CZ20023203A3 - Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo k epitopu receptorového komplexu NKG2D - Google Patents

Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo k epitopu receptorového komplexu NKG2D Download PDF

Info

Publication number
CZ20023203A3
CZ20023203A3 CZ20023203A CZ20023203A CZ20023203A3 CZ 20023203 A3 CZ20023203 A3 CZ 20023203A3 CZ 20023203 A CZ20023203 A CZ 20023203A CZ 20023203 A CZ20023203 A CZ 20023203A CZ 20023203 A3 CZ20023203 A3 CZ 20023203A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cells
ser
cancer
polypeptide
nkg2d
Prior art date
Application number
CZ20023203A
Other languages
English (en)
Inventor
Katrin Borschert
Roman Kischel
Monika Mayer
Peter Kufer
Gert RIETHMÜLLER
Ralf LUTTERBÜSE
Robert Hofmeister
Original Assignee
Micromet Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Micromet Ag filed Critical Micromet Ag
Publication of CZ20023203A3 publication Critical patent/CZ20023203A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo receptorového komplexu NKG2D k epitopu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká multifunkčního polypeptidu, který obsahuje první doménu, obsahující vazebné místo specificky rozpoznávající extracelulární epitop receptorového komplexu NKG2D, a druhou doménu mající receptorovou nebo ligandovou funkci. Dále se předkládaný vynález týká polynukleotidů kódujících multifunkční polypeptid, vektorů buněk obsahujících tyto Vynález se týká také výše uvedených molekul, obsahujících takové polypeptidy a polynukleotidy nebo tyto vektory přípravků obsahujících některou z samotnou nebo v kombinaci, a také specifického lékařského použití multifunkčního polypeptidu podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
V následujícím popisu je citováno několik dokumentů. Obsah každého z těchto dokumentů (včetně specifikaci nebo instrukcí výrobce apod.) je plně zahrnut v předkládaném popisu formou odkazu.
Mnohé multifunkční polypeptidové sloučeniny popsané v dřívějším stavu techniky jsou bispecifické protilátky různých molekulárních formátů, které byly vyvinuty ke znovuzacílení imunitních efektorových buněk proti maligním nebo infikovaným cílovým buňkám, pro clearing patogenu nebo autoprotílátek z krevního oběhu, pro zesílení terapie jinými léčivy, nebo jako vakcíny a nebo jako nosiče např. pro radioizotopy. Bispecifické protilátky navržené k přesměrování • · · · · · AA ·· ·· • · A Α φ * · · · A • » · · · · · • A A A AAAA· • A A · AAA
AAA '· AAA AAAA A« AAA· cytotoxické aktivity imunitních efektorových buněk proti cílovým buňkám obvykle obsahují vazebné místo rozpoznávající antigeny asociované s nádory nebo virové antigeny na cílové buňce, a druhé vazebné místo, které interaguje se spouštěcí molekulou na efektorové buňce. K efektorovým buňkám, které byly zacíleny v dosavadním stavu techniky pomocí bispecifických protilátek patří T-lymfocyty (T-buňky), NK-buňky, monocyty a polymorfonukleární neutrofily. Spouštěcí molekuly pro bispecifické protilátky byly obvykle vybrány ze skupiny buněčných povrchových receptorů, kterou tvoří CD64, CD16, α/β receptor T-buněk (TCR) a CD3, ale také byly hodnoceny alternativní spouštěcí molekuly jako je CD2, CD89, CD32, CD44, CD69 a TCR-zeta řetězec. Bispecifické protilátky schopné přesměrovat cytotoxické T-lymfocyty (fenotyp: CD3+/CD56-/CD8+) k cílení buněk buďto obsahují vazebné místo pro TCR, CD3, zeta-řetězec nebo CD2. Zapojením jedné z těchto spouštěcích molekul je však narušena antigenně specifická signalizace zprostředkovaná TCR-komplexem, jelikož buďto přímo epitopy TCR-komplexu samotné jsou účastny (TCR, CD3 nebo zetařetězec) nebo v případě CD2 molekuly, která přímo přispívá k TCR-signalizaci pomocí koagregace lek, proteinové tyrosinkinázy příbuzné src, asociované svým cytoplazmatickým koncem s TCR-komplexem.
Tudíž technickým problémem bylo připravit multifunkční polypeptidy, které zesilují specifickou aktivaci lymfocytů v přímém sousedství buněk souvisejících s nemocí, aniž by došlo k narušení specifičnosti receptorů a/nebo funkce těchto cytolytických lymfocytů. Řešení tohoto technického problému je popsáno v předkládaném popisu vynálezu a připojených patentových nárocích.
Výhodná řešení tohoto technického problému jsou popsána dále v příkladech provedení vynálezu.
• · · ·
Podstata vynálezu
V důsledku výše uvedených fakt předkládaný vynález se týká multifunkčního polypeptidu, který obsahuje první doménu, obsahující vazebné místo specificky rozpoznávající extracelulámí epitop receptorového komplexu NKG2D, a druhou doménu mající receptorovou nebo ligandovou funkci.
Termín multifunkční polypeptid v kontextu předkládaného vynálezu znamená polypeptid, který projevuje ve vhodných podmínkách (také in vitro), jako jsou například fyziologické podmínky včetně patologických, například in vivo nebo ex vivo, alespoň dvě odlišné biologické funkce, tedy například tři, čtyři, pět nebo šest funkcí. K fyziologickým in vitro podmínkám patří pufrované roztoky, jako jsou například fosfátem pufrované roztoky s pH v rozmezí 5 až 9, a další uvedené v připojených příkladech. Funkce jsou podrobněji specifikovány níže. Zahrnují vazbu specifických domén s molekulami, které budou dále specifikovány v tomto popisu. Vazba může následně spustit další biologickou funkci včetně toho, že takto může zahájit celou kaskádu (funkcí), vazbu k receptoru, modulaci signálních drah nebo genovou expresi, a/nebo ovlivnit apoptotickou buněčnou smrt. Alespoň dvě z těchto domén poskytují odlišné biologické funkce a výhodně dvě domény specifikované výše se přirozeně spolu nevyskytují, tzn. přirozeně se nevyskytují v této konfiguraci, nebo se vůbec nevyskytují na stejném polypeptidu nebo proteinu nebo proteinovém komplexu.
týká se jako je například který je výhodně s vhodným ligandem.
Termín receptorová nebo ligandová funkce se přirozeně se vyskytující nebo uměle (ne-přirozeně vyskytující vazebné funkce přirozeně se vyskytující molekuly receptor, povrchu
K příkladům takových párů receptor/ligand patří např. protilátky/antigeny nebo další členy nadrodiny Ig a jejich odpovídající ligandy, nebo hormonové receptory /hormony nebo sacharidy/lektiny. Ligandy obecně, ale nikoliv výlučně, označují molekuly, které mají přirozeně se vyskytující vazebnou partnerskou molekulu. . V souladu s tím, co bylo uvedeno výše, mohou to být antigeny nebo hormony. Avšak mohou mít i jinou než přirozenou konfiguraci nebo mohou být i jiného než přirozeného původu. Receptory/ligandy jak byly popsány výše mohou být přírodního původu, rekombinantní nebo (semi) syntetického původu.
NKG2D je lektinu-podobný receptor C-typu NK buněk (Houchins (1991) J.Exp.Med. 172:1017), který tvoří receptorový komplex NKG2D spolu s DAP10 (Wu (1999) Science 285: 730). DAP10 nese ve své cytoplazmatické doméně motiv aktivační sekvence pro PI3-kinázu působí jako modul signální transdukce pro NKG2D, který ve své cytoplazmatické doméně postrádá signální motiv. Sestavení tohoto receptorové komplexu spouští signální kaskádu, která je schopná indukovat cytotoxicitu NK buněk. Podobně jako další receptory NK buněk, receptorový komplex NKG2D byl také nalezen v některých subpopulacích T lymfocytů, zejména γ/δ T lymfocytů, CD8+ α/β T lymfocytů a v mizivé menšině CD4+ α/β T lymfocytů (Bauer (1999) Science 285: 727).
NK buňky jsou dominantní efektory humorální imunitní reakce, získávají svou antigenní specifičnost prostřednictvím vazby protilátek IgG ke svému povrchovému Fcy receptoru CD16. Tedy CD16 působí jako specifický antigenní receptor, který umožňuje NK buňkám vyzbrojeným protilátkou zničit cílové buňky antigenně specifickým způsobem.
T-lymfocyty jsou efektory buněčné imunitní reakce, nesou
TCR-komplexy jakožto specifické antigenní receptory.
• · to · • to
• toto
TCR-komplex je složen z několika invariantních řetězců včetně CD3-komplexu a zeta řetězce, a také dvou variabilních řetězců, které komplexu poskytují klonotypovou (klonální) antigenní specifičnost. V závislosti na typu variabilního řetězce nalezeného v TCR-komplexu (buďto oí a β řetězce nebo γ a δ řetězce), mohou být T lymfocyty rozděleny na α/β nebo γ/δ T lymfocyty. TCR-zprostředkované rozpoznávání cílových buněk pomocí cytotoxických T-lymfocytů, t j . CD8+ α/β T lymfocytů a γ/δ T lymfocytů obvykle vede k lýze cílových buněk.
IIIA, zatímco zprostředkováno
Většina známých bispecifických protilátek namířených proti lymfocytům rekrutuje buďto pouze NK buňky nebo T lymfocyty. NK buňky jsou obvykle rekrutovány prostřednictvím zapojení CD16, tvořícím hlavní extracelulární část komplexu Foy-receptoru rekrutování T lymfocytů je obvykle prostřednictvím CD3, invariantní multiřetězcovou složkou receptorů T lymfocytů (TCR). Bispecifické protilátky namířené na zeta řetězec asociovaný s CD16 na NK buňkách a také s TCR na T lymfocytech jsou schopné zapojit oba typy efektorových lymfocytů (WO 00/03016). Avšak bispecifické protilátky namířené na zeta řetězec, jako např. protilátky namířené na CD3, také aktivují non-cytotoxické CD4 + T lymfocyty, které in vivo, na rozdíl od CD8+ T lymfocytů, přispívají k nežádoucím vedlejším účinkům, např. díky systémovému uvolňování cytokinů, aniž by podstatně přispěly k cytotoxické eliminaci cílových buněk.
NKG2D-specifické multifunkční molekuly podle vynálezu (kterými jsou ve výhodném provedení bifunkční molekuly obsahující první a druhou doménu, jak byly popsány výše) na rozdíl od bispecifických protilátek namířených proti lymfocytům známých v dosavadním stavu techniky, jsou schopny rekrutovat s výjimečnou přesností celou škálu lymfocyrů, které přirozeně nesou cytotoxický fenotyp, tj . NK buňky. CD8+ α/β • ·· ·
T lymfocyty a γ/δ T lymfocyty, aniž by podstatně ovlivnily další typy buněk jako jsou CD4 + α/β T lymfocyty, které obvykle nejsou cytotoxické.
Termín rekrutování cytotoxických lymfocytů, jak se používá v předkládaném popisu vynálezu, není omezen na přesměrovanou lýzu, ale zahrnuje i zesílení cytotoxicity a instruování (priming) T lymfocytů.
Tedy NKG2D-namířené molekuly podle vynálezu jsou unikátní tím, že přesně a úplně, a přitom výlučně, rekrutují všechny relevantní cytotoxické lymfocyty. Dalším rozdílem proti bispecifickým protilátkám namířeným proti lymfocytům známým z dosavadního stavu techniky je to, že multifunkční molekuly podle vynálezu ani přímo ani nepřímo neinteragují se specifickými antigenními receptory cytotoxických lymfocytů zahrnující protisměrné (upstream) cytoplazmatické kroky v odpovídající signální kaskádě. Jinými slovy, funkce komplexu receptoru T lymfocytů není narušena, neboť multifunkční polypeptid podle vynálezu se k němu neváží. Signální kaskáda po směru (downstream) od signálu poskytnutého receptorem T lymfocytů není tudíž ovlivněna interakcí s multifunkčním polypeptidem podle vynálezu. Výsledkem je to, že aktivace cytotoxických lymfocytů je díky jejich antigenní specificitě se zapojují do specifické imunitní reakce proti těm cílovým buňkám, které jsou rozpoznávány multifunkčními a/nebo proliferace selektivně, takže podporována receptorové molekulami podle vynálezu.
Zmíněná protisměrná signální kaskáda T- a NK-buněk zahrnuje polypeptidy ITAM, Src kinázy, ZAP-70/Syk a adaptorové proteiny jako jsou například LAT a SLP-76 zodpovědné za rekrutování efektorových molekul po směru signální kaskády. Signální kaskáda po směru zahrnuje molekuly jako je např. Pl3-kináza a také PLCy, Grb2, Vav, Cbl a Nck.
tt ···· φ *· ·» ·· tttt tt · tt /» · »· · • « · · » · ♦ • · tttt · · · ··· tt tttttt ···· ·· ····
Tím, že zabrání zapojení specifických antigenních receptorů a/nebo protisměrných cytoplazmatických kroků odpovídajících signálních kaskád, multifunkční molekuly podle vynálezu výhodně interferují v menší míře se specifickým rozpoznáváním antigenu ve srovnání s bispecifickými protilátkami známými ve stavu techniky, které se např. vážou k CD16 Fcy receptorovému komplexu NK buněk nebo k CD3 složce TCR komplexu na T lymfocytech. Užitím bispecifických protilátek známých ve stavu techniky mohou být změněny lymfocytové efektorové funkce zprostředkované specifickou imunitní reakcí na cílové buňky zapojením specifických antigenních receptorů a/nebo protisměrnými cytoplazmatickými kroky odpovídajících signálních kaskád. Naproti tomu multifunkční molekuly podle vynálezu zapojením receptorovového komplexu NKG2D, který není ani přímo asociován se specifickými antigenními receptory ani s protisměrnými kroky jejich cytoplazmatických signálních kaskád, jsou schopny zesílit aktivaci těch cytotoxických lymfocytů, které rozpoznávají stejné cílové buňky prostřednictvím svých specifických antigenních receptorů.
To vysvětluje překvapující výsledek popsaný v příkladech této přihlášky, kde NKG2D-zprostředkovaný signál může akcelerovat instruování naivních CD8+ T lymfocytů dokonce i v přítomnosti (i) silného primární signálu zprostředkovaného zapojením antigenně specifického receptorového komplexu T lymfocytů, a (ii) maximální kostimulace poskytnuté B7-1, dominantním mediátorem druhého signálu T lymfocytů.
A dále bylo překvapivě zjištěno, že cytotoxicita CD8+ T lymfocytů a NK buněk spouštěná zapojením TCR-komplexu nebo CD16, v daném pořadí, mohou být zesíleny NKG2Dzprostředkovaným signálem (viz Příklad 6) .
♦
0 0 ♦ 0 0 · · • · · • · 4···
Avšak nejvíce překvapující bylo, že cytotoxicita NK a T lymfocytů a také instruování T lymfocytů mohou být dokonce zesíleny pomocí NKG2D-namířené protilátkové molekuly, která sama neindukuje žádnou podstatnou přesměrovanou lýzu (viz Příklady 5 a 6).
Takže multifunkční NKG2D-namířené polypeptidy podle vynálezu s odlišnými schopnostmi rekrutovat cytotoxické lymfocyty mohou být výhodně vybrány pro odlišné účely. Tak například, pokud je nezbytná jen čistá imunomodulace, mohou být výhodné NKG2D-namířené molekuly, které samy neindukují přesměrovanou lýzu. Avšak eliminace cílových buněk může být mnohem důkladnější, když jsou použity multifunkční NKG2Dnamířené polypeptidy, které přímo spouštějí cytotoxítu lymfocytů. A navíc, pro určité aplikace mohou být výhodné multifunkční NKG2D-namířené polypeptidy, které odlišně rekrutují CD8+ T lymfocyty a NK lymfocyty.
V jiném výhodném provedení předkládaného vynálezu je vazebné místo vazebným místem imunoglobulinového řetězce.
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu je vazebné místo přirozený NKG2D-ligand receptorového komplexu.
Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu je přirozený NKG2D-ligand vybrán ze skupiny, kterou tvoří MIC-A, MIC-B, ULBP1 a ULBP2.
V ještě dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu vazebné místo specificky rozpoznává extracelulární epitop NKG2D nebo DAP10.
A dále ve výhodném provedení předkládaného vynálezu receptorová nebo ligandová funkce je antigenní vazebné místo protilátky nebo jejího fragmentu nebo derivátu proti antigenům asociovaným s nádorem, antigenům infekčních agens, nebo povrchovým markérům subpopuiace buněk jako jsou například
diferenciační antigeny (CD antigeny) , přirozené ligandy nebo receptory nebo jejich fragmenty nebo modifikace, které interagují s antigeny asociovanými s nádory nebo povrchovými markéry, výhodně hereguliny, vážící se na antigeny asociované s nádory erbB-2, -3 a -4, CD4, který interaguje s gp 120 buněk infikovaných HIV, nebo hormon stimulující melanocyty (MSH) , který se váže na MSH receptor na melanocytech a z nich pocházejících nádorech (maligní melanomy) nebo chemokiny vážící se na odpovídající chemokinové receptory, nebo MHC molekuly nebo jejich fragmenty komplexované s peptidy, které se váží na receptory T lymfocytů s předefinovanou specifičností a tedy rozpoznávají určité subpopuiace T lymfocytů nebo antigenní vazebná místa receptorů T lymfocytů, která specificky interagují s předefinovanými MHC-peptidovými komplexy, nebo NKp46, který interaguje s hemaglutininem (HA) viru chřipky.
Předchozí publikace ukázaly, že hemaglutinin viru chřipky může zesilovat lýzu virem infikovaných cílových buněk NK buňkami a také přímo aktivovat NK buňky (Trinchiere, Adv. Immunol. 47 (1989), 187-376, Alsheikhly, Scand J Immunol., 17 (1983), 129-38, Alsheikhly, Scand J Immunol. 22 (1985), 52938). Nedávno bylo ukázáno, že fúzní protein, který tvořila extracelulární doména NKp46 a Fc část imunoglobulinu (Ig), se přímo vázal ke glykoproteinu hemaglutinin-neuraminidáza (HN) exprimovanému na povrchu přechodně transfekovaných buněk 293 (Mandelboim, Nátuře 409 (2001), 1055-60). Přidání buněk NK Gal, NK linie pocházející ze zdravého dárce lymfocytů periferní krev, indukovalo lýzu HN-transfekovaných T lymfocytů 293 alespoň čtyřikrát účinněji než netransfekovaných buněk (Mandelboim, Nátuře 409 (2001), 1055-60). Stejné výsledky byly získány pro cílové buňky infikované virem chřipky. Tato data ukazují, že existuje přímá interakce mezi NKp46 a « · hemaglutininem, a dále demonstrují, že mechanismus pro eliminaci buněk infikovaných virem chřipky pomocí NK buněk je zprostředkován interakcí hemaglutininu (HA) exponovaného na virem infikovaných buňkách a NKp4 6 exprimovaným na povrchu NK buněk.
Receptorová nebo ligandová funkce, která je schopná vazby k hemaglutininu (HA) viru chřipky je například odvozena z monoklonální protilátky jako je např.:
a) monoklonální protilátka IIB4 vázající se na zbytky 155,
159, 188, 189, 193, 198, 199, 201 viru chřipky kmenu H3 (Kostolansky, J Gen 81 (2000), 172735).
b) monoklonální protilátka LMBH6 pocházející z myší postupně imunizované bromelain-štěpeným hemaglutininem (BHA) z viru chřipky A/Aichi/2/68, A/Victoria/3/75 a A/Philippines/2/82 (všechny H3N2), která rozpoznává HA chřipkových kmenů H3N2 (Vanlandschoot, J. Gen. Virol. 79 (1998), 1781-91).
c) monoklonální protilátka (MoAb) C179 namířená na stejnou oblast stonkového úseku HA-H2 (Lipatov, Acta Virol. 41(1997), 337-40).
V tomto provedení vynálezu druhá doména představuje ve výhodném provedení antigen, který je extracelulámí částí povrchové molekuly na buňkách, které se podílejí na patologickém procesu v humánním onemocnění, jako je např. karcinom, virová infekce nebo autoimunitní porucha. Eliminace nebo funkční umlčení takových cílových buněk může být usnadněno in vivo aplikací bifunkční molekuly podle vynálezu, což vede k terapeuticky prospěšnému účinku.
Fragmenty protilátky si uchovávají vazebnou specifičnost kompletní protilátky a patří k nim fragmenty Fab, F(ab ' )2 a Fv.
·*··
00 0·
0 000« · · ·
0 · 0 0 0 · 00 0 · · · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 000 0 000 0000 00 0·00
Deriváty protilátky si také uchovávají vazebnou specifičnost a patří sem fragmenty scFv. Pro další informace viz Marlow and Lané, Antibodies, Laboratory Manual CSH Press, Cold Spring Harbor 1988.
K humánní karcinomům patří například karcinom prsu, karcinom tračníku, karcinom pankreatu, karcinom vaječníků, karcinom ledvinných buněk, karcinom čípku, melanom, malobuněčný plicní karcinom (SCLC), karcinom hlavy a krku, karcinom žaludku, rhabdomyosarkom, karcinom prostaty, folikulární nehodgkinský lymfom (NHL), B lymfocytární lymfom, mnohočetný myelom, T buněčné a B buněčné leukémie, a Hodgkinův lymfom.
K antigenům asociovaným s nádory patří pan-karcinomové antigeny jako je např. CEA (Sundblad Hum. Pathol. 27, (1996)
297-301, Ilantzis Lab. Invest. 76(1997), 703-16), EGFR typu I (Nouri, Int. J. Mol. Med. 6 (2000), 495-500) a EpCAM (17 — 1A/KSA/GA733-2, Balzar J. Mol. Med. 77 (1999), 699-712). EGFR typu I je obzvláště nadměrně exprimován v gliomu, EpCAM v karcinomu tračníku, MRD (minimální reziduální nemoc) a karcinomu tračníku. EGFR typu II (Her-2, ErbB2, Sugano Int. J. Cancer 89 (2000), 329-336) je upregulován (zvýšeně exprimován) v karcinomu prsní žlázy a glykoprotein TAG-72 (sTN antigen, Kathan Arch. Pathol. Lab. Med. 124 (2000), 234-9) byl zjištěn jako nadměrně exprimovaný v karcinomu prsu. EGFR deleční neoepitop by mohl také hrát roli antigenu asociovaného s nádorem (Sampson Proč. Nati. Acad. Sci. USA 97 (2000), 75038). Antigeny A33 (Ritter Biochem. Biophys. Res. Commun. 236 (1997), 682-6), Lewis-Y (DiCarlo Oncol Rep. 8 (2001), 387-92),
Cora (CEA-related Cell Adhesion Molecule CEACAM 6, CD66c, NCA90, Kinugasa Int. J. Cancer 76 (1998), 148-53) a MUC-1 (Mucin) jsou asociovány s karcinomem tračníku (Iida Oncol. Res. 10 (1998), 407-14). Thomsen-Friedenreichův antigen (TF, Galip-3
GalNAcal-O-Thr/Ser) se vyskytuje nejen v karcinomu tračníku (Baldus Cancer 82 (1998), 1019-27) ale také v karcinomu prsu (Glinsky Cancer. Res. 60 (2000), 2584-8). Overexprese Ly-6 (Eshel J. Biol. Chem. 275 (2000), 12833-40) a desmogleinu 4 v karcinomu hlavy a krku a E-cadherinový neoepitop v karcinomu žaludku, jak bylo popsáno (Fukudome Int. J. Cancer 88 (2000), 579-83). Membránový antigen (PSMA, Lapidus Prostatě 45 (2000), 350-4) specifický pro prostatu, antigen kmenových buněk (2000) 288-96)
STEAP prostaty (PSCA, Gu Oncogene 191 (Hubert, Proč Nati Acad Sci U S 96 (1999), 14523-8) jsou asociovány s rakovinou prostaty. Alfa a gamma podjednotky acetylcholinového receptoru fetálního specifické imunohistochemické markéry typu (AChR) jsou pro rhabdomyosarkom (RMS, Gattenlohner Diagn. Mol. Pathol. 3 (1998), 129-34;
Dále byla popsana asociace
CD20 s folikulárním nehodgkinským lymfomem (Yatabe Blood 95 (2000), 2253-61, Vose
Oncology (Huntingt) 2 lymfomem (Kroft Am. J antigen plazmatických (Greiner (2001) 141-7), CD19 s B-buněčným
Clin. Pathol. 115 (2001), 385-95), buněk Wue-1 s mnohočetným myelomem
Virchows Arch 437 (2000), 372-9), CD22 s B lymfocytární leukémií (dÁrena Am. J. Hematol. 64 (2000), 27581), CD7 s T-lymfocytární leukémií (Porwit-MacDonald Leukemia 14 (2000) , 816-25) a CD25 s určitými typy T a B buněčných leukémií (Wu Arch. Pathol. Lab. Med. 124 (2000), 1710-3). CD30 je asociován s Hodgkinovým lymfomem (Mir Blood 96 (2000),
4307-12). Exprese melanomového chondroitinsulfátproteoglykanu (MCSP, Eisenmann Nat. Cell. Biol. 8 (1999), 507-13) a gangliosidu GD3 byla pozorována v melanomech (Welte Exp Dermatol 2 (1997), 64-9), přičemž GD3 byl také pozorován u malobuněčného plicního karcinomu (SCLC, Brezicka Lung Cancer 1 (2000), 29-36). Exprese gangliosidu GD2 byla také zvýšena v
SCLC a v neuroblastomu (Cheresh et al. Cancer Res. 10 (1986), • 4 ·· • · · • ·
5112-8). Karcinom vaječníků je asociován s receptorem Muellerianovy inhibiční substance (MIS) typu II (Masiakos Clin. Cancer Res. 11 (1999), 3488-99) a renální a také cervikální karcinom s expresí karboanhydrázy 9 (MN/CAIX, Grabmaier Int. J. Cancer 85 (2000) 865-70). Zvýšená exprese CA 19-9 byla zjištěna v karcinomu pankreatu (Nazli Hepatogastroenterology 47 (2000), 1750-2).
V nejvýhodnějším provedení předkládaného vynálezu je antigen asociovaný s nádorem vybrán ze skupiny, kterou tvoří: Lewis Y, CEA, Muc-1, erbB-2, -3 a -4, Ep-CAM, E-cadherin neoepitop, EGF-receptor (např. EGFR typu I nebo EGFR typu II), EGFR deleční neoepitop, CA19-9, Muc-1, LeY, TF-, Tn- a sTnantigen, TAG-72, PSMA, STEAP, antigen Cora, CD7, CD19 a CD20, CD22, CD25, Ig-α a Ig-β, A33 a G250, CD30, MCSP a gplOO, CD44v6, MT-MMPs, (MIS) receptor typu II, karboanhydráza 9, F19antigen, Ly6, desmoglein 4, PSCA, Wue-1, GD2 a GD3 a také antigeny TM4SF (CD63, L6, CO-29, SAS) nebo alfa a gamma podjednotky acetylcholinového receptoru fetálního typu (AChR).
Všechny viry chřipky A, B a C mají segmentovaný genom, ale pouze určité subtypy chřipky A a chřipky B způsobují vážné onemocnění u lidí. Dva hlavní proteiny viru chřipky jsou povrchové glykoproteiny - hemaglutinin (HA) a neuraminidáza (NA) . Hemaglutinin (HA) se podílí na vazbě a membránové fúzi virové částice s receptory hostitelské buňky a představuje hlavní cíl pro neutralizační protilátky. Infektivita viru chřipky závisí na štěpení HA specifickými proteázami hostitele. NA se podílí na uvolňování potomstva virionů z buňky. U ptáků, přirozených hostitelů chřipkového viru, způsobuje gastrointestinální infekce a je přenášen faecoorální cestou. U savci se zdá být replikace chřipkových subtypů omezena na buňky respiračního epitelu, avšak mohou nastat i systémové komplikace.
Virus rubelly (RV) je příčinným agens nemoci známé jako spalničky. Spalničky jsou především nemocí dětského věku, a jsou po celém světě endemickou nemocí. Přirozená infekce rubellou se vyskytuje pouze u lidí a je obecně mírná, avšak v dospělém věku mohou nastat komplikace jako je např. polyataralgie. RV infekce u žen během prvního trimestru těhotenství může způsobit celé spektrum vrozených vad u novorozence, známých jako syndrom kongenitální rubelly (CRS) . Způsob, jakým RV infekce vede k teratogenezi není dosud znám. Cytopatologie infikované fetální tkáně vede k předpokladu nekrózy a/nebo apoptózy a také. inhibice buněčného dělení prekurzorových buněk účastnících se organogeneze. Viriony viru rubelly (RV) obsahují dva glykosylované membránové proteiny, El a E2, které existují jakožto heterodimer a tvoří komplexy virových hrotů (spikes) na ovrchu virionů. Vznik heterodimeru E1-E2 je nezbytný pro intracelulámí transport a expresi El a E2 společně na buněčném povrchu (Yang, J. Virol. 72 (1998), 8747-8755). Glykoproteiny El a E2 exprimované na povrchu buněk infikovaných virem rubelly představují cílové molekuly pro vazbu multifunkčních polypeptidů podle předkládaného vynálezu.
