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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Blockern der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten.
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Autoimmunität beruht
auf einer spezifischen, adaptiven Immunantwort gegen körpereigene
Antigene. Normalerweise lässt
das Immunsystem körpereigene
Substanzen unbehelligt und bekämpft
nur Fremdkörper. Autoimmunität lässt sich
als Ergebnis eines Zusammenbruchs der Toleranz gegenüber körpereigenen
Stoffen und/oder eines defekten Kontroll- und Regulationsmechanismus
des Immunsystems auffassen. Die genauen Ursachen für die Entstehung
von Autoimmunkrankheiten sind bisher unbekannt. Es wird jedoch vermutet,
dass neben umweltbedingten auch erbliche Faktoren eine Rolle spielen.
T-Lymphozyten scheinen an der Auslösung der Krankheiten wesentlich
beteiligt zu sein, da sie sowohl als cytotoxische T-Lymphozyten
als auch durch die Aktivierung von Makrophagen Gewebeschädigungen
verursachen können.
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Autoimmunkrankheiten
lassen sich in gewebe- oder organspezifische sowie systemische,
also nicht-organspezifische Autoimmunkrankheiten einteilen. So ist
bspw. die Erkrankung Multiple Sklerose ein Beispiel für eine organspezifische,
vermutlich T-Zell-vermittelte
Autoimmunerkrankung beim Menschen.
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Bei
der T-Zell-vermittelten Immunantwort erkennen zytotoxische T-Lymphozyten
körpereigene
Peptide in Kontext von MHC-Klasse I Molekülen (MHC = major histocompatibility
complex/Haupthistokompatibilitätskomplex)
und führen
zur Zerstörung
der erkannten Zelle. Dies ist vermutlich der Fall bspw. bei der
rheumatoiden Arthritis und bei dem insulinabhängigen Diabetes mellitus.
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Der
Nachweis von Autoimmunkrankheiten, die durch autoreaktive T-Lymphozyten
verursacht werden, ist schwierig, da die Isolierung und Charakterisierung
der entsprechenden autoantigenen Peptide technisch schwierig ist.
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In
der Praxis ist das therapeutische Vorgehen oft konfrontiert mit
chronischen, langsam fortschreitenden Autoimmunkrankheiten. Zu Teilerfolgen
führte
der Einsatz von Immunsuppressiva und Corticosteroiden.
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Andere
Therapieansätze
machen sich die Idee zunutze, dass bestimmte Peptide die Autoimmunreaktion
verhindern können.
Die Peptide, die eine ähnliche
Aminosäurestruktur
wie das die Krankheit verursachende Selbstpeptid besitzen, binden
dann zwar an die MHC-Moleküle,
die von den T-Zell-Rezeptoren der autoreaktiven T-Zellen erkannt
werden, jedoch werden die T-Zellen dadurch nicht mehr aktiviert.
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Mit
anderen Therapieansätzen
soll erreicht werden, dass lösliche
Komplexe aus MHC-Molekülen, Peptid
und einem Toxin an diejenige T Zellen binden, die den Schaden im
Organismus auslösen.
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In
anderen Ansätzen
werden Cytokine, die bei der Auslösung von Autoimmunkrankheiten
beteiligt sind, durch Antagonisten blockiert, wie bspw. Interleukin-1-
und Tumor-Nekrosis-Faktor-α-Antagonisten.
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Neuere
Studien haben nun Anhaltspunkte aufgezeigt, wonach der NKG2D-Rezeptor
eine Rolle zumindest bei manchen Autoimmunkrankheiten spielt.
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Der
aktivierende Immunrezeptor NKG2D wird auf natürlichen Killerzellen (NK Zellen)
und mehreren T-Zellsubpopulationen einschließlich CD8+ T Zellen exprimiert.
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NK
Zellen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems
und als solche an der Immunabwehr von Viren und Tumoren beteiligt.
Dabei bestimmt das Zusammenspiel von Signalen aktivierender und
inhibitorischer Rezeptoren die Aktivierung von NK Zellen. Durch
die Vermittlung des aktivierenden Immunrezeptors NKG2D erkennen
zytotoxische Lymphozyten, das heißt NK Zellen und CD8+ T Zellen,
virusinfizierte bzw. maligne Körperzellen,
die infolge dessen eliminiert werden können. Außer auf CD8+ αβ T Zellen
und NK Zellen konnte die NKD2D-Expression auch auf γδ T Zellen
gezeigt werden.
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Der
Rezeptor NKG2D wird konstitutiv auf der Zelloberfläche exprimiert
und ist mit dem Adapterprotein DAP10 assoziiert. Nach Interaktion
mit seinen MHC Klasse I-ähnlichen
Liganden vermittelt der Rezeptor NKG2D über das Adapterprotein ein
Aktivierungssignal in die zytotoxischen Lymphozyten.
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Als
NKG2D-Liganden sind bisher im Menschen die MHC-Klasse-I-Ketten-ähnlichen
Moleküle
A (MICA), MICB und die UL16-bindenden Proteine (ULBP) 1, 2, 3 und
4 (= RAET1E) und RAET1L sowie RAET1G identifiziert worden (siehe
Steinle et al., „Interactions
of human NKG2D with its Ligands MICA , MICB, and homologs of the
mouse RAE-1 Protein Family",
Immunogenetics 53:279-287, 2001; Cosman et al., „ULBPs, novel MHC Class I
related Molecules, bind to CMV Glycoprotein UL 16 and stimulate
NK Cytotoxicity through the NKG2D Receptor", Immunity 14:123-133, 2001; Bacon et
al., „Two
human ULBP/RAET1 molecules with transmembrane regions are ligands
for NKG2D", J. Immunol.
