CN1529711A - 检测内毒素的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有纯化的鲎因子C，特别是重组制备的因子C，和表面活性剂的试剂可以在检测内毒素的灵敏，快速和可重复分析中使用。

Description

检测内毒素的方法和试剂
本申请要求了2001年6月28日申请的序号为60/310,125共同未决临时申请的利益并且引作参考。
发明领域
本申请涉及检测内毒素的试剂和方法。
发明背景
革兰氏阴性菌内毒素广泛污染各种各样的物质，例如水，食物，药品，和肠胃外制剂。
针对内毒素污染最常使用的试验使用来自鲎血淋巴的阿米巴样细胞溶胞产物。但是由于这些动物的总数减少，开发用于检测内毒素的不依靠使用鲎血淋巴的快捷而可靠的方法变得越来越重要。
发明概述
本发明提供检测内毒素的试剂和方法。本发明的一个实施方案是检测内毒素的试剂，含有纯化的鲎因子C蛋白和表面活性剂。所述表面活性剂可以是下式所示的两性表面活性剂：
Figure A0281429600081
Figure A0281429600091
其中R1是具有1-4个碳原子的亚烷基；Y和Y′各自是(1)氢，(2)低级烷基，或(3)羟基低级烷基；R2和R3各自是(1)低级烷基或(2)羟基低级烷基；n是0或1，当n是0时，R4是具有大约8至大约18个碳原子的烷基；当n是1时，R4是具有1至大约6个碳原子的亚烷基；R5是具有大约8至大约18个碳原子的烷基；并且M是氢，钠，钾或铵。表面活性剂可以是下式所示的阴离子表面活性剂：
(R6)n1-(Y)Ar(SO3M)n2           (E)
R5OSO3M                        (F)
其中R5，Y，和M具有上面给出的相同定义；R6是8-24个碳原子的烷基；nl是1-3的整数；n2是1或2；并且Ar是苯基或萘基。表面活性剂可以是下式所示的阳离子表面活性剂：
其中R5，Y，和Y′具有上面给出的相同定义。表面活性剂可以是下式所示的非离子型表面活性剂：
R5R7R8N O                      (H)
其中R5、Y和Y′具有上面给出的相同定义，并且R7和R8各自是甲基或乙基。表面活性剂是选自大约10-30摩尔的环氧乙烷与具有6个碳原子的六元醇和具有10-20个碳原子的酯基的单酯的缩合产物的那些非离子型表面活性剂。
本发明的另一个实施方案是检测试验样品中的内毒素的方法。试验样品接触(1)一种含有(a)纯化的鲎因子C蛋白和(b)表面活性剂的试剂，形成试验样品-试剂混合物和(2)因子C底物，形成接触过的试验样品。因子C底物的裂解产生可检测信号。接触过的试验样品中是否存在可检测信号。可检测信号的量相对不分析含内毒素的对照样品有所增加则表明试验样品中存在内毒素。
本发明的另一个实施方案是检测试验样品中的内毒素的方法。试验样品接触(1)一种含有(a)重组Carcinoscorpius rotundicauda因子C蛋白和(b)表面活性剂的试剂，和(2)N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素从而形成接触过的试验样品。通过在因子C蛋白被表达到上清液中的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的载体的宿主细胞的方法来制备因子C蛋白。分析接触过的试验样品中是否存在荧光信号。可检测信号的量相对不含有内毒素的对照样品有所增加则表明试验样品中存在内毒素。
本发明的另一个实施方案是检测试验样品中的内毒素的方法。试验样品接触含有纯化的鲎因子C蛋白和如上所述的表面活性剂的试剂从而形成试验样品-试剂混合物。试验样品-试剂混合物接触因子C底物，其中因子C底物的裂解产生了可检测信号。分析接触过的试验样品-试剂混合物中是否存在可检测信号。可检测信号的量相对于不含有内毒素的对照样品有所增加则表明试验样品中存在内毒素可测信号量相对不含内毒素的对照样品有所增加则表明试验样品中存在内毒素。
本发明的另一个实施方案是检测试验样品中的内毒素的方法。试验样品接触一种试剂，该试剂含有重组Carcinoscorpius rotundicauda因子C蛋白和表面活性剂。通过在因子C蛋白被表达到上清液中的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的载体的宿主细胞的方法来制备因子C蛋白。试验样品-试剂混合物接触N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素。分析接触过的试验样品-试剂混合物中是否存在荧光信号。可检测信号的量相对不合有内毒素的对照样品有所增加则表明试验样品中存在内毒素。
