CN108700566A - 免疫原性调节的方法 - Google Patents

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Abstract

将肿瘤活检的肿瘤免疫原性增加的离体测定用作确定患者肿瘤免疫治疗的指导。最优选地，离体测试将包括将活检样品暴露于应激条件以产生预处理肿瘤细胞，然后用免疫感受态细胞分析增加的活化或活性。测试条件包括将活检样品暴露于免疫刺激组合物、针对新表位的抗体和/或经修饰的细胞，并且免疫原性的增加优选通过将它们暴露于T细胞和/或NK细胞来确定。

Description

免疫原性调节的方法
本申请要求于2016年2月19日提交的美国临时申请序列号62/297,751的优先权。
技术领域
本发明的领域是用于离体治疗癌症以确定增加体内癌症免疫原性的患者治疗选择的组合物和方法。
背景技术
背景技术描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。如果并入的参考文献中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反，则本文提供的该术语的定义适用，并且参考文献中该术语的定义不适用。
基于来自病变组织的基因组学或蛋白质组学见解的个性化医疗已成为癌症治疗中越来越有前途的工具。然而，尽管可以从相对少量的病变组织获得大量信息，但治疗通常限于相对少量的具有充分表征靶标的实验或批准药物。例如，用靶向突变形式的HER2的抗体(曲妥珠单抗)治疗乳腺癌可以改善肿瘤过表达HER2蛋白的结果。同样，在癌症生长由包含激酶的途径驱动的情况下，可以使用靶向这种激酶的激酶抑制剂而使治疗有效(例如，使用阿法替尼、厄洛替尼等抑制EGFR，或使用博舒替尼、伊马替尼等抑制Bcr-Abl)。然而，在许多情况下，癌症会对特定药物产生抗药性，并且常恢复生长。
可选地或另外地，癌症治疗还可以包括免疫疗法以使用免疫***的一种或多种组分来帮助清除异常细胞。例如，免疫疗法可以涉及细胞因子和/或免疫检查点抑制剂以刺激免疫应答，而在另一个示例中，细胞或经修饰的细胞用作治疗剂。在又另一个示例中，已报道了癌症疫苗在某些疾病中至少部分有效。不幸的是，基于免疫的癌症治疗通常是高度不可预测的，因为在大多数情况下，疗效取决于患者免疫***所呈现和/或可用的特定表位，以及患者免疫***的健康(其通常已经受到先前化疗治疗的损害)。此外，许多肿瘤也表现出强烈的免疫逃避，免疫疗法必须解释这些普遍不太被理解的机制。
一些人试图通过鉴定患者特异性新表位并在免疫疗法中使用它们来解决该问题。例如，WO2016/172722公开了癌症新表位和使用新表位产生用于免疫疗法的合成抗体的方法。在另一个示例中，US2016/0326597公开了患者癌症样品中新表位的用途，其中一些新表位对某些MHC复合物具有比其它新表位更强的结合亲和力。通过鉴定具有更强结合亲和力的新表位，这些新表位可用于鉴定可能通过施用免疫检查点调节剂对治疗有反应的个体。其他人试图开发靶向肿瘤抗原的个体表达模式的患者特异性肿瘤治疗(参见例如WO2014/082729)，用于刺激、引发和/或扩增针对表达抗原的细胞的T细胞。
还有一些人试图通过确定个体患者对癌症治疗，特别是免疫治疗的敏感性来解决免疫应答不一致的问题。例如，WO2011/131246公开了通过评估应激反应标志物或巨自噬反应标志物的表达来确定肿瘤对癌症治疗敏感性性的离体方法。
然而，没有人考虑到癌细胞上的新表位和其它标志物的表达可能根据给予癌细胞的应激条件而变化，因此不能识别它们在患者间的变异。因此，即使本领域已知有许多癌症治疗选择，但它们中的全部或几乎全部都有一些缺点。因此，仍然需要改进的癌症治疗***和方法。
发明内容
本发明的主题涉及通过特定治疗增加肿瘤的免疫原性并且单独使用这些治疗或与免疫刺激组合使用以消除肿瘤和形成针对肿瘤的免疫记忆的多种***、组合物和方法。
在本发明主题的一方面，发明人考虑了一种确定患者治疗选择的方法，其包括将患者的多个肿瘤活检样本离体暴露于单独的且不同的多个应激条件以产生各自预处理肿瘤细胞的步骤。在另一步骤中，然后使预处理肿瘤细胞与多个免疫感受态细胞接触，并量化免疫感受态细胞对预处理肿瘤细胞的应答。在又一步骤中，当应答满足或超过预定阈值时，选择应激条件作为治疗选择。
在其它可能性中，合适的应激条件包括低剂量化疗(例如节律低剂量)，暴露于低剂量辐射，热休克处理，缺氧，高氧，暴露于慢性炎症条件，暴露于活性氧物质，暴露于天然或经修饰的免疫T-或NK细胞，暴露于抗体和/或环境应激条件(例如DNA损伤剂、HSP90抑制剂、GSK3抑制剂、病毒感染)。
应激条件可能导致在应激细胞上表达的多种标志物，包括NKG2D配体的过表达(相对于不暴露于应激条件的相同细胞)，检查点抑制剂配体的表达，新表位的表达，或可能导致信号途径的激活或失活(例如凋亡途径、细胞***途径)等。
此外，考虑了多个活检样品可以暴露于免疫刺激剂，并且特别考虑的免疫刺激剂包括细胞因子(例如IL-15、IL-15超级激动剂、IL-2、IL-7、IL-21)，TLR配体(例如PAMP、DAMP)和/或检查点抑制剂。
如果需要，还考虑了合适的方法可以包括确定活检样品上的一个或多个新表位，以针对它产生抗体或其它结合分子的步骤。另外，可以产生含有编码一个或多个新表位的重组核酸的病毒载体或重组病毒，特别优选免疫感受态细胞将用病毒载体或重组病毒转化。此外，在预处理肿瘤细胞与免疫感受态细胞接触后，针对预处理肿瘤细胞可以确定一个或多个进一步的新表位。最典型地，免疫感受态细胞是T细胞和/或NK细胞(特别是NK92细胞或基因工程NK细胞，例如aNK细胞、haNK细胞或taNK细胞)。
