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Verfahren zur Herstellung von Erythromycin B Die vorliegende Erfindung
bezieht sich auf neuartige antibiotische Stoffe, insbesondere auf die Herstellung
von Erythromycin B und seine Säureanlagerungssalze.
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Erythromycin ist ein Antibiotikum mit breiter antibakterieller Wirksamkeit,
das sich als wirksames therapeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten
erwiesen hat, die durch Mikroorganismen verursacht werden; es wird zur Züchtung
des Mikroorganismus Streptomyces erythreus auf künstlichem Nährboden, hergestellt.
Der Mikroorganismus und die für die Herstellung von Erythromycin geeigneten Nährmedien
und Gärverfahren sind in dem Deutschen Patent Nr. 920 934 ausführlich beschrieben
worden.
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Es wurde nun noch ein neues Antibiotikum gefunden, das sich zusammen
mit Erythromycin herstellen läBt, indem man Streptomyces erythreus auf künstlichem
Nährboden züchtet. Das neue Antibiotikum wurde von seinen Erfindern mit »ErythromycinB»
bezeichnet und wird in der vorliegenden Beschreibung unter diesem Ausdruck geführt.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Erythromycin
B, bei dem man einen Erythromycin B erzeugenden Stamm des Streptomyces erythreus
unter
submersen aeroben Bedingungen in einem Nährmedium züchtet, das eine Quelle für ässimilierbares
Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, bis der genannte Organismus
im Nährmedium genügend antibiotische wirksame Stoffe erzeugt hat. Dann entfernt
man das Mycel aus dem Nährmedium, zieht alle wirksamen antibiotischen Stoffe mit
einem mit Wasser nicht mischbaren polaren Lösungsmittel aus dem Medium aus, entfernt
das Lösungsmittel und trennt das Erythromycin B von jeglichem anwesenden Erythromycin.
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Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein -Antibiotikum, das aus
einer stickstoffhaltigen Base oder deren Säureanlagerungssalzen besteht, wobei die
Base folgende Eigenschaften besitzt: Bei Titration in einer Lösung von Dimethylformamid
in Wasser im Verhältnis 2 : i ein PK'a von etwa 8,5; nach den Titrationsdaten ein
Molekulargewicht von etwa 736 und in Chloroformlösung mit einer Konzentration von
etwa 6,o Gewichtsvolumprozent folgender unterscheidbaren Absorptionsmaxima in einem
Infrarot-Absorptionsspektrum im Bereich zwischen 2,4 u und 12;o ,u 2,8o; 3,34; 5,8o;
59o; 6,84; 7,24; 7.50; 7.79; 8.04; 8,54; 8,98; 9,14; 9,48; 9,86;10,24;
10,56; 1o,96; 11,22; 11,54 und 11.94.
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Erythromycin B besitzt einige dem Erythromycin ähnliche Eigenschaften,
weist jedoch in seiner chemischen Struktur bestimmte deutliche Unterschiede auf,
die sich durch Vergleich der Infrarot-Absorptionsspektren beider Stoffe leicht zeigen
lassen. In den Zeichnungen bringt Fig. i einen Vergleich zwischen den Infrarot-Absorptionsspektren
der Chloroformlösungen von Erythromycin und Erythromycin B. Außerdem zeichnet sich
Erythromycin B durch eine größere Stabilität in stark sauren Lösungen aus.
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Erythromycin B wird auf ähnliche Weise wie Erythromycin hergestellt,
indem man den Mikroorganismus Streptomyces erythreus auf einem Nährmedium züchtet,
das Quellen für assimilierbaren Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält,
wobei eine Brühe entsteht, die das Antibiotikum Erythromycin B neben Erythromycin
enthält. Die Brühe wird zur Entfernung des Mycels filtriert, und die Mischung der
Antibiotika, nämlich von Erythromycin B und Erythromycin, wird durch Extraktion
mit einem nicht polaren, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel getrennt. Das
in der Mischung enthaltene Erythromycin B läßt sich von' Erythromycin durch Verfahren
abtrennen, bei denen die verschiedenen Löslichkeiten beider Stoffe ausgenutzt werden,
z. B. durch Adsorption und anschließende selektive Auswaschung, oder durch Gegenstromextraktion
unter Verwendung mehrerer miteinander nicht mischbarer Lösungsmittel in einer Extraktionsanlage
mit einer Vielzahl von Röhren.