本发明的另一个实施方案是检测内素素的试剂盒。试剂盒包括一种试剂，该试剂含有(a)纯化的鲎因子C蛋白和(b)如上所述的表面活性剂，和检测试验样品中内毒素的方法的说明书。该方法包括步骤(1)使试验样品接触含有(a)纯化的鲎因子C蛋白和(b)如上所述的表面活性剂的试剂，从而形成试验样品-试剂混合物；(2)试验样品-试剂混合物接触因子C底物，其中因子C底物的裂解产生可检测信号；和(3)分析接触过的试验样品-试剂混合物中是否存在可检测信号。可检测信号的量相对不含有内毒素的对照样品有所增加则表明试验样品中存在内毒素。
附图的简要描述
附图1.说明Zwittergent 3-14和Tween 20对重组因子C活性的影响的图。
附图2.说明Zwittergent 3-14和Tween 80对重组因子C活性的影响的图。
附图3.说明Zwittergent 3-14和TritonX-114对重组因子C活性的影响的图。
附图4.说明使用DPR(N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基)香豆素底物检测内毒素的图。
附图5.说明使用VPR(N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基)香豆素底物检测内毒素的图。
附图6.说明不同Zwittergent浓度下的鲎属因子C活性的图。
附图7.说明存在和不存在表面活性剂的条件下内毒素灵敏度的图。
附图8.说明以DPR香豆素作为底物一小时一步骤的内毒素测定结果的图。
附图9.说明Zwittergent 3-14和辛基硫代苷对重组因子C活性的影响的图。
附图10.说明Zwittergent 3-14和Genapol C-100对重组因子C活性的影响的图。
附图11.说明Zwittergent 3-14和TX-100对重组因子C活性的影响的图。
本发明的详细描述
本发明涉及用于检测内毒素的试剂和使用该试剂的方法。所述试剂含有纯化的鲎因子C蛋白和表面活性剂。该试剂能与因子C的底物联合使用，所述底物通过裂解产生可检测信号从而检测试验样品中的内毒素。表面活性剂的存在将内毒素对纯化的因子C的激活作用提高了3-7倍，能够更加快捷和灵敏地测定试验样品中的内毒素水平。试剂优选含有重组因子C，因此消除了连续供给鲎血淋巴的需要。
纯化的因子C
本发明的试剂的一个成分包括纯化的鲎因子C蛋白。本发明的实施中可以使用来自四个已知鲎种LiTnulus polyphemus，Cacinoscorpius rotundicauda，Tachypleudus tridentata或Tachypleudus gigas中的任一种纯天然因子C。天然因子C能被生物化学纯化或者能重组制备纯化的因子C。
本文使用的″纯化的因子C″是指下文中定义的因子C蛋白的组合物，其含有少于30％重量的来自四个已知的鲎种中任一种的非因子C天然阿米巴样细胞溶胞产物成分。组合物具体含有细胞培养上清液，其含有重组因子C蛋白质(见下文)。从天然来源纯化鲎因子C的方法是已知的，例如公开于Nakamura等，Eur.J.Biochem.154，511-21，1986；Navas等，Biochem.Intl.21，805-13，1990；Tokunaga等，J.Biochem.109，150-157，1991；美国专利5,985,590和美国专利5,716,834中。这些方法或者它们的等同方法中的任何方法都能用来获得纯化的因子C。还可以参见实施例11。利用本领域中公知的任何方法例如SDS凝胶电泳来评价因子C制剂的纯度。
优选地，重组制备纯化的因子C。来自Tachypleus tridentata和Carcinoscorpius rotundicauda的天然因子C的氨基酸序列是已知的，是这些蛋白质的天然存在的编码序列。SEQ ID NO：1和3分别提供了SEQ ID NO：2和4所示的Tachypleus tridentata因子C氨基酸序列的编码序列。SEQ ID NO：5和7分别提供了SEQ ID NO：6和8所示的Carcinoscorpius rotundicauda因子C氨基酸序列的编码序列。因为遗传密码子的简并性，可以预期编码各种天然因子C蛋白的很多其它序列，本发明具体涉及这些编码序列制备纯化因子C的用途。
本发明还涉及纯化的天然和非天然存在的，即重组制备的因子C变体的用途，前提是所述变体保留了因子C酶活性。利用本领域公知的因子C酶活性的测定方法能评价因子C酶活性。参见，例如，Tokunaga等，J.Biochem.109，150-57(1991)和Nakamura等，Eur.J.Biochem.176，89-94，1988。也可以应用下面实施例1和13中描述的内毒素分析方法。天然存在的因子C变体包括，例如，因子C mRNA剪接变体或突变的因子C基因的产物。
利用碱基取代，***，或缺失能构建非天然存在的因子C变体从而制备具有因子C活性的蛋白质。根据使用Blast2排列程序(Blosum62，预期10，标准遗传密码子)测定的结果，非天然存在的因子C变体与天然存在的因子C之间有50，75，80，85，90，95，97，98，或99％的差异。在本发明实施中也能使用保留了因子C活性的天然的和重组制备的因子C的片段。因此，本文使用的″因子C″包括天然存在的和非天然存在的具有上述特性蛋白和蛋白片段。