关于量化免疫感受态细胞的应答的步骤，特别考虑了显微测定、发光测定、荧光测定和放射测定中的一种或多种。因此，预定阈值可以是预定的肿瘤细胞的预定裂解或凋亡速率，但也可以是比色或荧光信号。
从以下优选实施方式的详细描述以及附图中，本发明主题的各方面的目的、特征、方面和优点将变得更加明显，附图中相同的数字表示相同的部件。
附图说明
图1展示了通过使用多种应激条件探询癌细胞的免疫原性从而确定患者治疗的示例性方法。
具体实施方式
本发明的主题提供了确定患者的治疗选择的***和方法，特别是通过特定治疗鉴定增加肿瘤免疫原性的病症，并单独或与免疫刺激组合使用这些治疗。
虽然本发明的主题易于进行各种修改和替换实施方式，但某些说明实施方式在附图中示出并且将在下面详细描述。然而，应该理解，并不意图将本发明限制于所公开的特定形式，相反，本发明将覆盖落入权利要求范围内的所有修改、替代实施方式和等同物。以下讨论提供了本发明主题的许多示例。尽管每个实施方式代表发明要素的单个组合，但是本发明的主题被认为包括所公开要素的所有可能组合。因此，如果一个实施方式包括要素A、B和C，并且第二实施方式包括要素B和D，即使没有明确地披露，本发明的主题也被认为包括A、B、C或D的其它剩余组合。
本发明人现在已经发现，通过使用先前在使用肿瘤活检的一系列离体治疗中鉴定的干预使肿瘤更具免疫原性，可以更有效地治疗患者中的肿瘤。如本文所用，术语“免疫原性”是指产生或促进免疫应答的细胞的特征，或导致在体外、离体或体内与免疫原性细胞接触的免疫细胞的活化的特征。因此，在本发明主题的一方面，发明人考虑了通过诱导肿瘤或癌细胞变得更具免疫原性来确定患者的治疗选择的方法。图1显示了考虑方法的一个示例性说明。其中一个步骤包括将来自患者肿瘤的多个活检样品离体暴露于单独的且不同的多个应激条件。
在一个优选的实施方式中，将来自患者肿瘤活检的活组织分成多个样品，使得每个样品可以暴露于不同类型/条件的应激条件下。例如，肿瘤活检取自诊断患有小细胞肺癌的患者，并且活检被分成多个样本(例如至少2个、至少4个、至少10个、至少20个或至少50个等)。当然，应该理解的是，活检不必限于实体瘤，但是循环肿瘤细胞以及血源性癌症(例如各种淋巴瘤，如CML、AML、ALL等)也被明确认为适用于本文。
如本文所用，不同的应激条件是可以独立地和分开地在肿瘤细胞中诱导的应激条件(例如通过在不同时间点进行的处理，通过使用不同化学品的处理等)。例如，在一些实施方式中，应激条件可以由单一的应激原因(例如仅加热、仅单一化学品等)引起。在其它实施方式中，应激条件可以由多个应激原因引起。例如，可以通过一个应激原因A和另一个应激原因B的同时处理来诱导应激条件。对于另一个示例，可以通过一个应激原因A和另一个应激原因B的依次处理来诱导的应激条件。还考虑了一个应激原因A的多次治疗(例如热休克1分钟，共3次，其中时间间隔为1分钟)和一个应激原因A的单次治疗(例如单次热休克1分钟或3分钟)是两种不同的不同应激条件。
在进一步考虑的示例中，应激条件可以包括节律低剂量化学疗法。最典型地，低剂量治疗将是等于或小于70％，等于或小于50％，等于或小于40％，等于或小于30％，等于或小于20％，等于或小于10％，或等于或小于5％的化学治疗剂的LD50或IC50的暴露。另外，在有利的情况下，这种低剂量方案可以以节律方式进行，例如US7758891、US7771751、US7780984、US7981445和US8034375中所述的。关于这种低剂量方案中使用的特定药物，考虑了所有化学治疗剂都被认为是合适的。在其它合适的药物中，激酶抑制剂、受体激动剂和拮抗剂、抗代谢、细胞抑制和细胞毒性药物都在本文中考虑。然而，特别优选的药剂包括确定为干扰或抑制驱动肿瘤生长或发展的途径中组件的那些药剂。可以使用例如WO2011/139345和WO2013/062505中描述的组学数据的途径分析来鉴定这种药物。
在一些实施方式中，考虑的应激条件还可以包括一种或多种环境应激条件。例如，来自活检样品的一部分癌细胞可以暴露于辐射，优选低剂量辐射。在该示例中，癌细胞可以经受各种剂量的辐射，并且通常的剂量将在0.01-0.1Gy、0.1-1Gy、1-10Gy、10-100Gy的范围内，并且在一些情况下甚至更高。辐射可以来自各种来源，并且可以采用γ辐射、α粒子曝光和/或β发射器。然而，通常优选γ辐射或X射线曝光。最典型地，并且在使用辐射作为应激条件的情况下，额外的化学治疗剂将包括干扰双链DNA修复和同源链交换修复的药物。
对于另一个示例，环境应激条件可以包括将癌细胞暴露于高温(例如通常至少40℃、至少42℃、至少45℃或至少47℃)不同时间范围(例如10秒、1分钟、5分钟、10分钟等)，并且在需要时，在每次暴露于环境应激条件之间具有多种间隔(例如单次曝光、1分钟间隔的多次暴露、具有不同时间间隔的多次暴露等)。
对于又一个示例，环境应激条件可以包括剥夺氧以模拟肿瘤缺氧。这里，至少一部分癌细胞可以维持缺氧(例如小于15％、小于10％、小于5％、小于3％、小于1％O2)预定时间(例如至少1小时、至少24小时、至少3天、至少1周、至少3周等)。同样地，考虑了可以包括高氧条件。例如，至少一部分癌细胞可以在高氧条件下(例如超过22％、超过25％、超过30％、超过35％O2)维持给定时间(例如至少1小时、至少24小时、至少3天、至少1周、至少3周等)。