Rabies (vzteklina) je významná nemoc zvěře a rabies psů stále ještě představuje jeden z hlavních problémů veřejného zdravotnictví v mnoha rozvojových zemích. Virus rabies je přenášen ve slinách při pokousání zvířetem. Teprve nedávno bylo zjištěno, že virus rabies je přenášen na člověka také netopýry, často bez známé expozice. Ve své klasické formě je nemoc dobře rozpoznávána, ale v případě paralytické nemoci, která se podobá Landreho a Guillain-Barreho syndromu, je diagnóza problematická. Po expozici viru rabies může být vzteklině zabráněno u neimunizovaných pacientů lokálním ··· · • · · · · · « • · · · ····· • · · · « · · ··· · ··· ···· ·· ···· vyčištěním poranění a aplikací vakcíny a humánních rabiesspecifických imunoglobulinů.
Glykoprotein rabies RGP je transmembránový glykoprotein typu I velikosti 505 aminokyselin, který je důležitý pro biologii a patogenezi infekce virem rabies. RGP také stimuluje rozvoj neutralizačních protilátek u hostitele. N-vázaná glykosylace je nezbytná pro imunogenicitu a pro expresi RGP na buněčném povrchu (Wojczyk, Biochemistry 34 (1995), 2599-2609).
RGP viru rabies exprimovaný na povrchu infikovaných buněk představuje cílovou molekulu pro vazbu multifunkčního polypeptidu podle předkládaného vynálezu.
V dalším výhodnějším provedení předkládaného vynálezu je povrchový markér pro infikované buňky vybrán ze skupiny, kterou tvoří antigeny virové obálky, např. u humánních retrovirů (HTLV I a II, HIV1 a 2) nebo humánních herpetických virů (HSVl a 2, CMV, EBV), hemaglutinin např. viru chřipky (chřipka A, B nebo C) , glykoproteiny El a E2 viru rubelly nebo RGP viru rabies.
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu je multifunkční polypeptid bispecifická molekula, výhodně bispecifická protilátka. Pro další informace o konstrukci a přípravě bispecifických protilátek viz WO/00/06605.
Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu je multifunkční polypeptid vybrán ze skupiny, kterou tvoří syntetická, chimérická a humanizovaná protilátka.
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu je multifunkční polypeptid jednořetězcová (protilátka).
V ještě dalším výhodném provedení vynálezu jsou dvě domény spojeny pomocí polypeptidového linkeru (spojky).
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu první a/nebo druhá doména napodobují nebo odpovídají VH a VL úseku ··*· *· ·9 k · · přírodní protilátky. Příklady takových protilátek jsou humánní, myší, potkanní a velbloudí protilátky, protilátky získané z imortalizovaných B-lymfocytů (např. hybridomových buněk), z in vitro sekcí kombinatorických protilátkových knihoven (např. pomocí exprese na fágu - fágového displeje) nebo z Ig-transgenní myši.
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu alespoň jedna doména je jednořetězcový fragment variabilního úseku protilátky.
V ještě dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou domény uspořádány ve sledu VlNKG2D-VhNKG2D-VhTA-Vl-TA nebo VL-TA-VHTA-VHNKG2D-VLNKG2D, kde TA představuje cílový antigen.
Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu je s nádorem asociovaný antigen vybrán ze skupiny, kterou tvoří Lewis Y, CEA, Muc-1, erbB-2, -3 a -4, Ep-CAM, E-cadherin neoepitop, EGF-receptor (např. EGFR typu I nebo EGFR typu II), EGFR deleční neoepitop, CA19-9, Muc-1, LeY, TF-, Tn- a sTnantigen, TAG-72, PSMA, STEAP, antigen Cora, CD7, CD19 a CD20, CD22, CD25, Ig-α a Ig-β, A33 a G250, CD30, MCSP a gplOO, CD44v6, MT-MMPs, (MIS) receptor typu II, karboanhydráza 9, F19antigen, Ly6, desmoglein 4, PSCA, Wue-1, GD2 a GD3 a také TM4SF-antigeny (CD63, L6, CO-29, SAS) nebo alfa a gamma podjednotky fetálního typu acetylcholinového receptoru (AChR).
V dalším zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu polypeptidový linker obsahuje množství glycinových, serinových a/nebo alaninových zbytků.
V jednom dalším zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu polypeptidový linker obsahuje množství po sobě jdoucích kopií aminokyselinové sekvence.
• ·»·
99 99
9 9 9
9 9 » • 9 9 9 · • < · 9
999 99 9999
A dále ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu polypeptidový linker obsahuje 1 až 5, 5 až 10 nebo 10 až 15 aminokyselinových zbytků.
V nejvýhodnějším provedení předkládaného vynálezu polypeptidový linker obsahuje aminokyselinovou sekvenci: GlyGly-Gly-Gly-Ser.
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu multifunkční polypeptid obsahuje alespoň jednu další doménu.
Imunitní reakce specifické pro cílové buňky mohou být dále podpořeny kombinací bifunkční molekuly podle vynálezu s činidly, která mají kostimulační nebo koaktivační vlastnosti na cílovou buňku.
V jedné alternativní kombinaci s další činidlem molekuly podle vynálezu mohou samy být vybaveny dalšími funkčními doménami, které mohou být připojeny např. přes další aminokyselinový linker. Tyto další domény mohou např. zprostředkovat CD28- nebo CD137-zapojení (viz dále). Navíc lze předpokládat, že mohou být konstruovány deriváty bifunkční molekuly podle vynálezu, které obsahují více než jednu přídatnou funkční doménu.
Alternativně molekuly podle vynálezu mohou být v přípravku kombinovány s více než jedním dalším činidlem, např. s jednou molekulou, která zapojuje CD28, a další molekulou, která zapojuje CD137.
Tato činidla zmíněná výše mohou např. obsahovat vazebné místo specificky rozpoznávající cílové buňky a extracelulární doménu B7-1 (CD80) nebo B7-2 (CD86) , které interagují s CD28 na T- a NK-lymfocytech. Alternativně, B7-1 nebo B7-2 mohou být nahrazeny vazebným místem CD28-specifické protilátky. na T lymfocytech CD28 působí jako kostimulační molekula, která je absolutně nezbytná ke zprostředkování tzv. druhého signálu
999 9 * 99 to· ·
9 9 ·
99 9
9 9
9 9
9 to
9 9 9
9 9
9999 v průběhu aktivace primárních T lymfocytů prostřednictvím antigenně specifického zapojení TCR ( = první signál). Na NK buňkách CD28 přispívá k indukci cytotoxicity proti cílovým buňkám exprimujícím CD28 ligandy (Chambers (1996) Immunity 5: 311) . Další činidla, která mohou být výhodně kombinována s bifunkční molekulou podle vynálezu obsahovat vazebné místo specificky rozpoznávající cílovou buňku a vazebné místo CD137specifické protilátky nebo extracelulámí část CD137-Iigandu.
V nejvýhodnější provedení vynálezu další doména je připojena prostřednictvím kovalentní nebo nekovalentní vazby.
V dalším nejvýhodnějším provedení předkládaného vynálezu alespoň jeden další doména obsahuje efektorovou molekulu mající konformaci vhodnou pro biologickou aktivitu, schopnou sekvestrace iontu nebo selektivní vazby k pevnému nosiči nebo k preselektované determinantě.
V ještě dalším nejvýhodnějším provedení předkládaného vynálezu další doména má kostimulační a/nebo koaktivační funkci.
Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu je kostimulační funkce zprostředkována pomocí CD28-ligandu nebo CD137-Iigandu.
V dalším zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu CD28-ligand nebo CD137-ligand je B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), aptamer nebo protilátka nebo její funkční fragment nebo funkční derivát.
Termín funkční fragment protilátky je definován jako fragment protilátky, který si uchovává vazebnou specifičnost původní protilátky (viz například Harlow and Lané, Antibodies, Laboratory Manual LSH Press, Cold Spríng Harbor, 1988). Příkladem takových fragmentů jsou fragmenty Fab a F(ab)2 fragment.
«••toto · » to ·· ·· • · « 9 · · · ··· • to · · · · »
Funkční deriváty protilátky si uchovávají nebo v podstatě uchovávají vazebnou specifičnost původní protilátky. Příkladem takového derivátu je fragment scFv.
Předkládaný vynález se týká také polynukleotidu, který po expresi kóduje multifunkční polypeptid a/nebo funkční část multifunkčního polypeptidů podle vynález. Termín funkční část je definován v kontextu předkládaného vynálezu jako ta část, která nese specifickou funkci první, druhé nebo jakékoliv další domény multifunkčního polypeptidového konstruktu podle vynálezu.
Polynukleotid podle vynálezu je DNA, RNA nebo jejich derivát jako je například PNA. Výhodně je polynukleotid podle vynálezu DNA.
A dále se vynález týká vektoru, který obsahuje polynukleotid podle předkládaného vynálezu.
Mnohé vhodné vektory jsou odborníkům v molekulární biologií známy, výběr pak závisí na požadované funkce, a patří k nim plazmidy, kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory obvykle používané v genetickém inženýrství. Metody, které jsou odborníkům dobře známy a mohou být použity ke konstrukci různých plazmidů a vektorů byly popsány v odborné literatuře, viz například Sambrook, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y, a Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Vektory podle vynálezu mohou být rekonstituovány do liposomů vhodných pro přenos do cílových buněk.
Vektory mohou být například fágy, plazmidy, virové nebo retrovirové vektory. Retrovirové vektory mohou být replikačně kompetentní nebo replikačně defektní. V případě replikačně • · · « a
defektnich retrovirů k množení viru obecně dochází pouze v komplementujících hostitelských buňkách.
Polynukleotidy mohou být připojeny k vektoru obsahujícímu selekční markér pro propagaci (množení) v hostiteli. Obecně, plazmidový vektor je vnášen ve formě precipitátu, jako je například precipitát s fosforečnanem vápenatým, nebo ve formě komplexu s nabitými lipidy. Jestliže vektorem je virus, může být sbalen in vitro užitím vhodné sbalovací buněčné linie a pak transdukován do hostitelských buněk.
Polynukleotidový inzert by měl být operativně spojen s vhodným promotorem, jako je například promotor PL fága lambda, lac, trp, phoA a tac promotory z E. coli, časné a pozdní promotory SV40 a promotory retrovirových LTR, aby bylo uvedeno alespoň několik málo příkladů. Další vhodné promotory jsou odborníkům dobře známy. Expresní konstrukty dále obsahují místa pro iniciaci transkripce a terminaci a v transkribovaném úseku také ribosomální vazebné místo pro translaci. Kódující úsek transkriptů exprimovaný pomocí konstruktů výhodně obsahuje na počátku iniciační kodon translace a na konci polypeptidu, který má být translatován, vhodně umístěný terminační kodon (UAA, UGA nebo UAG).
Jak se ukazuje, expresní vektory výhodně obsahují alespoň jeden selekční markér. K takovým markérům patří dihydrofolátreduktáza, rezistence ke G418 nebo neomycinu pro kultury eukaryotických buněk, a geny rezistence k tetracyklinu, kanamycinu nebo ampicilinu pro kultury E. coli a další bakterie. K reprezentativním příkladům vhodných hostitelů, které však nejsou omezující, patří bakteriální buňky, jako jsou například buňky E. coli, Streptomyces a Salmonella typhimurium, buňky hub, jako jsou například kvasinky, buňky hmyzu, jako jsou například buňky S2 z Drosophila a buňky Sf9 ze Spodoptera, živočišné buňky, jako
ft ♦ · · · ft · · • · • ·
• ft · • · * ft • « ·
ft á • · • ft 9
• · • · • • ft
• · · < • » • ftftft
jsou například buňky CHO, COS, 293 a buňky Bowesova melanomu, a také rostlinné buňky. Vhodná kultivační média a podmínky pro výše popsané hostitelské buňky jsou v oboru dobře známy.
K výhodným vektorům pro použití v bakteriích patří pQE70, pQE60 a pQE-9, které jsou dostupné od firmy QIAGEN, lne., vektory pBluescript, Phagescript vektory, pNH8A, ρΝΗΙβΑ, ρΝΗΐδΑ, pNH46A, které jsou dostupné od firmy Stratagene Cloning Systems, lne., a ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 a pRIT5, které jsou dostupné od firmy Pharmacia Biotech, lne.
K výhodným vektorům pro použití v eukaryotických buňkách jsou pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI a pSG dostupné od firmy Stratagene, a pSVK3, pBPV, pMSG a pSVL dostupné od firmy Pharmacia. Obecně k typickým klonovacím vektorům patří pBscpt sk, pGEM, pUC9, pBR322 a pGBT9. K typickým expresním vektorům patří pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT. Další vhodné vektory jsou odborníkům známy a jsou snadno dostupné.
Dále mohou být také použity např. savčí buňky, které již obsahují ve svém genomu molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid popsaný výše, ale neexprimují ho stejně nebo ho neexprimují vhodným způsobem, např. díky slabému promotoru, a do savčích buněk mohou být vneseny regulační sekvence, jako je například silný promotor, do těsné blízkosti endogenní molekuly nukleové kyseliny kódující polypeptid, a tím indukována exprese tohoto polypeptidu.
V tomto kontextu termín regulační sekvence označuje molekulu nukleové kyseliny, která může být použita k zesílení exprese polypeptidu, a sice tím, že se integruje do genomu buňky v těsné blízkosti kódujícího genu. K takovým regulačním sekvencím patří promotory, enhancery (zesilovače), inaktivované umlčující intronové sekvence, 3'UTR a/nebo 5 ' UTR kódující úseky, proteinové a/nebo RNA stabilizující elementy, molekulv nukleové kvselinv kódující reculační proteiny, např., transkripční faktory schopné indukovat nebo spouštět genovou expresi nebo další kontrolní elementy genové exprese, o kterých je známo, že aktivují genovou expresi a/nebo zvyšují množství genového produktu. Vložení regulační sekvence vede ke zvýšení a/nebo indukci exprese polypeptidu, což nakonec vede ke zvýšenému množství polypeptidu v buňce. Tedy cílem předkládaného vynálezu je buďto de novo exprese polypeptidu a/nebo zvýšení exprese polypeptidu.
Předkládaný vynález se dále týká buněk transfekovaných polynukleotidem podle vynálezu.
Buňky podle vynálezu jsou buňky eukaryotické (např. kvasinky, hmyzí nebo savčí buňky) nebo prokaryotické buňky. Nej výhodněji jsou buňky podle vynálezu savčí buňky, jako jsou například humánní buňky, které mohou být členy buněčné linie jako jsou např. buněčné linie CHO, COS, 293 nebo buňky Bowesova melanomu.
Vnesení konstruktu do hostitelské buňky může být provedeno pomocí transfekce s kalciumfosfátem, DEAE-dextranem zprostředkovanou transfekcí, transfekcí zprostředkovanou kationtovým lipidem, elektroporací, transdukcí, infekcí nebo dalšími metodami. Takové metody jsou popsány v mnoha základních standardních laboratorních příručkách, jako je například Davis, Basic Methods In Molecular Biology (1986). Konkrétně vynález zahrnuje i situaci, kdy polypeptidy jsou exprimovány hostitelskou buňkou postrádající rekombinantní vektor.
Předkládaný vynález dále poskytuje molekuly nukleové kyseliny obsahující polynukleotid kódující expresi multifunkčního polypeptidu a/nebo funkční části multifunkčního polypeptidu podle vynálezu jak je popsán v tomto textu a v připojených příkladech. Sekvence nukleové kyseliny dvou odlišných fragmentů humánního NKG2D zahrnující nukleotidy (nt) tttttt ·« ·· • · · · · « · tt · · · · • · · <· · · • tt · · · tt · tt tttttt · · · tttttttt až 462 a (nt) 123 až 462 odpovídající aminokyselinovým sekvencím SEKVENCE ID. Č. 3 a SEKVENCE ID. Č. 4 byly amplifikovány pomocí PCR z cDNA-templátu ukázaného na obrázku 1. Výsledné plazmidy VV1-NKG2-D (nt 64-462) a VV1-NKG2-D (nt 123-462) byly použity k imunizaci tří myší BALB/c ve stáří 6 až 8 týdnů, jak je popsáno v připojených příkladech. Výsledné lymfocyty byly fúzovány s buňkami myšího myelomu SP2/0 (z ATCC, Americké sbírky tkáňových kultur a mikroorganismů) a pak byla provedena selekce hybridomů, jak je ukázáno v příkladech. Bylo ukázáno, že tři hybridomy nazvané 11B2, 8G7 a 6E5 tvoří monoklonální protilátky reaktivní s nativním NKG2D na povrchu jako humánních CD8+ T lymfocytů tak i NK-buněk (pro další informace viz připojené příklady). Dále se ukázalo, že supernatanty subklonů 11B2D10, 8G7C10 a 6E5A7 reagovaly s
NKG2D na CD56+ NK- a CD8+ T lymfocytech (jak je prokázáno v připojených příkladech). Tyto subklony byly uloženy v DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Německo, 23. března 2001, v souladu s požadavky Budapešťské dohody o ukládaní mikroorganizmů.
Dále se vynález týká způsobu přípravy multifunkčního polypeptidu a/nebo částí multifunkčního polypeptidu podle vynálezu, který zahrnuje kultivací buněk podle předkládaného vynálezu a izolaci multifunkčního polypeptidu nebo jeho funkčních částí z kultur, jak bylo popsáno například v publikaci Mack, 1995, PNAS, 92, 7021.
Polypeptidy mohou být izolovány a purifikovány z rekombinantních buněčných kultur metodami, které jsou odborníkům dobře známy, jako je např. precipitace s ammoniumsulfátem nebo ethanolem, kyselá extrakce, aniontova nebo kationtová chromatografie na iontoměniči, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie s hycrofobní interakcí, afinitní chromatografie, chromatografie na hydroxyapatitu, a lektinová chromatografie. Nejvýhodnější je použít pro purifikaci vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).
V závislosti na hostiteli použitém v postupu rekombinantní produkce, polypeptidy mohou být glykosylovány nebo nejsou glykosylovány. Kromě toho, polypeptidy mohou také obsahovat iniciační (modifikovaný) methioninový zbytek, v některých procesů zprostředkovaných dobře známo, že N-koncový případech hostitelem.
jakožto výsledek Tedy, v oboru je methionin kódováný po translaci iniciačního kodonu je obecně po translaci s vysokou účinností odstraňován z jakéhokoliv proteinu ve všech eukaryotických buňkách. Zatímco N-koncový methionin u většiny proteinu je také účinně odstraněn i u u některých proteinů je neúčinný, a sice v prokaryotický závislosti na většiny prokaryot, odstraňovači proces povaze aminokyseliny, kovalentně navázán.
na kterou je N-koncový methionin
Je třeba také rozumět, že proteiny mohou být exprimovány v bezbuněčných systémech, např. užitím in vitro translačních systémů, které jsou odborníkům dobře známy.
Termín exprese znamená tvorbu (produkci) proteinové nebo nukleotidové sekvence v buňce. Avšak tento termín také zahrnuje expresi proteinu bezbuněčných systémech. Zahrnuje transkripci na RNA produkt, post-transkripční modifikace a/nebo translaci na proteinový produkt nebo polypeptid z DNA, která kóduje produkt, a také případné post-translační modifikace (viz výše). V závislosti na použitých specifických konstruktech a podmínkách, proteiny mohou být izolovány z buněk, z kultivačního média nebo s obou.
Termíny protein a polypeptid používané v předkládané přihlášce jsou vzájemně zaměnitelné. Polypeptid se týká polymeru aminokyselin (aminokyselinové sekvence) a nijak se • ··« ► · 9999 netýká specifické délky molekuly. Takže definice polypeptidů zahrnuje peptidy i oligopeptidy. Tento termín se také týká nebo zahrnuje modifikované polypeptidy, kdy post-translační modifikace jsou například glykosylace, acetylace, fosforylace apod. definice zahrnuje například polypeptidy obsahující jeden nebo více analogů aminokyselin (včetně například nepřírodních aminokyselin apod.), polypeptidy se substituovanými vazbami, a také další modifikace v oboru známé, jak přirozeně se vyskytující tak i umělé. Tak například odborníkovi je dobře známa možnost exprimovat nejenom nativní protein, ale také exprimovat protein jako fúzní polypeptid, nebo přidat signální sekvenci cílící (směrující) protein do specifického kompartmentu hostitelské buňky, např. zajišťující sekreci proteinu do kultivačního média apod. Protein podle vynálezu může být také exprimován jako rekombinantní protein s jednou (polypeptidovou) nebo více polypeptidovými doménami přidanými pro usnadnění purifikace proteinu. K takovým doménám usnadňujícím purifikaci patří, avšak výčet není nijak omezující, peptidy chelatující kovy, jako jsou například histidin-tryptofanové moduly umožňující zmobilizovaných kovech, domény proteinu purifikaci na zmobilizovaném imunoglobulinu, a doména použitá v extenzním/afinitním purifikačním systému FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA) . Vložení štěpitelné spojovací sekvence, jako je například faktor XA nebo enterokináza (Invitrogen, San Diego, CA) mezi purifikační doménu a požadovaný protein, je také užitečné pro usnadnění purifikace. Jeden z takových expresních vektorů poskytuje expresi fúzního proteinu obsahujícího protein interagující s buněčným cyklem, a obsahuje nukleovou kyselinu kódující 6 hístidinových zbytků následovanou thioredoxinem a štěpným místem enterokinázy. Histidinové zoytky umožňují purifikaci pomocí IMIAC (afinitní chromatoarafíz ímzózLizovaným iontem kovu, popsaná v Porath, purifikaci na A umožňující
Protein Expression and Purification 3 (1992), 263-281), zatímco enterokinázové štěpné místo poskytuje prostředek, jak oddělit (vyčistit) požadovaný protein z fúzního proteinu. Kromě rekombinantní produkce, fragmenty proteinu podle vynálezu mohou být vytvořeny také přímo peptidovou syntézou metodami syntézy na pevné fázi (viz např. Stewart et al (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154). Proteinová syntéza in vitro může být prováděna buďto ručně nebo s použitím automatických přístrojů. Automatizovanou syntézu lze provádět například s použitím syntetizátoru peptidů Applied Biosystems 431 (Perkin Elmer, Foster City, CA) podle protokolu od výrobce. Různé fragmenty polypeptidu podle vynálezu mohou být syntetizovány chemicky a/nebo modifikovány odděleně a pak spojeny chemickými metodami, aby vytvořily kompletní molekulu. Jakmile je jednou exprimován nebo syntetizován, protein podle předkládaného vynálezu může být purifikován standardními postupy, které jsou odborníkům známy, včetně precipitace ammoniumsulfátem, použití afinitní kolony, chromatografie na koloně, gelové elektroforézy apod., viz např. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982). V podstatě čistý proteiny jsou výhodně přibližně alespoň z 90 až 95 % homogenní, ne j výhodněj ší pro farmaceutické použití je homogenita 98 až 99 % nebo vyšší. Jakmile je jednou purifikován, buďto částečně nebo do požadovaného stupně homogenity, protein podle vynálezu může pak být použit terapeuticky (včetně extrakorporálního použití) nebo použit pro vývoj a realizaci testů.
Předkládaný vynález se dále týká přípravku, který obsahuje polypeptid podle vynálezu, polynukleotíd podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu.
Ve výhodném provedení přípravku podle předkládaného vynálezu přípravek dále obsahuje molekulu, která poskytuje kostimulační a/nebo koaktivační funkci.
V takovém provedení přípravek podle vynálezu může obsahovat multifunkční polypeptid, který buďto obsahuje nebo neobsahuje další doménu, jak byla definována výše v tomto textu. Jestliže multifunkční polypeptid obsahuje další doménu, která poskytuje kostimulační a/nebo koaktivační funkci, pak další molekula obsažená v přípravku podle vynálezu může mít stejnou nebo odlišnou kostimulační a/nebo koaktivační funkci.
V přípravku obsažené složky jsou ve společném balení jako oddělené složky např. v jedné nebo více nádobkách, např. lahvičkách, výhodně ve sterilních podmínkách, volitelně v pufru nebo vodném roztoku, jejichž příklady jsou specifikovány v tomto textu níže.
Ve zvláště výhodném provedení přípravku podle předkládaného vynálezu je kostimulační funkce zprostředkována pomocí CD28-ligandu nebo CD137-ligandu.
V jiném výhodném provedení přípravku podle předkládaného vynálezu CD28-ligand nebo CD137-ligand je B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), aptamer nebo protilátka nebo její funkční fragment nebo derivát.
V dalším výhodném provedení přípravku podle předkládaného vynálezu přípravek je farmaceutický přípravek dále volitelně obsahující farmaceuticky přijatelný nosič.
Přípravky podle vynálezu mohou také obsahovat, a to v závislosti na požadované lékové formě (formulaci), farmaceuticky přijatelné, obvykle sterilní, netoxické nosiče nebo ředidla, které jsou definovány jako vehikula obecně používaná pro formulaci farmaceutických přípravků pro veterinární nebo humánní podávání. Ředidlo je vybráno tak, aby
·· ·· 44
4 4 4 · 4 4
4 4 4 « • 4 · 4 · 4
4 4 4 4
44« 4444 44 4444 neovlivňovalo biologickou aktivitu výsledné kombinace. K příkladům takových ředidel patří destilovaná voda, fyziologický roztok (soli), Ringerův roztok, roztok dextrózy a Hankův roztok. Kromě toho, farmaceutický přípravek nebo formulace mohou také obsahovat další nosiče, adjuvancia nebo netoxické, neterapeutické a neimunogenní stabilizátory apod.
Terapeuticky účinná dávka označuje takové množství proteinu nebo jeho protilátky, antagonisty nebo inhibitoru, které zmírní symptomy nebo zlepší stav. Terapeutická účinnost a toxicita sloučeniny může farmaceutickými postupy na experimentálních zvířatech, být stanovena standardními buněčných kulturách nebo např. jako ED50 (dávka terapeuticky účinná u 50 % populace) a LD50 (dávka letální pro 50 % populace). Poměr dávek mezi terapeutickými a toxickými účinky je terapeutický index a vyjadřuje se jako podíl LD50/ED50.
Další příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou v oboru dobře známy a patří k nim fosfátem pufrovaný roztok soli, voda, emulze, jako je například emulze typu olej/voda, různé typy smáčedel, sterilní roztoky apod. Přípravky obsahující takové nosiče mohou být formulovány obvyklými metodami. Tyto farmaceutické přípravky mohou být podávány pacientovi ve vhodných dávkách. Podávání vhodný přípravků lze provádět různými způsoby, např. formou intravenózního, intraperitoneálního, subkutánního, intramuskulárního, topického nebo intradermálního podávání. Léčebný režim stanoví ošetřující lékař s ohledem na klinické faktory. Jak je odborníkům v medicíně dobře známo, dávky pro kteréhokoliv pacienta závisí na mnoha faktorech, jako je např. velikost pacienta, plocha povrchu těla, věk, konkrétní podávaná sloučenina, pohlaví, doba a způsob podávání, celkový zdravotní stav a případně další současně podávané léky. Typické dávky
00
00
0 0
0000 jsou v rozmezí například 0,001 až 1000 pg (nukleové kyseliny pro expresi nebo pro inhibici exprese v tomto rozsahu), avšak mohou být i značně nižší nebo vyšší než tento rozsah uvedený jako příklad, zejména vzhledem k výše zmíněným faktorům. Obecně by měl být léčebný režim pro pravidelné podávání farmaceutického přípravku by měl být v rozsahu 1 pg až 10 mg jednotek na den. Pokud jde o léčebný režim kontinuální infúzí, dávky by měly být v rozsahu 0,1 pg až 10 mg jednotek na kilogram tělesné hmotnosti na minutu.
Denní režim perorálních dávek je výhodně přibližně 0,1 až 80 mg/kg celkové tělesné hmotnosti, výhodně přibližně 0,2 až 30 mg/kg, výhodněji přibližně 0,5 mg až 15 mg. Denní parenterální režim je přibližně 0,1 pg/kg až 100 mg/kg celkové tělesné hmotnosti, výhodně přibližně 0,3 pg/kg až 10 mg/kg, výhodněji přibližně 1 pg/kg až 1 mg/kg. Denní režim při topickém podávání je v dávkách výhodně 0,1 mg až 150 mg, podávaných jednou až čtyřikrát, výhodně dvakrát až třikrát denně. Dávka při denním režimu při podávání formou inhalace je výhodně přibližně 0,01 mg/kg až 1 mg/kg na den.
