird ferner auch durch den vorliegenden Mikroorganismus Streptomyces fradiae ATCC 31669 unter gesteuerten Fermentationsbedingungen produziert.

Zur Erfindung gehören weiter auch Verfahren zur Herstellung von DOML und Dihydro-DOML durch schwach saure Hydrolyse von DOMM und Dihydro-DOMM. Dihydro-DOML kann auch hergestellt werden, indem man (1) DOMM durch schwach saure Hydrolyse in DOML überführt und (2) dieses DOML dann zu Dihydro-DOML reduziert. Die hierbei anzuwendenden schwach sauren Hydrolysebedingungen sind bekannt. Zur Durchführung dieser Hydrolyse können entsprechende wäßrige Lösungen mit einem pH-Wert von etwa 4 oder darunter verwendet werden. Es kann bei Temperaturen von etwa 20 bis 100⁰C gearbeitet werden. Die zur Durchführung dieser Hydrolyse erforderliche ümsetzungszeit ist abhängig vom pH-Wert des Reaktionsgemisches und der jeweiligen Arbeitstemperatur= Bei höheren pH-Werten läuft die Umsetzung langsamer, während sie bei höheren Temperaturen rascher abläuft. Bei einem pH-Wert von 2 und einem Arbeiten bei Raumtemperatur ist eine ümsetzungszeit von etwa 6 bis 24 Stunden erforderlich. Zur Durchführung dieser Reaktion behandelt man entweder DOMM oder Dihydro-DOMM solange mit einer schwach sauren Lösung, daß es zu einer Entfernung der Mycarosylgruppe unter Bildung von DOML oder Dihydro-DOML kommt.

Wahlweise und gelegentlich auch vorzugsweise kann man DOML oder Dihydro-DOML herstellen, indem man DOMM oder Dihydro-DOMM in der Fermentationsbrühe, in welcher sie gebildet werden, unter Anwendung schwach saurer Bedingungen der oben

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beschriebenen Art. solange behandelt, daß es hierdurch zu einer Umwandlung von DOMM oder Dihydro-DOMM in DOML oder Dihydro-DOML kommt. Das auf diese Weise erzeugte DOML oder Dihydro-DOML läßt sich aus der Fermentationsbrühe durch Anwendung bekannter Techniken isolieren.

DOMM und Dihydro-DOMM können in ihren Stellungen 2', 4", 3", 2^f'', 3¹'', 4'" und 3 durch übliche Behandlung mit Acylierungsmitteln verestert und hierdurch in die entsprechenden Acylesterderivate überführt werden. In ähnlicher Weise kann man auch DOML und Dihydro-DOML an den in den Stellungen 2', 4' , 2 ' ' ' , 3¹¹¹, 4^Ift und 3 befindlichen

Hydroxylgruppen verestern. Ferner kann man auch die Steiges

lung 20 von Dihydro-DOMM und Dihydro-DOML verestern. Am einfachsten verläuft die Veresterung der in Stellung 2' befindlichen Hydroxylgruppe von DOMM und Dihydro-DOMM. Leicht lassen sich auch die in den Stellungen 2' und 4' befindlichen Hydroxylgruppen von DOML und Dihydro-DOML verestern. Zu hierfür geeigneten Acylierungsmitteln gehören beispielsweise Anhydride, Halogenide (gewöhnlich in Kombination mit einer Base oder einem anderen Säurefänger) und aktive Ester organischer Säuren. Ferner lassen sich solche Äcylierungen auch unter Einsatz eines Gemisches einer organischen Säure und einem Dehydratisierungsmittel erreichen, wie NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid. Weiter können derartige Äcylierungen auch enzymatisch durchgeführt werden, wie dies beispielsweise aus US-PS 4 092 473 hervorgeht. Die entsprechenden Acylderivate können nach ihrer Bildung in bekannter Weise abgetrennt und gereinigt werden.