在一些实施方式中，环境应激条件可以包括通过施用生理量的炎症相关试剂来模拟慢性炎症。在这些实施方式中，炎症相关试剂可以包括参与肿瘤发展的细胞因子，包括肿瘤坏死因子(TNF-α)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素10(IL-10)，转化生长因子(TGF-β)。另外地或可替代地，环境应激条件还可以包括将癌细胞暴露于慢性氧化应激和/或暴露于自由基。例如，活检样品可以暴露于低剂量的以外源性过氧化氢(H2O2)作为活性氧物质(ROS)来源(例如在10μM-20μM、20μM至30μM、30μM至40μM之间等)用于急性期(例如12小时、24小时、48小时、7天等)或高剂量(例如100μM-200μM、200μM至300μM、300μM至400μM)等)用于慢性期(例如1个月、3个月、6个月等)。
在又一个示例中，环境应激条件可以包括将癌细胞暴露于一种或多种化学品或条件，包括各种DNA损伤剂(例如DNA嵌合剂、甲基化剂、链断裂剂、UV辐射诱导调光剂等)，可诱导内质网(ER)应激诱导的细胞凋亡的肽或试剂(例如热休克蛋白(HSP)90抑制剂、糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂、蛋白质N-糖基化抑制剂(例如衣霉素等)，蛋白质转运阻断剂(例如布雷菲德菌素A等)，ER的钙摄取抑制剂(例如毒胡萝卜素等))。
在一些实施方式中，环境应激条件可以包括将癌细胞暴露于与各种类型的癌症相关的一种或多种类型的病毒。例如，这些病毒包括人***瘤病毒(HPV)，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，人疱疹病毒8(HHV-8)，人T淋巴细胞病毒-1(HTLV-1)，Merkel细胞多瘤病毒(MCV)和/或猿猴病毒40(SV40)。容易理解的是，感染剂量和暴露时间可以根据病毒的休眠和活性、癌细胞的类型和其它个体患者的状况而变化。
考虑了上文讨论的应激条件的条件(例如持续时间、频率、时间、剂量、浓度等)对于直接或间接诱导肿瘤细胞产生预处理肿瘤细胞是有效的。如本文所用，预处理肿瘤细胞是表达至少一种与在用应激条件处理之前的肿瘤细胞不同特征的肿瘤细胞。例如，在一些实施方式中，应激条件有效影响蛋白质表达、细胞周期和/或对细胞凋亡的敏感性。例如，预处理肿瘤细胞可以改变一种或多种细胞蛋白的表达水平(例如细胞表面受体蛋白、核受体蛋白、分泌蛋白，包括与损伤相关的分子模式(DAMPS)、干扰素和细胞因子相关的蛋白等)和/或核苷酸(例如mRNA、微小RNA等)。对于另一个示例，预处理肿瘤细胞可以改变它们的形态或与环境的相互作用(例如细胞形状、与其它细胞或细胞外基质的粘附水平等)。对于另一个示例，预处理肿瘤细胞改变细胞蛋白质的活性，特别是与信号传导和细胞周期有关的蛋白质(例如激酶、磷酸酶、热休克蛋白、糖基化酶等)。
尽管不希望受任何特定理论或假设的约束，但发明人还考虑了来自暴露于应激条件的活检样品的预处理肿瘤细胞的至少一部分(例如至少20％、优选至少40％、更优选至少60％)将暴露或呈递一个或多个抗原表位或其它信号，其量足以触发NK细胞和/或T细胞(CD4+和/或CD8+)活化。在一个优选的实施方式中，相对于来自相同活检样品但不暴露于相同的应激条件的肿瘤细胞，来自活检样品的预处理的癌细胞的至少一部分(例如至少20％、优选至少40％、更优选至少60％)显示出应激标志物更高的表达水平(例如至少20％、至少高30％、至少高50％等)或更高的细胞表面表达水平，特别是NKG2D配体(例如MICA、MICB、RAET1E/ULBP4、RAET1G/ULBP5、RAET1H/ULBP2，RAET1/ULBP1、RAET1L/ULBP6、RAET1N/ULBP3等)。同样地，来自活检样品的预处理的癌细胞的至少一部分也可以响应于应激条件在其表面上表达和/或呈递一个或多个新表位。
不管应激条件的具体类型如何，一般考虑应选择能够避免细胞立即死亡的应急条件和向癌细胞提供应急条件的条件。在优选实施方式中，可以基于预定阈值确定提供应激条件的最佳或期望条件。例如，预定阈值可以是预处理肿瘤细胞的预定裂解或凋亡速率。因此，通常调节条件以使细胞杀伤作用小于的50％，更通常小于30％，甚至更通常小于10％，最典型地小于5％的组织中所有细胞。因此，如此预处理肿瘤细胞在处理后是活的(但可能具有降低的增殖速率)并且最优选地表现出显著改变的基因表达谱(其可以在随后的组学分析中建立，特别是通过转录组学和/或蛋白质组学分析)。取决于应激条件的特定类型和严重性，预处理可以在几秒到几天内进行。在适当的情况下，可以使预处理的细胞在与免疫感受态细胞接触之前恢复数小时至数天。
在一个特别优选的实施方式中，然后将预处理的癌细胞暴露于免疫感受态细胞或与其接触。如本文所用，术语“免疫感受态细胞”包括参与免疫应答的产生、繁殖或维持的任何细胞，因此特别包括有助于固有性和/或适应性免疫的细胞。因此，特别考虑的免疫感受态细胞包括抗原呈递细胞，特别是树突细胞、T细胞、NK细胞等。在特别优选的方面，免疫感受态细胞包括NK92细胞、被修饰为具有组成性活性的或对新表位具有特异性的同种异体NK92细胞、或者基因工程NK细胞(例如aNK细胞、haNK细胞或taNK细胞)。可选地，免疫感受态细胞还包括CD4+和/或CD8+T细胞，其可以对患者是幼稚的或同种异体的(任选地被修饰为组成性活性的或对新表位具有特异性，例如通过嵌合T细胞/抗原受体)。在进一步的实施方式中，免疫感受态细胞也可以是细胞的混合物，特别是来自获得活检的患者的免疫感受态细胞。例如，这种混合物可以是未纯化的(例如全血)，部分纯化的(例如血沉棕黄层)，或分离的细胞类型(例如树突细胞或巨噬细胞或T细胞)。