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Der für das erfindungsgemäße Gärverfahren benutzte Actinomycet gehört
nach der Klassifizierung in Bergeys »Manual of Determinative Bacteriologya (6. Ausgabe,
S. 938, zur Gattung Streptomyces der Ordnung Actinomycetales. Seinen morphologischen
Eigenschaften nach scheint der Organismus mit einem vonWaksman (Soil Science 8,
71 bis 214 (191g) unter dem Namen »Actinomyces 181a beschriebenen Actinomyceten,
der später von ihm mit Streptomyces erythreus bezeichnet wurde, nahe verwandt zu
sein. Die Eigenschaften der Kulturen des von Waksman beschriebenen und des neuen
isolierten Organismus nach vorliegender Erfindung weisen einige Unterschiede auf,
und das neue isolierte Lebewesen nach vorliegender Erfindung wurde vorläufig als
ein Stamm des Streptomyces erythreus klassifiziert. Eine der Kulturensammlung- des
Northern Regional Research Laboratory überlassene Kultur des Organismus erhielt
dort die, Kulturennummer NRRL 2338.
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Die_ vorliegende Erfindung wird unter besonderer Bezunahme auf den
obenerwähnten Stamm des Organismus beschrieben, es wird jedoch darauf hingewiesen,
daß die erfindungsgemäßen Gärverfahren der Erfindung nicht nur die Verwendung des
Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, sondern auch andere Erythromycin B erzeugender
Stämme des Streptomyces erythreus einschließen, die sich durch bekannte Isolier-und
Stammodifizierverfahren, z. B. durch Auswahl gezüchteter Organismen sowie Einwirkung
von Modifizierungsmitteln, wie Röntgenstrahlen, U. V.-Licht, und chemischen Mitteln,
z. B. Stickstofflost, auf die Organismen leicht herstellen und isolieren lassen.
Weitere Erythromycin B erzeugende Stämme sind z. B. die Streptomyces erythreus-Stämme
NRRL 2359. 2360 und 2361: Wie bereits erwähnt, kann man Streptomyces erythreus,
Stamm NRRL 2338, zur Gewinnung wirksamer antibiotischer Mittel in einem Nährmedium
züchten. Als Nährmedium lassen sich verschiedene Medien verwenden, da aus den oben
beschriebenen Versuchen hervorgeht, daß der Organismus in der Lage ist, von verschiedenen
Energiequellen zu leben. Bestimmte Nährmedien werden jedoch zur Gewinnung der Antibiotika
aus wirtschaftlichen Gründen zur Erzielung höchster Ausbeuten und leichterer Isolierbarkeit
der Antibiotika bevorzugt. Die nach vorliegender Erfindung als Quellen für Kohlenhydrat
bevorzugten Bestandteile der Nährmedien sind z. B. Stärke und Glukose. Andere Quellen
sind Rohrzucker, Dextrin, Melasse u. dgl. Zu den bevorzugten Quellen für Stickstoff
gehören Maiswasser, grobes oder feines Sojabohnenmehl und in Schlempe enthaltene
lösliche Stoffe; andere geeignete Quellen dafür sind Casein, Aminosäuremischungen-
Peptone (sowohl von Fleisch wie auch von Soja herrührend) u. dgl. Ebenso können
anorganische Quellen für Stickstoff, wie z. B. Nitrat-oder Ammomumsalze, verwendet
werden.
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Zu den dem Medium einzuverleibenden anorganischen Nährsalzen gehören
die üblichen, Ionen abgebenden Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-,
Sulfatsalze u. dgl.
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Wie es auch für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen
erforderlich ist, sollten auch dem zur Züchtung des erfindungsgemäßen Actinomyceten
Nährmedium die wichtigsten Spurenelemente zugesetzt werden. Derartige Spurenelemente
sind aber gewöhnlich schon als Verunreinigungen in den anderen zugegebenen Bestandteilen
des Mediums enthalten.
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Zur Erzielung günstigsten Wachstums und höchster Entwicklung des Streptomyces
erythreus, Starrem
NRRL 2338, sollte man das Nährmedium vor der
Impfung mit dem Organismus auf einen pH-Wert zwischen 6,o und 7,5, vorzugsweise
etwa 6,5, einstellen. Man hat beobachtet, daß das Medium während der Wachstumszeit
des Organismus und der Herstellung der Antibiotika allmählich alkalisch wird und
eine Alkalinität von etwa pH 7,2 bis etwa 8,5 oder mehr erreichen kann, wobei der
endgültige pH-Wert mindestens teilweise vom Anfangs-p$-Wert des Mediums, den im
Medium anwesenden Puffersubstanzen und der Wachstumszeit des Organismus abhängt.