Die 2'-Monoesterderivate von DOMM und Dihydro-DOMM lassen sich durch allgemein bekannte selektive Veresterungstechniken herstellen, beispielsweise durch Behandlung des Antibiotikums mit einer stöchiometrischen Menge (oder einer leicht überschüssigen Menge) eines Acylierungsmittels, wie eines Acylanhydrids, bei etwa 0⁰C bis Raumtemperatur über eine Zeitdauer

I ά I ö U /

von etwa 1 bis 24 Stunden bis zur praktischen Beendigung der Veresterung. Der erhaltene 2'-Monoester läßt sich aus dem Reaktionsgemisch durch übliche. Verfahren isolieren, beispielsweise durch Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation.

Brauchbare Acylester sind- solche organischer Säuren unter Einschluß aliphatischen cycloaliphatischer, arylischer, aralkylischer oder heterocyclischer Carbonsäuren, Sulfonsäuren und Alkoxycarbonsäuren, die jeweils 2 bis 18 Kohlenstoff atome enthalten, sowie anorganische Säuren, wie Schwefelsäure oder Phosphorsäure.

Zu Beispielen für geeignete Ester gehören Ester von Säuren, wie Essigsäure, Chloressigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isovaleriansäure, Alkoxycarbonsäure, Stearinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Cyclohexancarbonsäuren ß-Cyclohexylpropionsäure, 1-Ädamanty!carbonsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure, Mandelsäure oder 2-Thienylessigsäure, von Alkylsulfonsäuren, Arylsulfonsäuren oder Aralky!sulfonsäuren, wobei die Arylsulfonsäuren und Aralkylsulfonsäuren an ihrem aromatischen Rest gegebenenfalls-Substituenten enthalten können, wie Halogen, Nitro oder Niederalkoxy. Zu geeigneten Estern gehören ferner auch die Halbester von Dicarbonsäuren, wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Malonsäure oder Phthalsäure.

Pharmazeutisch unbedenkliche Esterderivate werden bevorzugt, nämlich Ester, die gegenüber den damit zu behandelnden warmblütigen Tieren keinerlei wesentliche toxische Effekte aufweisen. Es sind jedoch auch andere Esterderivate geeignet, wenn auch nur als Zwischenprodukte.

DOMM, Dihydro-DOMM, DOML, Dihydro-DOML und die angegebenen Derivate bilden ferner auch Säureadditionssalze. Die Säure-

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additionssalze von DOMM, Dihydro-DOMM, DOML, Dihydro-DOML und ihren" Acylderivateri gehören ebenfalls zur Erfindung. Solche Säureadditionssalze eignen sich beispielsweise zur Abtrennung, Reinigung und Kristallisation von DOMM, Dihydro- DOMM _r DOML, Dihydro-DOML und ihren Acylderivaten. Darüber hinaus verfügen diese Salze auch über eine bessere Löslichkeit in Wasser=

Beispiele für geeignete Salze sind solche, die durch übliche Reaktion sowohl mit organischen Säuren als auch mit anorganischen Säuren gebildet werden, beispielsweise mit Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Muconsäure, D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glykoisäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure,.Methansulfonsäure, Benzolsulf onsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure.

Pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze sind eine besonders bevorzugte Gruppe erfindungsgemäßer Salze. Hierunter werden Salze verstanden, die so wenig toxisch sind, daß sie sich zur chemotherapeutxschen Behandlung von Bakterieninfektionen bei warmblütigen Tieren verwenden lassen.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen werden gewöhnlich in.. Form veterinärmedizinischer Formulierungen verabreicht, indem man sie in herkömmliche Hilfsmittel und Trägermittel einarbeitet, nämlich pharmazeutisch unbedenkliche organische oder anorganische Trägersubstanzen, die. sich enteral, parenteral oder topisch anwenden lassen und die die Wirkstoffe nicht durch Reaktion zerstören.

Zu Beispielen für pharmazeutisch unbedenkliche Träger gehören unter anderem Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Pflan-

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zenöle, Polyethylenglykole,- Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talkum, Kieselsäure, Paraffine, Parfümöl, Fettsäuremonoglyceride, Fettsäurediglyceride oder Hydroxymethylcellulose. Die jeweiligen pharmazeutischen Zubereitungen können sterilisiert und gegebenenfalls auch noch mit Hilfsmitteln vermischt sein, wie Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Netzmitteln, Emulgatoren, Puffern, Farbstoffen oder Aromen, die mit dem jeweiligen Wirkstoff nicht in schädlicher Weise reagieren.