通常，当使用的免疫感受态细胞是NK细胞时，处理的肿瘤细胞与NK细胞的比例在10,000：1至1：10,000之间，更通常在1,000：1至1：1,000之间，并且最通常在10：1到1：10之间。存在许多适用于本文的NK细胞，并且特别考虑的NK细胞包括如NantKwest，Inc.(9920Jefferson Blvd.，Culver City，CA 90232；参见http://nantkwest.com/platform/)所述的aNK细胞、haNK细胞和taNK细胞。在细胞经遗传修饰以具有对表位的亲和力的情况下，特别优选这些表位为可能引起强免疫应答的新表位(即HLA匹配的患者和肿瘤特异性新表位)。
在进一步考虑的方面，应当注意，来自活检样品的至少一些已经接受应激条件的癌细胞可以有效地激活或增加免疫感受态细胞的应答。在一些实施方式中，免疫感受态细胞和/或应激细胞的应答可以通过免疫毒性测试来评估。例如，在免疫感受态细胞是NK细胞的情况下，可以使用显微分析(例如检测形状损失的变形)、发光分析(例如检测发光剂的泄漏)、荧光分析(例如检测裂解剂的转运或递送)或放射分析(例如检测同位素的泄漏)来评估NK细胞的杀伤作用。从不同的角度来看，NK或其它免疫感受态细胞的杀伤作用可作为所述预处理肿瘤细胞的免疫原性的量度。以相同的方式，预期增加的免疫原性也可以通过肿瘤细胞的物理参数的变化(例如大小、密度、形状变化或对基质的粘附的增加或减少)来证明。检测免疫感受态细胞杀伤力的任何适当的方法均被考虑。例如，所述处理的细胞的免疫原性可以通过使用(51)Cr释放分析来确定针对靶肿瘤细胞的细胞溶解活性，或通过使用流式细胞术测定确定穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素的胞内水平来确定(参见例如Methods MolBiol.2010；598:207-19；Scand J Immunol.2012年4月；75(4)：455-62；或AceaBiosciences Inc.的xCELLigence System)。
在其它实施方式中，免疫感受态细胞的应答包括细胞表面受体蛋白的相对表达水平。例如，NK细胞活化由抑制性(例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、LIR(白细胞抑制性受体)、Ly49的抑制性同种型)和活化性受体(NCR(天然细胞毒性受体)，CD94：NKG2异二聚体，CD16(FcγIIIA)，Ly49的活化同种型等)刺激的平衡决定。因此，在这些实施方式中，蛋白表达的差异性和相对性可以通过任何合适的方法量化以检测蛋白的表达和/或定位，例如通过FACS分析、显微镜分析、发光分析、荧光分析、放射分析、蛋白印迹等。
考虑了免疫感受态细胞的更强响应(例如更高的细胞因子和/或趋化因子释放，一些细胞表面受体蛋白的更高表达水平，更强的细胞溶解活性等)可能反映出预处理癌细胞更高的免疫原性。在一些实施方式中，可以统计性地评估免疫感受态细胞应答的量化，以确定与其它应激条件相比哪种应激条件更有效地诱导应答。当使用更有效的应激条件来引发免疫细胞应答，并用免疫感受态细胞治疗患者时，这种免疫感受态细胞可能更高效率和有效地引发体内针对癌细胞的免疫应答。因此，应当理解，上述分析中的免疫细胞(例如NK细胞等)应答可以用作可能的治疗成功的预测指标。
还考虑了并非所有提供给癌细胞的应激条件都可能引发与接触癌细胞的免疫感受态细胞相同的免疫应答。换句话说，癌细胞的免疫原性可以根据应激条件而变化。某些应激条件的有效性可能因癌症类型而异。例如，应激条件A可以有效诱导非小细胞肺癌的癌细胞的免疫原性，但可能不能有效诱导大细胞神经内分泌肿瘤癌细胞的免疫原性。即使癌症类型相同，一些应激条件的有效性仍可能因患者病情而异。对于另一个示例，应激条件A可以有效诱导患者X乳腺癌癌细胞的免疫原性，应激条件B可能无法有效诱导患者Y乳腺癌癌细胞的免疫原性。因此，应当理解，该方法可用于鉴定有效的治疗方法，为个体化免疫治疗提供平台，使患者的特异性免疫***对患者特异性肿瘤的应答最大化。
虽然提供应激条件可以有效引发暴露于应激条件的癌细胞的免疫原性，但是考虑了应急条件联合免疫刺激剂的共同治疗或共同施用可以进一步增强癌细胞的免疫原性。任何可增加或调节癌细胞免疫原性的合适类型的免疫刺激剂均考虑。例如，免疫刺激剂可以包括刺激性细胞因子(例如白细胞介素(IL)-15、IL-15超级激动剂、IL-2、IL-7、IL-21等)，和一种或多种Toll样受体(TLR)配体(例如纤维蛋白原、硫酸乙酰肝素片段、透明质酸片段、HSP70等)。在一些实施方式中，免疫刺激剂还可以包括一种或多种促进免疫***攻击癌细胞的检查点抑制剂(例如伊匹单抗派姆单抗和纳武单抗)。
在一些实施方式中，可提供两种或更多种不同的免疫刺激剂与应激条件联合。在这些实施方式中，两种或更多种不同的免疫刺激剂之间的比例可以根据癌症的类型和阶段以及患者的特征(例如年龄、性别、健康状况等)、应激条件的类型、以及和免疫刺激剂共同治疗的时机而变化。例如，免疫刺激剂可与应急条件同时用于治疗、在应激条件处理后用于治疗(例如在应激条件完成一分钟后、一小时后、一天后等)。在更进一步的实施方式中，免疫刺激剂可在使活检经受应激条件之前施用(例如在应激条件开始前一分钟、前一小时、前一天等)。