173:1078-1084, 2004). In der Maus sind die NKG2D-Liganden RAE-1α, β, γ ,δ und ε, sowie H60
und das ULBP-Homolog MULT1 beschrieben worden.
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Die
verschiedenen NKG2D-Liganden haben unterschiedliche Expressionsmuster.
Die Liganden werden nach derzeitigem Kenntnisstand nicht oder nur
in geringem Umfang von normalen Körperzellen exprimiert, während unter
pathologischen Bedingungen ihre Expression hochreguliert wird, wie
beispielsweise bei Transformationen (bspw. epitheliale Tumore, Gliome,
Leukämien),
Infektionen (bspw. durch das humane Cytomegalovirus (HCMV) oder
durch Mycobacterium tuberculosis) oder bei zellulärem Stress.
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Trotz
der aufgezeigten Möglichkeiten
zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten besteht immer noch ein großes Interesse,
Alternativen zu den bisher eingesetzten Therapieansätzen zu
finden, da die aufgezeigten Ansätze
oftmals schwerwiegende Nebenwirkungen verursachen oder nur mit großem Aufwand
und unter hohen Kosten durchzuführen
sind oder nur Teilerfolge erbringen.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, Substanzen zur Herstellung
eines Arzneimittels bereitzustellen, welches zur Prophylaxe und/oder
Therapie von Autoimmunkrankheiten dient.
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe durch die Bereitstellung von zumindest einem Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion gelöst, der
ausgewählt
ist aus der Gruppe umfassend löslicher
NKG2D-Rezeptor, lösliches
MICA, lösliches
MICB, lösliches
ULBP1, lösliches
ULBP2, lösliches
ULBP3, lösliches
ULBP4, lösliches
RAET1L, lösliches
RAET1G, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate
der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der
NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.
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Die
Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass durch die Gabe
eines genannten löslichen Blockers
der NKG2D-Rezeptor-/Liganden-Interaktion
der Ausbruch von Autoimmunkrankheiten verhindert oder zumindest
gebremst werden konnte.
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Ogasawara
et al. („NKG2D
Blockade Prevents Autoimmune Diabetes in NOD Mice", Immunity 20:757-767,
2004) zeigten, dass NKG2D-Liganden-Expression
in Pankreas von erkrankten NOD-(„nonobese diabetic"-) Mäusen nachgewiesen
werden konnte. Dieselbe Arbeitsgruppe konnte auch zeigen, dass eine
Blockade des NGK2D-Rezeptors
durch anti-NKG2D monoklonale Antikörper in NOD-Mäusen den
Ausbruch der Krankheit verhindern konnte.
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Ferner
konnten Groh et al. („Stimulation
of T-Cell Autoreactivity by Expression of NKG2D and its MIC Ligands
in Arthritis", Proceedings
of the National Academy of Sciences, USA, 100:9452-9457, 2003) in ihren Studien
zeigen, dass beim Menschen auf Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider
Athritis NKG2D-Liganden
vorliegen und dass deren Interaktion mit NKG2D-Rezeptoren, die bei diesen Patienten
auch auf CD4+ CD28- T-Zellen
exprimiert werden, die Zerstörung
von Synovialzellen bedeutend beeinflussen kann.
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Jedoch
ist in keiner der neueren Studien gezeigt, noch ist ein Hinweis
darauf zu finden, dass durch lösliche
NKG2D-Rezeptoren, MICR/B oder lösliches
ULBP die NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion derart beeinflusst werden
kann, dass der Ausbruch von Autoimmunkrankheiten verhindert oder
zumindest verzögert
werden kann.
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Die
Erfinder haben mit ihren Versuchen hingegen erstmalig gezeigt, dass
durch die Gabe von löslichem
NKG2D-Rezeptor der Ausbruch von Symptomen der Multiplen Sklerose
deutlich gehemmt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen somit die
Möglichkeit
auf, lösliche
Liganden oder Fragmente davon im Rahmen einer Therapie bei Autoimmunkrankheiten
einzusetzen. Darüber
hinaus zeigten transgene Mäuse,
die eine hohe Konzentration von löslichem MICR im Serum enthielten,
ebenfalls eine ähnliche
Verzögerung
des Krankheitsausbruchs.
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Durch
die Gabe von löslichem
NKG2D-Rezeptor und dessen Bindung an seine (an Zelloberflächen gebundenen)
Liganden wird verhindert, dass diese Liganden den auf Oberflächen von
(u.a.) NK Zellen exprimierten NKG2D-Rezeptor binden und diese aktivieren.
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Andererseits
kann die Gabe von löslichen
NKG2D-Liganden bewirken, dass diese an den auf Oberflächen von
(u.a.) NK Zellen exprimierten NKG2D-Rezeptor binden, diesen jedoch
nicht aktivieren können,
da hierzu vermutlich ein Zell-Zell-Kontakt notwendig ist.
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Vorliegend
bedeutet „Fragment" jedes Fragment eines
der genannten löslichen
Peptide, welches wie das lösliche
Protein an den NKG2D-Rezeptor binden kann. Mit „Derivaten" sind jede Protein-Abwandlungen gemeint, die vom löslichen
Protein abweichende Modifizierungen aufweisen, bspw. Aminosäuresubstitutionen, und
zwar insbesondere an den Stellen der löslichen Proteine, über welche
die Bindung der Proteine an den NKG2D-Rezeptor nicht vermittelt
wird. Auch solche Proteine oder Peptide, die von den Blockern abgeleitet sind,
können
für eine
erfindungsgemäße Verwendung
eingesetzt werden.
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Ferner
bedeutet vorliegend „allelische
Varianten" alle
Varianten von Nucleotidsequenzen der für die genannten Proteine codiernden
Gene, die zumindest bisher im Stand der Technik bekannt sind. So
sind bspw. für
MICA bisher 56 Allele identifiziert worden (siehe bspw. auf der
Internetseite des EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) www.ebi.ac.uk/imgt/hla)
und für
MICB 16 Allele.