Die vorliegenden Verbindungen können ferner auch in Futterzusätze eingearbeitet werden, beispielsweise in ein Futtervorgemisch.

Zur Erfindung gehört daher weiter auch eine veterinärmedizinische Formulierung aus einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Hilfsmittel und einem Wirkstoff, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als Wirkstoff 0,1 bis 90 Gew.-% einer Verbindung der obigen Formel (I) oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes oder Esters hiervon enthält.

Durch die Erfindung werd entferner- auch Verfahren zur Herstellung von 5-0-Mycaminosyltylonolid (OMT) und 20-Dihydro-5-0-mycaminosyltylonolid (Dihydro-OMT) bereitgestellt. OMT und Dihydro-OMT werden in US-PS 3 4 59 853 beschrieben. Die Herstellung von OMT und Dihydro-OMT erfolgt gemäß US-PS 3 459 853, indem man von Tylosin, Desmycosin, Macrocin, Lactenocin oder Dihydroderivaten hiervon die Neutralzucker durch gesteuerte saure Hydrolyse entfernt. Erfindungsgemäß werden nun neue Ausgangsmaterialien bereitgestellt, .aus denen sich OMT und Dihydro-OMT herstellen lassen. Durch Umsetzung von DOMM und DOML nach dem in US-PS 3 459 853 beschriebenen Verfahren gelangt man so beispielsweise zu OMT₇ während sich durch entsprechende Reaktion von Dihydro-DOMM

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und Dihydro-DOML Dihydro-OMT herstellen läßt.

Die Erzeugung von DOMM und Dihydro-DOMM erfolgt durch Züchtung eines diese Verbindungen produzierenden Stammes von Streptomyces fradiae unter submersen aeroben Bedingungen

in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität,. Hierbei wird natürlich DOMM zuerst gebildet. Das Dihydro-DOMM entsteht dann, wenn die Fermentation über eine längere Zeitdauer durchgeführt wird, so daß es zu einer enzymatischen Reduktion des vorhandenen DOMM kommen kann.

Zum Wachsenlassen von Streptomyces fradiae ATCC 31669 kann man irgendeines der verschiedenen Kulturmedien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen. Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des gewünschten Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Zu bevorzugten Kohlenstoffquellen für eine großtechnische; Fermentation gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie Dextrin,- Glucose^ Stärke oder-Maismehl ν oder auch öle, wie Sojabohnenöl. Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maismehl, Sojabohnenmehl, Fischmehl oder Aminosäuren. Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien einverleibt sein können, gehören die üblichen löslichen Salze, welche beispielsweise Ionen von Eisen, Ka-^ 1ium, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat oder Nitrat liefern.

Im Kulturmedium sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erforderlich sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in so hoher Menge vor,wie sie für ein Wachsen des Mikroorganismus, benötigt werden. Besteht das Problem einer zu starken Schaumbildung, dann kann der Zusatz kleiner Mengen (nämlich Mengen von etwa

0,2 ml/1) eines Antischaummittels, .wie Polypropylenglykol (mit einem Molekulargewicht von etwa 2000) zu großtechnischen Fermentationsmedien notwendig sein.

Zur Bildung wesentlicher Mengen an DOMM oder Dihydro-DOMM wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen an DOMM oder Dihydro-DOMM lassen sich auch durch Züchtung in Schüttelkolben herstellen. Infolge der verzögerten Produktion des Antibiotikums bei einer Beimpfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus wird vorzugsweise ein vegetatives Impfgut verwendet. Die Herstellung eines solchen vegetativen Inoculums erfolgt durch Beimpfen eines kleinen Volumens an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das hierdurch erhaltene vegetative Inoculum wird dann in einen größeren Tank übertragen. Das für das vegetative Inoculum verwendete Medium kann das gleiche sein, wie es auch für größere Fermentationen eingesetzt wird, es lassen sich hierfür jedoch auch andere Medien verwenden.

Streptomyces fradiae ATCC 31669 kann bei Temperaturen

zwischen etwa 10 und 37⁰C wachsen. Zu einer optimalen Bildung an Antibiotikum scheint es bei einer Temperatur von etwa 28⁰C zu kommen.

Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird auch beim vorliegenden Verfahren durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Für eine entsprechend wirksame Bildung an Antibiotikum soll die prozentuale Luftsättigung bei einer Tankproduktion etwa 30 % oder darüber betragen (bei 28°C und 1 bar Druck).

Die Bildung des Antibiotikums läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe gegenüber Or-

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ganismen untersucht, von denen man weiß, daß sie auf diese Antibiotika ansprechen. Ein hierzu brauchbarer Versuchsorganismus ist Staphylococcus aureus ATCC 9144. Der Bioversuch wird normalerweise durch eine automatische turbidometrische Methode durchgeführt. Darüber hinaus läßt sich die Bildung an Antibiotikum auch ohne weiteres durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter UV-Detektion überwachen. Hierzu wird beispielsweise hingewiesen auf J. Chromatographie Science 16, 492 bis 495 (1978).

Nach erfolgter Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man das DOMM oder Dihydro-DOMM unter Anwendung von in der Fermentationstechnik üblichen Methoden aus dem Fermentationsmedium gewinnen. Der Gewinnung von DOMM oder Dihydro-DOMM geht eine anfängliche Filtration der Fermentationsbrühe voran. Die hierdurch erhaltene filtrierte"Brühe läßt sich dann gewünschtenfalls weiter reinigen, wodurch man zum gewünschten Antibiotikum gelangt. Diese Reinigung kann unter Anwendung der verschiedensten Techniken durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren für die filtrierte Brühe besteht darin, daß man den pH-Wert der Brühe auf etwa 9 einstellt, die Brühe mit einem geeigneten, Lösungsmittel extrahiert, wie Ethylacetat, Amylacetat oder Methylisobuty!keton, die organische Schicht mit einer wäßrigen sauren Lösung extrahiert und das Antibiotikum dann durch Basischstellen des wäßrigen Extrakts ausfällt. Das hierdurch erhaltene Antibiotikum kann gewünschtenfalls durch Extraktion, Adsorption und/oder Kristallisation weiter gereinigt werden.

Die Eigenschaften von Streptomyces fradiae ATCC 31669 sind genauso wie diejenigen anderer Mikroorganismen einer Variation zugänglich. So lassen sich beispielsweise unter Anwendung der verschiedensten bekannten physikalischen und chemischen mutagerien Mittel, wie Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitro-

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soguanidin künstliche Varianten oder Mutanten des Stammes ATCC 31669 herstellen. Alle natürlichen oder künstlichen Varianten, Mutanten oder Rekombinanten von Streptomyces fradiae ATCC 31669, die ihre Eigenschaft zur Bildung von DOMM beibehalten, können erfindungsgemäß verwendet werden.

Die DOMM-Verbindungen hemmen das Wachstum pathogener Bakterien, insbesondere grampositiver Bakterien und Arten von Mycoplasma.

Die vorliegend erhältlichen neuen Verbindungen hemmen das Wachstum von Mikroorganismen, so daß sie sich beispielsweise zur Verhinderung, Bekämpfung oder Behandlung mikrobieller Infektionen verwenden lassen, und zwar insbesondere von Infektionen, die durch grampositive Bakterien sowie durch Arten von Mycoplasma hervorgerufen werden.

Aus der folgenden Tabelle III gehen entsprechende Werte für die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC-Werte) hervor, gemessen durch die üblichen Agar-Verdünnungs-Versuche, in denen DOMM (freie Base) bestimmte Bakterien hemmt.

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Tabelle III Wirksamkeit' der freien Base von DOMM" in vitro Organismus MIC-Werte

Streptococcus pyogenes C203 0,25

Streptococcus pneumoniae Park I ^l 0,25

Streptococcus sp. (Gruppe D) 282 4,0

Pasteurella multocida 12,5

Pasteurella hemolytica 50,0

Mycoplasma gallisepticum 0,78

Mycoplasma hyopneumoniae 0,78

Mycoplasma hyorhinis 3,12

Die DOMM-Verbindungen haben sich auch in vivo gegenüber experimentellen Bakterieninfektionen als antimikrobiell wirksam erwiesen. Zu diesem Zweck verabreicht man Mäusen mit experimentell hervorgerufenen Infektionen zwei Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung und ermittelt die sich hierdurch ergebende Wirksamkeit in Form des jeweiligen EDcQ-Wertes (wirksame Dosis in mg/kg, die einen 50 %-igen Schutz der untersuchten Tiere ergibt (J. Bacteriol. 81, 233 bis 235 (1961))). Die hierbei für DOMM erhaltenen gehen aus der folgenden Tabelle IV hervor.