考虑了癌细胞的免疫原性可以与癌细胞中至少一些新表位的表达紧密相关。因此，新表位可以用于产生抗体，然后该抗体用于靶向经处理的活检细胞，和/或可以用于产生包含编码多个新表位中至少一个的重组核酸的病毒载体(然后可以将活检样品或预处理的细胞暴露于病毒载体)。
因此，通过鉴定肿瘤细胞中呈递的新表位也可增强肿瘤活检的离体治疗以确定最有效的治疗。新表位可以表征为在肿瘤细胞中表达的随机突变，其产生独特的和肿瘤特异性抗原。因此，从不同的角度来看，可以通过考虑突变的类型(例如删除、***、颠换、转变、易位)和突变的影响(例如无意义、错义、框架移位等)来识别新表位，其可作为第一内容过滤器，通过它消除沉默和其它非相关(例如非表达)突变。还应当理解，新表位序列可以定义为具有相对短长度(例如7-11个聚体)的序列段，其中这些段将包括氨基酸序列中的改变。最典型地，改变的氨基酸将位于或靠近中心氨基酸位置处。例如，典型的新表位可具有A4-N-A4、或A3-N-A5、或A2-N-A7、或A5-N-A3、或A7-N-A2的结构，其中A是蛋白原性的氨基酸且N是改变的氨基酸(相对于野生型或相对于匹配正常)。例如，本文考虑的新表位序列包括具有相对短长度(例如5-30个聚体、更典型地7-11个聚体、或12-25个聚体)的序列段，其中这些段包括氨基酸序列中的改变。
因此，应当理解，根据改变的氨基酸的位置，可以在包括改变的氨基酸的许多新表位序列中呈现单个氨基酸改变。有利地，这种序列可变性允许多个新表位的选择，因此增加了潜在有用靶标的数量，然后可以基于一种或多种期望的性状(例如对患者HLA型的最高亲和力、最高结构稳定性等)进行选择。最典型地，新表位的长度被计算为2-50个氨基酸，更典型地为5-30个氨基酸，最典型地为9-15个氨基酸，改变的氨基酸优选位于中心或以改善其与主要组织相容性复合物(MHC)结合的方式定位。例如，当表位由MHC-I复合物呈递时，典型的新表位长度将为约8-11个氨基酸，而通过MHC-II复合物呈递的典型新表位长度具有约13-17个氨基酸长度。容易理解的，由于新表位中改变的氨基酸的位置可能不在中心，因此新表位的实际肽序列和实际拓扑结构可能会显著变异。
优选地，当癌细胞暴露于一种或多种应激条件时，新表位显示出从头表达或增强的表达。因此，可以通过多种组学分析鉴定表达或显示出增强表达的新表位，包括核酸测序，特别是操作于DNA上的NGS方法(例如Illumina测序、离子流测序、焦磷酸测序、纳米孔测序等)、RNA测序(例如RNAseq、基于逆转录的测序等)、以及蛋白质测序或基于质谱的测序(例如SRM、MRM、CRM等)。在国际专利申请号PCT/US16/65412中详细描述了DNA测序、RNA测序、蛋白质测序以及对这些测序结果的计算分析的更详细的方法，该专利申请以其整体并入本文。
考虑了在暴露于有效应激条件后显示出增强的免疫原性的许多癌细胞可以表现出新表位的不同表达。例如，癌细胞在暴露于有效应激条件后可以表达不同类型的新表位。对于另一个示例，癌细胞可以以不同的比例表达多个新表位。对于又另一个示例，癌细胞可以表达多个新表位，并且这些多个新表位表现出不同的半衰期或细胞表面稳定性(例如由于向细胞表面的运输，内吞作用等)。因此，进一步考虑了合适的方法将包括进一步的步骤，即在暴露于应激条件和/或免疫刺激剂之前确定活检样品的新表位的类型和/或表达，以及在使预处理肿瘤细胞与多个免疫感受态细胞接触的步骤之后，确定预处理肿瘤细胞的新表位的类型和/或表达。
此外，还考虑了一些新表位在患者的癌细胞和非癌细胞之间是常见的。在这种情况下，靶向那些表位的治疗方法可能诱导自身免疫症状，这是不希望的。因此，该方法优选地包括确定活检样品癌细胞中的新表位的类型/表达，以及确定同一患者(或甚至来自相同的活检样品)的非癌细胞的新表位的类型/表达，并比较所述表位表达的步骤。例如，肿瘤活检的一部分和患者的相应正常样品(同一患者的非肿瘤样品，例如外周血单核细胞(PBMC)样品)也进行组学分析。在特别优选的方面，组学分析包括全基因组测序、外显子组测序、RNA测序(优选用转录水平测定量化)和/或蛋白质组学分析(来自核酸的预测，更优选来自组织切片或***固定和石蜡嵌入(FFPE)样品的分析)。
然后使用所得的组学分析来鉴定肿瘤新表位，其进一步分析转录水平(即是否转录和到达何种程度)和与HLA型患者的HLA匹配。用于鉴定和使用新表位的合适方法在我们于2016年10月12日提交的共同未决的美国申请号15/292021中公开，并且基于组学数据的HLA预测在我们于2016年8月25日提交的共同未决的国际专利申请PCT/US16/48768中描述。然后可以将新表位用于癌症疫苗从而用于治疗，如于2016年12月7日提交的共同未决的国际专利申请PCT/US16/65412中所述的。所有这些参考文献都以其整体并入本文。
一旦鉴定出可能有助于或甚至引起癌细胞的免疫原性的一个或多个新表位，还考虑了所述新表位能够在癌细胞中过表达以进一步增强癌细胞的免疫原性。例如，在提供一种或多种应激条件时，新表位A在癌细胞中特异地和高度地上调/表达。在这种情况下，可以将新表位A的全部或片段克隆到病毒载体或用于哺乳动物转染的载体中(例如用诸如荧光素或抗生素抗性的标志物)，并递送到免疫感受态细胞中，特别是树突状细胞，以帮助产生免疫反应。额外地或可选地，可进行途径分析以鉴定将导致新表位A过表达的一种或多种交替的非应激条件。在其它合适的途径分析工具中，PARADIGM是特别优选的(参见例如WO2011/139345或WO2013/062505)。