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Somit
werden unter „Fragmenten,
Derivaten oder allelische Varianten der genannten Blocker" alle Substanzen
verstanden, die die gleichen Bindungseigenschaften wie die genannten
Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion aufweisen.
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Es
können
jedoch nicht nur die genannten Proteine als Blocker eingesetzt werden,
sondern vielmehr jeder niedermolekulare synthetisch hergestellte
Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Ligangen-Interaktion. Solche
synthetisch hergestellte Blocker können bspw. dadurch identifiziert
werden, dass durch Zugabe synthetischer Substanzen, die z. B. durch
kombinatorische Chemie hergestellt wurden, im „high throughput"-Verfahren eine Blockierung
der Interaktion zwischen rekombinant hergestelltem löslichem
MICA, das z. B. auf Mikrotiterplatten oder sog. „beads" immobilisiert wird, und mit rekombinant
hergestelltem löslichem,
biotinyliertem NKG2D analysiert wird. Eine Bindung von NKG2D an
MICA kann über
Streptavidin-Konjugate detektiert werden (z. B. Streptavidin-Phycoerythrin
in der Durchflusszytometrie oder Streptavidin-Meerrettichperoxidase
in ELISA-Verfahren).
Derart identifizierte synthetische Blocker können dann in funktionellen
Versuchen, z. B. in Zytotoxizitätsexperimenten
mit NK Zellen, getestet werden.
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Als
Blocker können
aber auch bspw. Antikörper
eingesetzt werden, die gegen den NKG2D-Rezeptor gerichtet sind,
oder Fragmente davon.
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Polyklonale
Antikörper
können
in herkömmlicher
Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere von Kanninchen,
mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung
des Immunglobulins erhalten werden.
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Monoklonale
anti-NKG2D-Rezeptor-Antikörper
können
nach Standardprotokollen gemäß dem von Köhler und
Milstein beschriebenen Prinzip („Continuous cultures of fused
cells secreting antibody of predefined specificity", Nature 256:495-497,
1975) gewonnen werden. Hierfür
werden bspw. Mäuse
immunisiert und anschließend
antikörperproduzierende
Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert, bspw. durch Fusion
mit Myelomzellen. Anschließend
wird der Überstand
der erhaltenen Hybridome mittels immunologischen Standardassays
auf monoklonale anti-NKG2D-Rezeptor-Antikörper gescreent. Für den therapeutischen
oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper ggf.
auf herkömmliche
Weise chimerisiert (siehe bspw. Neuberger et al., „Recombinant
antibodies possessing novel effector functions" Nature 312:604-608, 1984) oder humanisiert
(siehe bspw. Riechmann et al., „Reshaping human antibodies
for therapy", Nature 332:323-327, 1988) werden.
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Insbesondere
ist bevorzugt, wenn als Blocker ein Protein oder Peptid eingesetzt
wird, das eine Aminosäuresequenz
enthält,
die ausgewählt
ist aus den im beiliegenden Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen
mit den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID NR. 15, und insbesondere ein Protein,
das eine Aminosäuresequenz aufweist, die
ausgewählt
ist aus den Sequenzen mit der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 15.
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Das
im beigefügten
Sequenzprotokoll aufgeführte
Peptid mit der SEQ ID-Nr. 1 des beigefügten Sequenzprotokolls stellt
die komplette (full-length) Aminosäuresequenz des NKG2D-Rezeptors
dar. Dieser weist eine cytoplasmatische Domäne (AS 1-51), eine Transmembrandomäne (AS 52-72)
und eine Ektodomäne
(AS 73-216) auf. Mit der Aminosäuresequenz
der SEQ ID- Nr. 2 des beigefügten
Sequenzprotokolls ist vorliegend die diese Ektodomäne umfassende
Sequenz identifiziert. Mit der SEQ ID-Nr. 3 des beigefügten Sequenzprotokolls
ist die Sequenz von MICA*01, mit der SEQ ID-Nr. 5 die Sequenz von
MICB*02 identifiziert. Die SEQ ID-Nrn. 4 und 6 sind jeweils Sequenzabschnitte
von MICA*01 und MICB*02. Unter den SEQ ID-Nrn. 7 bis 15 des beigefügten Sequenzprotokolls
sind jeweils die full-length Sequenzen sowie Sequenzabschnitte der
Proteine ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, RAET1L und RAET1G aufgeführt. Eine Übersicht über die
bereits bekannten Sequenzen sowie deren Datenbank-Identifikationsnummern
(Accession Number) findet sich in der beigefügten Tabelle 1.
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Es
ist bevorzugt, wenn die Blocker, also löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches
MICA/B und lösliche
ULBP-Moleküle,
für die
Verwendung rekombinant hergestellt werden.
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Hierbei
kann es von Vorteil sein, nicht das full-length Protein zu exprimieren,
sondern bspw. nur bindungsrelevante Domänen der Proteine. So kann bspw.
der lösliche
NKG2D-Rezeptor ohne die cytoplasmatische Region und ohne die Transmembran-Domäne exprimiert
werden (z. B. von Asn 80 bis Val 216; = SEQ ID Nr. 2); lösliches
MICA kann bspw. von Glu 1 bis Lys 276 (= SEQ ID-Nr. 4), lösliches
MICB von Glu 1 bis Lys 276 (= SEQ ID-NR. 6), lösliches ULBP1 von Asp 1 bis
Lys 181 (= SEQ ID-NR. 8), lösliches
ULBP2 von Asp 1 bis Ala 181 (= SEQ ID-NR. 10) und lösliches
ULBP3 von Asp 1 bis Ala 181 (= SEQ ID-Nr. 12) exprimiert werden.