Postup léčení může být monitorován pomocí periodických hodnocení. Dávky jsou různé, avšak výhodná dávka pro intravenózní podávání DNA je přibližně 106 až 1012 kopií DNA molekuly. DNA může také být podávána přímo do cílového místa, např. pomocí biolistického (biobalistického) zařízení pro interní nebo externí cílové místo, nebo také pomocí katétru do místa v arterii. Přípravky obsahující např. polynukleotid, molekulu nukleové kyseliny, polypeptid, protilátku, léčivou, sloučeninu, jeji prekurzor (předléčivo) nebo její farmaceuticky přijatelné soli mohou být podávány jakýmkoliv způsobem obvykle používaným pro podávání léčiv, například tedy perorálně, topicky, parenterálně nebo inhalací. K přijatelným sciím parrr icetát, methylester, HCI, sulfát, chlorid apod.
• 9 «4 4* • 4 4 4 4 · · 444
4 4 4 4 9 4
4 4 94444
4 4 4 4 4 4 • 4« 4 44« 4444 44 4444
Léčiva mohou být podávána v obvyklých lékových formách připravených kombinací léčiv se standardními farmaceutickými nosiči obvyklými postupy. Léčiva a předléčiva identifikovaná a získaná podle předkládaného vynálezu mohou být také podávána v obvyklých dávkách v kombinaci se známou druhou terapeuticky účinnou sloučeninou. K takovým terapeuticky účinným sloučeninám patří například sloučeniny uvedené již výše. Standardní postupy zahrnují míchání, granulaci a lisování, nebo rozpouštění jednotlivých komponent, jak je to potřeba pro požadovanou formulaci. Je známo, že forma a charakter farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla jsou určovány množstvím účinných složek, které musí být v přípravku kombinovány, způsobem podávání a dalšími proměnnými faktory, které jsou odborníkům známy. Nosiče musí být přijatelné v tom smyslu, že musí být kompatibilní s dalšími složkami přípravku a nesmějí nijak negativně ovlivňovat příjem přípravku organizmem. Použitý farmaceutický nosič může být buďto tuhá látka nebo kapalina. K příkladům tuhých nosičů patří laktóza, terra alba, sacharóza, talek, želatina, agar, pektin, arabská guma, stearát hořečnatý, stearová kyselina apod. K příkladům kapalných nosičů patří fosfátem pufrovaný roztok soli, sirup, olej jako je například arašídový olej a olivový olej, voda, emulze, různé typy smáčedel, sterilní roztoky apod.. Nosiče nebo ředidla mohou obsahovat látky, které zpožďují účinek, kteréžto látky jsou odborníkům dobře známy, příkladem je monostearát nebo distearát glycerolu samotný nebo s voskem. Mohou být využity různé farmaceutické (lékové) formy. Pokud je použit tuhý nosič, pak přípravek může být tabletován, vložen ve formě prášku nebo pelet do tvrdé želatinové tobolky nebo ve formě pastilky nebo zdravotního bonbonu. Množství tuhého nosiče je různé pro různé formy, ale výhodně je přibližně 25 mg až 1 g. Když je použit kapalný nosič, přípravek je ve formě sirupu, emulze, měkké ·«·· želatinové tobolky, sterilní tekutiny pro injekci v ampuli nebo nevodná kapalná suspenze.
Přípravek může být podáván topicky, tedy jinými slovy nesystémovým způsobem, kdy podávaná sloučenina nevstupuje významně do krevního oběhu. To zahrnuje externí aplikaci na epidermis nebo do bukální dutiny, vkapávání sloučeniny na ucho, do oka nebo do nosu. Naproti tomu systémové podávání se týká perorálního, intravenózního, intraperitoneálního a intramuskulárního podávání.
Lékové formy vhodné pro topické podávání představují tekutý nebo polotekutý přípravek vhodný pro penetraci přes kůži na místo zánětu, jako je například mazání, locíon, krém, mast nebo pasta a kapky vhodný pro podávání na oko, do ucha nebo do nosu. účinná složka může představovat v případě léku pro topické podávání 0,001 % až 10 % (hmot.), například 1 % až 2 % hmotnosti přípravku. Může to být až 10 % (hmot.), ale výhodně je to méně než 5 % (hmot.), výhodněji 0,1 % až 1 % (hmot.) přípravku. Lociony podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které jsou vhodné pro aplikaci na kůži nebo na oko, a které jsou vhodné např. například pro použití při UV ochraně. Oční lociony obsahují sterilní vodný roztok volitelně obsahující baktericidní látky, a připravují se podobným způsobem jako oční kapky. Lociony nebo mazání pro aplikaci na kůži mohou také obsahovat činidla, která urychlují vysýchání a ochlazují kůže, jako je například alkohol nebo aceton, a zvlhčovadla jako je například glycerol nebo olej jako je například ricínový olej nebo arašídový olej.
Krémy, masti nebo pasty podle předkládaného vynálezu jsou polotuhé formulace účinné látky pro externí aplikace. Mohou být připraveny smícháním účinné složky jemně rozdrcené nebo práškové formě, samotné nebo v roztoku nebo suspenzi ve vodné nebo nevodné kapalině, užitím vhodného zařízení, s mastným •t • · ···· ·· · · • · • · · • · «·· · · ·· ·· • 9 9
9 9 · · • · ·
9900 nebo nemastným základem. Masťový základ obsahuje uhlovodíky jako je například tuhý, měkký nebo tekutý parafin, glycerol, včelí vosk, metalické mýdlo, guma (arabská), olej přírodního původu jako je například mandlový, kukuřičný, arašídový, ricínový nebo olivový olej, tuk z vlny a jeho deriváty nebo mastné kyseliny, jako je například stearová nebo olejová kyselina, spolu s alkoholy, jako je například propylenglykol nebo makrogol. Přípravky mohou dále obsahovat jakákoliv vhodná povrchově aktivní činidla (surfaktanty) , jako je například aniontový, kationtový nebo neiontový surfaktant jako je například sorbitanester nebo jeho polyoxyethylenový derivát. Suspendující činidla, jako jsou například přírodní gumy, deriváty celulózy nebo anorganické materiály, jako jsou například křemičitany, a další přísady, jako je například lanolin, může být také součástí přípravku.
Kapky podle předkládaného vynálezu obsahují sterilní vodné nebo olejové roztoky nebo suspenze a mohou být připraveny rozpuštěním účinné složky ve vhodném vodném roztoku baktericidního a/nebo fungicidního činidla a/nebo jakéhokoliv jiného vhodného konzervačního činidla, výhodně včetně povrchově aktivního činidla (surfaktantu). Výsledný roztok může pak být vyjasněn filtrací, přenesen do vhodné nádobky, která je pak uzavřena a sterilizována autoklávováním nebo alespoň půlhodinovou inkubací při teplotě 98 až 100 °C. Alternativně může být roztok sterilizován filtrací a přenesen do vhodné nádobky aseptickým způsobem. Příkladem baktericidního a fungicidního činidla vhodného pro přidání do kapek je nitrát nebo acetát fenylrtuťnatý (0,002%), chlorid benzalkonia (0,01 %) a chlorhexidinacetát (0,01 %). Vhodným rozpouštědlem pro přípravu olejového roztoku je např. glycerol, naředěný alkohol a propylenglykol. Přípravek podle předkládaného vynálezu může být podáván parenterálně, tj.
·« intravenózním, intrámuskulárním, subkutánním, intranazálním, intrarektálním, intravaginálním nebo intraperitoneálním způsobem podávání. Obecně jsou výhodné subkutánní a intramuskulární formy parenterálního podávání. Vhodné lékové formy pro takové podávání mohou být připraveny obvyklými postupy. Přípravek může také být podáván pomocí inhalace, tj . užitím intranazální a perorální inhalace.. Vhodnou lékovou formou pro takové podávání je například aerosolový přípravek nebo inhalátor s odměřenými dávkami, které lze vyrobit známými postupy.
V jiném výhodném provedení přípravku podle předkládaného vynálezu je přípravek diagnostický přípravek volitelně dále obsahující vhodný prostředek pro detekci.
například (c) radiomohou být
K vhodným prostředkům pro detekci patří (a) chromofory, (b) fluorescenční barviva, nukleotidy, biotin nebo DIG. Tyto značky kondenzovány s nukleotidovými analogy. Značení amplifikované cDNA se může provádět postupme popsaným v připojených příkladech nebo jak popsal, kromě jiných, Spirin (1999),
Invest. Opthamol. Vis. Sci. 40, 3108-3115
Předkládaný vynález se týká také použití multifunkčního polypeptidu podle vynálezu, polynukleotidu podle vynálezu nebo vektoru podle vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení onemocnění jako jsou karcinomy, infekční a/nebo autoimunitní onemocnění, rakovina (tj. maligní solidní nádory a hematopoetické formy karcinomu jako jsou leukemie a lymfomy), benigní nádory jako je např. benigní hyperplázie prostaty (BPH), autonomní adenom štítné žlázy nebo jiných endokrinních žláz, adenom tračníku, počáteční stádia maligních onemocnění, infekční onemocnění způsobená viry, bakteriemi, houbami, protozoy nebo helminty, autoimunitní onemocnění, kdy je požadována eliminace subpopulace imunitních buněk, která je • · příčinou nemoci, prevence rejekce transplantátu nebo různé alergie.
Ve výhodném provedení použití podle předkládaného vynálezu infekční onemocnění je infekce virová, bakteriální nebo houbová, karcinom (kůže) hlavy a krku, karcinom žaludku, karcinom jícnu, kolorektální karcinom jater a žlučovodu, karcinom, malobuněčný plicní karcinom, karcinom tračníku, karcinom pankreatu, plicní karcinom, karcinom hrtanu, karcinom prsu, maligní melanom, mnohačetný myelom, sarkomy, rhabdomyosarkomy, lymfomy, folikulární nehodgkinský lymfom, leukemie, leukemie T- a B-lymfocytů, Hodgkinův lymfom, lymfom B-lymfocytů, karcinom vaječníků, karcinom dělohy, karcinom děložního čípku, karcinom prostaty, karcinom genitálií, karcinom ledvin, karcinom varlete, karcinom štítné žlázy, karcinom močového měchýře, plazmacytom nebo karcinom mozku, a autoimunitní onemocnění je ankylozující spondylitida, akutní uveitida, Goodpastureův syndrom, roztroušená skleróza mozkomíšní, Gravesova nemoc, Myasthenia gravis, systémový lupus erythematosis, diabetes mellitus závislý na inzulínu, revmatoidní artritida, Pemphigus vulgaris, Hashimotova thyroíditida nebo autoimunitní hepatitída.
Předkládaný vynález se dále týká použití polynukleotidu podle vynálezu nebo vektoru podle vynálezu pro výrobu přípravku pro genovou terapii.
Z popisu předkládaného vynálezu také plyne, že různé polynukleotidy a vektory kódující výše popsané peptidy nebo polypeptidy jsou podávány buďto samotné nebo v jakékoliv kombinaci užitím standardních vektorů a/nebo jiných systémů pro aplikaci genů, a volitelně společně s farmaceuticky přijatelným nosič nebo excipientem. Například polynukleotid podle vynálezu může být použit samotný nebo jako součást vektoru pro expresi (póly)peptidu podle vynálezu v buňkách, např. pro účely genové terapie nebo diagnostiky onemocněni, které patři k onemocněním nebo souvisí s onemocněními uvedenými výše. Polynukleotidy nebo vektory podle vynález jsou vkládány do buněk, které pak produkují (póly)peptid. Následně po podání polynukleotidy nebo vektory podle vynálezu mohou být trvale integrovány do genomu pacienta. Na druhé straně mohou být užity takové virové vektory, které jsou specifické pro určitý typ buněk nebo tkáně a persistují v takových buňkách. Vhodné farmaceutický nosiče a excipienty jsou v oboru dobře známy. Polynukleotidy nebo vektory připravené podle vynálezu mohou být použity pro prevenci nebo léčení nebo zpomalení všech druhů onemocnění, která již byla uvedena výše.
V popsaných provedeních vynálezu je vektor podle vynálezu výhodně vektor pro transfer genu nebo směrovací (targeting) vektor. Genová terapie, která je založena na vnášení terapeutických genů, například pro vakcinaci do buněk metodami ex vivo nebo in vivo, je jednou z nejdůležitějších aplikací transferu genů. Vhodné vektory, metody nebo systémy pro přenos genů pro in vitro nebo in vivo genové terapie jsou odborníkům známy a byly popsány v odborné literatuře, viz např. Giordano, Nátuře Medicine 2 (1996), 534-539, Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911919, Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner,
Lancet 348 (1996), 370-374, Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086, Onodua, Blood 91 (1998), 30-36, Verzeletti, Hum.
Gene Ther. 9 (1998), 2243-2251, Verma, Nátuře 389 (1997), 239242, Anderson, Nátuře 392 (Supp. 1998), 25-30, Wang, Gene
Therapy 4.(1997), 393-400, Wang, Nátuře Medicine 2 (1996),
97/00957, US-A-5,580,859, US-ASchaper, Current Opinion in
714-716, WO 94/29469, WO 5,589,466, US-A-4,394,448, Biotechnology 7 (1996), 635-640, a citované ve výše uvedených publikacích.
také další publikace
Polynukleotidy a vektory podle vynálezu být konstruovány pro přímé vnášení do buněk nebo pro vnášení do buněk prostřednictvím lipozomů nebo virových vektorů (např. adenovirových nebo retrovirových vektorů). Výhodně jsou buňky zárodečné buňky, embryonální buňky nebo vaječné buňky, nebo buňky z nich pocházející, nejvýhodnější je použití kmenových buněk. Jak již bylo zmíněno výše, k vhodným systémům pro vnášení genů patří lipozómy, aplikační systémy využívající receptorem zprostředkovaný přenos, nahá DNA, virové vektory jako jsou například herpetické viry, retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry, a další. Podání nukleové kyseliny pro genovou terapii podle vynálezu na specifické místo v těle může být také uskutečněno pomocí biolistického aplikačního systému, jako je například systém popsaný Williamsem (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729).
Je jasné, že do buněk vnesené polynukleotidy a vektory exprimující genový produkt po vnesení do těchto buněk výhodně zůstávají v takovém stavu po celou dobu života buňky. Například buněčné linie, které trvale exprimují polynukleotid podle vynálezu pod kontrolou vhodné regulační sekvence mohou být konstruovány metodami genového inženýrství, které jsou odborníkům dobře známy. Spíše než s použitím expresních vektorů, které obsahují virový replikační počátek, mohou být hostitelské buňky transformovány polynukleotidem podle vynálezu a selekčním markérem, které jsou v jednom plazmidu nebo v oddělených plazmidech. Po vnesení cizorodé DNA se modifikované buňky ponechají růst po dobu 1-2 dnů v obohaceném médiu a pak jsou přeneseny na selektivní médium. Selekční e markér v rekombinantním plazmidu poskytuje rezistenci k selekci a umožňuje růst buňkám, které mají plazmid trvale integrovaný do svého chromozómu, z nichž některé pak tvoří shluky buněk, ze kterých mohou být klonovány a množeny buněčné « » ·· linie. Takto připravené buněčné linie jsou zejména použitelné pro screening a detekci sloučenin, např. podílejících se na aktivaci nebo stimulaci příjmu fosfátu.
Může být použita celá řada selekčních systémů, jako je např. (aniž by výčet byl omezující) thymidinkináza viru herpes simplex (Wigler, Cell 11(1977), 223), hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáza (Szybalska, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 48(1962), 2026) a adenin fosforibosyltransferáza (Lowy, Cell 22 (1980), 817) v buňkách tk, hgprt nebo aprt, v daném pořadí. Také rezistence k antimetabolitům může být použita jako základ pro selekci, např. dhfr, který poskytuje rezistenci k methotrexatu (Wigler, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567, O'Hare, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), gpt, který poskytuje rezistenci ke kyselině mykofenolové (Mulligan, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072), neo, který poskytuje rezistenci k aminoglykosidu G-418 (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1), hygro, který poskytuje rezistenci k hygromycinu (Santerre, Gene 30 (1984), 147) nebo pat (puromycin N-acetyltransferáza) poskytující rezistenci k puromycinu. Byly popsány i další geny vhodné jako selekční markéry, například trpB, který dovoluje buňkám metabolizovat indol místo tryptofanu, hisD, který dovoluje buňkám metabolizovat histinol místo histidinu (Hartman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047), a ODC (ornithindekarboxyláza), který poskytuje rezistenci k inhibitoru ornithindekarboxylázy, 2-(difluormethyl)-DLornithinu, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
Předkládaný vynález se dále týká léčení karcinomů, infekcí nebo autoimunitních onemocnění, které spočívá v tom, že se podává polypeptid podle vynálezu, polynukleotid podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu, a nebo přípravek podle vynálezu • · «· 4 4
J * · 4
4 · · 4 · 4
Φ 4 ·σ«4*
4 4 (i 9 4» ««4 4 ·· 4444 4» 4444 savci, který trpí uvedeným onemocněním. Vhodné způsoby podávání, dávky a léčebný režim byly již diskutovány výše v textu v souvislosti s farmaceutickým přípravkem podle vynálezu.
A dále se předkládaný vynález týká zpomalení patologického stavu, které spočívá v tom, že se podává polypeptid podle vynálezu, polynukleotid podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu, a nebo přípravek podle vynálezu savci, který trpí uvedeným patologickým stavem.
Ve výhodných provedeních předkládaného vynálezu je savec člověk.
A nakonec se vynález týká soupravy obsahující multifunkční polypeptid podle vynálezu, polynukleotid podle vynálezu, vektor podle vynálezu, buňky podle vynálezu nebo přípravek podle předkládaného vynálezu.
Složky soupravy nebo diagnostického prostředku podle předkládaného vynálezu mohou být baleny v nádobkách, jako jsou například lahvičky, volitelně v pufru a/nebo roztoku. Pokud je to vhodné, jedna nebo více složek může být baleno společně v jedné nádobce. Dodatečně nebo alternativně jed na nebo více z uvedených složek může být adsorbována na pevném nosiči jako je například nitrocelulózový filtr nebo nylonová membrána nebo jamky mikrotitrační destičky.
Popis obrázků
Obr. 1 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci rozpustného NKG2D obsahujícího C-koncovou histidinovou značku. Restrikční místa použitá pro klonování jsou ukázána na začátku (EcoRI) a konci (Sall) nukleotidové sekvence.
ti· • * * • 9 * • · · • · · • » · · » ·
Obr. 2 ukazuje vzhled molekuly NKG2D-namířené bispecifické jednořetězcové protilátky na úrovni DNA (panel A) a proteinu (panel B). Způsob účinku bispecifické protilátky je také ukázán v panelu B.
Obr. 3: SDS-PAGE bispecifické jednořetězcové protilátky anti-NKG2D (8R23) x anti-EpCAM (4-7) (pravá dráha), levá dráha ukazuje standard molekulární hmotnosti.
Obr. 4: Expresní vektor kódující sekretovaný karboxykoncový fragment humánního NKG2D použitého pro genovou imunizaci.
Exprese NKG2D fragmentu z ukázaného vektoru je řízena bezprostředním časným promotorem humánního cytomegaloviru (CMV). NKG2D fragment se skládá z vedoucího peptidu, který pochází z myšího imunoglobulinového lehkého řetězce kappa následovaného humánním epitopem myc. Kódující sekvence NKG2D je ukončena analogickým stop kodonem. Polyadenylační místo BGH, polyadenylační místo bovinního růstového hormonu, amp, gen rezistence na ampicilin, ColEl počátek, ColEl replikační počátek.
Obr. 5: Selekce hybridomů specificky vázajících NKG2Dpozitivní cílové buňky.
Vazba tří odlišných monoklonálních protilátek v hybridomových supernatantech 6E5, 8G7 a 11B2 buď k CD8“ pozitivním T lymfocytům (A) nebo k CD56 pozitivním NK (natural killer) buňkám je ukázána analýzou FACS. Zkratky jsou 6E5: 6E5/A7, 8G7: 8G7/C10 a 11B2: 11B2/D10
10H9 je kontrola s hybridomovým supernatantem postrádajícím NKG2D vazebnou aktivitu. Různé detekční protilátky jsou ukázány na obrázku.
Obr. 6: Zesilovací účinek monoklonální protilátky namířené proti NKG2D na instruování naivních T lymfocytů.
» 9 · • 9 9 »» 9999
Naivní T lymfocyty exprimující markér CD45RA (A) jsou nalézány na FACS skenech v horní levé bráně (brán). Naivní T lymfocyty byly instruovány v přítomnosti EpCAM-exprimující cílové buněčné linie (EpCAM/17-lA-transfekované CHO buňky) kombinací B7-1 x anti-EpCAM fúzního proteinu a jednořetězcové bispecifické anti-EpCAM x anti-CD3 molekuly (B-E) v nepřítomnosti (D a E) nebo přítomnosti (B a C) monoklonální protilátky proti NKG2D nazývané BAT221. Instruované T lymfocyty exprimující markér CD45 RO se vyskytují v nižší pravé bráně. Čísla udávají procento instruovaných předešle naivních T lymfocytů. Fluorescence 1: FITC-značená antiCD45RO, fluorescence 2: fykoerytrin-konjugovaná anti-CD45RA.
Obr. 7: zesilovací účinek monoklonální protilátky namířené proti NKG2D na produkci TNF lymfocyty T.
Naivní lymfocyty T byly instruovány v přítomnosti EpCAMexprimující cílové buněčné linie (EpCAM/17-lA-transfekované CHO buňky) kombinací B7-1 x anti-EpCAM fúzního proteinu a stoupající koncentrací, jak ukázáno, jednořetězcové bispecifické anti-EpCAM x anti-CD3 molekuly. Produkce TNF byla měřena komerčním testem TNF-α ELISA v přítomnosti (A) a nepřítomnosti (B) monoklonální protilátky proti NKG2D, nazývané BAT221.
Obr. 8: cytotoxická aktivita Melan A buněk a NK buněk přesměrovaná proti P815 buňkám několika ředěními supernatantu NKG2D hybridomů BAT 221 v kombinaci s monoklonálními protilátkami CD16 (5 μρ/πιΐ) a CD3 (0,2 μρ/ιηΐ) v daném pořadí. 200 000 NK buněk nebo 50 000 Melan A buněk bylo přidáno k 10 000 buňkám Kato III značených 51Cr v přítomnosti naředěné protilátky v celkovém objemu 200 μΐ. Kontrola pozadí (E+T) obsahuje efektorové buňky a cílové buňky bez ředění protilátky. Mikrotitrační destičky byly inkubovány po dobu 4 hodin ve 37 °C, 5% CO2. Po období inkubace bylo z každé jamky • ·· · • · odstraněno 50 μΐ supernatantu a testováno na uvolňování 51Cr na počítači impulzů gama.
Obr. 9: detekce specifické imunitní reakce u myší imunizovaných expresním vektorem kódujícím sekretovaný Ckoncový fragment humánního NKG2D. Analýza průtokovou cytometrií vazebné aktivity séra ředěného 1:30 pěti imunizovaných myší pro humánní CD8+ T lymfocyty a humánní NK buňky. 200 000 mononukleárních buněk z periferní krve zdravých dárců bylo inkubováno s naředěným sérem pěti myší. Navázaná myší protilátka byla detekována kozí-anti-potkaní Ig (IgG + IgM) protilátkou konjugovanou s fíuoresceinem (FITC) naředěnou 1:100 v PBS. Trojbarevná fluorescenční analýza byla prováděna aplikací pozitivní brány pro CD8+ (trikolóra) a negativní brány pro CD16+ (PE) buňky, a tak umožňující detekci FITCzprostředkované fluorescence výlučně připisované CD8+ T lymfocytům (fenotyp: CD8 + , CD16”) bez jakýchkoliv kontaminačních signálů od CD8+ NK buněk. Podobně byla trojbarevná fluorescenční analýza prováděna aplikací pozitivní brány pro CD56+ (PE) a negativní brány pro CD3+ buňky (trikolóra), umožňující tedy detekci FITC-zprostředkované fluorescence výlučně připisované NK buňkám (fenotyp: CD56+, CD3~) bez kterýchkoliv kontaminačních signálů od CD56+ T lymfocytů. Jako negativní kontrola bylo použito reprezentativní sérum neimunizované myši (preimunní sérum). Buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií na přístroji FACSscan (Becton Dickinson).
Obr. 10: Návrh fagemidu použitého pro expresi N-koncově blokovaných jednořetězcových protilátek v periplazmě E. coli.
P, bakteriální promotor, ompA, vedoucí sekvence pro periplazmatický transport, N2, náhradní N-koncová blokující doména, VH, variabilní doména těžkého řetězce scFv, VL, variabilní doména lehkého řetězce scFv, p53, tetramerizační «44 <
• · « • ♦ · · · » doména transkripčního faktoru p53, Flag-značka, značka epitop viru chřipky. Pozice míst různých restrikčních enzymů jsou ukázány nahoře. Esenciální kódující sekvence jsou ukázány jako černé rámečky.
Obr. 11: detekce NKG2D-specifických, N-koncově blokovaných jednořetězcových Fv fragmentů tvořených v periplazmě E.coli.
Aby se zvýšila sensitivita, byla vazebná avidita jednořetězcových Fv protilátek zvýšena fúzí tetramerizační domény transkripčního faktoru p53 ke karboxy konci N-koncově detekovány rozpustným a anti-FLAG blokované scFv. Tetramerizované scFv byly v periplazmatických frakcích testem ELISA rekombinantním NKG2D jako záchytovou protilátkou protilátkou konjugovanou s peroxidázou pro detekci. Jsou ukázány signály ELISA různých klonů. Všechny klony se signály >0,05 byly analyzovány dále.
Obr. 12: přechodná exprese a bispecifických molekul cílících NKG2D.
EpCAM vazba čtyř
CHO/dhfr- buňky byly přechodně transfekovány expresními vektory kódujícími čtyři odlišné jednořetězcové bispecifické molekuly. V A byl gen beta-galaktosidázy transfekován jako negativní kontrola. Různé bispecifické molekuly jsou B, 3B10xP4-3, C, 3Bl0xP4-14, D, 3B10xP5-2 a E, 3BlQxP5-23. Supernatanty buněčných kultur byly sklizeny po 5 dnech a testovány na expresi bispecifické protilátky analýzou FACS na EpCAM-specifickou vazbu k humánní buněčné linii Kato III karcinomu žaludku. Buněčně vázané bispecifické molekuly byly detekovány FITC-značenou ovčí anti-myší protilátkou. Jsou ukázány histogramy FACS.
Obr. 13: charakterizace dvou jednořetězcových bispecifických protilátek pro NKG2D soecifickou vazbu v testu ELISA. Dvě bispecifické protilátky 3B10 x P4-3 a 3B10 x P5-2
• ft • · · ft ft « ft ft ft ft ft byly přechodně exprimovány v supernatantech CHO buněčných kultur. Testem ELISA byla testována vazba k potaženému rozpustnému rekombinantnímu NKG2D s použitím antihexahistidinové protilátky konjugované s peroxidázou pro detekci bispecifických protilátek s hexahistidinovou značkou. Byly testovány dvě odlišné koncentrace, ředění supernatantů kultur A, ředění 1:1, B, ředění 1:2. Jako kontrola byla použita vazba EpCAM-specifické 3B10 x anti-CD3 bispecifické protilátky. Hodnoty získané pro tuto nespecifickou kontrolu byly subtrahovány od ukázaných odečtu.
Obr. 14: cytotoxické aktivita buněk Melan A (A) a buněk NK (B) přesměrovaná proti EpCAM-pozitivním Kato buňkám bispecifickou 3B10xP4-3 protilátkou. 200 000 NK buněk nebo 50 000 Melan A buněk bylo přidáno k 10 000 buněk Kato III značených 51Cr v přítomnosti několika ředění bispecifické protilátky v celkovém objemu 200 μΐ. Kontrola pozadí (E+T) obsahovala efektorové buňky a cílové buňky bez ředění protilátky. Mikrotitrační destičky byly inkubovány po dobu 4 hodin ve 37 °C, 5% CO2. Po období inkubace bylo z každé jamky odstraněno 50 μΐ supernatantu a testováno na uvolňování 51Cr na počítači impulzů gama.
Obr. 15: Specifická lýza cílových buněk čtyřmi jednořetězcovými protilátkami rekrutujícími mononukleární buňky periferní krve (PBMC) prostřednictvím NKG2D.