重组制备蛋白质的方法是本领域公知的，一般包括在表达蛋白质的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的表达载体的宿主细胞。回收表达蛋白或者，优选地，含有表达蛋白的上清液被直接用作重组因子C的来源。因此，″纯化的因子C″特别包括含有重组因子C的上清液。用于制备重组因子C的宿主细胞包括但不限于酵母细胞和昆虫细胞。美国专利5,985,590中具体公开了在巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主细胞中重组制备Carcinoscorpius rotundicauda因子C的方法。
获得重组因子C的一种特别优选的方法是根据实施例2-5所述在杆状病毒***中制备蛋白质。简要地说，将因子C编码序列克隆到pFASTBACI中。将得到的重组质粒转化到DH10BAC感受态细胞中，所述细胞包含带有小-attTn7靶位点的杆粒和辅助质粒。在有辅助质粒提供的转座蛋白存在的条件下，pFASTBAC质粒上小-Tn7转座因子可以与杆粒上的小-attTn7靶位点易位。通过IacZα基因的裂解鉴定包含重组杆粒的菌落。从包含重组杆粒的选择性DH10BAC克隆制备高分子量DNA。然后使用这种DNA转染S9昆虫细胞，然后分泌重组因子C。本发明特别令人惊奇地发现含有从培养细胞分离的被分泌的因子C的培养基不用进一步纯化就能和表面活性剂(如下所述)一起用作内毒素测定中的试剂。
表面活性剂
本发明的试剂还含有表面活性剂。实施本发明的过程中使用的表面活性剂包括美国专利4,322,217中描述的那些，但是也可以使用其它表面活性剂。有用的表面活性剂包括其结构中包括阴离子和阳离子基团的两性表面活性剂。例证是由式A所示的磺基甜菜碱：
R1是具有1至大约4个碳原子的亚烷基，
Y是无害的适当化学取代基，包括(1)氢，(2)被取代的或未被取代的低级烷基，例如，含有1-4个碳原子，例如甲基，乙基，丙基或羟基等；
R2和R3各自选自被取代的或未被取代的含有1-4个碳原子的低级烷基，例如，甲基，乙基，丙基，羟乙基，羟甲基，羟丙基等。
n＝0或1，
当n＝0时，R4是被取代的或未被取代的烷基，例如，含有大约8至大约18个碳原子，和
当n＝1时，R4是具有大约1至大约6个碳原子的亚烷基，R5是被取代的或未被取代的烷基，例如，含有大约8至大约18个碳原子。
术语″亚烷基″包括聚亚甲基和其它二价饱和的脂肪族基团。因此，连接中可以有亚烷基支化。术语″低级″是指含有1-4个碳原子的基团。
能在本发明的试剂中使用的磺基甜菜碱是本领域公知的并且被描述为两性离子表面活性剂。例如Fernley，J.Am.Oil Chem.Soc.55，98-103(1978)和美国专利3,280,179中记载了这样的化合物的制备。在优选的磺基甜菜碱表面活性剂中，上述结构中的R2和R3是甲基。并且优选的是R1是亚丙基。
有用的磺基甜菜碱表面活性剂的一种类型具有上述结构，其中n等于0并且R4是具有大约8至大约18个碳原子的烷基，优选直链烷基。对于这些磺基甜菜碱表面活性剂，R4成分的合适来源是牛油脂肪醇，其由各种链长的混合物组成，典型组成是大约66％的C18，30％的C16，和4％的C14等。其它合适的来源是被蒸馏的椰油脂肪醇的中间馏分，其也是由各种链长的混合物组成，典型组成是大约66％的C12，23％的C14，9％的C16和2％的C10。
其中n等于0的上述结构的具体磺基甜菜碱表面活性剂在美国专利3,539,521中给出。特别优选的这种类型的表面活性剂是N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐，它是从Calbiochem-Behring公司购得的，商品名是ZWITTERGENT 3-14。
另一种类型的有用磺基甜菜碱表面活性剂具有上述结构，其中n等于1并且R4是具有大约1至大约6个碳原子的亚烷基。在这些磺基甜菜碱中，n等于1，R5是具有大约8至大约18个碳原子的烷基。优选R5是直链。如上面所讨论的，具有大约10至大约18个碳原子的烷基的合适来源是牛油脂肪醇椰油脂肪醇。其中n等于1的上述结构的具体磺基甜菜碱表面活性剂在美国专利3,280,179中给出。
特别优选的磺基甜菜碱表面活性剂是3-(N，N-二甲基-N-酰基酰氨丙基铵)-2-羟基-丙烷-1-磺酸盐，其中酰基得自牛油脂肪醇或椰油脂肪醇，椰油脂肪醇是优选的。本领域技术人员公认，在牛油脂肪醇或椰油脂肪醇的这些衍生物的常规制备中，会产生酰基碳链长度不同的磺基甜菜碱的混合物。如上面所讨论的，这些脂肪醇主要含有提供具有期望的碳原子数，例如大约8至大约18个碳原子的酰基的碳链长度。因此，由牛油脂肪醇或椰油脂肪醇获得的这些混合物被用于提供用于本发明试剂的磺基甜菜碱表面活性剂。