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Wie bei der Erzeugung größerer Mengen anderer Antibiotika bevorzugt
man es auch für die Gewinnung großer Mengen Erythromycin B, die Kulturen unter submersen
aeroben Bedingungen zu züchten. Zur Herstellung begrenzter Mengen dieser Stoffe
kann man Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen züchten. Weiterhin ist
es bei Kulturen in großen Behältern bekanntlich vorteilhaft, zum Impfen dieser Behälter
die vegative Form des Organismus zu verwenden, um die Bildung des Antibiotikums
zu beschleunigen und dadurch die Anlage möglichst gut auszunutzen. Deshalb ist es
erwünscht, zuerst einen vegetativen Impfstoff des Organismus herzustellen, indem
man eine verhältnismäßig kleine Menge Kulturnährmediun mit der Sporenform des Organismus
impft und nach Bildung des frischen aktiven Impfstoffes diesen aseptisch in die
großen Behälter einführt. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff hergestellt
wird, kann das gleiche oder ein anderes als das für die Herstellung des Antibiotikums
verwendete sein.
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Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, läßt sich gut bei Temperaturen
zwischen etwa 25 und 37° züchten. Die höchsten Ausbeuten des Antibiotikums erhält
man, wenn man das Nährmedium der Kultur auf etwa 26 bis 30° hält.
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Bei der Herstellung von Antibioticis unter submersen Bedingungen ist
es üblich, sterile Luft durch das Nährmedium der Kultur zu blasen. Zur Erzielung
wirksamen Wachstums des Organismus und Gewinnung des Antibiotikums beträgt das Volumen
der füidie Bildung von Erythromycin und Erythromycin B eingeleiteten Luft vorzugsweise
über o,i Raumteil Luft in der Minute je Raumteil des Kulturnähr mediums. Das Wachstum
und die Bildung des Antibiotikums sind nochbesser, wenn mindestens 0,q. Raumteile
Luft auf i Raumteil des Kulturmediums durchgeleitet werden.
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Die Entstehungsgeschwindigkeit der antibiotischen Stoffe und die Konzentration
der antibiotischen Wirkstoffe im Nährmedium der Kultur läßt sich während der Wachstumszeit
des Mikroorganismus leicht verfolgen, wenn man Proben des Kulturnährmediums auf
ihre antibiotische Wirksamkeit gegenüber Organismen prüft, von denen man weiß, daß
sie auf das Antibiotikum reagieren, z. B. von Staphylococcus aureus und Myobacterium
tuberculosis. Für diese Untersuchungen empfiehlt es sich derart vorzugehen, daß
man Proben der Kultur fortschreitend immer mehr verdünnt, bestimmte Mengen der so
verdünnten Proben einem geschmolzenen Nähragar zusetzt, dann diesen Agar in einer
Petrischale erstarren läßt, mit einer frischen Kultur des S. aureus oder M. tuberculosis
impft und diejenige stärkste Verdünnung des Nährmediums der Kultur feststellt, bei
der das Wachstum des Organismus auf dem Agarnährboden noch gänzlich gehemmt wird.
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Man kann die erfindungsgemäßen antibiotischen Stoffe auch nach turbidimetrisciien
Versuchsverfahren erzeugen, wie sie gewöhnlich zur Herstellung anderer Antibiotika
angewandt werden.
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Die Anwesenheit von Erythromycin B und Erythromycin läßt sich durch
chromatographische Verfahren bestimmen. Bei einem Verfahren dieser Art löst man
etwa o,2 bis 0,5 y der zu untersuchenden Probe in einer kleinen Menge eines
Lösungsmittels, z. B. Alkohol, bringt einen Tropfen der konzentrierten Lösung auf
ein Ende eines Streifens Filterpapier, trocknet den entstehenden Fleck und entwickelt
ihn nach dem üblichen papierchromatographischen Verfahren.