Čtyři bispecifické protilátky všechny rozpoznávájící cílový EpCAM na humánní buněčné linii Kato III karcinomu žaludku jednořetězcovou Fv pocházející z monoklonální protilátky 3B10 byly konstruovány ze čtyř odlišných scFv specifických pro NK/CD8'specifický receptor NKG2D. Expresní vektory kódující čtyři bispecifické protilátky byly transfekovány pro přechodnou expresi do CHO buněk a byly sbírány suoernatantv. Supernatantv se sekretovanými • · * · 0 ·
9 » · · · · >00 • » · · 0 0 « 0 0 0 0 · 0 0 0 0 • · 9 9 9 9 9
999 9 999 0000 ·· 0000 bispecifickými protilátkami v uvedených ředěních byly testovány v testech cytotoxicity na specifickou lýzu Kato III buněk v přítomnosti humánních imunitních efektorových buněk (PBMC). V nepřítomnosti CHO supernatantu nebyla pozorována žádná buněčná lýza cílových buněk Kato III v přítomnosti PBMC. Ukázaná data jsou průměry zjišťovaných triplikátů. Cytotoxická aktivita PBMC přesměrovaná proti EpCAM-pozitivním Kato buňkám bispecifickými protilátkami 3B10xP4-3, 3B10xP4-14, 3B10xP5-2a 3B10xP5-23 v několika ředěních. 200 000 PBMC bylo přidáno k 10 000 buněk Kato III značených 51Cr v přítomnosti naředěných bispecifických protilátek v celkovém objemu 200 μΐ. Negativní kontrola obsahovala PBMC a cílové buňky bez ředění protilátky. Mikrotitrační destičky byly inkubovány po dobu 4 hodin ve 37°C, 5% CO2. Po období inkubace bylo z každé jamky odstraněno 50 μΐ supernatantu a testováno na uvolňování 51Cr na počítači impulzů gama.
Obr. 16: seznam sekvencí jak jsou popsány v připojených příkladech. Nukleotidové sekvence jsou ukázány v běžné 5' - 3' orientaci.
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
Produkce rekombinantního NKG2D
Aby se získala kódující sekvence DNA extracelulární části antigenu NKG2D, byla cDNA odvozená z RNA mononukleárních buněk periferní krve reverzní transkripcí použita jako templát pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR).
Celková RNA byla připravena z mononukleárních buněk periferní krve, které byly odděleny ze vzorku plné krve centrifugací na fikolovém gradientu podle standardních protokolů (J. E. Coligan, Wiley Intersience 1991).
Izolace RNA byla prováděna s použitím komerčně dostupného kitu pro izolaci (Quiagen) podle instrukcí výrobce.
Syntéza cDNA byla prováděna podle standardních protokolů (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, druhé vydání)
Pro PCR byl použit pár primerů s následujícími sekvencemi: Přímý („Forward) primer (sekv. id. č. 87):
5' -AGGTGTACACTCCTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCC-3'
Zpětný (reverzní) primer (sekv. id. č. 88) :
5'-TCATCCGGACACAGTCCTTTGCATGCAGATG-3'
Kromě sekvence hybridizující s NKG2D templátem cDNA, forward primer obsahuje místo BsrGI a reverzní primer místo BspEI pro umožnění klonování PCR amplifikačního produktu.
Produkt reakce PCR byl izolován elektroforézou na agarózovém gelu, purifikován s použitím komerčně dostupného kitu (Quiagen) podle instrukcí výrobce a pak inkubován s restrikčními enzymy BsrGI a BspEI s použitím standardních protokolů (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, druhé vydání). poté byl prováděn konečný purifikační krok.
Jak ukázáno na obr. 1, kódující sekvence NKG2D extracelulární domény byla fúzována prostřednictvím BsrGI k vedoucí sekvenci myšího imunoglobulinového těžkého řetězce, místo BspEI bylo fúzováno s místem Xmal, tak spojující kódující sekvenci poly-histidinové značky následovanou stop kodonem (sekv. id. č. 1 a 2).
·ο·
9» ·»
4 4 « *
4 ·
9 4
9· 4944
EcoRI/SalI DNA fragment ukázaný na obr. 1, který tvoří kódující sekvence N-koncového vedoucího peptidu, NKG2D extracelulární doména a C-koncová histidinová značka, byl klonován do plazmidového vektoru pFastBacl také připraveného štěpením restrikční enzymy EcoRI a Sáli. Tento plazmid je část Bac-to-Bac© bakulovirového expresního systému (Gibco BRL, instrukce výrobce jsou k dispozici na internetové adrese: http://www2.lifetech.com/catalog/techline/molecularbiology/man nuals PPS/bac.pdf. Pakliže není uvedeno jinak, všechny postupy týkající se Bac-to-Bac© bakulovirového expresního systému byly prováděny podle těchto instrukcí).
ng DNA správného plazmidového klonu pak byl transformován do DHlOBac kompetentních buněk (Bac-to-Bac® expresní systém). Tento kmen Escherichia coli již nese dva další plazmidy, (i) pomocný plazmid (pMON7124) poskytující Tn7 transpoziční funkce a (ii) takzvaný bakmid (pMONl4272), což je bakulovirový kyvadlový vektor. Po transformaci třetího plazmidu do těchto buněk byla kódující sekvence vložená do pfastBacl přenesena transpozicí do bakmidu, který obsahuje specifická cílová místa pro tuto transpozicí. To vede k destrukci LacZ-kódující sekvence, která poskytuje možnost selekce kolonií rekombínantním bakmidem pomocí . modrobílé selekce na agarových miskách obsahujících Blue-gal, IPTG a kombinaci antibiotik podle instrukcí výrobce.
Bílé kolonie obsahující rekombinantní bakmid se sekvencí rozpustného NKG2D byly vybrány a pěstovány přes noc. Specifický protokol poskytnutý výrobcem byl použit pro izolaci bakmidové DNA z těchto přes noc pěstovaných kultur.
Bakmidová DNA pak byla použita k transfekci hmyzích buněk SF9 s použitím reagencie CellFectín Reagent (Bac-to-Bac® expresní systém) podle instrukcí výrobce. Tři dny po transfekci byl sklízen rekomoinantní bakulovirus v tkáňovém * 0
0 supernatantu transfekovaných buněk. Tento supernatant měl nízký titr (přibližně 2xl07 jednotek tvořících plaky (pfu) na mililitr) v malém měřítku (2 ml) virový zásobní roztok. (Instrukce pro hmyzí buněčnou kulturu, propagaci bakulovirů a expresi proteinu v bakulovirovém expresním systému jsou k dispozici na internetové adrese: http://www.invitrogen.com/manuals.html. Pakliže není uvedeno jinak, všechny postupy týkající se hmyzí buněčné kultury a exprese proteinu byly prováděny podle těchto instrukcí). Pro expresi proteinu byl nezbytný vysoký titr a virový zásobní roztok ve velkém měřítku. Aby se získal takový virový zásobní roztok, byly prováděny následující kroky:
Dvě láhve pro tkáňové kultury o objemu 25 cm2, do každé bylo naneseno 2xl06 buněk SF9, byly infikovány s 30 μΐ výchozího virového zásobního roztoku, v daném pořadí. Po deseti dnech byly tkáňové supernatanty sklízeny jako virový zásobní roztok v malém měřítku s vysokým titrem. Pak bylo 500 ml suspenze kultury buněk SF9 o denzitě 2,0 x 106 buněk na mililitr infikováno 5 ml druhého virového zásobního roztoku. Postup infekce byl monitorován stanovením životaschopnosti buněk s použitím metody vylučování trypanové modři. Pří životaschopnosti buněk pod 10 % byl virový zásobní roztok sklízen a virový supernatant byl oddělen od buněk centrifugací. Musel být určen virový titr tohoto zásobního roztoku ve velkém měřítku. Pro tento účel byly buňky SF9 naneseny na 96 jamkové destičky pro tkáňové kultury v denzitě 1 x 104 buněk na jamku. Celkem 24 jamek bylo infikováno jedním z následujících ředění zásobního roztoku s vysokým titrem: 10 μΐ ředění l:105 na jamku, 10 μΐ ředění l:106 na jamku a 10 μΐ ředění l:107 na jamku. Objem musel být upraven na 120 μΐ na jamku. Po 14 dnech byla zjišťována životaschopnost buněk metodou vylučování trypanové modři. Ředění s vyváženým poměrem
A A t · A A· · A • A A A · · A
A A A · ·
A A A A A ·
A A AAA
AAA AAAA A· ·*·· jamek s životaschopnými a neživotaschopnými buňkami umožňující dostatečně přesné stanovení virového titru bylo očekáváno 1 x 108 až 1 x 109 pfu/ml.
Časový průběh exprese proteinu byl stanoven v MOI (mnohonásobek infekce) 5 pfu a 10 pfu na buňku v infekčním pokusu s dvěma suspenzemi kultur buněk SF9 v koncentraci 2,3 x 106 buněk/ml. Vzorky infikovaných kultur byly odebírány 24, 48, 72 a 96 hodin po infekci. Tyto vzorky byly analyzovány metodou western blotu podle standardních protokolů. Rozpustný NKG2D byl detekován protilátkou proti histidinové značce konjugovanou s peroxidázou.
Tedy optimální MOI a optimální doba inkubace po infekci byly použity pro expresi proteinu ve velkém měřítku v mnohonásobných suspenzních kulturách s objemem kultury 500 ml.
Rozpustný NKG2D byl purifikován z tkáňových supernatantů prostřednictvím své C-koncové histidinové značky afinitní chromatografií s použitím kolony Ni-NTA, jak bylo popsáno autory Mack (1995, Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021).
Příklad 2
Tvorba monoklonálních protilátek proti nativnímu NKG2D na humánních lymfocytech
Deset týdnů staré F1 myší z křížení balb/c x C57black byly imunizovány rozpustnou extracelulární doménou antigenú NKG2D. Antigen byl rozpuštěn v 0,9% NaCl v koncentraci 100 pg/ml. Roztok byl pak emulgován 1:2 s kompletním Freundovým adjuvanciem a každé myši bylo injikováno intraperitoneálně 50 μΐ. Myši dostaly imunizační zesilovací injekce po 4, 8 a 12 tvdnech stejným způsobem kromě toho, že kompletní Freundovo • · tttttttt adjuvans bylo nahrazeno nekompletním Freundovým adjuvanciem. Deset dnů po první imunizační zesilovací injekce byly odebírány vzorky krve a sérový titr protilátky proti NKG2D antigenu byl testován ELISA. Sérový titr byl více než lOOOkrát vyšší u imunizovaných než u neimunizovaných zvířat. Tři dny po druhé zesilovací injekci byly buňky sleziny fúzovány s buňkami P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) za vzniku hybridomových buněčných linií podle standardních protokolů, jak bylo popsáno v Current Protocols In Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach a Strober, Wiley-Interscience, 1992) . Po fúzi s PEG byly buňky naneseny v koncentraci 100 000 buněk na jamku na mikrotitrační destičky a pěstovány ve 200 μΐ RPMI 1640 média doplněného 10% fetálním bovinním sérem, 300 jednotkami/ml rekombinantním humánním interleukinem 6 a aditivem HAT pro selekci. Tkáňové supernatanty z hustě pěstovaných jamek byly testovány následujícím testem ELISA:
Jamky se dnem ve tvaru písmene U na 96 jamkové destičce (Nunc, maxisorb) byly potaženy přes noc ve 4°C rekombinantním NKG2D antigenem v koncentraci 5 μς/πιΐ. Potažené jamky byly třikrát promyty promývacím pufrem (0,lM NaCl, 0,05M Na2HPO4, pH 7,3, 0,05% Tween 20, 0,05% NaN3) a pak blokovány inkubací po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti 200 μΐ/jamku 2% odstředěného mléčného prášku suspendovaného v promývacím pufru. V dalším kroku byl hybridomový supernatant inkubován neředěný a v několika ředěních po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Po třech dalších promývacích krocích byla navázaná monoklonální protilátka detekována polyklonální protilátkou proti myšímu imunoglobulinu konjugovanou s křenovou peroxidázou. Po 5 násobném promytí byla ELISA nakonec vyvolána přidáním roztoku substrátu TMB (tetramethylbenziain, Roche Mannheim). Zbarvený precipitát byl měřen po 15 minutách ve 405 nm s použitím odečítacího zařízení pro tesry ELISA.
• · • · · · • · · · · • · · · ·φ·* ·· ····
Supernatanty z 10 klonů projevujících silný ELISA signály byly vybrány pro další analýzu. Aby byly identifikovány ty hybridomové klony, které tvoří monoklonální protilátky reaktivní s nativní NKG2D antigenem na intaktních NK buňkách a T lymfocytech, byla prováděna následující analýza průtokovou cytometrií:
x 106 PBMC byly inkubovány po dobu 30 minut na ledu s 50 μΐ neředěného hybridomového supernatantu a navázaná monoklonální protilátka byla pak detekována F(ab')2 fragmentem králičí anti-myší Ig protilátky konjugované s fluoresceinem (FITC) (Dako Hamburg, katalogové č. F0313) naředěným 1:100 v PBS. V dalším kroku byly volné valence buněčně vázané FITCkonjugované protilátky blokovány inkubací buněk po dobu 30 minut s 50 μΐ myšího séra (Sigma immunochemicals, Deisenhofen, M-5905) naředěného 1:10. Pro rozlišení mezi NK buňkami a T lymfocyty, byly v tomto bodě rozděleny značené PBMC. Jedna polovina byla obarvena s anti-CD8 protilátkou specifickou pro T lymfocyty konjugovanou se značkou pro trojbarevnou fluorescenční analýzu, tzv. trikolórou (Caltac Laboratories, Burlingame, USA, katalogové č. MHCD0306) naředěnou 1:100, druhá polovina byla obarvena s anti-CD56 protilátkou specifickou pro NK buňky konjugovanou s fykoerytrinem (PE) (Becton Dickinson, Heidelberg, katalogové č. 347747) naředěnou 1:25. Neznačené anti-CD16 a anti-CD6 protilátky specificky označující NK buňky nebo T lymfocyty, v daném pořadí, byly použity jako pozitivní kontroly primárního kroku značení, jako negativní kontrola sloužila myší monoklonální protilátka se zanedbatelnou specifičností místo hybridomových supernatantů reaktivních s rekombinantním NKG2D.
Buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií na přístroji FACSscan (Becton Dickinson, Heidelberg). FACS značení a měření intenzity fluorescence bylo prováděno, jak bylo popsáno v ·*··
Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach a Strober, Wiley-Interscience, 1992).
Dvoubarevná fluorescenční analýza byla prováděna aplikací pozitivní brány pro CD8+ a CD56+ buňky, v daném pořadí, tak umožňující detekci FITC-zprostředkované fluorescence odděleně na CD8+ T lymfocytech a NK buňkách. Ve srovnán s odlišným značením CD8+ T lymfocytů a NK buněk příslušnými kontrolními protilátkami, supernatant hybridomové buněčné linie 8R23 vykazoval silnou reaktivitu jak s NK buňkami tak s T lymfocyty, zatímco dva další supernatanty byly pouze slabě reaktivní s oběma podskupinami lymfocytů.
Alternativně byly monoklonální protilátky proti humánnímu NKG2D produkovány genovou imunizací myší. Pro tento účel byly dva odlišné fragmenty humánního NKG2D od nukleotidů (nt) 64 až 462 a od nt 123 až 462 odpovídající aminokyselinovým sekvencím sekv. id. č. 3 a 4 amplifikovány PCR z cDNA templátu ukázaného na obrázku 1, které kódují extracelulámí NKG2D segmenty ohraničené asparaginem (N) a valinem (V) nebo tryptofanem (W) a valinem (V), v daném pořadí. Jako PCR primery byly použity následující oligonukleotidy:
NKG2D-krátký-f (5'-ATCAAGCTTGTGGATATGTTACAAAAATAACT-3') (sekv. id. č. 80) a
NKG2D-stop-r (5'-CGCGGTGGCGGCCGCTTACACAGTCCTTTGCATG-3') (sekv. id. č. 82) pro amplifikaci NKG2D fragmentu: nt 123-462
A také NKG2D-f (5'-ATCAAGCTTGAACCAAGAAGTTCAAATTCC-3') (sekv. id. č. 81) a
NKG2D-stop-r (5'-CGCGGTGGCGGCCGCTTACACAGTCCTTTGCATG-3') (sekv. id. č. 82) pro amplifikaci NKG2D fragmentu: nt 64-462.
Plazmidy pro genetickou imunizaci byly konstruovány klonováním každého z těchto PCR produktů ve správném čtecím
9999
99 ·♦
9 9 9 9 • 9 · • · · · · • · · ·
9999 9 9 9 99 rámci na místa restrikčních endonukleáz HindlII a Notl vektoru VV1 (GENOVAC AG, Německo), jak ukázáno na obrázku 4.
Výsledné plazmidy VV1-NKG2D (nt 64-462) a VV1-NKG2D (nt 123-452) umožnily sekreci rozpustných extracelulárních NKG2D fragmentů značených epitopem myc na N-konci. Myc epitop byl použit k ověření exprese rozpustných NKG2D fragmentů. Pro toto byly konstrukty exprimovány přechodnou transfekcí na buňkách BOSC-23 (Onishi (1996) Exp Hematol 24: 324), perforovaných přidáním Cytoperm/Cytofix (Becton Dickinson) , NKG2D fragmenty značené myc byly intracelulárně barveny analýzou na přístroji FACScan po reakci s myší anti-myc monoklonální protilátkou (9E10, ATCC, CRL-1729) následovanou polyklonální králičí antimyší imunoglobulinovou protilátkou značenou fykoerytrinem.
Tři 6 až 8 týdnů staré BALB/c myši byly imunizovány šestkrát s VV1-NKG2D (nt 64-462) a dvě myši byly imunizovány třikrát s VV1-NKG2D (nt 64-462), pak následovaly tři imunizace s VV1-NKG2D (nt 123-462) s použitím „genové pistole Helios (Bio-Rad, Germany) podle publikovaného postupu (Kilpatrick (1998) Hybridoma 17: 569). Jeden týden po poslední aplikaci imunizačních plazmidů byla každé myši podána zesilovací intradermální injekce 300 μΐ rekombinantniho humánního NKG2D proteinu (viz příklad 1) koncentrovaného na 50 μρ/πιΐ ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty bez iontů Mg2+ a Ca2+ v místech aplikace DNA.
Čtyři dny později byly myší utraceny a jejich lymfocyty byly fúzovány s buňkami myšího myelomu SP2/0 (American Tissue Type Collection, USA) s použitím polyethylenglykolu (HybríMax, Sigma-Aldrich, Německo), naneseny v množství 100 000 buněk na jamku na 96 jamkové mikrotitrační destičky a pěstovány ve 200 μΐ DMEM média doplněného 10% fetálním bovinním sérem a aditivem HAT pro hybridomovou selekci (Kilpatrick (1998) Hybridoma 17:
569) .
»♦· 4
4» ·» ·♦ • · · * · • ftft · • ftft· · • ftft 4 • 4444 ·· «44·
Tkáňové supernatanty z hustě pěstovaných jamek byly testovány testem ELISA na zmobilizovaném rekombinantním NKG2D, jak bylo popsáno výše. Supernatanty z 122 klonů projevujících pozitivní ELISA signály byly vybrány pro další analýzu. Aby se identifikovaly ty hybridomové klony, které tvoří monoklonální protilátky reaktivní s nativním NKG2D antigenem na intaktních buňkách NK a CD8+ T lymfocytech, byly buňky analyzovány průtokovou cytometrií na přístroji FACSscan (Becton Dickinson, Heidelberg) :
Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) zdravých dárců byly izolovány ceňtrifugací na fikolovém hustotním gradientu. V každé jamce mikrotitrační destičky bylo inkubováno 200 000 PBMC s neředěným hybridomovým supernatantem. Po 30 minutách inkubace na ledu byly buňky dvakrát promyty PBS, a pak barveny F(ab')2 fragmentem kozí anti-myší IgG a IgM protilátky konjugované s fluoresceinem (FITC) (Jackson ImmunoResearch lne. West Grove, USA, kód 115-096068, 1:100) po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly dvakrát promyty PBS, a pak barveny značící směsí s dvěmi odlišnými protilátkami. Pro značení CD8+ T lymfocytů bylo 100 000 PBMC dále inkubováno po dobu 30 minut s CD16 protilátkou konjugovanou s fykoerytrinem (PE) (Becton Dickinson, Heidelberg, katalogové č. 347617) a CD8 protilátkou konjugovanou s trikolórou (Caltac Laboratories, Burlingame, USA, katalogové č. MHCD0806) . Pro značení buněk NK byla druhá polovina PBMC dále inkubována po dobu 30 minut CD56 protilátkou konjugovanou s fykoerytrinem (PE) (Becton Dickinson, Heidelberg, katalogové č. 347747) a CD3 protilátkou konjugovanou s trikolórou (Caltac Laboratories, Burlingame, USA, katalogové č. MHCD0306.). Aby se zabránilo zkřížené reakci mezi různými protilátkami ve značící směsi, bylo přidáno myší sérum (Sigma Aldrich, St. Louis, USA, katalogové č. 054H-8958) v konečném ředění 1:10.
4»4 4 ·· · • · • · · • · ··· * ·> Φ· • · * 4 » ·
4« ·· 4**4
Trojbarevná fluorescenční analýza byla prováděna aplikací pozitivní brány pro CD8+ (trikolóra) a negativní brány pro CD16+ (PE) buňky, a tak umožňující detekci FITC-zprostředkované fluorescence výlučně připisované CD8+ T lymfocytům (fenotyp: CD8+, CD16”) bez jakýchkoliv kontaminačních signálů od CD8+ NK buněk. Podobně byla trojbarevná fluorescenční analýza prováděna aplikací pozitivní brány pro CD56+ (PE) a negativní brány pro CD3+ buňky (trikolóra), umožňující tedy detekci FITCzprostředkované fluorescence výlučně připisované NK buňkám (fenotyp: CD56+, CD3“) bez kterýchkoliv kontaminačních signálů od CD56+ T lymfocytů. Jak ukázáno na obrázku 5, supernatanty hybridomů označených 11B2, 8G7 a 6E5 obsahovaly monoklonální protilátky reaktivní s nativním NKG2D na povrchu jak humánních CD8+ T lymfocytů tak buněk NK. Značení se supernatantem z hybridomů 10H9 je ukázáno jako reprezentativní příklad mnoha monoklonálních protilátek reaktivních s imobilizovaným rekombinantním NKG2D, kter ale nebyly schopné vazby komplexu nativní NKG2D-receptor na intaktních buňkách. FACS značení a měření intenzity fluorescence bylo prováděno, jak bylo popsáno v Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach a Strober, Wiley-Interscience, 1992).
hybridomy produkující protilátky reagující s NKG2D na CD5 6+ NK a CD8+ T lymfocytech byly subklonovány pomocí limitního ředění na 96 jamkových mikrotitračních destičkách. Pozitivní subklony byly identifikovány průtokovou cytometrií na NKG2D-pozitivních NK buňkách (Bauer (1999) Science 285: 727) inkubovaných se supernatanty sklizenými z jamek vykazujících buněčný růst. Monoklonální protilátka navázaná na buňky byla detekována F(ab')2 fragmentem králičí anti-myší Ig protilátky konjugované s fluoresceinem (FITC) (Dako, Hamburg, katalogové č. F0313) . Subklony 11B2D10, 8G7C10 a 6E5A7 byly »· *0 *
0^0
0000 <0 • 00
0· · · • · • 0 0 • · «00 0000
0· :* * *
* « *000 dále použity pro konstrukci NKG2D-namířených bispecifických protilátek (viz příklad 3).
Příklad 3
Konstrukce bispecifických jednořetězcových protilátek antiNKG2D x anti-EpCAM
Bispecifické protilátky byly konstruovány jak ukázáno na obrázku 2. Variabilní úseky VL a VH těchto protilátek vázající nativní NKG2D na intaktních buňkách byly klonovány z celkové RNA odpovídajících hybridomových buněčných linií, jak bylo popsáno (Orlandi (1989) Proč.Nati.Acad.Sci . USA 36: kromě toho, že PCR fragmenty variabilních amplifikovaných z hybridomů 11B2D10 (sekv. id. č.
č. 27-36), 6E5A7 (sekv. id. č
č. 17-26'
8G7C10 (sekv. id. 6H7E7, (sekv. id.
3833), úseků
7-16),
37-46) a byly přímo klonovány do TA klonovacího vektoru GEM-T Easy (Promega, katalogové č. A1360). Pak klonované VL a VH úseky sloužily jako templáty pro dvoukrokovou fúzní PCR, která měla za následek odpovídající scFv fragmenty s uspořádáním domén VL/VH. Pár primerů specifický pro VL použitý pro tento účel se skládá z oligonukleotidú 5'VLB5RRV (5'AGG TGT ACA CTC CGA TAT CCA GCT GAC CCA GTC TCC A 3' (sekv. id. č. 83)) a 3'VLGS15 (5'GGA GCC
GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TTT GAT CTC GAG CTT GGT CCC 3' (sekv. id. č. 84)), pár primerů VH z oligonukleotidú 5'VHGS15 (5'GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGG (AC)A(AG) CTG CAG (GC)AG TC(AT) GG 3'
3'VHBspEI (5'AAT CCG GAG GAG ACG GTG ACC GTG GTC CCT TGG CCC CAG 3' (sekv. id. č. 86)). V prvním kroku PCR byly získány VH a VL amplifikační produkty s následujícím programem PCR: denaturace v 94 °C po dobu 5 minut, nasedání primerů ve 37°C po dobu 2 minut, prodlužování v 72°C po dobu 1 minuty pro
GGT TCT CAG GT (GC)
sekv. id, . č. 85) ) a
GTG GTC CCT TGG CCC
to ·
9 • 9 9 · první cyklus, denaturace v 94 °C po dobu 1 minuty, nasedání primerů ve 37°C po dobu 2 minut, prodlužování v 72°C po dobu 1 minuty po dobu 6 cyklů, denaturace v 94°C po dobu 1 minuty, nasedání primerů v 55°C po dobu 1 minuty, prodlužování v 72°C po dobu 45 sekund a 18 cyklů, konečné prodloužení v 72°C po dobu 2 minut. Pro druhý krok fúzního PCR byly VH a VL PCR fragmenty purifikovány z agarózového gelu, smíchány s oligonukleotidovými primery 5'VLB5RRV a 3'VH BspEI a podrobeny následujícímu programu PCR: denaturace v 94 °C po dobu 5 minut jednou, denaturace v 94°C po dobu 1 minuty, nasedání primerů v 55°C po dobu 1 minuty, prodlužování v 72°C po dobu 1,5 minuty a 8 cyklů, konečné prodloužení v 72 °C po dobu 2 minut. VL/VH fúzní produkty kódující anti-NKG2D scFv-fragmenty byly purifikovány z agarózového gelu a štěpeny restrikčními enzymy BsrGI/BspEI. Savčí expresní vektor pEF-DHFR (Mack (1995) Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021) obsahující EcoRI/SalI klonovaný
DNA fragment popsaný ve WO0003016, obr. 10, byl také štěpen restrikčními enzymy BsrGI/BspEI za uvolnění fragmentu o velikosti 750 bp, zbylý vektorový fragment byl purifikován v gelu a použit pro klonování anti-NKG2D scFv-fragmentů.
Tedy výsledné deriváty savčího expresního vektoru pEF-DHFR obsahují EcoRI/SalI DNA inzerty kódující bispecifické jednořetězcové protilátky, jak bylo popsáno (Mack (1995) Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021), které jsou namířeny proti NKG2D a EpCAM. EpCAM je exprimován mnoha epitelovými nádory a již používán jako cílový antigen pro adjuvantní léčení resekovaného kolorektálního karcinomu s myší monoklonální protilátkou.
Expresní plazmidy pro anti-NKG2D x anti-EpCAM bispecifické jednořetězcové protilátky (sekv. id. č. 47-49) byly transfekovány do DHFR defektních CHO buněk elektroporací, selekce stabilních transfektant, genová amplifikace a produkce ► to · to to • to to · · proteinu byly prováděny, jak bylo popsáno (Mack (1995) Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021). Bispecifická protilátka byla purifikován z tkáňového supernatant prostřednictvím C-koncové histidinové značky s použitím kolony Ni-NTA, jak bylo popsáno (Mack (1995) Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021, viz také obr.
3) .