另外，经鉴定的新表位中的至少一些也可用于产生针对那些新表位的一种或多种抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体)。然后，经处理的细胞可以进一步暴露于针对那些新表位的抗体。在其它益处中，考虑了添加这些抗体将有效增加组织活检(和患者)中的ADCC。
尽管增强的肿瘤细胞免疫原性可有益于增强免疫细胞应答，但免疫原性不应显著影响非肿瘤细胞。因此，关于肿瘤细胞的最佳合适治疗以优化免疫原性，考虑了高于对照的任何治疗是合适的，并且更通常高于对照至少20％，或至少40％，或至少60％。最优选地，这种治疗对组织中的非肿瘤细胞的细胞毒性也较低，并且本领域普通技术人员将能够容易地确定使免疫原性最大化和细胞毒性最小化的最佳治疗。例如，免疫原性的合适结果包括预处理肿瘤细胞的裂解或凋亡以及缺乏非肿瘤细胞的裂解或凋亡。
一旦确定出合适的治疗，可以使用这些药剂和方案治疗患者，以增加产生急性(并且优选持久的)免疫应答的可能性。此外，应当理解，可以用将递送重组核酸的免疫***毒组合物进一步增强患者的治疗，所述重组核酸包括编码如上所述的新表位(和任选的其它分子，包括共刺激分子和检查点抑制剂)的基因。为了进一步增加免疫应答，可以采取随后的肿瘤活检来调整或修改治疗策略以增加免疫原性，遵循本文所述的基本原理。在该上下文中，应当理解，额外的组学信息可提供对(新)表位的见解，所述(新)表位对于引发治疗有效的免疫应答是关键的。实际上，发明人考虑了多种这样的治疗鉴定，且治疗将导致表位扩散或抗原级联，其可有利地针对肿瘤表位和新表位“撒开更宽的网”。最后，考虑了使用检查点抑制剂，这些抑制剂可以局部施用于肿瘤，以减少不受控制的(自身)免疫应答的潜在问题。
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明某些实施方式的表述数量或范围的数字应理解为在某些情况下通过术语“约”进行修饰。因此，在一些实施方式中，数值参数在书面说明书和所附权利要求书中列出的近似值可以根据特定实施方式试图获得的所需性质而变化。在一些实施方式中，数值参数应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施方式中列出的数值尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能包含必然由其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。除非上下文指示相反，否则本文所述的所有范围应解释为包括其端点，并且开放式范围应解释为仅包括商业实用值。同样，除非上下文指出相反的情况，否则应将所有值列表视为包含中间值。
如本文的描述和随后的权利要求中所使用的，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数指代，除非上下文另有明确说明。此外，如在本文的描述中所使用的，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，除非上下文另有明确规定。
除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。关于本文的某些实施方式提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
本文公开的本发明的替代要素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与该组中的其它成员或本文中找到的其它元素任意组合地提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，可以将一个或多个组成员包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，本文的说明书被认为包含经修改的组，因此实现了所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了所附权利要求的范围之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的最广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他的方式指代要素、组件或步骤，指示所引用的要素、组件或步骤可以存在，或被利用，或与未明确引用的其它元素、组件或步骤组合。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种确定对患者的治疗选择的方法，其包括：
将所述患者的多个肿瘤活检样本离体暴露于相应且不同的多个应激条件以产生相应的预处理肿瘤细胞；
使所述预处理肿瘤细胞与多个免疫感受态细胞接触，并量化所述免疫感受态细胞对所述预处理肿瘤细胞的应答；以及