Geeignet für
die Expression sind bspw. Sf9 Insektenzellen oder eukaryontische
Expressionssysteme, wie z.B. 293T oder COS7 Zellen.
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Bei
der erfindungsgemäßen Verwendung
ist insbesondere bevorzugt, wenn die Autoimmunkrankheiten ausgewählt sind
aus der Gruppe umfassend Multiple Sklerose, Diabetes Typ I, rheumatoide
Arthritis, Psoriasis, Spondylarthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus
Crohn, Colitis ulcerosa und Systemischer Lupus Erythematodes (SLE).
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Insbesondere
ist bevorzugt, wenn die Verwendung bei der schubförmigen Multiple
Sklerose erfolgt, vorzugsweise in der Anfangsphase der schubförmigen Multiplen
Sklerose.
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Bei
der Multiplen Sklerose sind in den Entzündungsherden (Plaques) u.a.
T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen zu finden, was als
Hinweis auf eine Autoimmunreaktion gewertet wird. Ferner konnten Autoantikörper gegen
verschiedenen Komponenten der Myelinschicht nachgewiesen werden,
bspw. gegen basische Myelinproteine, Proteolipid-Proteine oder gegen
das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Zur Therapie der
multiplen Sklerose wird momentan insbesondere rekombinant hergestelltes
Interferon β eingesetzt,
insbesondere beim schubförmigen
Krankheitsverlauf.
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Der
Autoimmunkrankheit Diabetes Typ I liegt eine zellulär vermittelte
chronische und irreversible Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des
Pankreas zugrunde, wobei vermutlich ein auf den β-Zellen präsentiertes Peptid von autoimmunen
T-Lymphozyten erkannt
wird, die ihrerseits die β-Zellen
zerstören.
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Bei
der rheumatoiden Arthritis handelt es sich um eine Autoimmunkrankheit,
bei welcher vermutlich durch eine Veränderung von Synovialzellen
eine Immunantwort von T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen induziert
wird, die zur Antikörperbildung
gegen Synovialzellen führt.
Als Folge werden Hydrolasen, Kollagenasen und lysosomale Enzyme
freigesetzt, die zur Zerstörung
von Gelenkknorpel führen.
Eine Therapie erfolgt momentan mit Antiphlogistika, Corticosteroiden
u.a. Antirheumatika, sowie mit anti-TNF-α-Antagonisten.
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Eine
mögliche
Erklärung
der NKG2D-Wirkungsweise bei der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten
ist eine Induktion von NKG2D-Liganden
durch zellulären
Stress oder virale oder bakterielle Infektionen auf den Zellen der
Organe bzw. Gewebe, die von der Autoimmunität betroffen sind. Diese induzierte
Expression von NKG2D-Liganden könnte
dann eine Lyse der entsprechenden Zellen durch NK Zellen vermitteln.
Hierdurch würde
nicht nur das entsprechende Gewebe zerstört, sondern auch sehr viele
Autoantigene freigesetzt, die wiederum von Antigen-präsentierenden
Zellen aufgenommen und über
MHC-Moleküle
präsentiert
werden könnten,
was zur Aktivierung potentiell autoreaktiver T Zellen führen könnte. Alternativ
könnten
autoreaktive T Zellen auch direkt durch die NKG2D-Liganden-Expression
auf dem betroffenen Gewebe aktiviert werden.
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Mit
der erfindungsgemäßen Verwendung
wird ein Ansatz aufgezeigt, mit welchem eine neue Alternative zur
Behandlung der oben angegebenen Krankheiten ermöglicht wird. Die Erfinder konnten
nämlich
in eigenen Versuchen zeigen, dass in Mäusen bei einem Einsatz von
löslichem
NKG2D-Rezeptor der Ausbruch der schubförmigen Multiplen Sklerose im
Vergleich zu unbehandelten Mäuse
deutlich hinausgezögert
werden konnte. Gleiches wurde mit MICA-transgenen Mäusen gezeigt,
die hohe Serumkonzentrationen an löslichem MICA enthalten.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die zumindest einen Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion
enthält.
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Dabei
ist bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest
einen Blocker enthält, der
ausgewählt
ist aus der Gruppe umfassend löslicher
NKG2D-Rezeptor, lösliches
MICA, lösliches
MICB, lösliches
ULBP1, lösliches
ULBP2, lösliches
ULBP3, lösliches
ULBP4, lösliches
RAET1L, lösliches
RAET1G, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate
der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der
NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.
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Die
Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die als Blocker ein Protein enthält,
das eine Aminosäuresequenz
enthält,
die ausgewählt
ist aus der im beigefügten
Sequenzprotokoll aufgeführten
Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 15, und insbesondere ein Protein,
das eine solche Aminosäuresequenz
aufweist.
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Dabei
ist nicht ausgeschlossen, dass die Zusammensetzung auch mehrere
der genannten Blocker enthält.
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Die
Zusammensetzung kann darüber
hinaus auch weitere Zusatzstoffe und/oder Träger enthalten, die üblicherweise
bei der Zubereitung einer zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzung
verwendet werden. Solche Inhaltsstoffe sind zum Beispiel Verdünnungsmittel,
Bindemittel, Suspensionsmittel, Schmiermittel, Stabilisatoren usw.
Dazu zählen,
sind aber nicht hierauf beschränkt,
z.B. Wasser, Salzlösungen,
Alkohole, pflanzliche Öle,
Polyetylenglycole, Monoglyceride, etc. Eine Übersicht über derartige Inhaltsstoffe
findet sich beispielsweise in A. Tippe, „Handbook of Pharmaceutical
Excepients", 3.
Edition 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical
Press.