Příklad 4
Protilátky namířené proti extracelulámí doméně DAP-10
Protilátky reaktivní s extracelulámí doménou komplexu NKG2D-receptor byly také získány podle následujícího protokolu:
až 8 týdnů staré BALB/c myši byly imunizovány peptidem odpovídajícím kompletní extracelulámí doméně humánního DAP-10 obsahujícího 30 aminokyselin (sekv. id. č. 5, QTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP) nebo její části (Wu (1999) Science 285: 730), konjugovaným s nosičovým proteinem, v daném pořadí. Například peptid obsahující 21 N-koncových aminokyselin extracelulámí domény DAP-10 (sekv. id. č. 6, QTTPGERSSLPAFYPGTSGSC) může být kondenzován ke KLH aktivovanému maleinimidem řízeným způsobem prostřednictvím merkaptoskupiny C-koncového cysteinu. Konjugát může být rozpuštěn v 0,9% NaCI v koncentraci 100 μς/πιΐ, roztok pak emulgován 1:2 s kompletním Freundovým adjuvans a jednotlivé myši infikovány 50 μΐ intraperitoneálně. Myši mohou dostat zesilovací imunizační injekce připomínající primární imunizaci po 4, 8 a 12 týdnech, kromě toho, že kompletní Freundovo adjuvans může být nahrazeno nekompletním Freundovým adjuvans. Deset dnů po první zesilovací imunizační injekci byly odebrány vzorky krve a titr sérové protilátky testován testem ELISA na • · · · imobilizovaném BSA konjugovaném s 21-merním DAP-10 peptidem, jak bylo popsáno výše pro KLH.
Tři dny po druhé zesilovací injekci buňky sleziny z myší s pozitivním sérovým titrem byly fúzovány s buňkami P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) za vzniku hybridomových buněčných linií podle standardních protokolů, jak popsáno v Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach a Strober, Wiley- Interscience, 1992). Po PEG fúzi buňky byly naneseny po 100 000 na jamku na mikrotítrační destičky a pěstovány ve 200 μΐ RPMI 1640 médiu doplněném 10% fetálním bovinním sérem, 300 jednotkami/ml rekombinantního humánního interleukinu 6 a aditivem HAT pro selekci. Tkáňové supernatanty z hustě pěstovaných jamek byly testovány na reaktivitu k DAP10 peptidu následujícím testem ELISA:
Jamky se dnem ve tvaru písmene U na 96 jamkové destičce (Nunc, maxisorb) byly potaženy přes noc ve 4°C peptid-BSAkonjugátem v koncentraci 5 μg/ml. Potažené jamky byly třikrát promyty promývacím pufrem (0,lM NaCl, 0,05M Na2HPO4, pH 7,3, 0,05% Tween 20, 0,05% NaN3) a pak blokovány inkubací po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti 200 μΙ/jamku 2% odstředěného mléčného prášku suspendovaného v promývacím pufru. V dalším kroku byl hybridomový supernatant inkubován neředěný a v několika ředěních po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Po třech dalších promývacích krocích byla navázaná monoklonální protilátka detekována polyklonální protilátkou proti myšímu imunoglobulinu konjugovanou s křenovou peroxidázou. Po 5 násobném promytí byla ELISA nakonec vyvolána přidáním roztoku substrátu TMB (tetramethylbenzidin, Roche Mannheim) . Zbarvený precipitát byl měřen po 15 minutách ve 405 nm s použitím odečítacího zařízení pro testy ELISA.
Aby byly identifikovány ty peptid-reaktivní hybridomové klony, které tvoří monoklonální protilátky schopné vazby k • · β» · t · ··· ·
DAP-10 v komplexu NKG2D-receptor na intaktních NK buňkách a CD8+ T lymfocytech, byla prováděna trojbarevná fluorescenční analýza na PBMC, která byla popsána v příkladu 2.
Variabilní úseky monoklonálních protilátek značící intaktní NK buňky a CD8+ T lymfocyty byly klonovány z odpovídajících hybridomových buněčných linií a použity pro konstrukci bispecifických jednořetězcových protilátek, jak popsáno v příkladu 3.
Příklad 5
Zesílené instruování naivních CD8+ T lymfocytů NKG2D-namířenými protilátkami
Pro experimenty instruování in vitro byly izolovány naivní humánní CD8 + T lymfocyty:
Mononukleární buňky (PBMC) byly připraveny centrifugací na fikolovém hustotním gradientu z 500 ml periferní krve získané od zdravého dárce. CD8+ T lymfocyty byly izolovány negativní selekcí s použitím komerčně dostupného kitu pro separaci buněk (R&D Systémy, HCDBC-1000) . Kolona pro CD8+ T lymfocyty byla naplněna 2 x 108 PBMC, které byly preinkubovány se směsí protilátek výrobce doplněné 1 μg monoklonální anti-CDllb protilátky (Coulter 0190) na kolonu. Protože instruované neproliferující cytotoxické CD8+ T lymfocyty sdílejí CD45RA+/RO~ fenotyp s naivními CD8+ T lymfocyty, CDllb byl zaveden jako další markér buněčné purifikace, aby bylo možné odstranit dřívější podskupinu T lymfocytů. Tak pouze
CDllb'/CD8+ T lymfocyty vstoupily do purifikačního postupu založeného na CD45 izoformách, což mělo nakonec za následek naivní CD8+ T lymfocyty, které jako naivní CD4 + T lymfocyty nesou CD45RA+/RO~ fenotyp. úspěšná purifikace CD8+ T lymfocytů • ♦ · · byla kontrolována průtokovou cytometrií po jednom značení anti-CD8 protilátkou. Absence CDllb+ buněk v preparátech CD8+ T lymfocytů byla potvrzena jedním značením anti-CD28 protilátkou, protože CDllb-pozitivní CD8+ T lymfocyty jsou vždy CD28-negativní a naopak.
CD45RO+ buňky byly odstraněny od purifikovaných CD8'
T lymfocytů protilátkou inkubací s myší monoklonální anti-CD45RO (PharMingen, UCHL-1, 31301), pak následovaly magnetické perličky konjugované s polyklonální ovčí anti-myší lg protilátkou (Dynal, 110.01). čistota zbylých naivních CD8 + T lymfocytů byla prokázána >95%, jak stanoveno průtokovou cytometrií po dvojitém značení s anti-CD45RA/anti-CD45RO. Průměrný výtěžek naivních CD8+ T lymfocytů na 500 ml periferní krve byl 5 χ 106 (CD8).
Experiment instruování in vitro s naivními CD8+ T lymfocyty byl prováděn takto:
000 EpCAM transfekovaných buněk CHO na jamku bylo inkubováno na 96 jamkové kultivační destičce s plochým dnem po dobu 2 hodin, destičky byly potaženy přes noc polyklonální králičí anti-myší IgGl protilátkou (Dako, Z0013) naředěnou 1:1000 v PBS. Poté, co buňky adherovaly k umělé hmotě, byly ozářeny dávkou 14000 rad. Pak bylo přidáno 50000 purifikovaných naivních CDB+ T lymfocytů na jamku v RPMI 1640 médiu doplněném 10% humánním AB sérem, 100 U/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu, 2mM glutaminem, lmM pyruvátem sodným, lOmM HEPES pufrem, lx neesenciálními aminokyselinami (Gibco) a 50μΜ β-merkaptoethanolem. EpCAM specifický B7-1/4-7 jednořetězcový konstrukt popsaný ve WO9925818 (příklad 7) byl přidán v koncentraci 500 ng/ml spolu s 1 μg/ml myší IgGl izotypové kontroly (Sigma, M-7894) a buď s 250 ng/ml, 50 ng/ml bispecifické jednořetězcové protilátky nebe- bez bispecifické jednořetězcové protilátky (bsc) EpCAM x CD3 (Mack (1995) Proč.
lymfocytech. koncentrace laskavě poskytnutým Dr myší NKG2D-specifickou
Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 7021). 500 ng/ml B7-1/4-7 jednořetězcového konstruktu byla maximální koncentrace, která ještě sama o sobě neovlivnila expresi CD45 izoformy na CD8+ T V paralelním experimentu byly použity stejné a kombinace bsc EpCAM x CD3 a B7-1/4-7 jednořetězcového konstruktu kromě toho, že IgGl izotypová kontrola byla nahrazena naředěným hybridomovým supernatantem Moretta, Janov, Itálie, obsahujícím IgGl protilátku BAT221 v konečné koncentraci 1 μρ/πιΐ. Alternativně NKG2D-specifická monoklonální protilátka byla vyměněna za bispecifickou protilátku vázající NKG2D a EpCAM, jako sekv. id. č. 47-49 a 72-79. Na rozdíl od monoklonální protilátky nebyla na pevné fázi imobilizována žádná bispecifická protilátka.
Všechny experimenty byly prováděny ve třech opakováních identických jamek. Kromě toho byla připravena sada dvou identických 96 jamkových destiček, aby bylo jisté, že bude k dispozici dostatek buněk pro průtokovou cytometrii ve dnech 3 a 6. 3. Den byl sklizen supernatant z jedné 96 jamkové destičky a byla určována koncentrace TNF-α s použitím komerčně dostupného kitu ELISA (PharMingen, 2600KK). Buňky byly také sklízeny a podrobeny analýze průtokovou cytometrii na expresi CD45-izoformy. Navíc byla z každé jamky druhé 96 jamkové destičky odstraněna polovina supernatantu a nahrazena čerstvým médiem upraveným odpovídající koncentraci B7-1/4-7 jednořetězcového konstruktu, bsc EpCAM x CD3, BAT221 a/nebo izotypové kontroly. 6. Den byly sklízeny buňky z této 96 jamkové destičky a typ exprese jejich CD45-izoformy byl analyzován průtokovou cytometrii. Obecně byly buňky a supernatanty ze tří identických jamek (triplikáty) sloučeny pro analýzu průtokovou cytometrii a analýzu cytokinů, v daném pořadí.
• · · *
Průtoková cytometrie byla prováděna na přístroji FACScan (Becton Dickinson). Analýza průtokovou cytometrií exprese CD45-izoformy byla prováděna dvojím značením 1 x 105 buněk PEkonjugovanou monoklonální anti-CD45RA protilátkou (Coulter, 2H4, 6603904) a FITC-konjugovanou monoklonální anti-CD45RO protilátkou (DAKO, UCHL-1, F 0800) po dobu 30 minut na ledu. Monitorování průtokovou cytometrií purifikace T lymfocytů bylo stejně prováděno jednoduchým barvením monoklonální anti-CD8 protilátkou konjugovanou s trikolórou (Medac, MHC0806) a FITCkonjugovanou monoklonální anti-CD28 protilátkou (Medac, MHCD2801).
V těchto experimentech instruování byl primární signál zprostředkován bispecifickou jednořetězcovou protilátkou (bscAb) EpCAM x CD3, což imitovalo rozpoznávání specifického antigenu prostřednictvím receptoru T lymfocytů (TCR), druhý nebo kostimulační signál byl zprostředkován EpCAM-specifickým B7-1/4-7 jednořetězcovým konstruktem prostřednictvím zapojení CD28 na T lymfocytech. Tedy mohl být stanoven účinek NKG2Dnamířené protilátky na instruování naivních CD8+ T lymfocytů, které byly aktivovány prostřednictvím signálu podobného TCR a kostimulačního signálu. Nehumánní stimulační buňky vybavené EpCAM-specifickými konstrukty byly použity, aby se zabránilo signálům pozadí, které mohou vzniknout, když humánní stimulační buňky náhodně exprimují kostimulační receptory. Kinetika instruování T lymfocytů byla monitorována průtokovou cytometrií ve dnech 3 a 6 současným měřením exprese CD45RA a CD45RO. Jak ukázáno na obrázku 6, téměř celá populace naivních T lymfocytů změnila CD45 fenotyp na fenotyp instruovaných T lymfocytů, tj . CD45RA/RO+, během 6 dnů v přítomnosti B7-1/4-7 jednořetězcového konstruktu (500 ng/ml a bscAb EpCAM x CD3 (250 ng/ml). V souladu s tím byl 3. Den pozorován přechodný stav. Překvapivě další přítomnost NKG2D-namířené protilátky dále urychlovala proliferaci a instruování naivních CD8+ T lymfocytů. To mohlo být usuzováno z vyššího procenta CD8+ T lymfocytů lokalizovaných 3. Den v nižším pravém kvadrantu na obrázku 6B, jestliže buňky dostaly další NKG2D-signál ve srovnání s menším procentem, když byly naivní T lymfocyty stimulovány prostřednictvím signálu podobného TCR a kostimulačního signálu samotného. Protože TNF-α je typicky produkován instruovanými CD8+ T lymfocyty, ale ne jejich naivními protějšky, účinek zesíleného instruování T lymfocytů mohl být potvrzen vyššími koncentracemi TNF-α měřenými 3. Den v supernatantu CD8 + T lymfocytů dostávajících NKG2D-signál ve srovnání s lymfocyty instruovanými v nepřítomnosti NKG2Dnamířené protilátky (obrázek 7).
Ještě 6. den výsledky průtokové cytometrie (obrázek 6 C a E), když byl proces instruování téměř ukončen, prokazovaly NKG2D-zprostředkovanou podporu instruování T lymfocytů: ztráta CD45RA-exprese během 6 dnů se ukázala být hlubší v přítomnosti NKG2D-zprostředkovaného signálu než v jeho nepřítomnosti, jak měřeno vyšším procentem CD8+ T lymfocytů lokalizovaných v nižším pravém poli na obrázku 6C.
Příklad 6
NKG2D-namířené protilátky zesilují cytotoxicitu CD8+ T lymfocytů a buněk NK spouštěnou zapojením komplexu TCR nebo komplexu FcyRIII
Aby se otestovalo rekrutování cytotoxických lymfocytů, tj. CD8+ T lymfocytů a NK buněk NKG2D-namířenými protilátkami, prováděli původci testy uvolňování 51Cr s použitím myší FcyRpozitivní buněčné linie P815 jako cíle a buď Melan A ·· · ftw ·* ( * * specifického humánního klonu CD8+ T lymfocytů (buňky Melan A) nebo NK buněk (Bauer (1999) Science 285: 727) jako efektorů.
Test uvolňování 51Cr měřící buněčnou cytotoxicitu byl prováděn, jak bylo popsáno (Mack (1995) Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021) s menšími modifikacemi. 10 000 buněk P815 značených 51Cr bylo buď smícháno s 50 000 buňkami Melan A nebo s 200 000 buněk NK na jamku mikrotitrační destičky s kulatým dnem. NK buňky byly inkubovány po dobu 4 hodin v přítomnosti 5 μς/ιηΐ protilátky CD16 (3G8) a/nebo naředěného hybridomového supernatantu obsahujícího myší NKG2D-specifickou monoklonální protilátku BAT221. Buňky Melan A byly inkubovány po dobu 4 hodin v přítomnosti 0,2 μς/πιΐ CD3 protilátky (OKT3) a/nebo naředěného BAT221 supernatantu. Maximum uvolňování 51Cr bylo stanoveno lýzou cílových buněk pufrem Mály (2% SDS/0,37% EDTA/0,53% Na2CO3). Spontánní 51Cr uvolňování bylo stanoveno s použitím cílových buněk inkubovaných v nepřítomnosti efektorových buněk a protilátek. Cílové buňky inkubované s efektorovými buňkami v nepřítomnosti protilátky sloužily jako negativní kontrola. Specifická lýza byla vypočtena jako [(cpm, experimentální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)]/ [(cpm, maximální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)]. Test cytotoxicity byl prováděn s trojím opakováním vzorků. Jak ukázáno na obrázku 8, samotný BAT221 neindukoval podstatnou lýzu cílových buněk na rozdíl od publikovaných NKG2D protilátek (Bauer (1999) Science 285: 727). Jak bylo očekáváno, protilátky CD16 a CD3 indukovaly přesměrovanou lýzu cílových buněk NK buňkami a Melan A buňkami, v daném pořadí. Ale, ačkoliv nebyl samotný cytotoxický, BAT221 překvapivě zesiloval cytotoxicitu cílových buněk spouštěnou zapojením komplexu TCR na Melan A buňkách a komplexu FcyRIII na NK buňkách. Alternativně buňky P8Í5 byly ' nahrazeny např. EpCAMoozitivními buňkami Kato a NKG2Dsoecifická monoklonální ···· protilátka vyměněna za bispecifickou protilátku vázající NKG2D a EpCAM podobné sekv. id. č. 47-49 a 72-79. Komplex TCR na CD8+ T lymfocytech byl zapojen bispecifickou protilátkou vázající CD3 a povrchový antigen na cílových buňkách nebo specifickým rozpoznáváním TCR antigenu cílové buňky zpracovaného do komplexu MHC I. Komplex FcyRIII na buňkách NK může být zapojen bispecifickou protilátkou vázající CD16 a povrchový antigen na cílových buňkách nebo monoklonální protilátkou specifickou pro cílové buňky, jako např. humánní EpCAM protilátka vázaná k FcyRIII prostřednictvím své částí Fc.
Příklad 7
Bispecifické jednořetězcové protilátky s NKG2D vazebným místem lokalizovaným C-koncově od cílového vazebného místa
Pět Balb/c myší bylo geneticky imunizováno humánní NKG2D, jak popsáno v příkladu 2. Aby se identifikovaly myši se sérovou protilátkovou reaktivitou na povrch humánních lymfocytů podobnou typu exprese komplexu NKG2D-receptor, byla prováděna trojitá fluorescenční analýza na PBMC, jak popsáno v příkladu 2 s myším sérem naředěným 1:10, 1:20 a 1:40. Jak ukázáno na obrázku 9, pouze jedno myší sérum (č. 4) projevovalo silné značení obou CD8+ T lymfocytů a NK buněk. Buňky sleziny této myši byly použity jako imunoglobulinový rejstřík pro konstrukci kombinatorické protilátkové knihovny, jak bylo popsáno ve WO9925818 (příklad 6). Rejstřík klonované protilátky byl vystaven na vláknitém fágu jako N2-VH-VL-fúzní protein, imitující C-koncovou polohu odpovídajícího antigen vazebného místa v bispecifické jednořetězcové protilátce. Selekce NKG2D reaktivních scFv-fragmentů byla prováděna dvěma koly prohledávání knihovny na zmobilizovaném rekombinantním NKG2D proteinu, jak bylo popsáno ve WO9925818 pro 17-1A nebo
EpCAM antigen, pak následovala tři kola prohledávání na NKG2Dpozitivních NK buňkách. Prohledávání na buňkách bylo prováděno v PBS/10%FCS resuspendováním 2-5 x 106 NK buněk v 500 μΐ suspenze fága, pak následovalo 45 minut mírné třepání ve 4°C. Pak byly buňky plus navázané fágové částice stočeny ve stolní centrifuze ve 2500 rpm po dobu 2 minut. Výsledný pelet pak byl dvakrát promyt a resuspendován v 1 ml PBS/10%FCS, pak následovala znovu centrifugace (třetí kolo prohledávání). Během čtvrtého kola prohledávání byly použity 3 promývací kroky, a také 5 promývacích kroků během pátého kola prohledávání. Specificky navázané fágové částice byly eluovány z NK buněk resuspendováním a inkubací v 500 μΐ HCl-glycinu po dobu 10 minut následovanou neutralizací s 30 μΐ 2M Tris-base (pH 12) . Eluáty byly použity pro infekci nové neinfikované kultury E.coli XLl Blue. Po pěti kolech produkce fága a následné selekci na vazbu antigenu fágů vystavujících scFv, byly izolovány plazmidové DNA z kultur E.coli odpovídající čtvrtému a pátému kolu prohledávání. Pro produkci rozpustných scFv-protilátkových fragmentů, které nesou N2-doménu na svém N-konci, byl DNA fragment kódující CT-doménu produktu genuIII vyříznut enzymy Spel/Notl a nahrazen tetramerizační doménou humánního p53 (Rheinnecker (1996) J Imunol. 157: 2989) ohraničenou N-koncovým Ig-kloubovým úsekem a C-koncovým Flagepitopem (obrázek 10, sekv. id. č. 50 a 51). Po ligaci byl výsledný pool plazmidové DNA transformován do 100 μΐ teplotně kompetentních buněk E.coli XLl Blue a nanesen na misky na LBagar s karbenicilinem. Jednotlivé kolonie byly kontrolovány PCR screeningem na integritu klonovaných VH a VL oblastí a kolonie s intaktními variabilními úseky podrobeny periplazmatické expresi rozpustných protilátkových fragmentů, jak bylo popsáno ve WO9925813 (příklad 6) . Periplazmatické preoarátv bvly testovány testem ELISA na imobilizovaném • ·· · rekombinantním NKG2D a specificky vázající N2-scFv-p53-fúzní proteiny detekovány anti-Flag M2 protilátkou konjugovanou s peroxidázou (Sigma, A-8592). Jak ukázáno na obrázku 11, bylo identifikováno mnoho NKG2D-reaktivních klonů ze čtvrtého a pátého kola prohledávání. ScFv-kódující fragmenty pozitivních klonů byly vyříznuty s použitím BspEI z fágového displejového vektoru a subklonovány do plazmidového vektoru BS-CTI (viz WO 00-06605, obrázek 2) připraveného štěpením s BspEI a Xmal, pak následovala defosforylace telecí intestinální fosfatázou. Správná orientace scFv-fragmentů byla kontrolována analytickým štěpením restrikčními enzymy BspEI a Spěl. Inzercí do BS-CTI byly scFv-kódující fragmenty fúzovány ve shodném čtecím rámci ke značce Hisg (sekv. id. č. 52-71) . V dalším kroku byly scFvfragmenty vyříznuty BspEI a Sáli z BS-CTI a subklonovány pomocí BspEI/SalI do savčího expresního vektoru pEF-DHFR, který obsahoval EpCAM-specifickou, CD3'namířenou bispecifickou jednořetězcovou protilátku, jak bylo popsáno (Mack (1995) Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021), kromě toho, že scFv-f ragment EpCAM-specifické monoklonální protilátky M79 byl nahrazen fragmentem monoklonální protilátky 3B10, který se váže k EpCAM s vysokou afinitou (= bsc 3B10 x CD3) . Tedy CD3specifický scFv-fragment byl nahrazen NKG2D-reaktivními scFv-fragmenty, což mělo za následek EpCAM-specifické, NKG2D-namířené bispecifické jednořetězcové protilátky (sekv. id. č. 72-79).
Buňky CHO/dhfr- byly vybrána pro přechodnou expresi molekul podobných protilátkám. Transfekce buněk byla prováděna s použitím transfekční reagencie TransFast (Promega, Heidelberg) podle protokolu výrobce. Stručně, 2,5 x 105 buněk bylo naneseno do každé jamky na šesti jamkových destičkách 20 hodin před transfekcí. Transfekční směs byla připravena přidáním 6 μρ plazmidové DNA obsahující protilátkové sekvence nebo gen β-galaktosidázy k 1 ml MEM alfa média bez doplňků. Po • ·· · • · »···
promíchání bylo přidáno 30 μΐ reagencie TransFast. Směs byla vortexována a inkubována po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Pak byla odstraněna média z buněk a nahrazena transfekční směsí. Po 1 hodině inkubace ve 37 °C byla transfekční směs odsáta a k buňkám bylo přidáno čerstvé kompletní MEM alfa. Produkce proteinu byla analyzována 4 až 5 dnů po transfekcí analýzou FACS. Supernatanty byly sklízeny po 4 až 5 dnech. Aby se odstranil buněčný debris, byly supernatanty stočeny. Funkce protilátek byla analyzována ve vazebných studiích antí-EpCAM specifické části na buňkách Kato
III. Na každý vzorek bylo inkubováno 4 x 105 buněk v 75 μΐ transfekovaného buněčného supernatantu naředěného s 25 μΐ pufru FACS (1% teplem inaktivované FBS, 0,05% Na3N v PBS). Vzorky byly inkubovány po dobu 30 minut ve 4°C. Po promytí buněk dvakrát s 200 μΐ pufru FACS byly buňky inkubovány s 2 μρ/πιΐ protilátky anti-Penta.His (QIAGEN, Holandsko) po dobu 30 minut ve 4°C. Pak byly buňky opět promyty a inkubovány po dobu 30 minut s ovčím anti-myším FITC konjugátem (SIGMA, Deisenhofen). Vazba byla detekována přístrojem FACS Calibur (BectonDíckinson) (obrázek 12). Supernatanty buněk CHO přechodně transfekovaných bsc 3B10 x P4-3 a bsc 3B10 x P5-2 vykazovaly pozitivní ELISA signály na imobilizovaném rekombinantním NKG2D antigenu (obrázek 13) .
Jako alternativa k NKG2D, byly DAP10 peptidové konjugáty, jak popsáno v příkladu 4, použity pro imunizaci myší, jejichž buňky sleziny byly zdrojem imunoglobulinového rejstříku pro konstrukci kombinatorické protilátkové knihovny, jako byla knihovna popsaná v tomto příkladu. Tedy, vazebná místa pro DAP10 reaktivní protilátky rozpoznávající komplex NKG2Dreceptor na CD8+ T lymfocytech a buňkách NK, dokonce i při lokalizaci C-koncově od cílového vazebného místa v bispecifické jednořetězcové protilátce, mohou být vybrána ·· ·♦
9 prohledáváním knihovny na imobilizovaném peptidovém konjugátu a/nebo buňkách exprimujících komplex NKG2D-receptor.
Příklad 8
Rekrutování CD8 + T a NK efektorových buněk bispecifickými jednořetězcovými protilátkami s NKG2D-vazebným místem lokalizovaným C-koncově od cílového vazebného místa
Aby se otestovalo rekrutování cytotoxických lymfocytů, tj. CD8+ T lymfocytů a NK buněk NKG2D-namířenými bispecifickými protilátkami, prováděli původci testy uvolňování 51Cr s použitím buněčné linie Kato karcinomu žaludku jako cíle a buď Melan A specifického humánního klonu CD8+ T lymfocytů (buňky Melan A), NK buněk (Bauer (1999) Science 285: 727) nebo nestimulovaných PBMC od zdravého dárce jako efektorů.
Test uvolňování 51Cr měřící buněčnou cytotoxicitu přesměrovanou proti EpCAM-pozitivním buňkám Kato byl prováděn, jak bylo popsáno (Mack (1995) Proč Nati Acad Sci USA 92: 7021) s menšími modifikacemi. 10 000 buněk Kato značených 51Cr bylo buď smícháno s 50 000 buněk Melan A nebo s 200 000 buněk NK nebo PBMC na jamku mikrotitrační destičky s kulatým dnem a inkubováno po dobu 4 hodin (Melan A a NK buňky) nebo 18 hodin (PBMC) . v přítomnosti tkáňového supernatantu z buněk CHO naředěného 1:2, které byly transfekovány odlišnými EpCAMspecifickými, NKG2D-namířenými bispecifickými jednořetězcovými protilátkami (3B10 x P4-3, 3B10 x P4-14, 3B10 x P5-2 a 3B10 x P5-23), jak popsáno v příkladu 8. Maximum uvolňování 51Cr bylo stanoveno lýzou cílových buněk pufrem Mály (2% SDS/0,37% EDTA/0,53% Na2CO3) . Spontánní 51Cr uvolňování bylo stanoveno s použitím cílových buněk inkubovaných v nepřítomnosti efektorových buněk a bispecifické protilátky. Cílové buňky inkubované s efektorovými buňkami v nepřítomnosti protilátky • ·· · · ···· jako negativní kontrola. Specifická lýza byla jako [(cpm, experimentální uvolňování) - (cpm, (cpm, maximální uvolňování) - (cpm, Test cytotoxicity byl prováděn s sloužily vypočtena spontánní uvolňování)]/ spontánní uvolňování)] triplikáty vzorků. Jak ukázáno na obrázku 14, supernatant buněk CHO přechodně transfekovaných s bispecifickou jednořetězcovou protilátkou indukoval slabou, ale reprodukovatelnou a
NKG2D-namířenou 3B10 x P4-3 titrovatelnou cytolýzu EpCAM-pozitivních Kato buněk jak Melan A tak NK buňkami ve 4 hodinovém testu uvolňování 51Cr. Mimoto supernatanty buněk CHO přechodně transfekovaných s NKG2Dnamířenými bispecifickými jednořetězcovými protilátkami 3B10 x P4-3, 3B10 x P4-14, 3B10 x P5-2 a 3B10 x P5-23, v daném pořadí, indukovaly podstatnou lýzu cílových buněk PBMC v 18 hodinovém testu uvolňování 51Cr (obrázek 15).