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Zu den Lösungsmitteln, die zur Entwicklung des Papierstreifens, d.
h. zum Auseinanderziehen der Adsorptionszonen dienen können, gehören: i : 99 (V/V)
konzentrierte Ammoniumhydroxydlösung; destilliertes, mit Methylisobutylketon gesättigtes
Wasser; destilliertes, mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser mit Zusatz von
2 % (V/V) Piperidin; o,i molekulare, mit Methylisobutylketon gesättigte Boratpufferlösung
mit einem pH-Wert von 9,9; 0,15 n mit Methyhsobutylketon gesättigte Natronlauge;
o,i molekulare saure Kaliumphosphat-Pufferlösung mit 3 Volumprozent Äthanolgehalt
u. dgl. Die Entwicklungsdauer ist etwa q. bis 5 Stunden oder so lange, bis die Lösungsmittelfront
das Ende des Streifens erreicht. Nach der Entwicklung stellt man die Lage der antibiotischen
Substanz auf dem Streifen mit einem Bioautogramm fest. Hierbei legt man den entwickelten
Filterpapierstreifen auf die Oberfläche eines etwa 3 mm dicken, in einer großen
Glasschale befindlichen Agarnährbodens, den man durch Impfen eines warmen sterilen
Agarnährmediums mit Bacillus subtilis hergestellt hatte. Das Antibiotikum dringt
vom Papier aus in das Agar ein. Nach io Minuten wird der Papierstreifen entfernt,
die Schale gekippt und die Lage des Filterpapierstreifens sowie der Lösungsmittelfront
und die Stelle, an der die Versuchslösung aufgetragen wurde, direkt außen auf der
Unterseite der Glasschale vermerkt. Das Agarmedium wird über Nacht bei etwa 37°
in umgekehrter Lage bebrütet. Das Auftreten klarer Zonen im Medium, d. h. von Streifen,
die frei von bakteriellem Wachstum sind, zeigt die Lage der antibiotischen Substanz
entsprechend deren Verteilung auf dem Filterpapier an. Durch Messen der von dem
Antibiotikum und dem Lösungsmittel zurückgelegten Entfernungen bestimmt man den
Rf-Wert oder das Verhältnis der Wanderungsgeschwindigkeit des Antibiotikums zu der
des Lösungsmittels. Es wurde gefunden, daß sich Erythromycin B bei diesem Versuch
weniger schnell bewegt als Erythromycin. Bei Anwesenheit einer Mischung von Erythromycin
B und Erythromycin erscheinen im Bioautogramm zwei klare Zonen; ist jedoch nur eine
Zone frei vom Bakterienwachstum, so kann man durch Vergleich der Lage dieser Zone
mit der Lage einer unter genau denselben
Bedingungen mit reinem
Erythromycin B oder Erythromycin erhaltenen Zone feststellen, welches der beiden
Antibiotika vorhanden ist. Unter günstigsten Bedingungen beträgt der Rf-Wert von
Erythromycin B etwa drei Viertel desjenigen von Erythromycin.
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In den Zeichnungen zeigt Fig.2 ein mit einem Papierchromatogramm hergestelltes
Bioautogramm, auf dem gleichzeitig Erythromycin B, Erythromycin und eine Mischung
aus annähernd gleichen Mengen Erythromycin und ErythromycinB chromatographiert wurden.
Für die Entwicklung, d. h. Zonentrennung,, benutzte man hierbei als Lösungsmittel
eine i°/oige wäßrige Lösung von konzentriertem Ammoniumhydroxyd, die mit Methyhsobutylketon
gesättigt war. Die schwarzen Flächen bedeuten Zonen, in denen keinerlei . bakterielles
Wachstum auftrat.
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Im allgemeinen ist die gesamte antibiotische Wirksamkeit bei submersen
aeroben Kulturen innerhalb von etwa 2 bis 5 Tagen nach Impfung des Nährmediums am
größten, bei Oberflächen- oder Schüttelkulturen erst innerhalb etwa 5 bis io Tagen.
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Gewöhnlich entstehen im Nährmedium der Kultur annähernd gleiche Mengen
Erythromycin und Erythromycin B; dieses Verhältnis hängt jedoch von der Dauer der
Bebrütungszeit ab. Kürzere -Wachstumszeiten, etwa von i oder 2 Tagen, begünstigen
die überwiegende Bildung von Erythromycin B. Eine Verlängerung der Bebrütungszeit
führt zu einer relativen Verminderung der Erythromycin B-Menge im Vergleich zu der
des Erythromycins und kann sogar einen absoluten Rückgang der Gesamtmenge des im
Nährmedium der Kultur vorhandenen Erythromycins B verursachen. Der Grund für diese-relative
oder absolute Abnahme ist nicht bekannt.