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Je
nach Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, also oral
oder parenteral, wird die Zusammensetzung formuliert sein, also
beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten oder aber flüssigen Zubereitungen,
die bspw. auch injiziert oder intravenös verabreicht werden können. Die
Verabreichung kann ferner in Abhängigkeit
vom Patienten und der Erkrankung, systemisch oder lokal und subtil
gerichtet vorgenommen werden.
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Ferner
kann die Zusammensetzung weitere aktive Inhaltsstoffe oder Arzneimittel
ausweisen, wie beispielsweise Interferone und ähnliche.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann dann bei Autoimmunkrankheiten
eingesetzt werden, wie bspw. Multiple Sklerose, Diabetes Typ I,
rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Spondyl arthritiden, Zöliakie,
Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Systemischer Lupus
Erythematodes (SLE).
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Weitere
Vorteile ergeben sich aus den Figuren und dem nachfolgenden Beispiel.
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Es
versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend
noch zu erläuternden
Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern
auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar
sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung werden in den nachfolgenden Figuren näher erläutert. Es
zeigen:
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1 NKG2D-Liganden-Expression im ZNS bei
Patienten mit Multipler Sklerose sowie in humaner Mikroglia:
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1A:
Immunhistochemische Anfärbung
von demyelinisierten ZNS-Läsionen
(„plaque" bzw. „shadow
plaque") von MS-Patienten.
Gezeigt sind Anfärbungen
von MHC-Klasse II Molekülen
(MHC-II), MIC-Molekülen
(BAMO1) und „Major
Basic Protein" (MBP),
sowie mit einer Isotypkontrolle.
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1B:
Quantifizierung von MICA Transkripten mittels Echtzeit-PCR im ZNS
von gesunden („Normal") versus MS-Patienten („MS") mit Normierung
auf die T98G Gliomazelllinie, sowie von unreifen Dendritischen Zellen
(DC „imm") versus reifen DC
(„DC
mature") versus
isolierter Mikroglia.
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2 NKG2D-Liganden-Expression im ZNS und
in Mikrogliazellen bei der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis
von Mäusen:
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2A:
Nachweis von RAE-1 und NKG2D im ZNS von C57BL/6 Mäusen am
Tag der EAE-Induktion (day 0) sowie am Tag 10 bzw. 20 nach EAE-Induktion
mittels Immunblot. Die Zahlen geben die Einheiten der relativen
Densitometrie wieder (Tag 0 normiert auf 1.0). Zur Kontrolle der
aufgetragenen Proteinmenge wurde β-Aktin
detektiert.
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2B:
Quantifizierung von RAE-1δ Transkripten
mittels Echtzeit-PCR im ZNS von C57BL/6 Mäusen („Normal") und C57BL/6 Mäusen nach EAE-Induktion („EAE") mit Normierung
auf die Maus-Gliomazelllinie GL261, sowie in isolierten Astrozyten
und Mikrogliazellen von C57BL/6 Mäusen.
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3 Effekt der NKG2D-Blockade bei der experimentellen
autoimmunen Encephalomyelitis (EAE).
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3A:
Durchschnittlicher „clinical
score" von je sechs
H2-Kb-MICA transgenen Mäusen (offene Kreise) sowie
sechs nicht-transgenen Geschwistern (geschlossene Kreise) an Tagen
0 bis 30 nach EAE-Induktion.
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3B:
Durchschnittlicher „clinical
score" an Tagen
0 bis 25 nach EAE-Induktion von fünf C57BL/6 Mäusen bei
Gabe von löslichem
NKG2D (offene Kreise; die sechste Maus zeigte keinerlei Symptome)
sowie von sechs Mäusen
bei Gabe von PBS (geschlossene Kreise). PBS bzw. sNKG2D wurde an
Tagen 0, 2, 4, 6, 8, und 10 intraperitoneal appliziert.
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3C:
MOG-Peptid spezifische T Zellproliferation bei Mäusen, bei denen EAE induziert
wurde, und die entweder mit PBS oder mit löslichem NKG2D, wie in 3B beschrieben,
behandelt wurden. Milzzellen wurden mit 1μg/ml oder 10μg/ml MOG-Peptid stimuliert.
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3D:
Durchschnittlicher „clinical
score" an Tagen
0 bis 30 nach EAE-Induktion von je sechs C57BL/6 Mäusen bei
Gabe von löslichem
NKG2D (offene Kreise) sowie bei Gabe von PBS (geschlossene Kreise).
PBS bzw. sNKG2D wurde an Tagen 10, 12, 14, 16, 18, und 20 intraperitoneal
appliziert.
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3E:
MOG-Peptid spezifische T Zellproliferation bei Mäusen, bei denen EAE induziert
wurde, und die entweder mit PBS oder mit löslichem NKG2D, wie unter 3D beschrieben,
behandelt wurden. Milzzellen wurden mit 1μg/ml oder 10μg/ml MOG-Peptid stimuliert.
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Beispiel
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1. Material und Methoden
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1.1 Patienten
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Hirne
von MS-Patienten wurden immunohistochemisch untersucht. Die Studie
wurde gemäß dem durch
das Ethikkomitee des Universitätsklinikums
Tübingen
zugelassenen Protokoll durchgeführt.
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1.2 Antikörper
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Folgende
monoklonale Antikörper
wurden verwendet: BAMO1 (Maus IgG1), anti-MICA/B;
anti-Maus RAE-1γ (R & D Systems, Wiesbaden,
Deutschland), anti-Maus NKG2D (R & D
Systems) und anti-β-Aktin
(Santa Cruz Biotechnologies).