在本发明的试剂中使用的特别优选的这类材料是N-椰油酰氨基-丙基-N，N-二甲基-N-2-羟基丙基磺基甜菜碱。这种物质的一个例子是LONZAINE CS，是从Lonza，Inc.，Fair Lawn，N.J.购得的。
其它两性表面活性剂包括式B例示的N-长链烷基氨基羧酸：
Figure A0281429600171
式C例示的N-长链烷基亚氨基二羧酸：
Figure A0281429600172
和式D例示的N-长链烷基或酰氨基甜菜碱：
Figure A0281429600173
其中R1，R2，R3，R4，Y，和n具有它们在式A中的相同定义，M是氢或者成盐金属，并且Y′具有和式A中的Y相同的定义。Y和Y′可以是相同或不同的。具体的两性洗涤剂例子是N-烷基-β-氨基丙酸，N-烷基-β-亚氨基二丙酸，和N-烷基-N，N-二甲基甘氨酸；烷基可以是，例如，得自椰油脂肪醇，十二烷基醇，十四烷基醇(或者十二烷基-十四烷基混合物)，氢化牛油醇，十六烷基醇，十八烷基醇，或者这些醇的混合物。被取代的氨基丙酸和亚氨基二丙酸经常以钠盐或其它盐的形式供给，这些盐也可以在本发明的试剂中使用。
具体的例子包括Witco Chemical Corporation以商品名EMCOLCC 37-18出售的椰油甜菜碱，Lonza Inc.以商品名LONZAINE CO出售的椰油酰氨基丙基甜菜碱，和Henkel Corporation以商品名DERIPHAT 160出售的N-牛油-β-亚氨基二丙酸二钠。
其它两性洗涤剂的例子是脂肪咪唑啉，例如通过长链脂肪酸(例如10-20个碳原子)与二亚乙基三胺和具有2-6个碳原子的一卤代羧酸反应制备的那些脂肪咪唑啉，例如1-椰油-5-羟乙基-5-羧甲基咪唑啉。具体的例子包括椰油咪唑啉，从Lonza，Inc.以商品名AMPHOTERGE K-2购得，和癸二酸咪唑啉，从Lonza，Inc.以商品名AMPHOTERGE KJ-2购得。
有用的表面活性剂的其它例子包括阴离子合成表面活性剂，一般被描述为其分子结构中含有亲水和亲脂基团并且在含水介质中离子化从而产生带有亲脂基团和亲水基团的阴离子的那些化合物。烷基芳基磺酸盐，烷烃硫酸盐，和硫酸氧乙基化烷基苯酚是阴离子类型的表面活性化合物。
烷基芳基磺酸盐是一类由式E所示的合成阴离子表面活性剂：
(R6)n1-(Y)Ar(SO3M)n2    [E]
在式E中，R6是具有大约1至大约24个碳原子的直链或支链烃基，至少一个R6具有至少8个碳原子；n1是1至3；n2是1至2；Ar是苯基或萘基，以及Y和M具有与在式B中相同的定义。R6可以是，例如，甲基，乙基，己基，辛基，叔辛基，异辛基，壬基，癸基，十二烷基，十八烷基等等。
作为例子的烷基芳基磺酸盐化合物包括十二烷基苯磺酸钠，癸基苯磺酸钠，甲基十二烷基苯磺酸铵，十二烷基苯磺酸铵，十八烷基苯磺酸钠，壬基苯磺酸钠，十二烷基萘磺酸钠，十七烷基苯磺酸钠，二十烷基萘磺酸钾，十一烷基萘磺酸乙胺和二十二烷基萘磺酸钠。
烷基硫酸盐是一类式F代表的合成阴离子表面活性剂：
R5OSO3M                          (F)
其中R5和M具有与在式B中相同的定义。作为例子的硫酸烷基酯类阴离子表面活性剂化合物包括十八烷基硫酸钠，十六烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠，壬基硫酸钠，癸基硫酸铵，十四烷基硫酸钾，二乙醇氨基辛基硫酸盐，三乙醇胺十八烷基硫酸盐，和壬基硫酸铵。
硫酸化氧乙烯化烷基苯酚是一类式G代表的合成阴离子表面活性剂：
其中A是氧，硫，碳酰胺基团，硫代碳酰胺基团，羧基或硫代羧酸酯基团，z是3-8的整数，并且R5和M具有与在式B中相同的定义。举例说明的硫酸化氧乙烯化烷基苯酚类阴离子表面活性剂化合物包括壬基苯氧基四亚乙基氧硫酸铵，十二烷基苯氧基三亚乙基氧硫酸钠，癸基苯氧基四亚乙基氧硫酸乙醇胺，和辛基苯氧基三亚乙基氧硫酸钾。
其它有用的表面活性剂的例子包括非离子型表面活性化合物，广义上被描述为非离子化但从氧化的侧链获得亲水特性的化合物，例如聚氧乙烯；分子的亲脂部分可以来自脂肪酸，苯酚，醇，酰胺或胺。通常，通过使烯化氧，例如环氧乙烷，环氧丁烷，环氧丙烷等，与脂肪酸，含有一个或多个羟基的直链或支链醇，酚类，硫代酚类，酰胺，或者胺反应，从而生成聚亚氧烷基乙二醇醚类和酯类，聚氧乙烯烷基酚，聚氧乙烯硫酚，聚氧乙烯酰胺等。一般优选对于每摩尔脂肪酸，醇，酚，硫酚，酰胺或胺反应大约3至大约30摩尔，更优选10至30摩尔的烯化氧。
举例说明的这些非离子型表面活性剂是通过烯化氧与具有8至18个碳原子的脂肪族醇，例如辛基，壬基，癸基，十八烷基，十二烷基，十四烷基醇等，与酯基含有10-20个碳原子的六羟基醇的一元酯例如脱水山梨糖醇单月桂酸酯，脱水山梨糖醇单油酸酯和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯，与其中烷基含有4-20个碳原子的烷基苯酚，例如丁基，二丁基，戊基，辛基，十二烷基，十四烷基苯酚等，或者与其中烷基含有1-8个碳原子的烷基的烷基胺反应而获得的。