	Heraus- LD )	Subkutane ED_cn-	Tabelle IV	χ 2)
		Streptococcus pyogenes C203	-Werte von DOMM (mg/kg	Staphylococcus aureus 3055
Verbindung	1/1 133	Streptococcus pneumoniäe Park I	3,8 139
DOMM Bakterielle förderung (x	37,5 41,2

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Ausführuriqsbeispiele :

Die Erfindung wird im folgenden anhand, von Beispielen weiter erläutert.

Beispiel 1 ^A- Schuttelkolbenfermentation von DOMM

Ein lyophilisiertes Pellet von Streptomyces fradiae ATCC 31669 wird in 1 bis 2 ml sterilem Wasser dispergiert. Mit einer Teilmenge der hierdurch erhaltenen Lösung (0,5 ml) beimpft man dann ein vegetatives Medium (150 ml) folgender Zusammensetzung:

Bestandteile - Menge (%)

Maisquellwasser 1,0

Hefeextrakt 0,5

Sojabohnenschrot 0,5

CaCO₃ 0,3

Sojabohnenöl (roh) 0,45

Deionisiertes Wasser ' " 97,25

Statt dessen kann man auch eine in. flüssigem Stickstoff aufbewahrte vegetative Kultur von Streptomyces fradiae ATCC 31669 in jeweils einem Volumen von 1 ml verwenden, rasch auftauen und zum Beimpfen des vegetativen Mediums einsetzen. Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei 29⁰C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden in einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.

3 1 ÖU / S

Mit dem hierdurch erhaltenen bebrüteten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 7 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Rübenmelasse 2,0

Maismehl 1 ,5

Fischmehl 0,9

Maisgluten 0,9

NaCl 0,1

'(NH₄V₂HPO₄ 0,04

CaCO₃ 0,2

Sojabohnenöl (roh) 3,0

Deionisiertes Wasser 91,36

Das inokulierte Fermentationsmedium wird in einem 50 ml fassenden Kolben bei 29°C über eine Zeitdauer von etwa 6 Tagen auf einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.

B. Tankfermentation von DQMM

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inoculum verwen- · det man 60 ml des inkubierten vegetativen Mediums, das in ähnlicher Weise wie oben unter A. beschrieben hergestellt wird, zum Beimpfen von 40 1 eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe mit folgender Zusammensetzung:

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Bestandteile Menge (%]

Maisquellwasser 1,0

Sojabohnenmehl 0,5

Hefeextrakt 0,5

CaCO₃ 0,3

Sojabohnenöl (roh) 0,5

Lecithin (roh) 0,015

Wasser 97,185

Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt.

Das vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 68 1 fassenden Tank etwa 40 Stunden bei 29°C unter ausreichender Belüftung und Rührung bebrütet.

Mit dem auf diese Weise erzeugten inkubierten Medium der zweiten Stufe (4 1) beimpft man dann 44 1 steriles Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Fischmehl 0,875

Maismehl . 1,5

Maisgluten 0,875

CaCO₃ 0,2

NaCl 0,1

(NH₄)2^HPO4 0,04

Rübenmelasse 2,0

Sojabohnenöl(roh) 3,0

Lecithin 0,09

Wasser 91,32

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Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 7,2 eingestellt.

Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 68 1 fassenden Tank etwa 4 Tage bei 28⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird derart mit steriler Luft belüftet, daß die Menge an gelöstem Sauerstoff zwischen etwa 30 und 50 % bleibt, und es wird mittels herkömmlicher Rührer bei einer Geschwindigkeit von etwa 250 UpM gerührt.

Beispiel 2 Isolierung von DOMM

Die nach Beispiel 1 erhaltene geerntete Gesamtbrühe (38 1) wird mittels einer Filterhilfe filtriert. Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen und das Waschwasser zum FiI-trat gegeben.