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1.3 Zelllinien
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Die
humane maligne Gliomazelllinie T98G wurde von Dr. Tribolet (Lausanne,
Schweiz) erhalten. Die Maus-Gliomazelllinie GL261 war ein Geschenk
von XO Brakefield (Harvard Medical School Boston, USA). Die Zellen
wurden in DMIM-Medium kultiviert, welches mit 2mM L-Glutamin (Gibco
Life Technologies, Paisley, Großbritannien),
10 % FCS (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) und Penicillin (100
IU/ml)/Streptomycin (100 μg/ml;
Gibco) ergänzt
war.
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1.4 Immunoblot
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Zu
den angegebenen Zeitpunkten nach Induzierung der experimentellen
autoimmunen Encephalomyelitis wurde das Gehirngewebe der Mäuse isoliert.
Das Gewebe wurde in Lysispuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8) mit 120 mM
NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 2 μg/ml
Aprotinin, 10 μg/ml
Leupeptin und 100 μg/ml
PMSF) mittels Ultraschall aufgeschlossen. Aliquots der Gewebelysate
wurden auf 12 % SDS- PAGE
Gelen unter nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt
und auf Nitrozellulose überführt. Die
Gesamtmenge an Protein der Lysate betrug 40 μg je Spur. Nach Blockierung
der unspezifischen Bindungsstellen mit 5 % (w/v) Milchpulver in
PBS für
30 Minuten wurden die Filter mit den spezifischen monoklonalen Antikörpern über Nacht
bei 4°C
inkubiert, gewaschen und mit Peroxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen
oder Ziegen-Anti-Ratte IgG (1:3000 verdünnt; Santa Cruz Biotechnologies,
Santa Cruz, USA) drei Stunden lang bei 22°C inkubiert. Die Primärantikörper wurden
in einer Konzentration von 1 μg/ml
in PBS mit 0,05 % Tween20 und 1,3 % fettarme Milch eingesetzt.
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1.5 Isolierung der humanen
Mikrogliazellen
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Primäre gliale
Zellen wurden aus adulten Patienten während einer chirurgischen Resektion
gewonnen, welche zur Behandlung einer nicht Tumor-bezogenen unheilbaren
Epilepsie durchgeführt
wurde. Die Gewebeproben wurden in Regionen entnommen, die abseits
der aktiven Stelle lagen. Die methodische Isolierung und Kultivierung
adulter menschlicher Mikroglia wurde bereits beschrieben, bspw.
von Yong et al. („Culture
of Cells from Human Brains Biopsies", Protocol for Neural Cell Culture,
Seite 35-42, 1992).
Hierzu wurden ein bis drei mm3 Gewebe mit
0,025 % Collagenase A und DNase (50 mg/ml) (Böhringer, Mannheim) für 45 Minuten behandelt,
und anschließend
mittels Passage durch ein 130 μm
Nylonnetz mechanisch auftrennt. Die Zellen wurden über einen
30 %igen Percoll-Gradienten (Pharmacia) bei 15.000 rpm für 30 Minuten
weiter aufgetrennt. Die Zellen, die aus der Zwischenschicht gewonnen
wurden, enthielten eine gemischte gliale Zellpopulation, die aus
ungefähr
65 % Oligodendroglia, 30 % Mikroglia und 5 % Astroglia bestand.
Zur Anreicherung der Mikroglia wurde die gemischte Zellpopulation
in Eagels MEM suspendiert, das mit 5 % FCS, 2,5 U/ml Penicillin,
2,5 mg/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin und 0,1 % Glukose (alles von
Gibco) ergänzt
war, und wurde über
Nacht in 25 cm2 Gewebekulturflaschen oder
48-Well-Platten (Falcon, Fisher Scientific) in feuchter Atmosphäre bei 37°C mit 5 %
CO2 inkubiert. Die weniger adhärierenden
Oligodendroglia wurden durch vorsichtiges Schütteln entfernt. Die übrigen adhärierenden
Zellen, also Astroglia und Mikroglia, ließ man morphologisch über drei
Tage entwickeln. Danach wurden die weniger adhärierenden Astroglia durch rotierendes
Schütteln für fünf Stunden
bei 150 rpm abgespült.
Die zurückbleibenden
Mikroglia (1,2 × 105
Zellen(cm2) waren zu 95 % rein, was durch
Immunzytochemie bestätigt
werden konnte.
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1.6 Isolierung von Maus-Mikrogliazellen
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Maus-Mikrogliazellen
wurden von primären
gemischten Hirngliazellkulturen durch Anwendung eines modifizierten,
bereits beschriebenen Verfahrens isoliert (siehe Magnus et al.,
J. Neuropatol. ex. Neurol. 2002, 61(9):760-766).
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1.7 Real-time PCR
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RNA-Extraktion
und cDNA-Synthese wurden mittels Standardverfahren durchgeführt. Die
quantitative Analyse der Gen-expression wurde mit QRT-PCR unter
Verwendung des ABI Prism 7000 Sequenzdetektionssystems (Applied
Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) wie zuvor beschrieben durchgeführt (siehe
Wiendl et al. Brain, 2003, 126:1026-1035). Dabei wurde die cDNA-Amplifikation
unter Verwendung der SYBRGreen-Chemie nachgewiesen. Die Zyklus parameter
betrugen zwei Minuten bei 50°C,
zehn Minuten bei 95°C,
sowie vierzig Zyklen mit jeweils fünfzehn Sekunden Denaturierung
bei 95°C
und eine Minute Annealing bei 60°C.