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Die in der Kultur des Str. erythreus-Stammes NRRL 2338 entstehenden
Antibiotika lassen sich durch Extraktions- oder Adsorptionsverfahren aus dem Nährmedium
gewinnen. Hierbei werden die erstgenannten Verfahren deshalb bevorzugt, weil sie
schneller und billiger sind. Für die Extraktion der Antibiotika aus dem Nährmedium
der Kultur werden mit Wasser nicht mischbare, polare organische Lösungsmittel bevorzugt,
z. B. von Fettsäurealkylester,. wie Äthyl- und Amylacetat; chlorierte Kohlenwasserstoffe,
wie Chloroform und Dichloräthylen; Alkohole mit geringer Wasserlöslichkeit, wie
Butanol und Amylalkohol; Ketone mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Methylamylketon,
und andere Verbindungen, wie Äthyläther und Dibutyläther. Es können aber auch andere
Lösungsmittel von ähnlicher Beschaffenheit verwendet werden. Vorzugsweise wird die
filtrierte Nährbrühe vor- der Extraktion auf einen pH-Wert von etwa 9,5 oder
höher eingestellt.
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Das Erythromycin B läßt sich leicht von dem Erythromycin unter Ausnutzung
der unterschiedlichen Löslichkeit und Adsorptionseigenschaften der beiden Verbindungen
abtrennen. So wird z. B. Erythromycin B auf Cellulose stärker als Erythromycin adsorbiert.
Deshalb erscheint bei Adsorption einerMischung von Erythromycin und Erythromycin
B aus deren gemeinsamer Lösung auf einer Säule aus Cellulose und Auswaschung dieser
Säule mit einem geeigneten Lösungsmittel das Erythromycin bereits im ersten Waschwasser,
während Erythromycin B auf der Säule bleibt und erst bei längerem Auswaschen gewonnen
wird. Bei einer anderen Durchführungsform des Verfahrens kann man die beiden Verbindungen
durch selektive Extraktionsverfahren in einer Gegenstromanlage unter Gewinnung von
Erythromycin B trennen.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Isolierung und
der Eigenschaften von Erythromycin B Beispiel i Eine Sporen enthaltende Kultur des
Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, wird hergestellt, indem man den Organismus
auf einem Agarschrägnährboden folgender Zusammensetzung züchtet
| Dextrin ....................... 159 |
| Trypton........................ 5 g |
| Agar:........,................. 20 g |
| Betain ........................ 0,59 |
| gelöste Mineralmischung) ....... 2 ccm |
| Wasser zur Auffüllung auf ...... i Liter |
*) Die Mineralmischung enthält folgende Bestandteile
| K,HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100,0 g |
| NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ioo,o
g |
| MgS04 ... .. .. ...... ....... .. .. ioo,o g |
| Fes 04 - 7 H20. . : . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g |
| ZnS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0
g |
| CuSO4-5 11,0 ................. 0,59 |
| MnC12 q. H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,59 |
| CoC12 6 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,1 g |
| CaCl2 . . . . . . . : . . . . . . . . . . . . . . . . . 40,09 |
| Wasser zur Auffüllung auf ...... i Liter |
Der Schrägnährboden wird io Tage lang bei 33° bebrütet. Man gewinnt die Sporen in
Form einer wäßrigen Suspension, indem man den Schrägnährboden mit einer kleinen
Menge sterilem destilliertem Wasser bedeckt und die Sporen vorsichtig von der Oberfläche
des Nährbodens abschabt.
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Etwa i ccm der auf diese Weise erhaltenen Sporensuspension verwendet
man zur Impfung des folgenden sterilisierten Nährmediums unter sterilen Bedingungen:
| Casein-Pancreatin-hydrolysat ..... i g |
| Melasse . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g |
| KZHP04 ...................... 0,15 g |
| Wasser......................... ioo ccm |
Das geimpfte Nährmedium wird etwa 72 Stunden lang bei etwa 28° bebrütet, bis gute
vegetative Entwicklung zu beobachten ist. Etwa 5 ccm des das vegetative Wachstum
enthaltenden Nährmediums benutzt man zur Impfung eines
250 ccm fassenden
Erlenmeyerkolbens, der etwa 75 ccm eines sterilisierten Gärmediums folgender Zusammensetzung
enthält
| Rohrzucker .................... 45 g |
| Sojabohnenmehl . . . .. . . . . . . . . . . . 2o g |
| Aus kondensierter Melasseschlempe |
| gewonnene lösliche Stoffe ..... 2 g |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 2 g |
| Cobaltochloridhexahydrat . . . . . . . . o,ooi g |
| Wasser zur Auffüllung auf ...... i Liter |
Der Kolben mit dem geimpften Nährmedium wird in einen auf etwa 28° gehaltenen Brutraum
gestellt und 6 Tage lang auf einer sich drehenden Schüttelvorrichtung mit einem
Schüttelhub von etwa 5 cm und einer Geschwindigkeit von 24o Umdrehungen in der Minute
geschüttelt. Von Zeit zu Zeit werden Proben des Nährmediums auf die Gesamtmenge
der darin enthaltenen antibiotischen Wirkstoffe untersucht. Erreicht die Menge des
wirksamen Antibiotikums im Schüttelkolben einen Wert von etwa 25o bis
300 y/ccm der Brühe, so filtriert man diese zur Entfernung des Mycels.