Der pH-Wert des Filtrats wird mit 25 %-iger wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 9,1 eingestellt, worauf man das Filtrat mit Ethylacetat (9 1 und 5 1) extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird mit deionisiertem Wasser (3500 ml) versetzt. Sodann wird der pH-Wert dieser Lösung unter Verwendung einer 28 %-igen Phosphorsäurelösung (2 Teile Wasser auf 1 Teil konzentrierte Phosphorsäure) auf etwa 4,1 eingestellt. Nach erfolgter Extraktion wird die wäßrige Schicht abgetrennt. Der Ethylacetatextrakt wird erneut mit Wasser (3500 ml) unter Anwendung des gleichen Verfahrens extrahiert. Die beiden wäßrigen Extrakte werden vereinigt.

Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden mit Natriumhyr· droxid auf pH 8,5 eingestellt und zweimal mit Chloroform (3000 ml und 1200 ml) extrahiert. Die Chloroformextrakte werden unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu etwa 40 g

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roher Base von DOMM gelangt. Diese Base von DOMM wird durch Kristallisation aus Wasser-Aceton gereinigt, wodurch man zu etwa 30 g Base von DOMM gelangt.

DOMM stellt einen weißen Feststoff dar, der aus Aceton-Wasser kristallsiert. DOMM erweicht bei etwa 135 bis 140⁰C und schmilzt vollständig bei etwa 160⁰C. Eine Elementaranalyse von DOMM ergibt folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff = 59,5 %, Wasserstoff = 8 %, Stickstoff = 2 %, Sauerstoff = 30,5 %. DOMM hat eine empirische Formel von C..H₇₃NO₁₇ und ein Molekulargewicht von etwa 888 (887 durch Massenspektrometrie bestimmt).

Das Infrarotspektrum der freien Base von DOMM in Chloroform geht aus der beiliegenden Zeichnung hervor. Es lassen sich Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm ) beobachten: 3679 (schmal), 3604 (Schulter), 3486 (breit), 3012 (Schulter), 2979 (stark), 2938 (stark), 2880 (Schulter) , 2821 (Schulter), 2794 (sehr schmal), 2735 (sehr schmal), 1723 (stark), 1678 (mittel), 1627 (schmal),, 1593 (stark), 1477 (Schulter), 1459 . (mittel), 1409 (mittel), 1373 (mittel), 1333 (Schulter), 1316 (mittel), 1273 (schnal), 1183 (Schulter), 1161 (stark), 1114 (mittel), 1080 (stark), 1048 (stark), 1013 (mittel), 996 (mittel), 984 (Schulter), 960 (Schulter), 924 (sehr schmal), 902 (schmal), 865 (sehr schmal) und 841 (schmal).

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von DOMM in neutralem Ethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 283 nm (£= 22,550).

Die freie Base von DOMM hat folgenden spezifischen Drehwert :

/~OC7?⁵ = -39,69°" (C= 1, CH-OH).

231807 1

Eine elektrometrische Titration von DOMM in 66 %-igem wäßrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit. einem pK -Wert von etwa 7,14.

3.

Beispiel 3 Herstellung von DOML

Das nach Beispiel 2 hergestellte DOMM wird in verdünnter Chlorwasserstoffsäurelösung gelöst (Zugabe von HCl zu Wasser, bis die Lösung einen pH-Wert von 1,8 hat). Die erhaltene Lösung wird etwa 8 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann durch Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 9,0 eingestellt. Die basische Lösung wird mit Ethylacetat, Dichlormethan oder Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu der Base von DOML gelangt. Diese erweicht bei 115 bis 12O⁰C und schmilzt bei etwa 134 bis 140⁰C.