Die Daten wurden mit dem ABI PRISM® Detektionssystem
analysiert und unter Verwendung des ΔCT-Verfahrens
zur relativen Quantifizierung quantifiziert. Die Grenzwertzyklen
(CT) für
die 18S rRNA (Referenz) und MICA oder RAE-1 (Probe) wurden je zweimal
bestimmt. Ein Kalibrierungswert (100 %) wurde abgeschätzt und
die relative Veränderung
der Kopienzahl gemäß der Formel
rl = 2 – [(CTProbe – CT Referenz) – (CT Kalibrierungsprobe – CT Kalibrierungsreferenz)] berechnet. Die
folgenden spezifischen Primer wurden verwendet: 18S:5'-CGG CTA CCA CAT
CCA AGG AA-3' (SEQ
ID-Nr. 16), 5'-GCT GGA ATT ACC
GCG GCT-3' (SEQ ID-Nr.
17), MI-CA:5'-CCT TGG CCA TGA
ACG TCA GG-3' (SEQ
ID-Nr. 18), 5'-CCT
CTG AGG CCT CRC TGC G-3' (SEQ
ID-NR. 19), RAE-1δ:5'-TCC TAC CCC AGC
AGA TGA AG-3' (SEQ
ID-Nr. 20), 5'-CCA
CTT CAG TGG CAT TTG CTG-3' (SEQ ID-Nr. 21).
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1.8 Produktion von löslichem
Maus NKG2D-Rezeptor in Insektenzellen
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Der
rekombinante lösliche
Maus NKG2D-Rezeptor ohne die aminoterminale cytoplasmatische Region und
die Transmembrandomäne
wurde in Sf9 Insektenzellen (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)
unter Verwendung des BAC-to-BAC-Systems (Gibco Life Technologies,
Großbritannien)
hergestellt. Das Expressionskonstrukt (SEQ ID-Nr. 24) besitzt eine
amino-terminale FLAG/Hexahistidin-Markierungssequenz (siehe Steinle et
al., „Interactions
of human NKG2D with its ligands MICA, MICB and homologs of the mouse
RAE-1 Protein family",
Immungenetics 53:279-287, 2001). Die Sequenz des Maus NKG2D-Rezeptors
(full-length) ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll mit der SEQ
ID-Nr. 23 wiedergegeben.
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1.9 Mäuse
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Weibliche
C57BL/6-Mäuse
wurden von Charles River Labratories (Sulzfeld, Deutschland) käuflich erworben.
MICA-transgene C57BL/6-Mäuse
(freundlicherweise überlassen
von Dr. Spies, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle)
exprimieren MICA*07 cDNA unter Kontrolle eines MHC-Klasse I Promotors, nämlich des
MHC-Klasse I Gens Kb. Für die Experimente wurden Mäuse im Alter
von sechs bis acht Wochen eingesetzt.
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1.10 EAE Induktion und
Behandlung
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EAE
(experimentelle autoimmune Encephalomyelitis) wurde bei C57BL/6-Mäusen durch
subkutane Immunisierung mit 200 μg
MOG35-55Peptid in CFA (Sigma-Aldrich) induziert.
Ferner wurden intraperitoneal oder intravenös 200 ng Pertussistoxin (Calbiochem)
am Tag der Immunisierung und zwei Tage danach verabreicht. Körpergewicht
und klinische Einordnung („Clinical
Scores") (0 = gesund;
1 = schlaffer Schwanz; 2 = Ataxie und/oder Lähmung der Hintergliedmaßen; 3 =
Lähmung
der Hintergliedmaßen
und/oder Lähmung
der Vordergliedmaßen;
4 = Tetraparalyse; 5 = sterbend oder tot) wurden aufgezeichnet.
Die Versuche wurden gemäß den NIH
(National Institute of Health) Richtlinien „Guide for the Care and Use
of Laboratory Animals" durchgeführt. Bei
denjenigen Versuchen, bei welchen lösliche NKG2D-Rezeptoren (=
sNKG2D) eingesetzt wurden, um die NKG2D-Liganden-/NKG2D-Rezeptoren-Interaktion
zu blockieren, wurden die Tiere entweder mit löslichem Maus-NKG2D-Rezeptor
(intraperitoneal) oder mit PBS behandelt (i.p.). Am Tag der Immunisierung
oder am Tag zehn wurden jeweils 100 μg verabreicht und 50 μg jeweils
jeden zweiten Tag bis zehn Tage nach der Immunisierung oder am Tag
zwanzig.
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1.11 Splenozyten-Proliferations-Assay
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Aus
Milz gewonnene Zellsuspensionen (5 × 105-Zellen/Well)
wurden in 100 μl
RPMI 1640-Medium mit 10 % FCS (Biochrom KG), 2 mM L-Glutamin, 100
U/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco) und 50 μM 2-Mercaptoethanol (Gibco)
mit MOG35-55 in unterschiedlichen Konzentrationen
ausplattiert. Kontroll-Wells enthielten lediglich Respondersplenozyten
plus Medium. Alle Versuchsansätze
werden jeweils dreifach ausgemessen. Während des viertägigen Kulturzeitraums
wurden die Kulturen mit 1 μCi/Well
pulsiert [Methyl-3H]-Thymidin (Amersham). Die Zellen wurden
geerntet und die eingebaute Radioaktivität wurde anschließend in
einem „Wallac
1450 Microbeta plus" Flüssigszintillationszähler augezählt.
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1.12 Statistik
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Die
Signifikanzanalyse wurde unter Verwendung des zweiseitigen Students
t-Test durchgeführt,
wobei P < 0,05
als signifikant und P < 0,001
als hochsignifikant betrachtet wurde (Excel, Microsoft, USA). P-Werte wurden
mittels des Mantel log-rank Tests evaluiert (siehe Mantels "Evaluation of survival
data and two new rank order statistics arising in its consideration", Cancer Chemother.
Rep. 50163-170, 1966).