»· • » • ···· ··»· ··· · ·· ·· I · · • * ····
SEZNAM SEKVENCI <140> PCT/EP01/03414 <141> 2001-03-26 <150> 00 10 6467.4 <151> 2000-03-24 <160> 90 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 429 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 1 ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60 aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120 gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180 gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240 acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300 attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360 aactgttcaa ctccaaatac atacatctgc atgcaaagga ctgtgtccgg gcatcatcac 420 catcatcat 429 <210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: úměra sekvence • ·»·
- 72 -
<400> 2
Leu Phe Asn Gin Glu Val Gin Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
1 5 10 15
Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gin Phe
20 25 30
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gin Ala Ser Cys Met Ser
35 40 45
Gin Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gin Asp Leu
50 55 60
Leu Lys Leu' Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro
55 70 75 80
Thr Asn Gly Ser Trp Gin Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gin Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
115 120 125
Ile Cys Met Gin Arg Thr Val Ser Gly His His His His His His
130 135 140 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 3
Asn Gin Glu Val Gin Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys 15 10 15
Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gin Phe Phe Aso 20 25 30
UPi
A_a Ser 50 Leu Leu Lys Val Tyr 55 Ser Lys Glu Asp Gin Asp 60 Leu Leu Lys
Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn
65 70 75 80
Gly Ser Trp Gin Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu
85 20 95
Thr Ile Ile Glu Met Gin Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser
100 105 110
Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ssx rnu v» Pro Asn Thr Tyr Ile Cys
115 120 125
Met Gin Arg Thr Val 130 <210> 4 <211> 114 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 4
Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gin Phe Phe Asp Glu Ser Lys
5 10 15
Asn Trp Tyr Glu Ser Gin Ala Ser Cys Met Ser Gin Asn Ala Ser Leu
25 30
Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gin Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys 35 *40 45
Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp 50 55 60
Gin Trp Glu A,sp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile 63 70 75 30
Glu Met Gin Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly 35 20 25
110
100 <>
«
105
Thr Val <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 5
Gin Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly 15 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro 20 25 30 <210> 6 . __<211> '21 <212> PRT ' <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 6
Gin Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly 1 5 - 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys 20
<210> 7
<211> 321
<212> DNA
<212> Urně 2.
<220>
• · · · <400> 7 gacattcagc tgacccagtc tccagcctcc ctatccgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag cttggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcaggtcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctacgtggac gttcggtgga 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 8
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
- 20 25 30
Leu- Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Val Leu 'Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Thr Trp
85 > 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 11
<212>
<·21Ξ> Umělá sekvence
< 2 2 G >
<··??-.> Podís umělé se
• · · · to » · · · ·
- 76 <400> 9
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Len Ala 15 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 10
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp <210> 11 <211> 9 ,<212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence •<40Q> 11
Gin His Phe Trp Ser Thr Thr Trp Thr 1 5 <2I0> 12 <2I1> 351 <212> DMA <2I3> Umělá sekvence <220>
<23
Pccis umě:
semncs: uměj <400> 12 ;ace
5.CT“ CT5.5.C icaacc
- 77 cctgagcaag gccttgagtg gattggaagg attgatcctt acgatagtga aactcactac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggccatattg actgtagaca aatccgccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaaatgggt 300 gattactcct ttgactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 13
Gin 1 Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val A.rg Pro Gly 15 Ala
5 10
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Gin Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe
- 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
t 85 90 95
Ala Lys Met Gly Asp Tyr Ser Phe Asp' 'Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <212> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence • · · ·
<400> 14
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 15 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 15
Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 'Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210>16 <211> 8 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 16
Met Gly Asp Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 17 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Pocis umělé sekvence: umělá sekvence < 4 3 C >
····
- 79 - • · • · • · ··· • » · · ·
gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 12 0
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cctctggagt ccctgctcgc ISO
ttcagtggca gtgagtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg aatagcaacc cgcccacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agatcaaa 318
<210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 13
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ile 10 Leu Ser Ala Ser Pro 15 Gly
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
. -His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Sen Tyr Ser Leu 'Τ'ν^'κ· χ? Ser Arg Val Glu Ala C-lu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr
- 85 ~ 90 95
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<21i> 10
<212> PRT
<213;· Umelá sekvence
<- 2 Ω γ
·- _ .2 ů· Penis umele sekvence
<400> 19 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1_ 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 20
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 21
Gin Gin Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 22 -
<211> 357
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
agcac acc ~gcs.czz ccaggaaagg eg g g c cg cg a
gccgggagca gagcaccagc
ccc 120 2.5.G iflO cca 240 • · · · »· · · * · · aaaatgaata gtctgcaaat tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aggggggtac 300 gagggggcgg cctggtttgg ttactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 23
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Sér' Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Glu Gly Ala Ala Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <2ii> 10 <212> PRT <213> Umělá sekvence ···« ·-· ’ · ’ * a • · · · ♦ · Σ • ♦ · ζ · · · • · ··· ···· · ··· ·
- 82 <400> 24
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His 15 10 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 25
Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 15 10 15 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 26
Gly Gly Tyr Glu Gly Ala Ala Trp Phe Gly Tyr 15 10 <210> 27 <211> 321 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 27
gacattcagc tgacccactc tccagccatc ccgtctgcga grccaggaga aagagacaga 60
ttctcctgca gggccagtca gaccattggc acaagcattc actggtatca gcaaagaaca 123
aatggttctc caaggcctct cataaagtat gcttctgact caatcta^gg gaaccaaacc ISO
3223 ÍZ 7 aC g gcagtggatc agggacagat ttcactctta gcaccaacgg tgaggagr 240
gaagacactzg cagactacra ctgtcaacaa agaaaaa-saa ggccacaaac 2332223233 300
• · · ·
- 83 - .:. :
gggaccaagc tggagaccaa a 321 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 28
Asp 1 Ile Gin Leu Thr· 5 Gin Ser Pro Ala Ile 10 Leu Ser Val Ser Pro 15 C-ly
Glu Arg Val Ser ph θ Ser Cys Arg Ala Ser Gin Thr Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser c-ly
50 c ς 60
cer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Ser Ile Asn Gly Val Glu Ser
Ή5 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Thr Trp Pro Lsu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<21i> 11 ··
<212> PRT
< 213 > Umělá sekvence
<22Q> <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 2 9
Aru A la Ser Gin Thr Ile Gly Thr Ser Ile His
I · · • φ φ Φ· · • · φφ · <210> 30 <21Ι> 7 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 30
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
--<400> 31
Gin Gin Ser Asn Thr Trp Pro Leu Thr -~T 5 <210> 32 <211> 360 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 32
caggtgcagc tgcagcagcc aggacctggc ctagzgcagc cctcacagag cctgcccacc 6 0
acctgcacag tctcoggttt ctcattaact atctatggtg tacactgggt tcgccagcca 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg £.í:acggag-g gcggaagcac agacaataat 130
gcagctttca tatccagact gagcatcagc 2.5. g g 5. C 5.3. u c coaagcgcca agt. a a tc í ' a 240
aaaargagca grctgcaagc taacgacaca gccaca-act actgctccag aaagacacaa 300
gacggttacc acggagraat ggactacrgg ggcsaaggga. ccacggtcac cgacaccaaa 3 60
<210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 33
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr 20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Arg Gin Val Phe Phe 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Gin Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95
Arg Lys Ser His Asp Gly Tyr Tyr Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 34
Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr Gly Val His ·· ·4 *··· <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 35
Val Zle Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser 15 10 15 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 36 'Lys Ser His Asp Gly Tyr Tyr Gly Val Met Asp Tyr 15 10 <210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: uměla sekvence
<400> 37
gacattcagc tgacccagtc tccagccaac ccgtccgcga gtccagcaga aagagacagt 60
ttctcctgca gggcoagtca gagcattggc acaagcatoc actggtatca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagLaa gcttctgagt ctatctctgg gatcccatcc 130
aggtttagrg gcagcggatc agggacagaa tttactctta ccatcaacgg tgaggagaca 240
CaagaCaaag cagattatta cagccaacaa agtaatacct ggccactcac caacůraacraa 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 33 <21i> 107 ··»· •« · • · • · • · ··· · ·» «* • · · • » * ♦ · · • · · ·· ···· <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 38
.Asp Ile Gin Leu Til 27 Gin Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
C-lu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser ?rc Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Gly Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin G i ·*? Ser Asn Thr Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 39
Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Thr Ser Zle His <210> 40 <211> 7 *0*0 ♦ · • · * • · •»» · • ·» ·» ·* •» · · · · · • · * · « · Μ · · · • · · · · »···«·· ·· · · · <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 40
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 41
Gin Gin Ser Asn Thr Trp Pro Leu Thr 1 5 ~<210> 42 <211> 360 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 42
caggtgcagc tgcagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag ccčgcccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaacr atctatggtg tacactgggt tcgccagtct 120
ccaggaaagg gtccggagtg gctgggágtg atatggagtg gcggaagcac 5. g a c íz. a 13.& t· 180
gcagctttca tatccagact gagcatcagc aacgacaatt ccaagcgcca agutttcttt 240
aaaatgagca gtctgcaagc taatgacaca gccatatatt actgttccag aaagtcccat 300
gatggttact acggagtaat cgactactgg ggcoaaggga ccacggtcac cgrzctcctca 360
<210>
<21i>
120 •tt • i · *
- 89 • tt • tt* · * ·* * Λ 9 * · · * * a tttt· • · t ·· ·«· · ·
· « «4 tttt·· <400> 43
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr 20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Arg Gin Val Phe Phe 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Gin Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser 85 90 35
Arg Lys Ser His Asp Gly Tyr Tyr Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvencs <400> 44
Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr Gly Val His 15 10 <210> 45 <211> 16 <212> PPI • · · · • o ·* ·· • · · · * · · • ♦ · · · · ♦ ·· · · ·«··· • · · · · · · ··· 4 ······· ·· ····
- 90 .<213> Umělá sekvence <220> · <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 45
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
5 10 1 15 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 46
Lys Ser His Asp Gly Tyr Tyr Gly Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 47 <211> 507 <212> PRT ' <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 47
* Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ser -10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Glu Thr Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gly Asn Ile His 30 Asn Tyr
Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Gin 40 Gly Lys Ser Pro Gin 45 Val Leu Val
Tyr Asn 50 Ala Lys Thr Leu Ala 55 Asp Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 /-i n . r Sex* Giy Thr Gin 70 Tyr Ser Leu Lys Ile 75 Asn Ser Leu Gin Pro 80
• ·
Glu Asp Phe Gly Ser 85 Tyr Tyr Cys Gin 91 His 90 Phe • 4 · · 4 Thr 4 · · 4 · ·
Trp Ser Thr 95 Trp
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin
115 120 125
Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ale Ser Val Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Gin
145 150 155 160
Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr
165 170 175
Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Gly Asp Tyr
210 215 220
Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Leu Glu Gin Ser Gly Ala Glu Leu
245 250 255
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
260 265 270
Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu šer Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin
275 280 285
Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu Va.1 Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr
290 295 300
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys .-_-_a rr'-. v- Leu Thr Ala Asp Lys Ser
305 310 315 320
Ser Ser s. Ser Mer Glu τ ,~η Aru Gp·*· T .Λ.Ί ’ Thr Ser Glu Asp
Λ ···· « <9 • · · · · · to • 9 · · « 9 · · 9
Ala VcL-L Tvr Phe Cys Ala Arg Arg C-iy Ser Tyr •Asp Thr A.sn Tyr Asp
340 345 350
Trp Tyr Phe .Asp Val Trp C-ly Gin Gly φί· *· Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Gly Gly Glv Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser C-iy C-ly Gly Gly Ser Glu
370 375 330
Leu Val Met Thr C-ln Thr Pro Leu Ser Lau Pro Val Ser Leu Gly .Asp
385 390 3 S 5 400
Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser Asn
• 405 410 415
Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly C-ln Ser Pro
420 425 430
Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser .Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro A.sp
435 440 445
Arg Phe Ser Gly Ssr Gly Ser Gly Thr A.sp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
450 455 460
Arg Val Glu Ala C-lu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser Thr
4.65. 470 475 430
Kis Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys A.rg
435 490 495
Thr Thr Ser Eis Eis His His His H 2 rn’-> v Ser
500 505
<21Q> 43 <211> 510 <212> PRT <212> Umělá sekvence <220>
<225> Pccis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 43
Asp Ile Gin Leu Thr C-in Ser Pro Ala Ha Leu Ser Vel Ser Pro Gly
Glu Are Val Ser Phe Ser 'Cys Are Ala Ser Gin Thr Ile Gly Thr Ser • 4 • · · ·
- 93 20 25 30
Ile His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Gly Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Thr Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser C-ln Val Gin Leu C-ln Gin
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr Gly Val His Trp Val Arg
'145 150 155 160
Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Arg Gin Val Phe Phe Lvs Met Ser Ser Leu Gin
195 200 - 205
Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys A.rg Lys Ser His Asp Gly
210 215 220
Tyr Tyr Gly Val Met Asp Tyr Trp C-ly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin 7 Leu Glu Gin Ser Gly
245 250 255
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Sex* VčL_ _73 Leu Ser Cys Lys Ala
2 50 z. 2 3 270
Gl/ rr. rr. L, r.g -v- Asn T'/r Gly — Ser Trn V 3. — Lys Gin A.rg
• ·♦ ·
275 280 . 285
Pro Gly Gin Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly 290 295 300
Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala
305 310 315 320
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr 340 345 350
Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 355 360 365
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 370 375 380
Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser
385 390 395 400
Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val
405 410 415
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 420 425 430
Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 435 440 445
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 450 455 _ 460
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser
465 470 ‘ 475 430
Gin Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
485 490 495
Ile Lys Arg Thr Thr Ser His His His His His His Thr Ser 500 505 510
49
<211> 510
<2I2> PP.T
• · * ·· ·· ·· • · 4 O 4 * · ·
4 · · ♦ · ·#·<·· _ QZ _ · · ·· 4·· □ ··· * ··· ···· »· ··· <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 49
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Aia Ile 10 Leu Ser Val Ser Pro 15 C-Iv
Glu Arg Val Ser ΡΪαΘ Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly v Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Gly Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys C-ln C-ln Ser Asn Thr Trp Pro Leu
-- 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Ser Leu Ser Ile Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ile Tyr C-iy Val His Val A.rg
145 150 155 160
Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser C-iy
165 170 17 5
Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ssr .Arg Len Ser Tle S sir
130 135 190
Lys Asp Asn Ser Lys Arg Gin Val Phe lys Met Ser Leu Gin
195 200 205
Ala Λ f-. ΛΟ1* A '-r, U -r· 2. a T 7 o rr-y v- Tvr Cys C un >- Ars Lvs Ser His Asn C '/
? o n.
·· ·
44 44
4 « « · * 4 · · • 4 4 · ·
4 4 ·
4444 4 · 4444
- 96 Tyr Tyr Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Leu Glu Gin Ser Gly
245 250 255
Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala 260 265 270
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gin Arg 275 280 285
Pro Gly Gin Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly 290 295 300
Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala
305 310 315 320
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser
325 330 335
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr 340 345 350
Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 355 360 365
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 370 375 380
Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser
385 390 395 400
Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val
405 410 415
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Len His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 420 425 430
Gin Ser Pro Lys Len Lan Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 435 440 445
Val Pro As 45 0
Phe Ser Giv Ser Glv ;er Gly Thr Asp Phe Thr L= 460 ·• · ·♦··
Gin Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 485 490 495
Ile Lys Arg Thr Thr Šer His His His His His His Thr Ser 500 505 510 <210> 50 <211> 206 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 50 actagttccg gaaccccgct gggtgacacc acccacacct ctggaaaacc actggatgga 60 gaatatttca cccttcagat ccgtgggcgt gagcgcttcg agatgttccg agagctgaat 120 gaggccttgg aactcaagga tgcccaggct gggaaggagc caggggggag cgactacaag 180 gatgacgatg acaagtaagc ggccgc 206
-«210> 51 <211> 65 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 51
Thr 1 Ser Ser Gly Thr 5 Pro Leu Gly Asp Thr 10 Thr His Thr Ser Gly 15 Lys
Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu C-ln 1 o Arg Gly Arg Glu Arg
20 25 30
Plis Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala
35 40 45
GLn Ala. Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
50 C i 50
L7S
0 0 ·«·« «·· • 0 · * · · · • 0 · · *00·* · » 0 0 0 ·
- 98 - 0 0 0 · 0 0 0 0*00
<210> 52
<211> 777
<212> DNA
<213 > Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 52
gaggcgcagc tgctcgagga gtctggagga ggcttggcac agcctggggg tcctctgaga 60
ctctcccgtg caacttctgg gttcaccttc actgattact acatgagctg ggtccgccag 12 0
cctccaggaa aggcacrtga gcggttgggt tttattagaa acaaagctaa tggttacaca 180
acagagtaca gcgcatctgt gaagggtcgg ttcaccatct ccagagataa ttcccaaagc 240
atcctctatc ttcaaatgaa caccctgaga gctgaggaca gtcccactta ttactgtgca 300
agagataaga cagacttcga tgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360
ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctgagctcgt gatgacacag 420
tctccatcct ccctgactgt gacagcagga gagaaggtca ctatgagctg caagtccagt 480
cagagtctgt taaacagtgg aaatcaaaag aactacctga cctggtacca gcagaaacca 540
gggcagcctc ctaaactgtt gatctactgg ccatccacta gggaatctgg ggtccctgaa 600
cgcttcacag gcagtggatc tggaacagat tccaccccca ccatcagcag tgtgcaggct 660
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagaat gattatagtt atccgctcac gttcggcgct 720
gggaccaagc. .ttgagatcaa acgtacgact agttccgggc atcatcacca tcatcat 777
<210> 53 <211> 259 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 53 ··
Glu Val Gin. Leu Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Giy
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg 29 Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe 30 Thr Asp
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin a 0 Pro Pro Gly Lys Ala d Leu Glu m>-—»
Gly 3 0 Glu ,-n S-r
£ X 60
► ·» β · to « · · • · ·· · • · » · • · • · ·
Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gin Ser
70 75 80
Ile Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Pro Thr
90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Thr Asp Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 130 135 140
Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
145 150 155 160
Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
165 170 175
Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser 180 185 190
Thr.Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 195 ' 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala 210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Ser Ser Gly His His His
245 250 255
His His His <210> 54 <21i> 756 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <2?3> Poois umělé sekvence: uměuá sex • *
- 100
<400> 54
gaggtgcagc tgctcgagtc tggaggtggc ctcgtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtac gataaactat 130
acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240
ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcccttc attactgtgc aagaggggcg 300
gtagtagctc cctttgacta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt 360
ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggcrctg agctcgtcat gacccagcct 420
ccatcctcct tatctgcctc tctgggagaa agag-caccc tcacttgtcg ggcaagtcag 430
gacattggta gtagcttaaa ctggcttcag caggaaccag atggaactat taaacgcctg 540
atctacgcca catccagttt agattctggt gtccccaaaa ggttcagtgg cagtaggtct 600
gggtcagatt attctctcac catcagcagc cttgaccctg aagattttgt agactattac 660
tgtctacaat atgctagttc tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct tgagatcaaa 720
cgtacgacta gttccgggca tcatcaccat catcat 756
<210> 55 <211> 252 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 55
Glu Val Gin 1 Leu Leu Glu Ser 5 Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 20 Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 25 30
Trp Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Glu Ile 50 Asn Pro Asp Ser 55 Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 60
Lys Asp Lys 65 Phe Ile Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80
Len Gin Met Ser Lys Val Arg 3 5 Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 30 95
Ala Arg Gly Are. Var /al Ara 100 Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
• ···· · ·· ·· ♦· • · · ···· « · · • · · · · · ·
- ιοί -
Thr Val Thr 115 Val Ser Ser Gly Gly 120 Gly c-iy Ser Gly Gly 125 Gly Gly Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Me“ Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu mk -v- Cys Arg Ala Ser Gin
145 150 15 5 160
Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn Leu Gin Glu Pro Asp Gly rpk v-
165 17C 175
Ile Lys Arg Leu le Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro
180 135 190
Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr
210 215 220
Ala Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Arg Thr Thr Ser Ser Gly His His Kis His Kis His
245 250 <210> 56 <211> 768 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 56 ccogeeecoc 60
gaggtgcagc tgctcgagtc tggaggtggc cLggogcegc ccggaggatc
tcctgtgcag ccccacgatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120
c cegggeeeg ggcragaatg geooggegee eooeeocceg atagcagtac geoeeecoeL 130 240
ecgcceococ oeeeggeoee at„caccatc -cc^g^gaca ecgc^o.eeee c e o o - k
cogceeeoge gceeegogeg atctgaggac ecegcccooó attactgtgc eegecgcegc 300
tacggtagta gcoecgecog goecoocgeo gnctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 3 60
goggoggooc Lggcggcggc cccoccccog gcggocgooc ogegcocceg /1 A ft
atgacccagt coccegccoc cccacctgca ococoggceg aaactgtcac catcacatct 17 c
cgagcaagtg egeeoeoooe cecOce*- o e gca-ggcaco egcegeeece gggeeeeoco 540
• ·· · • · · • · · *
- 102 -
cctcagctcc tggtccataa tgcaaaaacc ttagcagaag gtgtgccatc aaggttcagt 600
agcagtggat caggcacaca gttttctctg aagatcaaca gcctgcagcc tgaagatttt 660
gggagttatt actgtcaaca tcattatggt actccgctca cgttcggtgc tgggaccaag 720
cttgagatca aacgtacgac tagttccggg catcatcacc atcatcat 768
<210> 57 <211> 25Ó <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umě lá sekvence
<400> 57
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg C-ln Ala ?rc Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
3 5 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Lvs Val Arg Ser GlU Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Trt Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gin Gly Τχΐχ· Thr Val Thr Val Se*“ Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser G ± u T .ZSIJ Gin Met Thr Gin Ser
130 135 140
?ro Ala Ser Leu Ser Ar s. Ser '7 c. r Gly Glu Thr 7 al Thr Ile Thr Cys
1 4^ = o - X z i £0
-4 G3 ch-'· __ - - '', Ser - . Tvv Gin •4 —>
103
Gin Gly Lys Ser 180 Pro Gin Leu Leu Val 185 Tyr Asn Ala Lys Thr 190 Leu Ala
Glu Gly Val 195 Pro Ser Arg Phe Ser 200 Ser Ser Gly Ser C-ly 205 Thr Gin Phe
Ser Leu 210 Lys Ile Asn Ser Leu 215 Gin Pro Glu Asp Phe 220 Gly Ser Tyr Tyr
Cys 225 Gin His His Tvr Gly 230 Thr Pro Leu Thr Phe 23 5 Gly Ala Gly Thr Lys 240
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Ser Ser Gly His His His His His His
245 250 255 <210> 58 <211> 774 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 58
gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctgatga agcctggggc ctcagtgaag 60
atatcctgca aggctactgg ctacacattc agtagctact ggatagagtg ggtaaagoag 120
aggcctggac atggccttga gtggattgga gagattttac ctggaagtgg tagtactaac 180
tacaatgaga agttcaaggg caaggccaca ttcactgcag atacatcctc caacacac^cc 240
tacatgcaac tcagoagcct gacatctgag gactctgccg tctattactg tgcaagagga 300
t w ci c y a cg t >— ggtttgctta ctggggcoaa gggaccacgg tcaccgtctc cacaggtggc 360
ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacacagtcc 420
ccatcctccc tgaotgtgac agcaggagag aaggtcacta tgagctgcaa gtccagucag 480
agtctgttaa acagtgaaaa tcaaaagaac tacttgacct ggtaccagca gaaaccacgg 540
cagcctccta aactgttgat ctactgggca tccactacgg aatctggggt ccctgatcgc 600
ttcacaggca gtggatctgg aacagatttc actctcacca tcagcagtgt gcaggc ugaa 660
gacctggcag tctattactg tcacaatgat tatacttatc C3CÍCúCGTZ cggrgccggg 720
acoaagcttg acatcaaacg tacgactagt tccgggcatc aCC3CC5.LCa tea c 774
<210> =a <211> 258
····
- 104 • · ft • ftftft <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 59
Glu 1 Val Gin Leu Leu 5 Glu Gin Ser Gly Ala 10 Glu Leu Met Lys Pro 15 Gly
Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val να t Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Ms t Ser Cys Lys Ser Ser Gin
145 150 155 150
cgr Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr C-ln
165 170 175
Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
180 185 190
Λ V--T Λ— j Glu Ser Gly Val Pro Αξό Arg Phe Thr Giy Ser Giy Ser Gly Thr
19 5 200 ? βζ
As? Phe Thr Leu Thr Ser S“1* Gin Ala Asp Leu Λ ' — ri—CX Vai
210 213 220 ····
105 — ··· ·#·
Tyr Tyr Cys Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Tli* Ser Ser Gly His His His His
245 250 255
His His <210> 60 <211> 768 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 60
gaggtgcagc tgctcgagga gtctggagga ggcttggtgc aacctggagg atccatgaaa 60
ctctcctgtg ttgcctctgg attcactttc agtaactact ggatgaactg ggtcogccag 120
LcLs.cagd.ga aggggcttga gtgggttgct Ly a. a. a. L c had. taattatgca 180
acacattatg cggagtctgt gaaagggagg ttcaccatct caagagatga ttccaaaagt 240
agtgtctacc tgcaaatgaa caacttaaga gctgaagaca ctggcattta ttactgtacc 300
aggctcccct acggctttgc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctco 360
tcaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tcoggtggtg gtggttctga gctcgtgctc 420
acccagtctc caaccaccat ggctgcatct cccggggaga agatcactat cacctgcagt 480
gccagctcaa gtataagttc caattacttg cattggtatc agcagaagcc aggattctcc 540
cctaaactct tgatttatag gacatccaat ctggcttctg gagtcccagc tcgcttcagt 600
ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc acaatLtggca ccatggaggc tgaagatgtt 660
gccacttact actgccagca gggtagtagt ataccgctca cgttcggtgc tgggaccaag 720
cttgagatca aacgtacgac tagttccggg catoatcacc atcatcat 763
<210> 61 *
<211> 256
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<229>
<223> Pccis umělé sekvence: umě
<400> 61
C-lu 7ai Gin Leu ·« 0» 00 « * · · • « · *
0·· · «00 «0000 ·· 0··· «•re
- 106 0 •
0 0
0
Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn 20 25 30
Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Kis Tyr Ala 50 55 60
Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser 65 70 75 80
Ser V-al Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile 85 SO 95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Leu Pro Tyr Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser C-iy Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser C-lu Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro 130 135 140
Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys 145 150
Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu 165 170
Le Thr Ile Thr Cys Ser 55 160
-3 Trp Tyr Gin Gin Lys 175
Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala 180 185 190
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr 195 200 205
Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220
Cys Gin Gin Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 225 230 235 240 tl Glu lis ivs Acc Tlíc Giic Ssc Sec Glv -^is ř 2 4 Ξ 2 Ξ 0 íis His His Hi, 2 5 ··»· toto ·*
Μ 9 9 » » * • · · ·
9 9
107 <210> 62 <211> 759 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 62 gaggtgcagc tgctcgagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 60 atcacttgca ctgtctctgg gttttcatta accagctatg gtgtacactg ggttcgccag 120 cctccaggaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg ctggtggaag cacaaattat 180 aattcggctc tcatgtccag actgagcatc agcaaagaca actccaagag ccaagttttc 240 ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccatgt actactgtgc cagagatcgg 300 tactacgtgg gtgctatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctgagctcca gatgacccag 420 tctccagcat ccctgtccat ggctatagga gaaaaagtca ccatcagatg cataaccagc 480 actgatattg atgatgatat gaactggtac cagcagaagc caggggaacc tcctaagctc 540 cttatttcag aaggcaatac tcttcgtcct ggagtcccat cccgattctc cagcagtggc 600 tatggtacag attttgtttt tacaattgaa aacatgctct cagaagatgt tgcagattac 660 tactgtttgc aaagtgataa cttgccgtac acgttcggag gggggaccaa gcttgagatc 720 aaacgtacga ctagttccgg gcatcatcac .catcatcat 759 <210> 63 <211> 253 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 63