举例说明的合成非离子型表面活性剂化合物包括环氧乙烷或环氧丙烷与下面的化合物缩合而获得的产物：丙二醇，乙二胺，二乙二醇，十二烷基苯酚，壬基苯酚，十四烷基醇，N-十八烷基二乙醇酰胺，N-十二烷基一乙醇酰胺，商品名为TWEEN 80的聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯，和商品名为TWEEN 20的聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
其他非离子型表面活性剂包括对应于式H的长链叔胺氧化物：
R5R7R8N→O               (H)
其中R5具有与在式A中相同的定义，以及R7和R8各自是甲基或乙基。式中箭头是半极性键的常规表示法。适合在本发明中使用的胺氧化物的例子包括二甲基十二烷基胺氧化物，二甲基辛基胺氧化物，二甲基癸基胺氧化物，二甲基十三烷基胺氧化物，和二甲基十六烷基胺氧化物。
阳离子表面活性试剂也可以被用作表面活性剂。这样的试剂是含有有机疏水性基团和阳离子增溶基团的那些表面活性化合物。典型的阳离子增溶基团是胺和四价基团。这样的阳离子表面活性试剂由式I所示：
其中R5，Y，和Y′具有与式C中相同的定义。
其它合适的合成阳离子表面活性剂的例子包括二胺，例如式J所示的那些二胺：
R9NHC2H4NH2      (J)
其中R是大约12至22个碳原子的烷基，例如N-2-氨基乙基十八烷基胺和N-2-氨基乙基十四烷基胺；酰胺-键联的胺如由式K所示的那些：
R5CONHC2H4NH3    (K)
诸如N-2-氨基乙基十八烷基酰胺和N-氨基乙基十四烷基酰胺；季铵化合物，其中典型地与氮原子连接的基团中的一个是含有1-3个碳原子的烷基，包括带有惰性取代基例如苯基的这种1-3个碳原子的烷基并且存在一种阴离子例如卤原子，乙酸根，甲基硫酸根等。典型的季铵化合物是乙基-二甲基十八烷基氯化铵，苄基-二甲基-十八烷基氯化铵，苄基二甲基-十八烷基氯化铵，三甲基十八烷基氯化铵，三甲基十六烷基溴化铵，二甲基乙基二月桂基氯化铵，二甲基-丙基-十四烷基氯化铵，和相应的甲硫酸盐和乙酸盐。
式L代表其它合适的阳离子表面活性剂：
Figure A0281429600212
其中R5具有和式A中相同的定义。并且其中每一a是1-15的整数。一个例子是氢化牛油的聚乙二醇胺，其中R5代表牛油残基并且a+a的平均值是5。
因子C-表面活性剂试剂中使用的其它有用表面活性剂包括TritonX100，Triton X-114，辛基-β-D-硫葡萄糖甙(OTG，Amresco #J575)，Genapol C 100(一种烷基聚氧乙烯C12E10；Calbiochem #345794)，Tween 20，和Tween 80。
因子C-表面活性剂
为了形成本发明的试剂，在水溶液中混合纯化的因子C和表面活性剂。为此目的的合适的缓冲液含有30mM Tris，pH 8.0，30mM NaCl，和0.3％乳糖。本发明的试剂中纯化的因子C的浓度优选范围是0.03-3微克/毫升。本发明的试剂中表面活性剂的浓度优选范围是0.001-0.003％。
纯化的因子C和表面活性剂的最佳浓度根据例如因子C和特定表面活性剂的纯度而不同。应用常规试验能确定纯化的因子C和表面活性剂的最佳浓度。在实施例1和13举例说明的测定中，表面活性剂ZWITTERGENT 3-14的最佳浓度是0.0025％。
内毒素测定
在对试验样品检测内毒素的测定中可以使用上述试剂。试验样品可以是对检测内毒素有用的任何样品，包括水，水溶液，例如缓冲液，药物制剂(例如，疫苗，静脉注射液，药物制剂)，生物医学造影剂(例如，颜料，放射性溶液)，酶制剂(例如胶原酶)，组织培养基，饮料，血液，尿液，脑脊髓液，淋巴，血清，和通过温育水或含有固体样品例如食品或外科手套的水溶液而形成的溶液。
可以进行两步法或一步法测定。为了进行两步测定(实施例1)，将试验样品与含有纯化的因子C和表面活性剂的试剂一起温育，然后加入裂解时会产生可检测信号的因子C底物。为了进行一步法测定(实施例13)，一起加入内毒素，含有纯化因子C和表面活性剂的试剂和底物。
裂解时产生荧光信号的底物是特别优选的，例如N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素(″DPR，″Bachem 1-1560.0050)和N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素(″VPR，″Bachem1-1120.0050)。DPR的浓度一般范围是大约10-100mM，25-100mM，5-100mM，75-100mM，25-75mM，50-75mM，25-50mM，或50-75mM。VPR的浓度一般范围是大约50-200mM，50-150mM，50-100mM，50-75mM，75-150mM，或75-100mM。