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2. Ergebnisse
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2.1 Expression von MICA
in MS-Läsionen
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Die
Expression von NKG2D-Liganden wurde in Gehirnproben von MS-Patienten und in
Kontroll-ZNS-Gewebe untersucht. Im ZNS-Gewebe der normalen grauen
oder weißen
Substanz von MS-Gewebeproben konnte keine Immunreaktivität für MICA/B
nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte eine starke MICA/B-Expression
in MS-Patientenproben
detektiert werden, die im Bereich von demyelinisierten ZNS-Läsionen mit
aktivierten, MHC Klasse II positiven Mikrogliazellen kolokalisiert
(1A). Diese Beobachtung konnte auf mRNA-Ebene bestätigt werden:
Hier zeigte sich eine starke Hochregulierung der MICA mRNA in Gewebeproben
entzündlicher
MS-Läsionen
im Vergleich zu Kontrollgewebe. Entsprechend zu den Beobachtungen
in vivo zeigten isolierte menschliche Mikrogliazellen, wie Dendritische
Zellen, ebenfalls eine Expression von MICA mRNA in vitro (1B).
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2.2 Expression von NKG2D-Liganden
und NKG2D-Rezeptoren im Maus EAE-Modell
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Nach
dem Nachweis einer starken NKG2D-Ligandenexpression in MS-Gehirnproben wurde
die pathogene Bedeutung der Expression dieser Proteine bei einer
entzündlichen
ZNS-Demyelinisierung im Tiermodell anhand der MOG-induzierten EAE
untersucht. Hierzu wurde die Expression des Maus-NKG2D-Liganden RAE-1
und des NKG2D-Rezeptors im Verlauf der EAE im ZNS untersucht. Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 2 gezeigt.
Ein Immunblot von Proteinen aus Gehirnen von Mäusen mit EAE zeigt, dass die
die Expression von RAE-1 und NKG2D im Verlauf der EAE deutlich ansteigt,
während
die Expression des Kontrollproteins (β-Aktin) unverändert bleibt
(2A). Dies deutet darauf hin, dass im Verlauf der
EAE Mikrogliazellen aktiviert wurden und NKG2D-positive Lymphozyten
in das Gehirn eingewandert sind. Diese Ergebnisse konnten auch auf
der mRNA-Ebene bestätigt
werden. Auch die relative Expression der RAE-1δ mRNA ist in Gehirngewebe von
Mäusen
mit EAE (an Tag 20 nach der Induktion) um ein Vielfaches höher als
in normalen Kontroll-Gehirngewebe (2B). In
isolierten Maus-Mikrogliazellen, nicht jedoch auf Astrozyten, konnten
ebenfalls erhöhte
RAE-1δ Transkriptmengen
nachgewiesen werden (2B).
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2.3 MICA-transgene Tiere
sind weniger empfänglich
für MOG-induzierte EAE.
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Für die Untersuchung
der Bedeutung der NKG2D-Rezeptor/NKG2DL-Liganden-Interaktion bei der entzündlichen
ZNS Demyelinisierung wurde der Krankheitsverlauf von MOG-induzierter
EAE in MICA-transgenen
C57BL/6-Mäusen
untersucht. Diese Mäuse
exprimieren eine MICA*07 cDNA konstitutiv unter Kontrolle eines
MHC Klasse I Promotors (H-2Kb) und weisen
hohe Konzentrationen an löslichem
MICA im Serum auf (45-90 ng/ml). Aufgrund dessen ist bei diesen
transgenen Mäusen
die NKG2D Expression deutlich vermindert, vermutlich durch eine
Liganden-induzierte Herabregulation, und NKG2D-vermittelte NKG2D-Effektorfunktionen
sind stark beeinträchtigt.
Im Vergleich zu nicht-transgenen Mäusen wurde bei den MICA-transgenen
Mäusen
eine bedeutende Verzögerung
des Ausbruchs der Krankheitssymptome beobachtet (3A).
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2.4 Blockierung von NKG2D-Liganden
mit löslichem
NKG2D-Rezeptor schützt Tiere
vor MOG-induzierter EAE.
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Um
zu untersuchen, ob eine Blockierung der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion
den Verlauf der EAE beeinflussen kann, wurde den Mäusen lösliches
NKG2D (sNKG2D) (wie unter 1.8 sowie 1.10 beschrieben) verabreicht,
um die Interaktion der Liganden mit dem Rezeptor in unterschiedlichen
Phasen der EAE zu unterbrechen. Hierzu wurde sNKG2D an den Tagen
null bis zehn (Frühphase)
verabreicht. Es konnte beobachtet werden, dass bei einer sNKG2D-Behandlung
während
der Frühphase
EAE deutlich später
ausbrach (3B). Es erkrankten auch nur
fünf der
sechs Mäuse
in der sNKG2D-behandelten Gruppe. Darüber hinaus war die MOG-Peptid-spezifische
T-Zellproliferation von Milzzellen aus Mäusen mit sNKG2D-Behandlung
im Vergleich zu Milzzellen von Kontroll-behandelten Mäusen signifikant
reduziert ( 3C).
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Als
nächstes
wurde der EAE-Verlauf bei einer Verabreichung von sNKG2D in der
Spätphase
(Tag 10 bis 20) untersucht. Hierbei ergab sich keine Verbesserung
im Krankheitsverlauf im Vergleich zu Kontroll-behandelten Tieren
(3D). Entsprechend war die MOG-Peptid-spezifische
T-Zell-Proliferation auch nicht durch die Verabreichung von löslichem
NKG2D-Rezeptor beeinflusst (3E).
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Insgesamt
entwickelten alle Tiere, die mit dem Peptid MOG-35-55 immunisiert
wurden, starke EAE-Symptome, jedoch hatte eine frühe Behandlung
mit löslichem
NKG2D-Rezeptor einen stark positiven Effekt, da hierdurch der Krankheitsausbruch
deutlich verzögert
werden konnte.
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