Glu 1 Val Gin Leu Leu 5 Glu Glu Ser Gly Pro 10 Gly Leu Val Ala Pro 15 Ser
Gin Ser Leu Ser 20 Ile Thr Cys Thr Val 25 Ser Gly Phe Ser Leu 30 Thr Ser
Tyr Gly Val 35 His Trp Val Arg Gin 40 Pro Pro Gly Lys Gly 45 Leu Glu Trp
Leu Gly Val Ile φ Ala Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Τ' - T . >
55 50
- 108 • · · · « • · · · ···· · · ··«
Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe 65 70 75 80
Leu Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser 130 135 140
Leu Ser Met Ala Ile Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser
145 150 155 160
Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu
165 170 175
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val 180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr 195 200 205
Ile Glu Asn Met Leu Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin 210 215 220
Ser Asp Asn Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240
Lys Arg Thr Thr Ser Ser Gly His His His His His His 245 250 <210> 64 <211> 753 <212> DNA <213> Umělá sekvencí <220>
<400> 54 • · » ·
- 109 - • · · • · • · · · • • • · ·
gaggtgcagc tgctcgagtc tggaggtggc ctggtccagc ctggaggatc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cotcacgatt cgatittagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 12 0
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtac gataaactat 180
acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240
ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtgc aagggaaact 300
gggacggagt ttgactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc agctggtggt 360
ggttctggcg gcggcggctc cggcggtcgt ggttctgagc tcgtgatgac coagactcca 420
tcctccatgt atgcatcgct gggagagaga gtcactatca cttgcaacgc gactcaggac 480
attaaaagct atttaagctg gtaccagcag aaacoatgga aatctcctaa gaccctgatc 540
tattatgcaa caagcttggc agatggggtc ccatcaagat tcagtggcag tggatctggg 600
caagattatt ctctaaccat cagcagcctg gagtctgacg atacagcaac ttattactgt 660
ctacagcatg gtgagagccc gcacacgttc ggagcgggga ccaagcttga gatcaaacgt 720
acgactagtt ccgggcatca tcaccatcat cat 753
<210> 65 <211> 251 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
-<400> 65
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly .....i 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thř~Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp A: 65 70' ^ia Lvs Asn Thr Len Tvr jeu Gin Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Thr C-iy Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 • ·
- 110 ··· ·
Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser Met Tyr 130 135 140
Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp
145 150 155 160
Ile Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Trp Lys Ser Pro
165 170 175
Lys Thr Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 195 200 205
Ser Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Gly 210 215 220
Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 225 230 235 240
Thr Thr Ser Ser Gly His His His His His His 245 250 <210>'66 <211> 771 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 66 cttagtcaag 60
gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagcttgrga ggccaggggc
ttgtcctgca aagcttccgg cttcaacatt aaagactact: atatgcactg ggtgaagcag 120
aggcctgaac agggcctgga gtggattgga tggattgatc ccgagaatgg taataccata 180
tatgacccga agttccaggg caaggccagt acaacagcag acacatcctc caacacagcc 240
tacctgcagc tcagcagcct gacatctgag gacactgccg cctattactg tgcttccttt 300
tattactacg gtagtagcta caggtacttc gaísgtccggg gccaagggac cacggtcacc 3 60
gccccctcag gtggrggtgg ttctggcggc ggcggcrccg gtggtggtgg ttctgagctc 420
grgatgaccc agactccacc ccccctaccc zzzzzzzzzg gagaaagagti cagtctcact 43 0
tgtcgggcaa gtcaggacat tggcagtagc ú caaaccggc ttsagcagga accagaíigga 540
α.<3*Σ5.;1~3.α.α.Ο gcctgaccta cgccacatcc agcts~agacú ctgg-gcccc caaaaggcíc 600
ug.ggcagta ggcctggg-c araccacccc gcagc^azga gccagaaga- SIC
---- accacccccc zzzzzzzzzz zzzz zz zzzz — ~
- 111 aagcttgaga tcaaacgtac gactagttcc gggcatcatc accatcatca t
771 <210> 67 <211> 257 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 67
Glu Val Gin Leu Leu Glu Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15
Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp 20 25 30
Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys 50 55 60
Phe Gin Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala -6-5 7 0 7 5 80
Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Ser Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Arg Tyr Phe Asp Val 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val-Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gin 130 135 140
Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gin Gin
165 170 175
Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu 130 185 190 • · · ·
Asp Ser Glv Val 195 Pro Lys Arg Phe 200 Ser Gly Ser Arg Ser 205 Gly Ser Asp
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Leu Gin Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
> Lys Leu Glu Ile Lys A.rg Thr Thr Ser Ser G-y His His His His His
245 250 255
His <210> 68 <211> 765 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <4ΌΌ> 68 gaggtgcagc tgctcgagga gtctggagga cgcttggtgc aacctggagg atccatgaaa 60 ctctcctgta ttgcctctgg attcactttc agtaattcct ggatgaactg ggtccgccag 120 tctccagaga aggggcttga gtgggttggt gaaattagat tgaaatctaa taattatgca 180 acacattatg cggagtctgt gaaagggagg ttcaccacct caagagatga ttccaaaa gt 240 agtgtctacc tacaaatgaa caacttaaga gttgaagaca ctggcattta ttactgtacg 300 aaggtggact actggggcca agggaccacg gtcaccgcct cctcaggtgg tggtggttct 360 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc 420 ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagcctttta 480 aacagtagca atcaaaagaa ctacttgacc tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct 540 aaactgttga tctactgggc atccactagg gaatccgggg tccctgatcg cttcacaggc 600 agtggatctg gaacagattt cactcccacc atcagcagrg tgcaggctga agacctcgca 660 gcttattacc gtcagaatga tťatagttat ccgcccacgt tcggtgctgg gaccaagctt 720 gagatcaaac gtacgactag ttccgggcat caccaccatc atcat 765 <210> 69 <211> 255 <212> PRT <213> Umělá sekvence
X ·~ P
- 113 <400> 69
Glu Val Gin Leu Leu 5 Glu Glu Ser Gly Gly 10 Gly Leu Val Gin Pro 15 Giv
Gly Ser Lys Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn
20 25 30
Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Ό—U Lys Gly Leu Glu Trp
3 5 40 45
Val Gly Glu Ile A.rg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala
‘50 55 60
Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser
65 70 75 80
Ser Val Tyr Leu Gin Met Asn A.sn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Thr Lys Val Asp Tyr Trp Gly C-ln Gly Thr Thr Val Tnr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser
130 135 14G
Val Gly Gin Lys Val Thr Meh Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu
145 150 15 5 160
Asn Sex* Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu' -Thr Trp Tyr Gin Gin Lvs Pro
165 170 17 5
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
130 185 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly T?ir Asp
135 200 205
Thr ZΊ e Ser Ser VčL-í. Gin A.ia Glu Aso ~ .31 i Ala Val Tyr m. - V — Cys
210 215 22 G
T’rr - C-1 v ,-ην-,
--- -“Si- - -- --- ---- w - - — - — 1 - ---
s “ 2 7 0 z. Z Z .·’ Γ|
• ·
- 114 Glu Ile Lys Arg Thr Thr Ser Ser Gly His His His His His His 245 250 255 <210> 70 <211> 774 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 70
gaggtgcagc tgctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtac gataaactat 180
acgccatctc taaaggatag attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240
ctgcaaatga gcaaagtgag gtctgaggac acagcccttt attactgtgc aagattgggg 300
caatgggggt actttgacta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt 360
ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg agctcgtgat gacacagtct 420
ccatcctccc tgactgtgac agcaggagag agggtcacta tgagctgcaa gtccagtcag 480
agtctgttaa acagtggaaa tcaaaagaac tacttgacct ggtaccagca gaaaccaggg 540
--cagcctccta aactgttgat čtactgggca tccacoaggg aatctggggt ccctgatcgc 600
ttcacaggca' gtggatctgg aacagatttc actctcacca tcagcagtgt gcaggctgaa 6S0
ga-cctggcag tttattačtg tcagaatgat tatagttatc ctctcacgtt cggtgctggg 720
accaagcttg agatcaaacg tacgactagt tccgggcatc atcaccatca tcat 774
<210> 71
<211> 258
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 71
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Len Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp 20 25
Phe Ser 30 • · φ · · · · ·· ·· • · · · φ · · · • φ φφφ • · · φ · · φ φ
Gly Glu 50 Ile Asn Pro Asp Ser Ser 55 Thr Ile Asn Tyr 60 Thr Pro Ser Leu
Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asr. Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
* Ala Arg Leu Gly Gin Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
·- 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Val Thr Ala Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin
145 150 155 160
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn C-ln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin
165 170 175
- Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
180 185 190
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin- Ala C-lu Asp Leu A.la Val
210 215 220
- Tyr Tyr Cys Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr -Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
» 225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Ser Ser Gly His His His His
245 250 255
His His <210> 72 <21Ι> 1497
116 • ···« • » · ·
<213> Umělá L sekvence
<220> <223> Popis ; umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 72
gatattgtga tgacgcaggc tgcatcctcc aacccactca cccttgcaac atcaccttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagcctccta catagoaacg ccatcaccta tttgtattgg 12 0
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcccgattt atcagacgtc caaccttgcc ISO
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagc gggčcaggaa ctgatttcac accgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggcgtt tactacogcg cccaaaaccc agaacttcct 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atoaaaggtg gcggtggttc tggcggcggc 360
ggctccggtg gtggtggttc tcaggtgcaa ctgcagcagt cagggcctga gctgaagaag 420
cctggagaga cagtcaagat ctcctgcaag gcotccgggt ataccttcac aaaccatgga 480
atgaactggg tgaagcaggc tccaggaaag ggtttcaagt ggatgggctg gataaacacc 540
tacactggag acccaacata tggtgatgac ttcaagggac ggtttgcctt ctctttggaa 600
acctctgcca gcactgccta tttgcagatc aacaacctca aaaatgagga cacggctaca 660
tatttctgtg caagattcac ctcccctgac tactggggcc aagggaccac ggtcacogtc 720
tcctccggag gtggtggatc cgaggtgcag ctgctcgagt ctggaggcgg cctggtgcag 780
cctggaggat ccctgaaact ctcctgtgca gcctccggat tcgattttag tagatactgg 840
atgagttggg tccggcaggc tccagggaaa gggctagaat ggattggaga aattaatcca 900
gatagcagta cgataaacta tacgccatct ctaaacgata aattcatcat ctccagagac 960
aacgccaaaa atacgctgta cctgcaaatg agcaaagtga gatctgagga cacagccctt 1020
tattactgtg caagaggggc ggtagtagct cccttcgact actggggcca agggaccacg 1080
-gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct ggcggcggcg cctccggtgg tggtggttct 1140
gagctcgtca' tgacccagtc tccatcctcc ttatccgcct ctctgggaga aagagtcagt 1200
c'tc'acttgtc gggcaagtca ggacattggt agtagcttaa actggcttca gcaggaacca 1260
gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc acacccactt tagattctgg tgtcoccaaa 1320
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 1380
gaacattttg tagactatta ctgtctacaa tatgctagtt ctccgtacac gttcggagag 1440
gggaccaagc ttgagatcaa acgtacgact acttccgggc atcatcacca tcatcat 1497
<210> 73
<211> 499
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sexvence
<400> 73
Asp * X β 7 <2. _ Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
ř-
X 3 X C X O
• 44 4 «· ·«
- 117 • 4 4 * 4
4 4 • 4 4
4 44 4 4 ·
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95
Leu Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin 115 120 125
Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 130 135 140
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 145 150 155 160
Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met Gly
........ 165 170 175
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Gly Asp Asp Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205
Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp-Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 210 215 220
Arg Phe Thr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230' 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser 260 265 270 • ·♦ ·
- 118 • ·· ·· ·· • · ♦ · · * · • · · · · • · · ♦ · · ♦ · · · · ······· «· · tt · ·
Gly Lys Gly 290
Ile Asn Tyr 305
Asn Ala Lys
Asp Thr Ala
Asp Tyr Trp 355
Gly Ser Gly 370
Thr Gin Ser 385
Leu Thr Cys
Gin C-ln Glu
Ser Leu Asp 435
Ser Asp Tyr 450
Asp Tyr Tyr 465
Gly Thr Lys
Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile 295
Thr Pro Ser Leu Lys Asp Lys 310
Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met 325 330
Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 340 345
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 360
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 375
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 390
Arg Ala Ser Gin Asp Ile Gly 405 410
Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg 420 425
Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe 440
Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu 455
Cys Leu Gin Tyr Ala Ser-Ser 470
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr 485 490
Asn Pro Asp Ser Ser Thr 300
Phe Ile Ile Ser Arg Asp 315 320
Ser Lys Val Arg Ser Glu 335
Ala Val Val Ala Pro Phe 350
Val Ser Ser Gly Gly Gly 365
Gly Ser Glu Leu Val Met 380
Leu Gly Glu Arg Val Ser 395 400
Ser Ser Leu Asn Trp Leu 415
Leu Ile Tyr Ala Thr Ser 430
Ser Gly Ser Arg Ser Gly 445
Glu Ser Glu Asp Phe Val 460
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 475 480
Ser Ser Gly His His His 495
His His His <2I0> 74 <211> 1509 < 212 > LNA • 9 · · • 9 99 9* • · · · · 9 9
- 119 - • · · · • 9
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 74
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccactca ctcttggaac atcaccttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcnccta catagraatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatcngcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgactt atcagatgtc caaccttgcc 130
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggccaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtggangtt tatcaccgcg ctcaaaatct agaacttcct 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaggtg gtggtggttc tggcggcggc 360
ggctccggtg gtggtggttc tcaggtgcaa ctgcagcagt cagggcctga gctgaagaag 420
cctggagaga cagtcaagat ctcctgcaag gcttctgcgt ataccttcac aaactatgga 430
atgaactggg tgaagcaggc tccaggaaag ggtttcaagc ggatgggctg gataaacacc 540
tacactggag agccaacata tggtgatgac ttcaagggac ggtttgcctt ctctttggaa 600
acctctgcca gcactgccta tttgcagatc aacaacccca aaaatgagga cacggctaca 660
tatttctgtg caagattcac ctcccctgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgcc 720
tcccccggag gtggtggatc cgaggtgcag ccgctcgagc ctggaggtgg cctggtgcag 780
cctggaggat ccctgaaact ctcctgtgca gcctcaggat tcgattttag tagatactgg 340
atgagttggg tccggcaggc tccagggaaa gggccagaat ggattggaga aattaatcca 900
gatagcagta cgataaacta tacgccatct ctaaaggata aattcatcat ctccagagac 960
aac50 caaaa atacgccgta cctgcaaaisg agcaaagtga gatctgagga cacagccctc 1020
tattactgtg caagacgcag ctacggtagt agctacgact ggtacttcga tgtctggggc 1080
--caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt 1140
ggtggtggtt ctgagctcca gatgacccag tctccagcct ccctatctgc atctgtggga 1200
gááactgtca ccatcacatg tcgagcaagt gagaatacct acagttattt agcatggtat 12 60
cagcagaaac agggaaaatc tcctcagctc ctggtctaca atgcaaaaac cttagcagaa 1320
ggcgtgccat caaggttcag tagcagtgga tcaggoacac agttttctct gaagatcaac 1380
agcctgcagc ctgaagattt tgggagttat tactgccaac atcattatgg tactccgctc 1440
acgttcggtg ctgggaccaa gcttgagatc aaacgcacga ctagttccgg gcatcatcac 1500
catcatcat 1509
119
<210> 75 —
<211> 503
<212> PRT ·
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Penis umělé sekvence: umělá sekvence
<4GG> 75
Asp ile Val Me“ Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr len Gly 1 5 10 15 len · 4* · 4 ·· »4 44
4 · · 4 · 4 9 9 9
9 9 9 9 9 9
4 4 · · 4 4 4
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu C-ln Lys Pro Gly C-ln Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ssr Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly T%-»- Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Vo.1 Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin
115 120 125
Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr
130 135 140
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
-145 150 155 160
Met- Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met Gly
165 170 175
Tro Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Gly Asp Asp Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu
195 200 205
Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
210 215 > 220
Arg Phe Thr Ser Pro Asp Tyr Trp c-ly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly C-ly Gly Ser Glu Val C-ln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
245 ώ 0' J 2ΞΞ
Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser «:SU Lvs Leu Ser Cys Ala Ala Ser
260 255 270
Gly Dra Asp 12% n Car Arg Tyr Trp ’Λθ r Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro
··»·
275 230 285
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr
290 295 300
Ile Asn mhr Pro Ser Leu Lys Asp Lvs 0½ s Ile Ile Ser Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Ms — Ser Lys Val Arg Ser Glu
> 325 330 335
Asp Thr Aia Leu Tyr Tyr Cys Ala A.rg Arg Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr
- 340 345 350
r Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly ΓΠ'··» >» — ..X Thr Val Thr Val Ser
'55 3 60 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Sen Ala Ser Val Gly
385 390 395 400
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
405 410 415
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val
420 425 430
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys τ! q Asn Ser Leu Gin Pro
450 45 5 460
- Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Gly Thr Pro Leu
465 470 • 475 480
Thn Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Ser Ser
48 5 490 495
Gly His His His His His His
500 <2L3> 76 < 2 2. L > L 5 0 Q
122 *44 * * «
Φ 4 * 4
494 ·»·· *4 » 4 9
4 «
Φ 9 · « 4 « • 4 4*44 <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 76
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag CtCCtydui-t atcagatgtc caaccttgcc ISO
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttcct 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaagatg gtggtggttc tggcggcggc 360
ggctccggtg gtggtggttc tcaggtgcaa ctgcagcagt cagcgcctga gctgaagaag 420
cctggagaga cagtcaagat ctcctgcaag gcttctgggt ataccttcac aaactatgga 480
atgaactggg tgaagcaggc tccaggaaag ggtttcaagt ggatgggctg gataaacacc 540
tacactggag agccaacata tggtgatgac ttcaagggac ggtttgcctt ctctttggaa 600
acctctgcca gcactgccta tttgcagatc aacaacctca aaaatgagga cacggctaca 660
tatttctgtg caagattcac ctcccctgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 720
tcctccggag gtggtggatc cgaggtgcag ctgctcgagg agtctggagg aggcttggtg 780
caacctggag gatccatgaa actctcctgt gttgcctctg gattcacttt cagtaactac 840
tggatgaact gggtccgcca gtctccagag aaggggcttg agtgggttgc tgaaattaga 900
ttgaaatcta ataattatgc aacacattat gcggagtctg tgaaagggag gttcaccatc 960
tcaagagatg attccaaaag tagtgtctac ctgcaaatga acaacttaag agctgaagac 1020
actggcattt attactgtac caggctcccc tacggctttg ctatggacta ctggggccaa 1080
gggaccacgg' tcaccgtctc ctcaggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt 1140
ggtggttctg agctcatgct cacccagtct ccaaccacca tggctgcatc tcccggggag 1200
aagatcacta tcacctgcag tgccagctca agtataagtt ccaattactt gcattggtat 1260
cagcagaagc caggattctc ccctaaactc ttgatttata ggacatccaa tctggcttct 1320
ggagtcccag ctcgcttcag tggcagtggg tctgggacct cttactctct cacaattggc 1380
accatggagg ctgaagatgt tgccacttac tactgccagc agggtagtag tataccgctc 1440
acgttcggtg ctgggaccaa gcttgagatc aaacgtacga ctagttccgg gcatcatcac 1500
catcatcat 1509
<210> 77
<211> 503
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá
<400> 77
Asp Ile Val Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly ··
- 123 -
Thr Ser Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Lvs Ser Leu Leu 30 His Ser
Asn Giy Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Len C-ln Lys Pro Giy Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Sex* Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 7 5 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn
- 85 90 95
Leu Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly Giy Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin
115 120 125
Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr
130 135 140
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
145 150 155 160
Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met Gly
165 170 175
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Giy Glu Pro Thr Tyr Gly A.sp Asp Phe Lys
ISO 185 190
Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu
195 200 - 2 05
Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Th.r Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Arg Phe Thr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Giv Giv Giv Gly Ser Glu Val Gin Leu Leu Glu Glu Ser Gly
G_y Gi'/ usu /a_ G_n
Ly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala - - ~ 7 η • · · ·
J · 0
0 0 0 « 0
0000000 0·
Ser Gly Phe Thr Phe 275
Pro Glu Lys Gly Leu 290
Asn Tyr Ala Thr His 305
Ser A.rg Asp Asp Ser 325
A.rg Ala Glu Asp Thr 340
Phe Ala Met Asp Tyr 355
Gly Gly Gly Gly Ser 370
Leu Val Leu Thr Gin 385
-Lys Tle Thr Ile Thr 405
Leu His Trp Tyr Gin 420
Tyr Arg Thr Ser Asn 435
Ser Gly Ser Gly Thr 450
Glu Asp Val Ala Thr 465
Thr Phe Gly Ala Gly 485
Gly His His His His 500
- 124 Ser Asn Tyr Trp Me~ Asn 280
Glu Trp Val Ala Glu Ile 295
Tyr Ala Glu Ser Val Lys 310 315
Lys Ser Ser Val Tyr Leu *2 n J d j
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr 345
Trp Gly Gin Gly Thr Thr 360
Gly Gly Gly Gly Ser Gly 375
Ser Pro Thr Thr Met Ala 390 395
Cys Ser Ala Ser Ser Ser 410
Gin Lys Pro Giy Phe Ser 425
Leu Ala Ser Giy Val Pro 440
Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 455
Tyr Tyr ,Cys Gin Gin Gly 470 475
Thr Lys Leu Glu Ile Lys 49 0
His His
0 ··· ·
Trp Val Arg Gin Ser 285
Arg Leu Lys Ser Asn 300
Gly Arg Phe Thr Ile 320
Gin Met Asn Asn Leu 335
Arg Leu Pro Tyr Gly 350
Val Thr Val Ser Ser 365
Gly Gly Gly Ser Glu 380
Ala Ser Pro Gly Glu 400
Ile Ser Ser Asn Tyr 415
Pro Lys Leu Leu Ile 430
Ala Arg Phe Ser Gly 445
Gly Thr Met Glu Ala 460
Ser Ser Ile Pro Leu 480
Aircj Tiiir Ss—
5 <210> 78
- 125 - • 0 i 0
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 73
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccactca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac acc.gagaacc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtctt tattactgtg ctcaaaatct agaacttcct 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaggtg gtggtggttc tggcggcggc 3 60
ggctccggtg gtggtggttc tcaggtgcaa ctgcagcagt cagggcctga gctgaagaag 420
cctggagaga cagtcaagat ctcctgcaag gcttctgggt ataccttcac aaactatgga 480
atgaactggg tgaagcaggc tccaggaaag ggtttcaagt ggatgggctg gataaacacc 540
tacactggag agccaacata tggtgatgac ttcaagggac ggtttgcctt ctctttggaa 600
acctctgcca gcactgccta tttgcagatc aacaacctca aaaatgagga cacggctaca 660
tatttctgtg caagattcac ctcccctgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 720
tcctccggag gtggtggatc cgaggtgcag ctgctcgagt ctggaggtgg cctggtgcag 780
cctggaggat ccctgaaact ctcctgtgca gcctcaggat tcgattttag tagatactgg 840
atgacttggg tccggcaggc tccagggaaa gggctagaat ggattggaga aattaatcca 90 0
gatagcagta cgataaacta tacgccatct ctaaaggata gattcatcat ctccagagac 960
.aacgccaaaa atacgctgta cctgcaaatg agcaaagtga ggtctgagga cacagccctt 1020
tattactgtg 'caagattggg gcaatggggg tactttgact actggggcca agggaccacg 1080
gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct 1140
gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gagggtcact 1200
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aS.ChUZOjG.a. atcaaaagaa ccacttgacc 1260
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct a S. 3. C £ CC C Cf cl tctactgggc atccactacg 1320
gaatctgggg tccctgatcg cttcacacgc agcggatcug gaacagattt cactctcacc 1380
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gcttactact gtcagaatga ttatagttat 1440
cctctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagaccaaac gtacgactag ttccgggcat 1500
catcaccatc atcat 1515
<210> 79 <2ll> 505 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Pode umělé sekvence: umělá sekvence
Gin Ala
Pro Val Thr Leu Glv
- 126 • · .· «to toto • * « to · · * toto·· · • * · · · · • · · to · to······ · · ····
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp 35 40
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met 50 55 .Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser 65 70
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 85
Leu Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly 100
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120
Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro 130 135
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 1-4-5-· 150
Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro 165
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu 180
Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu 195 200
Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu 210 215 .-.rg Phe Thr Ser Pro Asp Tyr Trp 225 230
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 245
Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
Ser Ser Lys Ser Leu Leu Kis Ser 25 30
Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 60
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 75 80
Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin 125
Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 155 160
Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met Gly 170 175
Pro Thr Tyr Gly Asp Asp Phe Lys 135 190
Thr -Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu 205
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 220
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 235 240
Val Glr. Leu Leu Glu Ser Gly Gly
Lsí! Lvs L.3U Se r Cvs Λ Z. 5. A.Z.5. Sez?
60
270
- 127
4) 4 · · • · · » · • · · *
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr
290 295 300
Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Lys Val Arg Ser Glu
325 330 335
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Gin Trp Gly Tyr Phe
340 345 350
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Val Ser Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met
370 375 380
Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val ψμ, v- Ala Gly Glu Arg Val Thr
3 8 5 390 395 400
Met Ser Cyš Lys Sex* Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys
405 410 415
Asn Tyr Leu Tb^ Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu
420 425 430
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg P ho
435 440 445
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe • u-ηχ-, v. Leu 'pbr Ile Ser Ser Val
450 455 460
Gin Ala Glu Asn Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asr, Asp Tyr Ser Tyr
465 470 475 480
Pro Leu Thr Phe Glv Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thir rr.’, -<·
435 490 495
S Θ27 Ser Glv Kis nZ. 3 Kis Kis T-’- ~ ní. 3
<210> 30
128 • toto· <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 80 atcaagcttg tggatatgtt acaaaaataa ct 32 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 81 atcaagcttg aaccaagaag ttcaaattcc 30 <210> 82 <211> 34 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 82 cgcggtggcg gccgcttaca cagtcctotg catg 34 <21Q> 83 <211> 37 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<222> Popis umělé sekvence: umělá sekvence • · · ·
- 129 aggtgtacac tccgatatcc agctgaccca gcctcca ·· ·· • ♦ · • · «
9 9
0 0
0 09·«
<210> 84
<211> 51
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 84
ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctcg
<210> 85
<211> 53
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 85 '
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtsmarc
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence
<400> 86
aacccggagg agacggtgac cgtggtccct tggccccag
<210> 87
<211> 39
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
< 2 2 3> Pocis umělé sekvence: umělá sekvence
- 130 <400> 87 aggtgtacac tccttattca accaagaagt tcaaattcc 39 <210> 88 <211> 31 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 88 tcatccggac acagtccttt gcatgcagat g 31 <210> 89 <211> 504 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: umělá sekvence <400> 89 gaattcacca tgggatggag ctgtatcatc ctctcctcgg tagcaacagc tacaggtgta 60 cactccttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120 cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180 tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240 aaagaggacc aggatctact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300 attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360 acaataattg aaatgcagaa gggagaotgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420 atagaaaacc gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt gtccgggcat 480 catcaccatc accattgagt cgac 504
<210> 90
<211> 162
<212> PRT
<213> Uměl
<222> Pocis umělé sekvence: umělá sekvence • 4 ···
130a <400> 90
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 Ile Ile Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly
Vel His Ser Leu Phe Asn Gin Glu Val Gin τ 2 θ Pro Leu Thr Glu Ser
20 25 30
Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys
35 40 45
Tyr Gin Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp TV27 Glu Ser Gin Ala Ser
50 55 60
Cys Met Ser Gin Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp
65 70 75 80
Gin Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val
85 90 9 5
His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gin Trp Glu Asp Gly Ser 17 e Leu
100 105 110
-Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gin Lys Gly Asp Cys Ala
115 - 120 125
Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro
130 135 140
Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gin Arg Thr Val Ser Gly His His His His
'145 150 155 160
131 ?(/ krt·· «· ·· • * » · « • · · « 9 9 9 9 9 »99
9»99 99 999»

Claims (2)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Multifunkční polypeptid obsahující (a) první doménu, která obsahuje vazebné místo specificky rozpoznávající extracelulámí epitop receptorového komplexu NKG2D, a (b) druhou doménu, která má receptorovou nebo ligandovou funkci.
    2. Multifunkční polypeptid podle nároku 1, kde vazebné místo je vazebné místo imunoglobulinového řetězce.
    3. Multifunkční polypeptid podle nároku 1, kde vazebné místo je přírodní NKG2D-ligand receptorového komplexu.
    4. Multifunkční polypeptid podle nároku 3, kde přírodní NKG2Dligand je vybrán ze skupiny, kterou tvoří MIC-A, MIC-B, ULBP-1 a ULB P-2.
    5. Multifunkční polypeptid podle nároků 1 až 4, kde vazebné místo specificky rozpoznává extracelulámí epitop NKG2D nebo DAP10.
    Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 kde receptorová nebo ligandová funkce je antigenní vazebné místo protilátky, nebo jejího fragmentu nebo derivátu, proti (I) antigenům asociovaným s nádory, (II) antigenům infekčních agens, nebo (III) povrchovým markérům buněčných ,, ~ η _ ....
    ;CU
    Σ K .x. cl G G X r. zz <c G G j_ čx <
    cil i c xcj
    • ··· · to ·· ·· toto ·· · ·«·· to· to ·*·· • · · · · * * to·· · ·«· «to·· ·· ····
    132 antigeny), přírodní ligandy nebo receptory nebo jejich fragmenty nebo modifikace, které interagují antigeny asociovanými s nádory nebo s povrchovými markéry, výhodně (I) hereguliny, vázající se na antigeny asociované s nádory erbB-2, -3 a -4, (II) CD4 interagující s gpl20 buněk infikovaných HIV, nebo (III) hormon stimulující melanocyty (MSH), který se váže k MSH receptoru na melanocytech a z nich vzniklých nádorech (maligních melanomech) nebo chemokiny vázající se na odpovídající chemokinové receptory, nebo MHC molekuly nebo jejich fragmenty komplexované s peptidy, které se vážou na receptory T lymfocytů s předefinovanou specificitou a tedy rozpoznávají určité subpopulace T lymfocytů, nebo antigenní vazebná místa receptorů T lymfocytů, která specificky interagují s předefinovanými MHC-peptidovvými komplexy, nebo NKp46 interagující s hemaglutininem (HA) virus chřipky.