选择所述应答满足或超过预定阈值时的应激条件作为治疗选择。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述应激条件选自由低剂量化疗、暴露于低剂量辐射、热休克处理、缺氧、高氧、暴露于慢性炎症条件，暴露于活性氧物质，暴露于天然或经修饰的免疫T-或NK细胞，暴露于抗体和/或环境应激条件组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述低剂量化疗包括节律低剂量化疗。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述环境应激条件选自由DNA损伤剂、HSP90抑制剂、GSK3抑制剂和病毒感染组成的组。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预处理肿瘤细胞相对于未暴露于所述应激条件的相同细胞过表达NKG2D配体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将多个活检样品暴露于免疫刺激剂的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为细胞因子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞因子选自由IL-15、IL-15超级激动剂、IL-2、IL-7和IL-21组成的组。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为TLR配体。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为检查点抑制剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定所述活检样品的多个新表位的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包括针对所述多个新表位的至少一个产生抗体的步骤。
13.根据权利要求11所述的方法，其还包括产生含有编码所述多个新表位中的至少一个的重组核酸的病毒载体，以及任选地使所述免疫感受态细胞与所述病毒载体接触的步骤。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在使所述预处理肿瘤细胞与所述多个免疫感受态细胞接触的步骤之后确定所述预处理肿瘤细胞的第二多个新表位的步骤。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫感受态细胞是NK细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述NK细胞是NK92细胞或选自由aNK细胞、haNK细胞和taNK细胞组成的组中的基因工程NK细胞。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，量化所述免疫感受态细胞的应答的步骤包括显微分析、发光分析、荧光分析或放射分析。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预定阈值是所述预处理肿瘤细胞预先确定的裂解或凋亡速率。
19.根据权利要求1所述的方法，其还包括将多个活检样品暴露于免疫刺激剂的步骤。
20.根据权利要求22所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为细胞因子。
21.根据权利要求23所述的方法，其中，所述细胞因子选自由IL-15、IL-15超级激动剂、IL-2、IL-7和IL-21组成的组。
22.根据权利要求22所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为TLR配体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为检查点抑制剂。
24.根据权利要求1所述的方法，其还包括确定所述活检样品的多个新表位的步骤。
25.根据权利要求27所述的方法，其还包括针对所述多个新表位的至少一个产生抗体的步骤。
26.根据权利要求27所述的方法，其还包括产生含有编码所述多个新表位中的至少一个的重组核酸的病毒载体，以及使所述免疫感受态细胞与所述病毒载体接触的步骤。
27.根据权利要求1所述的方法，其还包括在使所述预处理肿瘤细胞与所述多个免疫感受态细胞接触的步骤之后确定所述预处理肿瘤细胞的第二多个新表位的步骤。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫感受态细胞是NK细胞。
29.根据权利要求31所述的方法，其中，所述NK细胞是NK92细胞或选自由aNK细胞、haNK细胞和taNK细胞组成的组中的基因工程NK细胞。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，量化所述免疫感受态细胞的应答的步骤包括显微分析、发光分析、荧光分析或放射分析。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预定阈值是所述预处理肿瘤细胞预先确定的裂解或凋亡速率。

Claims (34)

1.一种确定对患者的治疗选择的方法，其包括：
将所述患者的多个肿瘤活检样本离体暴露于相应且不同的多个应激条件以产生相应的预处理肿瘤细胞；
使所述预处理肿瘤细胞与多个免疫感受态细胞接触，并量化所述免疫感受态细胞对所述预处理肿瘤细胞的应答；以及