对于特定底物的最佳浓度是不同的。例如，DPR的最佳浓度是50mM，而VPR的最佳浓度是100mM。此外，可以根据预计试验样品中存在的内毒素水平选择特定底物。内毒素浓度越高VPR底物线性范围越好，而DPR底物在较低内毒素浓度下就具有较好线性范围。因此，在期望更高灵敏度的测定中能使用DPR，而当预期存在较高内毒素水平并且要求较低灵敏度时，VPR是优选的底物。
利用本领域公知的任何方法能测定荧光。如果荧光剂与上述DPR或VPR底物使用，在360，380，390或395nm(狭缝宽5-40nm)下进行激发并且在440或460nm(狭缝宽2.5-40nm)下测定发光。参照标准内毒素浓度曲线，测定可以是定性或定量的。
测定可以在清澈的容器，例如玻璃或聚苯乙烯组织培养板中进行，或者可以在黑色容器(例如，黑色96-孔微量板)中进行。如果需要，测定适于使用例如96-孔微量滴定板对大量样品进行高通量筛选。
试剂盒
本发明还提供用于检测内毒素的试剂盒。试剂盒包括纯化的鲎因子C蛋白质和表面活性剂，如上所述。包括检测内毒素的试剂的使用说明。试剂盒还包括测定中使用的因子C底物。
本说明书中引用的所有的专利，专利申请和参考文献在这里表述上引作参考。上面的公开内容一般性地描述了本发明。参照下面的具体实施例能获得更完全的理解，提供实施例只是为了详细描述的目的而不是为了要限制本发明的范围。
实施例1
两步法内毒素测定
在测定缓冲液(30mM Tris，pH 8.0，30mM NaCl，0.3％乳糖，和0.0025％Zwittergent 3-14)中将内毒素与含有从产生重组因子C的Sf9细胞获得的重组Carcinoscorpius rotundicauda因子C的培养基一起预先温育1小时。向混合物中加入底物N-t-Boc-Asp(Obzl)-ProArg-7-酰氨基-4-甲基香豆素(DPR-香豆素)至50mM的终浓度。15-20分钟之后测定激活的因子C对底物进行裂解产生的荧光。图4给出结果。图5给出使用最终浓度是100mM的底物N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素进行相似测定的结果。
实施例2
将杆粒DNA-因子C转染到Sf细胞中并且收集重组病毒上清液
在含有50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的昆虫细胞培养基(ICCM)中以每35mm孔5×106的密度在6-孔组织培养板上接种Sf9细胞。Insect-Xpress(BioWhittaker Cat.#04-10270)或Sf-900 SFM是合适的培养基。但是，可以使用其中SF9细胞得以生长的任何参照培养基。平板在27℃温育1小时使细胞定居。同时，制备下述物质(每孔)：(1)100ml ICCM(没有抗生素)中的7mg杆粒-因子CDNA和(2)6mlCELLFECTIN(Gibco-BRL)加100ml ICCM(没有抗生素)。将溶液(1)和(2)轻轻混合并且在室温下温育1小时。向该混合物加入0.8ml的ICCM(没有抗生素)。
用2ml的ICCM(没有抗生素)小心冲洗粘着Sf9细胞。向各个孔加入1毫升CELLFECTIN-DNA复合物并且在27℃温育5小时。完全去除转染混合物，并且加入含有抗生素的2ml ICCM。27℃温育96小时之后，收集细胞培养上清液。在SIGMA 3K10甩平式转头，Nr.11133中以5000rpm离心10分钟来澄清上清液。在4℃下储存含有重组杆状病毒的上清液。
实施例3
重组病毒原液的扩增
在单层或悬浮液中用Sf9细胞进行病毒扩增。对于单层培养，从在75cm2组织培养瓶中生长了一天的80％汇合Sf9细胞的培养物倾析掉培养基。使用0.1-1的MOI的1毫升病毒(实施例2)感染细胞单层。使用Millipore GV millex过滤器(黄色；低-蛋白质结合)无菌过滤病毒原液。如下计算病毒接种物：
接种物体积＝(MOI×细胞总数)/以pfu/ml表示的病毒滴度
因此，对于1×107个细胞，以2×107pfu/ml的病毒滴度，接种物体积是0.5毫升。在引入细胞之前用ICCM将接种物体积调节至1毫升。
将烧瓶摇动几次，保证细胞单层被1毫升病毒接种物完全覆盖。然后烧瓶在不摇动下在27℃温育1小时。温育之后，竖直放置烧瓶，并且加入14ml新鲜ICCM。然后将烧瓶在27℃温育3天。
将培养上清液收集到灭菌无热源试管中并且使用Sigma3K10甩平式转头在4℃下以2000rpm离心10分钟。为了直接使用，将病毒原液保存在4℃下。对于长期贮存，将病毒原液放在-80℃下。
对于悬浮培养，使用存活率＞95％的对数生长期的Sf9细胞进行病毒扩增。测定细胞密度和存活率。用新鲜InsectXPRESS将Sf9细胞稀释至1×106细胞/毫升。按照下述方法以0.02MOI(病毒/细胞)对Sf9培养物加待扩增的病毒：