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Etwa i1/2 Liter der filtrierten Kulturbrühe werden mit Natronlauge
auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht und mit 0,75 Liter Amylacetat ausgezogen.
Der Amylacetatextrakt, in dem praktisch alle in der ursprünglichen Gärbrühe vorhandenen
antibiotischen Wirkstoffe enthalten sind, wird durch Vakuumeindampfung auf ein Volumen
von etwa io ccm eingeengt. Der konzentrierten Amylacetatlösung. setzt man
0,5 g gereinigte Cellulosefaser zu und trocknet die Mischung über Nacht im
Vakuum. Die trockene, feinpulverige Cellulose, auf der alle antibiotischen Wirkstoffe
der Brühe absorbiert sind, wird auf die Oberseite einer etwa 3,2 X 38 cm messenden
chromatographischen Adsorptionssäule gelegt, die etwa 161 g trockene gereinigte
Celiulösefaser enthält. Die Säule wird mit o,i°/oiger wäßriger, mit Methyhsobutylketon
gesättigter Ammoniumhydroxydlösung chromatographiert. Das Eluat wird in Fraktionen
gesammelt, die auf ihre antibiotische Wirksamkeit gegen S. aureus als Prüforganismus
untersucht werden. Die Anwesenheit von Erythromycin und/oder Erythromycin B wird
unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems wie oben durch chromatographische
Analyse mit Filterpapier bestimmt. Dabei zeigt sich, daß die ersten i2o ccm der
Auswaschflüssigkeit nur Erythromycin, die zweiten i2o ccm jedoch eine Mischung-
aus Erythromycin und Erythromycin B enthalten. Die folgenden aktiven Eluatfraktionen
enthalten nur Erythromycin B ; diese werden vereinigt und mit Chloroform ausgezogen.
Der Chloroformauszug wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der nur aus Erythromycin
B bestehende Rückstand wird mit einer Menge Hexan gewaschen und in 25 ccm Äther
aufgenommen. Die ätherische Lösung wird filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft.
Den Rückstand löst man in einer möglichst kleinen Menge warmen Acetons und läßt
abkühlen, wobei sich Kristalle des Erythromycins B abscheiden. Dieses kristalline
Antibiotikum enthält (ebenso wie das Erythromycin) eine bestimmte Menge gebundenes
Kristallisationslösungsmittel. Bringt man die kristalline Verbindung unter Bedingungen
zur Entfernung dieses Lösungsmittels, so hat dies den Verlust des Lösungsmittels
und damit der kristallinen Eigenschaften des Antibiotikums zur Folge.
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Beispiel 2 Man stellt ein sterilisiertes Nährmedium her, das folgende
Bestandteile enthält:
| Dextrose ...................... 159 |
| Sojabohnenmehl ................ i5 g |
| Maisfeststoffe .................. 5,09 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . 2,o g |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,o g |
| Wasser zur Auffüllung auf ...... i Liter |
Das Nährmedium wird mit einer Sporensuspension geimpft, die man herstellt, indem
man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, nach dem in Beispiel z beschriebenen
Verfahren auf einem Agarschrägnährboden züchtet und die Sporen zusammen mit einer
kleinen Menge sterilen destillierten Wassers abschabt. Das in einer 2-Liter-Flasche
befindliche geimpfte Nährmedium wird etwa 26 Stunden lang bei etwa 28° unter Schütteln
der Flasche in einer sich hin und her bewegenden Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag
von 5 cm und einer Geschwindigkeit von 114 vollständigen Ausschlägen in der Minute
bebrütet. Das erhaltene vegetative Mycel-Wachstum wird durch Zentrifugieren abgetrennt,
mit Wasser gewaschen und in etwa i Liter sterilem destilliertem Wasser erneut suspendiert.