选择所述应答满足或超过预定阈值时的应激条件作为治疗选择。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述应激条件选自由低剂量化疗、暴露于低剂量辐射、热休克处理、缺氧、高氧、暴露于慢性炎症条件，暴露于活性氧物质，暴露于天然或经修饰的免疫T-或NK细胞，暴露于抗体和/或环境应激条件组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述低剂量化疗包括节律低剂量化疗。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述环境应激条件选自由DNA损伤剂、HSP90抑制剂、GSK3抑制剂和病毒感染组成的组。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预处理肿瘤细胞相对于未暴露于所述应激条件的相同细胞过表达NKG2D配体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将多个活检样品暴露于免疫刺激剂的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为细胞因子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞因子选自由IL-15、IL-15超级激动剂、IL-2、IL-7和IL-21组成的组。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为TLR配体。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为检查点抑制剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定所述活检样品的多个新表位的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包括针对所述多个新表位的至少一个产生抗体的步骤。
13.根据权利要求11所述的方法，其还包括产生含有编码所述多个新表位中的至少一个的重组核酸的病毒载体，以及任选地使所述免疫感受态细胞与所述病毒载体接触的步骤。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在使所述预处理肿瘤细胞与所述多个免疫感受态细胞接触的步骤之后确定所述预处理肿瘤细胞的第二多个新表位的步骤。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫感受态细胞是NK细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述NK细胞是NK92细胞或选自由aNK细胞、haNK细胞和taNK细胞组成的组中的基因工程NK细胞。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，量化所述免疫感受态细胞的应答的步骤包括显微分析、发光分析、荧光分析或放射分析。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预定阈值是所述预处理肿瘤细胞预先确定的裂解或凋亡速率。
19.根据权利要求2所述的方法，其中，所述低剂量化疗包括节律低剂量化疗。
20.根据权利要求2所述的方法，其中，所述环境应激条件选自由DNA损伤剂、HSP90抑制剂、GSK3抑制剂和病毒感染组成的组。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预处理肿瘤细胞相对于未暴露于所述应激条件的相同细胞过表达NKG2D配体。
22.根据权利要求1所述的方法，其还包括将多个活检样品暴露于免疫刺激剂的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为细胞因子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述细胞因子选自由IL-15、IL-15超级激动剂、IL-2、IL-7和IL-21组成的组。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为TLR配体。
26.根据权利要求22所述的方法，其中，所述免疫刺激剂为检查点抑制剂。
27.根据权利要求1所述的方法，其还包括确定所述活检样品的多个新表位的步骤。
28.根据权利要求27所述的方法，其还包括针对所述多个新表位的至少一个产生抗体的步骤。
29.根据权利要求27所述的方法，其还包括产生含有编码所述多个新表位中的至少一个的重组核酸的病毒载体，以及任选地使所述免疫感受态细胞与所述病毒载体接触的步骤。
30.根据权利要求1所述的方法，其还包括在使所述预处理肿瘤细胞与所述多个免疫感受态细胞接触的步骤之后确定所述预处理肿瘤细胞的第二多个新表位的步骤。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫感受态细胞是NK细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述NK细胞是NK92细胞或选自由aNK细胞、haNK细胞和taNK细胞组成的组中的基因工程NK细胞。
33.根据权利要求1所述的方法，其中，量化所述免疫感受态细胞的应答的步骤包括显微分析、发光分析、荧光分析或放射分析。
34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预定阈值是所述预处理肿瘤细胞预先确定的裂解或凋亡速率。
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