病毒接种原液的体积(ml)＝(总细胞/毫升)×(培养物总体积×(MOI)/(以pfu/ml表示的病毒滴度)
在27℃+/-2℃下将旋转烧瓶温育三天，以90-120rpm恒速搅拌。将细胞培养物转移到无菌离心瓶中并且在4℃下以2000rpm离心10分钟。将上清液收集到灭菌容器中并且弃除细胞沉积物。上清液通过0.45微米过滤器被过滤到灭菌容器中。上清液进一步通过灭菌的0.2微米过滤器被过滤到灭菌容器中。最终的病毒原液在2-8℃下进行避光贮存。根据实施例4中的解释进行滴度测定。
实施例4
杆状病毒滴定
利用噬菌斑测定，终点稀释，或者其它病毒滴度试剂盒(例如，BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit，Clontech#K1599-1)能测定病毒滴度(每毫升的噬菌斑形成单位(PFU))。在固定的单层培养物中进行噬菌斑测定。如下进行噬菌斑测定：
噬菌斑测定数＝病毒稀释数×4(一式四份)+2正对照和2负对照
例如，对于病毒稀释度105，106，107，108，一式四份孔中每一份稀释液将是一个16-孔噬菌斑测定。噬菌斑测定中包括两个正对照和两个负对照，总共20孔。
在10％FBS血清培养基中制备每毫升5×105个细胞的细胞悬浮液。用上述细胞悬浮液以每孔2毫升接种6-孔板。在实验之前让细胞附着2小时。细胞达到大约80％汇合。
使用4.5ml培养基和0.5ml病毒原液在15毫升的无菌试管中制备10倍系列病毒稀释液。从各孔中抽吸出培养基。每孔加入1毫升病毒稀释液并且在27℃下温育2小时。
将1.3xSF-90011(Gibco-BRL #10967-032)加温至27℃。融化4％琼脂糖(Gibco 18300-012)并且保持在50℃水浴中。以3∶1的比例加入1.3x培养基和4％琼脂糖，制成含1％琼脂糖的培养基。将这种琼脂保持在40℃水浴中(例如，在可以放在通风厨中的烧杯中)。
快速操作以不使琼脂糖混合物固化，从细胞单层抽吸出病毒溶液。向各个孔中加入2ml 1％琼脂糖。将平板放在通风厨中，盖子微微开启10分钟。将平板倒置并且将它们放在具有用以提供湿度的潮湿纸巾的密封盒中。在27℃下温育5-7天，或者直到噬菌斑形成完好。
感染后第7天，加入0.5ml 0.033％中性红(在水中)，温育3分钟，并弃除。或者，加入0.5ml 0.1％台盼蓝(在水中)，摇动盖上盖子，静置3分钟，并弃除。将培养板温育2小时。借助光盒和放大镜，计数每个板上的噬菌斑。应用下式计算病毒滴度：
病毒滴度(pfu/ml)＝噬菌斑数目×病毒稀释度。
实施例5
在无血清培养物中转染用于生产重组因子C的Sf9细胞
使用高成活率Sf9细胞(例如，在无血清条件下成活率95-100％)。将对数期Sf9细胞培养至每毫升悬浮培养物至细胞密度达到1.5×106和2.5×106细胞。通过感染单层培养物中生长的Sf9细胞也可以进行重组因子C制备。测定细胞密度和成活率。用新鲜InsectXPRESS将Sf9细胞稀释至每毫升1.5×106细胞。如下，在MOI为1(病毒/细胞)下，向Sf9培养物加重组杆状病毒高滴度原液：
接种物HTS的体积(ml)＝(总细胞/毫升)×(培养物总体积×(MOI)/(以pfu/ml表示的病毒滴度)
感染后72小时收集上清液。将细胞培养物转移到无菌离心瓶中并且在4℃下以2000rpm离心10分钟。将上清液收集到无菌容器中并且弃除细胞沉积物。上清液通过0.45微米过滤器被过滤到无菌容器中。上清液进一步通过灭菌的0.2微米过滤器被过滤到无菌容器中。这种含有重组因子C的培养上清液可以在4℃下贮存至多一年并且能直接用来形成用于本发明内毒素检测的试剂。
实施例6
适应无血清培养基的Sf9细胞的培养和传代培养
Sf9细胞在没有CO2下在27℃下培养。最大通风是优选的。如果使用旋转培养瓶，则将旁边的螺旋盖松开以增加通气。适应在无血清培养基中生长的Sf9细胞在常规基础上应该以4-5天间隔进行传代培养。
在含有100毫升培养基的250ml旋转或摇瓶中以5.0×105细胞/毫升进行传代培养，松开盖子以提供最大通风。以90-100rpm搅拌培养物。细胞成活率应高于90％。
从27℃保温箱取出了4-5天龄的培养物并且用70％乙醇刮出。取出一份细胞悬浮液，使用台盼蓝染料测定细胞成活率和总的细胞数。确定达到5×105细胞/毫升所需要的细胞稀释度。将原液培养瓶旋转几次并且根据计算结果取出合适体积的细胞悬浮液。对含有制成体积达到100毫升的最终培养物所需要的足量预热新鲜培养基的新的250ml转瓶进行接种。将培养物放回到保温箱中。搅拌速度设置在90-100rpm。
实施例7
Sf9细胞的无血清培养物的低温保藏
在单层或者悬浮液中培养Sf9细胞。在生长的中对数期收集细胞(大约2天)，成活率＞90％。利用冰浴和灭菌过滤器保持条件培养基。