    7. Multifunkční polypeptid podle nároku 6, kde antigen asociovaný s nádorem je vybrán ze skupiny, kterou tvoří Lewis Y, Muc-1, erbB-2, -3 a -4, Ep-CAM, EGF-receptor (EGFR typu I nebo EGFR typu II), EGFR deleční neoepitop, CA19-9, Muc-1, LeY, TF-, Tn- a sTn-antigeny, TAG-72, PSMA, STEAP, Cora antigen, CD7, CD19 a CD20, CD22, CD25, Ig-α a Ig-β, A33 a G250, CD30, MCSP a gplOO, CD44-v6, MT-MMP, (MIS) receptor typu II, karboanhydráza 9, F19-antigen, Ly6, desmoglein 4, PSCA, Wue-1, GD2 a GD3, a také TM4SF-antigeny (CD63, L6, C029, SAS) nebo alfa a gamma podjednotky acetylcholinového receptoru (AchR) fetálního typu.
    8. Multifunkční polypeptid podle nároku 6, kde povrchový markér infikované buňky je vybrán ze skupiny, kterou tvoří antigeny obálky virů, např. humánních rerrovirů (HTLV I a II, HIV1 a • 0
    0 0 0 0 0 • · · ·
    0 0 0 « 0
    0 0 0 0
    0000 00 0000
    133
  2. 2) nebo humánních herpetických virů (HSV1 a 2, CMV, EBV) , hemaglutinin viru chřipky, např. viru chřipky A, B nebo C, glykoprotein El a E2 viru rubelly nebo RGP viru rabies.
    9. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, který je bispecifickou protilátkou.
    10. Multifunkční polypeptid podle nároku 9, který je vybrán ze skupiny, kterou tvoří syntetická, chimérická a humanizovaná protilátka.
    11. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, který je jednořetězcový.
    12. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde dvě domény jsou spojeny pomocí polypeptidového linkeru.
    13. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až
    12, kde první a/nebo druhá doména napodobují nebo odpovídají VH a VL úsek přírodní protilátky.
    14. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až
    13, kde alespoň jedna doména je jednořetězcový fragment variabilního úseku protilátky.
    15. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až
    14, kde domény jsou uspořádány v pořadí VLNKG2D-VHNKG2D-VHTA9 99 9
    9 9
    9 9
    9999
    134
    VL-TA nebo Vl-TA-VhTA-VhNKG2D-Vi,NKG2D, přičemž TA představuje cílový antigen.
    16. Multifunkční polypeptid podle nároku 15, kde cílový antigen je vybrán ze skupiny, kterou tvoří Lewis Y, Muc-1, erbB-2, -3 a -4, Ep-CAM, EGF-receptor (např. EGFR typu I nebo EGFR typu II), EGFR deleční neoepitop, CA19-9, Muc-1, LeY, TF, Tn- a sTn-antigen, TAG-72, PSMA, STEAP, antigen Cora, CD7, CD19 a CD20, CD22, CD25, Ig-α a Ig-β, A33 a G250, CD30, MCSP a gplOO, CD44-v6, MT-MMP, (MIS) receptor typu II, karboanhydráza 9, Fl9-antigen, Ly6, desmoglein 4, PSCA, Wue1, GD2 a GD3, a také TM4SF-antigeny (CD63, L6, CO-29, SAS) nebo alfa a gamma podjednotky fetálního typu acetylcholinového receptoru (AChR).
    17. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 12 až
    16, kde polypeptidový linker obsahuje větší počet glycinových, serinových a/nebo slaninových zbytků.
    18. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 12 až
    17, kde polypeptidový linker obsahuje větší počet po sobě jdoucích kopií aminokyselinových sekvencí.
    19. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 12 až 18, kde polypeptidový linker obsahuje 1 až 5, 5 až 10 nebo 10 až 15 aminokyselinových zbytků.
    20. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 4 až 19, kde polypeptidový linker obsahuje aminokyselinovou sekvenci Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.
    • ft • 1 • ft· ft
    135
    21. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 obsahující alespoň jednu další doménu.
    22. Multifunkční polypeptid podle nároku 21, kde další doména je navázána pomocí kovalentní nebo nekovalentní vazby.
    23. Multifunkční polypeptid podle nároku 21 nebo 22, kde alespoň jedna další doména obsahuje efektorovou molekulu mající konformaci vhodnou pro biologickou aktivitu, schopnou maskování iontu nebo selektivní vazby k pevnému nosiči nebo k předem vybrané determinantě.
    24. Multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23, kde další doména poskytuje kostimulační a/nebo koaktivační funkci.
    25. Multifunkční polypeptid podle nároku 24, kde kostimulační funkce je zprostředkovaná CD28-ligandem nebo CD137-ligandem.
    26. Multifunkční polypeptid podle nároku 25, kde CD28-ligand nebo CD137-ligand je B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), aptamer nebo protilátka nebo její funkční fragment nebo funkční derivát.
    27. Polynukleotid, který po expresi kóduje multifunkční polypeptid a/nebo funkční části multifunkčního polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26.
    • ·· · ·· ··»·
    136
    28. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 27.
    29. Buňka transfekovaná polynukleotidem podle nároku 27 nebo vektorem podle nároku 28.
    30. Způsob přípravy multifunkčního polypeptidů a/nebo částí multifunkčního polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26 vyznačující se tím, že zahrnuje kroky kultivace buněk podle nároku 29 a izolace multifunkčního polypeptidů nebo jeho funkčních částí z buněčné kultury.
    31. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, polynukleotid podle nároku 27 nebo vektor podle nároku 28.
    32. Přípravek podle nároku 31 vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje molekulu poskytující kostimulační a/nebo koaktivační funkci.
    33. Přípravek podle nároku 31 vyznačující se tím, že kostimulační funkce je zprostředkována CD28ligandem nebo CD137-Iigandem.
    34. Přípravek podle nároku 31 vyznačující se tím, že CD28-ligand nebo CD137-ligand je B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), aptamer nebo protilátka nebo její funkční fragment nebo funkční derivát.
    • · » · · tt · • · tt · · · • · tttttt • tttt tttttttt tt* tttttttt
    137
    35. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 31 až 34 vyznačující se tím, že je to farmaceutický přípravek dále volitelně obsahující farmaceuticky přijatelný nosič.
    36. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 31 až 35 vyznačující se tím, že je to diagnostický přípravek volitelně dále obsahující vhodný prostředek pro detekci.
    37. Použití multifunkčního polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, polynukleotidu podle nároku 27 nebo vektoru podle nároku 28 pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení onemocnění jako jsou karcinomy, infekční a/nebo autoimunitní onemocnění, rakovina (tj. maligní solidní nádory a hematopoetické formy karcinomu jako jsou leukemie a lymfomy), benigní nádory jako je např. benigní hyperplázie prostaty (BPH), autonomní adenom štítné žlázy nebo jiných endokrinních žláz, adenom tračníku, počáteční stádia maligních onemocnění, infekční onemocnění způsobená viry, bakteriemi, houbami, protozoy nebo helminty, autoimunitní onemocnění, kdy je požadována eliminace subpopulace imunitních buněk, která je příčinou nemoci, prevence rejekce transplantátu nebo různé alergie.
    38. Použití podle nároku 37, kde infekční onemocnění je virová, bakteriální nebo houbová infekce, rakovina je rakovina hlavy a krku, rakovina žaludku, rakovina jícnu, kolorektální karcinom, karcinom tračníku, rakovina jater a žlučovodu, rakovina pankreatu, rakovina plic, malobuněčný plicní karcinom, rakovina hrtanu, rakovina prsu, rakovina < · • · >
    • ·*·· » · · » * · ·» ····
    138 rakovina děložního genitálií, rakovina prsní žlázy, maligní melanom, mnohačetný myelom, sarkomy, rhabdomyosarkomy, lymfomy, folikulární nehodgkinský lymfom, leukemie, leukemie T- a B-lymfocytů, Hodgkinův lymfom, lymfom B-lymfocytů, rakovina vaječníků, rakovina dělohy, čípku, rakovina prostaty, rakovina ledvin, rakovina varlete, rakovina štítné žlázy, rakovina močového měchýře, plazmacytom nebo karcinom mozku, a autoimunitní onemocnění je ankylozující spondylitida, akutní přední uveitida, Goodpastureův syndrom, roztroušená skleróza mozkomíšní, Gravesova nemoc, Myasthenia gravis, systémový lupus erythematosis, diabetes mellitus závislý na inzulínu,
    Pemphigus vulgaris, Hashimotova autoimunitní hepatitida.
    revmatoidní artritida, thyroiditida nebo
    39. Použití polynukleotidu podle nároku 27 nebo vektoru podle nárok 28 pro výrobu přípravku pro genovou terapii.
    40. Způsob léčení karcinomu, infekčního nebo autoimunitního onemocnění vyznačující se tím, že se savci trpícímu takovým onemocněním podává polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, polynukleotid podle nároku 27 nebo vektor podle nároku 28 nebo přípravek podle nároku 35.
    41. Způsob zpoždění nemocí vyznačující se tím, že se savci trpícímu takovým onemocněním podává polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, polynukleotid podle nároku 27 nebo vektor podle nároku 28 nebo přípravek podle nároku 35.
    • 4 · 4
    44 44 44 • 4 4»
    4 4 « 4 4 4 4
    44 4 4 444*4
    4 4 4 4 4 *4 «44 4 444 4444 44 44«4
    139
    42. Způsob podle nároku 40 nebo 41 vyznačuj ící se tím, že savec je člověk.
    43. Souprava vyznačující se tím, že obsahuje multifunkční polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, polynukleotid podle nároku 27, vektor podle nároku 28, buňku podle nárok 29 nebo přípravek podle kteréhokoliv z nároků 31 až 36.
CZ20023203A 2000-03-24 2001-03-26 Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo k epitopu receptorového komplexu NKG2D CZ20023203A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00106467 2000-03-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20023203A3 true CZ20023203A3 (cs) 2003-08-13

Family

ID=8168233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20023203A CZ20023203A3 (cs) 2000-03-24 2001-03-26 Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo k epitopu receptorového komplexu NKG2D

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20040038339A1 (cs)
EP (1) EP1266014A2 (cs)
JP (1) JP2004500108A (cs)
CN (1) CN1423700A (cs)
AU (2) AU2001260153B2 (cs)
CA (1) CA2406993A1 (cs)
CZ (1) CZ20023203A3 (cs)
HU (1) HUP0300919A2 (cs)
IL (1) IL151873A0 (cs)
NO (1) NO20024489L (cs)
PL (1) PL358215A1 (cs)
WO (1) WO2001071005A2 (cs)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
WO2001066126A1 (en) * 2000-03-07 2001-09-13 Smithkline Beecham Corporation Sialoadhesin factor-2 antibodies
WO2002068615A2 (en) * 2001-02-28 2002-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center, Inc. Activation of lymphocyte populations expressing nkg2d using anti-nkg2d antibodies and ligand derivatives
US6821522B2 (en) * 2001-05-31 2004-11-23 The Regents Of The University Of California Tumor Therapy
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7563450B2 (en) 2001-10-04 2009-07-21 Immunex Corporation UL16 binding protein 4
WO2003045415A2 (en) * 2001-11-26 2003-06-05 University Health Network Self-assembling p53 peptides as gene delivery vehicles
WO2004024097A2 (en) * 2002-09-16 2004-03-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US9809654B2 (en) 2002-09-27 2017-11-07 Vaccinex, Inc. Targeted CD1d molecules
EP1413316A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-28 Bruno Robert Bifunctional conjugates or fusion proteins
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US20050025763A1 (en) * 2003-05-08 2005-02-03 Protein Design Laboratories, Inc. Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
EP1629013B1 (en) * 2003-05-31 2018-01-24 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody specific for epcam
ATE455127T1 (de) * 2003-05-31 2010-01-15 Micromet Ag Humane anti-humane cd3-bindungsmoleküle
CN104645327A (zh) 2003-07-24 2015-05-27 依奈特制药公司 使用nk细胞增效化合物提高治疗性抗体功效的方法和组合物
SI2380911T1 (en) 2003-11-05 2018-07-31 Roche Glycart Ag ANTIGEN-RELATED PATIENTS WITH INCREASED ATTENTION ON THE RECEPTOR FC AND EFFECTORAL FUNCTION
US7998481B2 (en) 2004-04-05 2011-08-16 The Regents Of The University Of California Modulation of NKG2D for treating or preventing solid organ allograft rejection
DE102004042894A1 (de) * 2004-08-30 2006-03-02 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Verwendung von Blockern der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion bei Autoimmunerkrankungen
WO2006036445A2 (en) * 2004-09-24 2006-04-06 Trustees Of Dartmouth College Chimeric nk receptor and methods for treating cancer
DK1831258T4 (en) 2004-12-28 2023-08-28 Innate Pharma Sa Monoklonale antistoffer mod NKG2A
US11254748B2 (en) 2005-04-15 2022-02-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9296816B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) * 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP2009500346A (ja) * 2005-06-29 2009-01-08 ユニバーシティー・オブ・マイアミ 癌処置用の抗体−免疫細胞リガンド融合タンパク質
US20080299137A1 (en) * 2005-10-28 2008-12-04 Novo Nordisk A/S Fusion Proteins That Bind Effector Lymphocytes And Target Cells
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
BRPI0712953B8 (pt) 2006-06-30 2021-05-25 Novo Nordisk As anticorpos anti-nkg2a, seu uso, e composição farmacêutica
CA2672120A1 (en) 2006-12-07 2008-06-12 Novartis Ag Antagonistic antibodies against ephb3
CA2678618C (en) 2007-02-21 2019-03-12 Vaccinex, Inc. Modulation of nkt cell activity with antigen-loaded cd1d molecules
US9434642B2 (en) 2007-05-21 2016-09-06 Corning Incorporated Mechanically flexible and durable substrates
US9611313B2 (en) 2007-06-26 2017-04-04 University Of Miami Antibody-endostatin fusion protein and its variants
EP2173377B1 (en) * 2007-06-26 2017-11-29 University of Miami Antibody-endostatin fusion protein and its variants
TWI439286B (zh) 2007-07-16 2014-06-01 Genentech Inc 抗－ｃｄ７９ｂ抗體及免疫共軛物及使用方法
AU2016273960B2 (en) * 2007-07-16 2019-01-24 Genentech, Inc. Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
AU2012204069B2 (en) * 2007-07-16 2013-09-26 Genentech, Inc. Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
ES2528922T3 (es) * 2007-07-16 2015-02-13 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD79b humanizados e inmunoconjugados y métodos de uso
US8940298B2 (en) * 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
US20100291113A1 (en) * 2007-10-03 2010-11-18 Cornell University Treatment of Proliferative Disorders Using Antibodies to PSMA
DK2222706T4 (en) 2007-12-14 2016-11-21 Novo Nordisk As Antibodies that bind to NKG2D and its use
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
JP5774312B2 (ja) 2008-01-24 2015-09-09 ノボ・ノルデイスク・エー／エス ヒト化抗ヒトｎｋｇ２ａモノクローナル抗体
MY157403A (en) 2008-01-31 2016-06-15 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
CN102046655B (zh) 2008-04-02 2016-09-14 宏观基因有限公司 Bcr-复合体-特异性抗体和其使用方法
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
TW201008580A (en) * 2008-06-03 2010-03-01 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
BRPI0913366A8 (pt) * 2008-06-03 2017-07-11 Abbott Lab Imunoglobulinas de domínio variável duplo e seus usos
ES2675730T3 (es) * 2008-06-04 2018-07-12 Macrogenics, Inc. Anticuerpos con unión alterada a FcRn y métodos de uso de los mismos
WO2010002862A2 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins
US8822645B2 (en) * 2008-07-08 2014-09-02 Abbvie Inc. Prostaglandin E2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
KR20110104032A (ko) * 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
EP2894226B1 (en) * 2009-01-08 2021-04-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for improving efficiency of nucleic acids amplification reactions
JP2012514476A (ja) 2009-01-08 2012-06-28 アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン オブ イェシバ ユニバーシティ，ア ディビジョン オブ イェシバ ユニバーシティ 細胞壁結合セラミド様糖脂質による細菌ワクチンおよびその使用
ES2712732T3 (es) * 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
US8420092B2 (en) 2009-03-19 2013-04-16 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Method of treating diabetes by administering an anti-NKp46 antibody
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
CA2757931C (en) 2009-04-07 2019-03-26 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
CA2757531A1 (en) * 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011028811A2 (en) * 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG179196A1 (en) 2009-09-16 2012-04-27 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
DK2486141T3 (en) 2009-10-07 2018-04-23 Macrogenics Inc FC-REGION-CONTAINING POLYPEPTIDES THAT PROVIDE IMPROVED EFFECTOR FUNCTION BASED ON CHANGES OF THE SCOPE OF FUCOSYLATION AND PROCEDURES FOR THEIR USE
CN102666875A (zh) 2009-10-15 2012-09-12 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CN102753194B (zh) 2009-12-02 2015-07-08 伊麦吉纳博公司 靶向人***特异性膜抗原的j591微抗体和双抗体
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
JP5998060B2 (ja) 2010-03-04 2016-09-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７−ｈ３と反応性のある抗体、その免疫学的に活性なフラグメントおよびその使用
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
MX339622B (es) 2010-08-02 2016-06-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos.
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
US9046513B2 (en) 2010-08-26 2015-06-02 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2621514B1 (en) 2010-09-28 2016-09-21 KAHR Medical (2005) Ltd Compositions and methods for treatment of hematological malignancies
KR20140002649A (ko) * 2010-10-27 2014-01-08 베이롤 칼리지 오브 메드신 Ｃｄ７０－양성 악성 종양에 대해 ｔ 세포를 재지정하기 위한 키메라 ｃｄ２７ 수용체
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
CA2836873C (en) 2011-05-21 2019-10-22 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
DK3006464T3 (en) 2011-06-10 2018-09-17 Canada Minister Nat Defence ANTIRICIN ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
AU2012268939B2 (en) 2011-06-17 2017-05-04 Novo Nordisk A/S Selective elimination of erosive cells
US9541480B2 (en) 2011-06-29 2017-01-10 Academia Sinica Capture, purification, and release of biological substances using a surface coating
EP2747785A4 (en) * 2011-08-26 2015-04-15 Univ California METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING RESPIRATORY DISEASES THROUGH NKG2D INHIBITION
JP2015508994A (ja) 2011-12-30 2015-03-26 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｉｌ−１３および／またはｉｌ−１７に対する二重可変ドメイン免疫グロブリン
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
EP3211002B1 (en) 2012-03-21 2020-05-13 Ben-Gurion University of The Negev Peptides derived from the ectodomain of nkp46
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
CA2871880A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
RU2636043C2 (ru) 2012-11-01 2017-11-17 Эббви Инк. Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения
US9371352B2 (en) 2013-02-08 2016-06-21 Vaccinex, Inc. Modified glycolipids and methods of making and using the same
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
RU2721707C2 (ru) 2013-03-14 2020-05-21 Макродженикс, Инк. Биспецифичные молекулы, иммунореактивные с иммунными эффекторными клетками, экспрессирующими активирующий рецептор
AU2014227732A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17
PL2992020T3 (pl) 2013-05-03 2020-06-01 Ohio State Innovation Foundation Odpornościowe komórki efektorowe wyrażające inżynierowane chimeryczne receptory antygenu swoiste dla CS1
WO2015015489A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biolinerx Ltd. Antibody for treating diabetes and autoimmune diseases
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
CN112457403B (zh) 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
BR112015027587A2 (pt) * 2013-12-31 2017-09-19 Dcb Usa Llc Anticorpos anti-vegf e uso dos mesmos
EP3126814B1 (en) 2014-04-01 2019-06-12 Academia Sinica Methods and systems for cancer diagnosis and prognosis
US10022443B2 (en) 2014-04-08 2018-07-17 Boston Pharmaceuticals Inc. Antibodies specific for IL-21 and uses thereof
KR101966408B1 (ko) 2014-04-10 2019-04-05 오비아이 파머 인코퍼레이티드 항체，약학적 조성물 및 이의 용도
CN106604742B (zh) 2014-07-03 2019-01-11 百济神州有限公司 抗pd-l1抗体及其作为治疗剂及诊断剂的用途
KR102524920B1 (ko) 2014-07-22 2023-04-25 아폴로믹스 인코포레이티드 항-pd-1 항체
JP6909153B2 (ja) 2014-08-05 2021-07-28 アポロミクス インコーポレイテッド 抗ｐｄ−ｌ１抗体
CN105381824B (zh) 2014-08-26 2019-04-23 中央研究院 收集器架构布局设计
PL3262071T3 (pl) 2014-09-23 2020-08-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób stosowania immunokoniugatów anty-CD79b
WO2016054101A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
EP3212232A4 (en) * 2014-10-31 2019-01-23 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. ANTIBODY BISPECIFIC ANTI-TLR9
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
WO2016089610A1 (en) * 2014-12-06 2016-06-09 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Bispecific antibody for cancer immunotherapy
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
AU2016219785B2 (en) 2015-02-20 2021-10-28 Ohio State Innovation Foundation Bivalent antibody directed against NKG2D and tumor associated antigens
KR20180012749A (ko) 2015-04-06 2018-02-06 지안후아 유 교아세포종에 대한 egfr-지시된 car 요법
US9994638B2 (en) * 2015-05-20 2018-06-12 Immunwork Inc. Peptide core-based multi-arm linkers for treating infectious diseases
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US11254744B2 (en) 2015-08-07 2022-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
CN109071679B (zh) 2016-02-05 2023-07-28 华盛顿大学 用于靶向的细胞因子递送的组合物和方法
CN108700566A (zh) * 2016-02-19 2018-10-23 河谷控股Ip有限责任公司 免疫原性调节的方法
US10107726B2 (en) 2016-03-16 2018-10-23 Cellmax, Ltd. Collection of suspended cells using a transferable membrane
BR112018071105A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Macrogenics, Inc. conjugado de droga e anticorpo, molécula de ligação, composição farmacêutica e uso
JP6993056B2 (ja) 2016-07-05 2022-02-15 ベイジーン リミテッド 癌治療のためのｐｄ－１アンタゴニスト及びｒａｆ阻害剤の組合せ
CN110087680B (zh) 2016-08-19 2024-03-19 百济神州有限公司 使用包含btk抑制剂的组合产品治疗癌症
WO2018137681A1 (en) 2017-01-25 2018-08-02 Beigene, Ltd. Crystalline forms of (s) -7- (1- (but-2-ynoyl) piperidin-4-yl) -2- (4-phenoxyphenyl) -4, 5, 6, 7-tetrahy dropyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-3-carboxamide, preparation, and uses thereof
AU2018219887A1 (en) * 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
MX2019009541A (es) * 2017-02-10 2019-12-16 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas que se unen a psma, nkg2d y cd16.
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
BR112019017256A2 (pt) * 2017-02-20 2020-04-14 Dragonfly Therapeutics Inc proteínas de ligação gd2, nkg2d e cd16
KR20190120775A (ko) * 2017-02-20 2019-10-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Cd33, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
CA3054086A1 (en) * 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding cd123, nkg2d and cd16
US11583588B2 (en) * 2017-05-05 2023-02-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Modular self assembly disassembly (SADA) technologies
EP3645569A4 (en) 2017-06-26 2021-03-24 BeiGene, Ltd. IMMUNOTHERAPY FOR LIVER CELL CARCINOMA
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
US20200231679A1 (en) * 2017-08-23 2020-07-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
WO2019071009A2 (en) * 2017-10-05 2019-04-11 Nantcell, Inc. LIPID ANTIGENS AND L-CELL RECEPTORS ON NK CELLS
CN107759701B (zh) * 2017-10-27 2021-07-02 杭州优善生物科技有限公司 嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用
CN111801334B (zh) 2017-11-29 2023-06-09 百济神州瑞士有限责任公司 使用包含btk抑制剂的组合治疗惰性或侵袭性b-细胞淋巴瘤
CN109957023A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2019127215A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric receptors comprising an nkg2d domain and methods of use thereof
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
WO2019195409A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and an antigen associated with tumors, mdscs and/or tams
US11505610B2 (en) 2018-04-06 2022-11-22 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-NRP2 antibodies
CN108728527B (zh) * 2018-06-06 2020-06-09 青岛泱深生物医药有限公司 Hcst基因作为诊治子痫前期的靶标
EP3897853A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and nkg2d antigen binding domains
EP3927722A4 (en) * 2019-02-18 2022-11-23 Courier Therapeutics, Inc. BISPECIFIC FUSION PROTEIN USING ORTHOPOXVIRUS MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS L-LIKE PROTEIN (OMCP) AND TUMOR-SPECIFIC BINDING PARTNER
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP4037711A4 (en) * 2019-10-03 2024-02-14 Atyr Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS USING ANTI-NRP2 ANTIBODIES
CN115947861B (zh) * 2022-07-25 2023-11-17 南京佰抗生物科技有限公司 一种高效杂交瘤融合方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0585257A4 (en) * 1991-03-28 1995-02-22 Univ Minnesota DNA AND AMINO ACID SEQUENCE SPECIFIC TO NATURAL K KILLER CELLS.
US5858682A (en) * 1996-08-02 1999-01-12 Pharmingen E2A/pbx1 fusion protein specific monoclonal antibodies
PT1032660E (pt) * 1997-11-17 2009-12-28 Micromet Ag Processo de identificação dos domínios do sítio de ligação que retêm a capacidade de ligação a um epítope

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001071005A3 (en) 2002-01-03
AU2001260153B2 (en) 2006-08-17
CN1423700A (zh) 2003-06-11
CA2406993A1 (en) 2001-09-27
NO20024489L (no) 2002-11-19
WO2001071005A2 (en) 2001-09-27
NO20024489D0 (no) 2002-09-19
EP1266014A2 (en) 2002-12-18
IL151873A0 (en) 2003-04-10
JP2004500108A (ja) 2004-01-08
AU6015301A (en) 2001-10-03
HUP0300919A2 (hu) 2003-07-28
PL358215A1 (en) 2004-08-09
US20040038339A1 (en) 2004-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20023203A3 (cs) Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo k epitopu receptorového komplexu NKG2D
KR102340832B1 (ko) 항 pd-1 항체 및 그의 용도
AU2001260153A1 (en) Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the NKG2D receptor complex
CN108373504B (zh) Cd24特异性抗体和抗cd24-car-t细胞
KR101837053B1 (ko) 종간 특이적 ＰＳＣＡｘＣＤ３, ＣＤ19ｘＣＤ3, ｃ-ＭＥＴｘＣＤ3, 엔도시알린ｘＣＤ3, ＥｐＣＡＭｘＣＤ3, ＩＧＦ-1ＲｘＣＤ3 또는 ＦＡＰαｘＣＤ3 이중특이적 단일쇄 항체
KR101229731B1 (ko) 다중특이적 탈면역화된 ｃｄ3-바인더
TW201837174A (zh) 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體及包含該抗體之分子
CA3032581A1 (en) Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
JP2020529864A (ja) 多重特異性抗体とその作製及び使用方法
JP2004500828A (ja) Ｍｕｃｉｎ−１特異的結合メンバー及びその使用方法
US20210269547A1 (en) Antibody tumor-targeting assembly complexes
WO2006117782A2 (en) Recombinant antibodies against cd55 and cd59 and uses thereof
US20220323600A1 (en) Teac and attac immunooncology compositions and methods
JP2022548947A (ja) Ｃｅａｃａｍ５およびｃｄ３に対する二特異性抗体
CN112040957A (zh) 靶向表达cd99的癌症的组合物和方法
KR20220145411A (ko) Cd19 및 cd20을 표적화하는 조합된 키메라 항원 수용체 및 그의 적용
JP2021505137A (ja) 悪性ｂ細胞を特異的に認知する抗体またはその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体及びその用途
WO2023160260A1 (zh) Cd7-car-t细胞及其制备方法和应用
EP3912992A1 (en) Car library and production method for scfv
IL298449A (en) Enhanced receptors for antigen binding
KR20230005001A (ko) 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
JP2022538397A (ja) キメラ抗原受容体設計で実施するためのウルトラモジュラー（ｕｌｔｒａｍｏｄｕｌａｒ） ＩｇＧ３ベーススペーサードメイン及び多機能部位
RU2805840C1 (ru) Полипептид, специфичный к муцину-1, и его применение
TW202233667A (zh) 黏蛋白１結合多肽、多核苷酸、載體、細胞、嵌合抗原受體、免疫細胞以及組成物
JP2022532994A (ja) がんの治療のための組成物及び方法