Beispiel 4 Herstellung von Dihydro-DOMM

Das nach Beispiel 2 hergestellte DOMM (50 mg) wird in einer wäßrigen Isopropylalkohollösung (etwa 40 %-ig, 25 ml) gelöst. Getrennt davon löst man Natriumborhydrid (20 mg) in einer 30 %-igen wäßrigen Isopropylalkohollösung (10 ml). Die so erhaltene Natriumborhydridlösung (1 ml) gibt man dann zu der DOMM enthaltenden Lösung. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten gerührt, worauf man es mit Phosphorsäure auf pH 7,5 einstellt und zur Entfernung des Isopropylalkohols unter Vakuum konzentriert. Das erhaltene wäßrige Konzentrat wird durch Zugabe von Wasser auf ein Volumen von 25 ml gebracht und dann mit Chloroform (50 ml) versetzt. Der

2 318 0 7 1

pH-Wert der wäßrigen Schicht wird auf 7,5 eingestellt. Nach erfolgter Extraktion trennt man. das Chloroform ab und dampft das Ganze unter Vakuum zur Trockne ein, wodurch man zu Dihydro-DOMM gelangt.

Beispiel 5 Herstellung von Dihydro-DOML

Das nach Beispiel 4 hergestellte Dihydro-DOMM wird wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt, wodurch man Dihydro-DOML erhält.

Beispiel 6 Anderes Herstellungsverfahren für DOML

DOML wird nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren aus DOMM hergestellt, indem man das DOMM in der Fermentationsbrühe, in der es gebildet wird, mit einer schwachen Säure behandelt. Die Isolierung des dabei erhaltenen DOML wird nach einem ähnlichen Verfahren durchgeführt, wie es in Beispiel 2 für die Isolierung von DOMM beschrieben ist.

Beispiel 7 Anderes Herstellungsverfahren für Dihydro-DOML

Das nach Beispiel 3 erhaltene DOML wird nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren reduziert, wodurch man zu Dihydro-DOML gelangt.

I 5 1 Ό U / I

Beispiel 8 2'-O-Propiönyl-DOMM

DOMM wird in Aceton gelöst und bei Raumtemperatur etwa 6 Stunden mit 1,2 Äquivalent Propionsäureanhydrxd behandelt, wodurch man 2'-O-Propionyl-DOMM erhält.

Beispiele 9 bis 11

Zur Herstellung von 2'-O-Tsovaleryl-DOMM geht man wie in Beispiel 8 beschrieben vor, wobei man jedoch Isovaleriansäureanhydrid verwendet.

Zur Herstellung von 2'-O-Benzoyl-DOMM geht man wie in Beispiel 8 beschrieben vor, wobei man jedoch Benzoesäureanhydrid verwendet.

Zur Herstellung von 2'-O-(n-Butyryl)DOMM geht man wie in Beispiel 8 beschrieben vor, wobei man jedoch n-Buttersäureanhydrid verwendet.

Beispiel 12 2',4'-Di-0-propionyl-DOML

Man löst DOML in Aceton und behandelt die erhaltene Lösung dann bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von etwa 6 Stunden mit etwas mehr als 2 Äquivalent Propionsäurean- . hydrid, wodurch man zu 2',4'-Di-0-propionyl-DOML gelangt.

2318 07 1

Beispiele 13 bis 15

Zur Herstellung von 2',4'-Di-O-isovaleryl-DOML geht man wie in Beispiel 12 beschrieben vor, verwendet hierzu jedoch Isovaleriansäureanhydrid.

Zur Herstellung von 2',4'-Di-O-benzoyl-DOML geht man wie in Beispiel 12 beschrieben vor, verwendet hierzu jedoch BenzoeSäureanhydrid.

Zur Herstellung von 2',4'-Di-O-(n-butyryI)DOML geht man wie in Beispiel 12 beschrieben vor, verwendet hierzu jedoch η-Butter Säureanhydrid. s

Hierzu 1 Bl. Zeichnung

υ u

Q CL)

fö ί3 -P

M O

2.5 100

0 4000

Mikron

8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40

3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 j 1000 800 600 400 250

Wellenzahl· (CM~¹)

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Makrolids der allgemeinen Formel I

worin Q für -CHO oder -CH₂OH steht und Y eine Hydroxylgruppe oder eine Mycarosyloxygruppe bedeutet, oder eines Salzes oder Esters hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces fradiae unter submersen "aerobenΓ Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität und Erzeugung des gewünschten Makrolids züchtet, mit der Maßgabe, daß man zur Herstellung eines Makrolids der Formel (I), worin Y für Hydroxyl steht, die Züchtung unter Anwendung schwach saurer Bedingungen durchführt.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces fradiae ATCC 31669 verwendet.