Der auf diese Weise hergestellte Impfstoff wird zur Impfung eines 4o Liter fassenden
Gärgefäßes verwendet, das etwa 2o Liter einer sterilisierten Gärbrühe von folgender
Zusammensetzung enthält
| Glykokoll ...................... 1509 |
| Rohrzucker .................... 1370 g |
| dl-a-Alanin .................... 17,8 g |
| primäres Natriumphosphat ...... ioo g |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . loo g |
| Magnesiumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . . io g |
| Ferrosulfat-heptahydrat ......... 0,49 |
| Zinksulfat-heptahydrat . . . . . . . . . . 0,2 g |
| Magnesiumchlorid-tetrahydrat .... 0,0329 |
| Cobaltochlorid-hexahydrat ....... 0,2 g |
| Wasser zur Auffüllung auf ...... 2o Liter |
Die Mischung aus anorganischen Salzen, Glykokoll und dl-a-Alanin wird zusammen sterilisiert
und der pH-Wert der Nährlösung nach der Sterilisation auf etwa 7,5 eingestellt.
Der Rohrzucker wird getrennt sterilisiert und der sterilisierten Nährlösung aseptisch
zugesetzt.
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Nach Abkühlung der sterilisierten Nährlösung setzt man den nach dem
oben beschriebenen Verfahren vegetativ hergestellten Impfstoff aseptisch zu. Der
Organismus wird in der Nährlösung etwa 4 Tage lang bei einer Temperatur von etwa
28° gezüchtet. Während der Wachstumszeit wird die Nährlösung gerührt und sterile
Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 Raumteilen Luft auf i Raumteil Flüssigkeit
in der Minute hindurchgeblasen. Mikrobiologische Versuche mit S. aureus als Versuchsorganismus
zeigen, da.ß der Gesamtgehalt an antibiotischen Wirkstoffen in der
Nährlösung
zuletzt etwa 250 y/ccm beträgt, wovon etwa 50 % aus Erythromycin B bestehen,
wie sich durch Papierchromatographie und Bioautogramm beweisen läßt. Die Nährlösung
wird zur Entfernung des Mycels. filtriert, und aus dem klaren Filtrat läßt sich
nunmehr Erythromycin 19 gewinnen.
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i1/21 der so erhal'fenen filtrierten Erythromycin und Erythromycin
B enthaltenden Nährlösung werden mit wäßriger Natronlauge auf einen pH-Wert von
9,5 eingestellt und mit etwa o,751 Amylacetat ausgezogen. Der Amylacetatextrakt
wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in etwa
250 ccm Chloroform aufgenommen, filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft.
Nun wird ein Lösungsmittelsystem hergestellt, indem man 2o Teile Methylisobutylketon,
2o Teile einer o,i molekularen Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 und
x Teil Aceton miteinander mischt. Läßt man diese Mischung stehen, so bildet sich
ein Zweischichtensystem, das man in eine ganz aus Glas bestehende, Zoo ccm fassende
6oröhrige Craig-Gegenstrom-Extraktionsanlage gibt. Der Verdampfungsrückstand des
Chloroformextraktes wird in io ccm der oberen Phase gelöst und in die erste Röhre
der Extraktionsanlage gegeben. Nun wird in üblicher Weise im Gegenstrom extrahiert.
Die Fraktionen werden wieder papierchromatographisch und mikrobiologisch unter Verwendung
von S. aureus als Versuchsorganismus analysiert. Dabei zeigt sich, daß die Fraktionen
Nr. 27 bis 40 nur Erythromycin B enthalten. Diese Fraktionen werden vereinigt und
im Vakuum bis auf 130 ccm eingedampft. Diese Rückstandslösung wird auf io °/o Natriumchloridgehalt
aufgefüllt, von mit verdünnter Natronlauge auf pH-Wert 9,8 eingestellt und
zweimal mit je 75 ccm Chloroform ausgezogen. Die vereinigten Chloroformextrakte
werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene eingedampft.
Den Verdampfungsrückstand löst man bei 47° in möglichst wenig Aceton auf, läßt langsam
abkühlen und gewinnt kristallines Erythromycin B aus der Lösung.
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Das auf diese Weise gewonnene Erythromycin B schmolz bei igo bis igi°
auf der Kofler-Heizbank. Die Elementaranalyse einer drei Stunden lang bei 6o° im
Vakuum über Phosphorpentoxyd getrockneten Probe ergab folgende Werte: 61,54% C;
9,45 °/o H; 2,0 °/0 N und (als Differenzwert) 28,or °/o O.
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Die elektrometrische Titration in 66°/oiger wäßriger Dimethylformamidlösung
zeigte die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe mit einem pK' a von 8,5 an.
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Das nach den Titrationsdaten ermittelte Molekulargewicht beträgt etwa
736.
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Das U.V.-Absorptibnsspektrum des in absolutem Methanol gelösten Erythromycins
B zeigte ein Maximum bei 286,uu, ein Minimum bei 259 Aß und E286=
59.
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Eine mikrobiologische Prüfung auf S.. aureus als Versuchsorganismus
zeigt, daß ein Milligramm Erythromycin B die gleiche antibiotische Wirksamkeit wie
etwa 75o y Erythromy in hat.
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Das Infrarot-Absorptionsspektrum einer 6°/oigen Lösung von Erythromyoin
B in Chloroform, auf Gewichts-Volumen-Grundlage, hat zwischen 2,4 ,u und 12 ,u folgende
unterscheidbare Absorptionsmaxima: 2:50; 3,34; 5,8o; 6,84; 7,24; 7,50; 8,04; 8.54;
8,981-9,4; 9,48; 9,86; =o,24; io,56;. io,g6;1x,22; x=,54 und 11,94. In Fig. i der
Zeichnung wird diese Infrarot-Absorptionskurve durch die ausgezogene Linie dargestellt.
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Stellt man gleichzeitig Chromatogramme von Erythromycin B- und Erythromycinproben
unter Verwendung von ammoniakalischem, mit ]Niethylisobutylketon gesättigtem destilliertem
Wasser als Entwicklungs-Lösungsmittel auf Filterpapierstreifen her, so ist das Verhältnis
der Geschwindigkeiten, mit denen sich die beiden Antibiotika bewegen, folgendes:
Erythromycin B ist in saurer Lösung viel beständiger als Erythromycin. Wenn man
wäßrige Lösungen mit je etwa 38 Einheiten Erythromycin B und Erythromycin in Kubikzentimeter
auf verschiedene pH-Werte einstellt und jedesmal eine Stunde lang bei etwa 25° stehenläßt,
zeigen die Lösungen von Erythromycin B eine viel größere Beständigkeit gegenüber
Säuren.
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Die Säureanlagerungssalze von Erythromycin B lassen sich herstellen,
indem man eine wäßrige Lösung einer Erythromycin-B-Base mit einer äquivalenten Menge
einer Säure behandelt und die Lösung im Vakuum zur Trockene eindampft. Bei einer
anderen Durchführungsform des Verfahrens kann man die Lösung der Erythromycin-B=Base
in einem organischen Lösungsmittel mit der Säure oder deren Lösung behandeln; das
Erythromycinsalz fällt dann direkt aus der Lösung, aus. Bei der Herstellung von
Säureanlagerungssalzen starker Säuren ist darauf zu achten, daß nicht während der
Anlagerung der Säure an das Antibiotikum örtlich zu hohe Konzentrationen der Säure
auftreten, da sich ein Teil des Erythromycins B zersetzen kann, wenn der pH-Wert
geraume Zeit unter etwa 2 sinkt. Geeignete Erythromycin-B-Salze sind das Hydrochlorid,
Sulfat, Citrat, Mandelat, Succinat, Oleat, Palmitat, Myristat, Stearat, Oxalat,
Thiocyanat und Glucoheptonat. Weitere ähnliche Salze lassen sich nach den obenerwähnten
Verfahren leicht herstellen. Für . therapeutische Zwecke sollten die verhältnismäßig
ungiftigen Salze ausgewählt werden. Das Hydrochlorid des Erythromycins B z. B. wird
hergestellt, indem man eine Äthanollösung der antibiotischen Base mit einer äquivalenten
Menge wäßriger Salzsäure behandelt und die Lösung unter Abscheidung des festen Salzes
im Vakuum zur Trockene eindampft. Das Salz wird durch Umkristallisation aus einer
Mischung von Äthanol und Aceton gereinigt.
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Das Erythromycin B und seine Salze sind wirksame Antibiotika, die
unter Berücksichtigung des erhöhten Molekulargewichts der Salze etwa dieselbe breite
antibakterielle. Wirksamkeit wie Erythromycin besitzen.