使用台盼蓝排除方法测定细胞成活率。计算达到1-2×107细胞/毫升终密度所必需的低温保藏培养基(50％新鲜无血清ICCM培养基和50％条件培养基中7.5％DMSO；无菌过滤)的体积。在冰上保持低温保藏混合物。同时，以800rpm/500×g离心3分钟从悬浮液中离心出细胞。如果大量细胞没有沉淀而是在上清液中，则弃除样品。
在所确定的冷却低温保藏混合物体积中重新悬浮细胞，达到1-2×107细胞/毫升。将1-1.5ml等份的细胞悬浮液快速分配到冷冻管中。在液氮的上部气相中在-70至-90℃下冷冻细胞。将小瓶置于液氮中。
实施例8
回收低温保藏的无血清Sf9细胞
在37℃水浴中快速摇动解冻瓶直到融化。从水浴中取出瓶子并且用无菌70％异丙醇刮擦。开启小瓶，将小瓶中的物质取出并放到合适大小的灭菌离心管中；用5个体积的在保温箱中已经平衡至27℃+/-2℃的InsectXPRESS培养基(或者等同物)稀释细胞悬浮液。以125×G将稀释的悬浮液离心10分钟。弃除液体并且将细胞再次悬浮于等于弃除液体体积的培养基中。测定细胞数和成活率。使用无血清培养基将成活的细胞密度调节至每毫升2×105细胞和3×105细胞之间。将27℃+/-2℃保温箱中的烧瓶转移到平台摇动器上连续摇动，每分钟转100-125转。当至少每26小时培养物的成活细胞数翻翻时，如实施例6所述可以扩展培养物。
实施例9
Sf9细胞对悬浮培养物的适应
开始100ml悬浮培养需要6-10汇合的75cm2单层T-瓶的Sf9细胞。通过一只手拿住烧瓶并且在另一只手的掌心扣打而使细胞离开瓶底。合并细胞悬浮液并且计数成活率。
室温下，使用250ml转瓶中含有的完全血清补充的或无血清生长培养基将细胞悬浮液稀释至大约5×105成活细胞/毫升。搅拌叶片顶部稍高于细胞悬浮液。从而提供了额外的换气。侧臂盖子应当松开四分之一圈。
以100rpm恒定搅拌速度在27℃温育细胞。成活细胞数达到1-2×106细胞/毫升(接种后3-7天)时的传染培养，将搅拌速度加快5rpm，直到培养物成活率＞80％传代培养。反复进行直到转瓶达到100rpm的搅拌速度或者摇瓶培养物达到130-140rpm。在这一点上，在传代培养期间将接种密度减小至3×105细胞/毫升。
如果还有大块细胞(例如，每块多于10个细胞)存在，在传代培养之前于不搅拌条件下将转瓶/摇瓶静置2-3分钟。这使得大块沉降到瓶底。合并上部三分之一的悬浮细胞用以计数并且接种到新的培养物中。对生长为单个细胞的细胞总体选用这个步骤。有必要重复该步骤2-3次直到结块减少。
实施例10
不同的去污剂和不同的去污剂浓度对重组因子C测定的影响
材料和方法
从指定厂家购买下面的试剂：Zwittergent 3-14(Calbiochem，Cat#693017)，Tween 20(ICN，Cat#194841)，Tween 80(ICN，Cat#194842)，Triton X-114(ICN，Cat#193971)，)，正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(OTG，Amresco，Cat#J575)和Triton X-100(ICN，Cat#194854)。使用20微升的各种去污剂(大约是终浓度的10倍)，150微升的1EU/毫升EC-6，10微升的rFC上清液031901I，20微升的300mM Tris，pH8.0和20微升的0.55mM DPR香豆素底物进行重组因子C(rFC)测定。使用Cytofluor读数器在38℃读取测定结果，读数器设置在390/440nm，每次循环5分钟，1小时。30分钟之后将数据作图。
结果
如图1-3和9-11所示，低浓度的Zwittergent 3-14，Tween20，Tween 80，Triton X-114，OTG，Genapol C-100和Triton X-100将rFC测定提高2-7倍。Zwittergent 3-14，Triton X114，OTG和TritonX-100增加的浓度范围窄，Tween 20，Tween 80和Genapol C-100增加的浓度范围宽。
表1总结了测试9种去污剂获得的结果。这些去污剂可以被分为三组：对于提高重组因子C活性具有窄浓度范围的去污剂，对于提高重组因子C活性具有宽浓度范围的去污剂，和抑制重组因子C活性的去污剂。
表1.
  去污剂        去污剂浓度范围      CMC(mM)      MW     种类
   rFC提高   rFC抑制
  第1组
  Zwittergent   0.001-＜0.004％ ＞＝0.004％   0.1-0.4     363.6     ZW
  Triton X-100   0.001-＜0.008％ ＞＝0.008％   0.2-0.9     631   非离子型
  Triton X-114   0.001-＜0.016％ ＞＝0.016％   0.35     537   非离子型
  OTG   0.031-＜0.5％   ＞＝0.5％     9     308.4   非离子型
  第2组
  GenapolC-100   0.001-0.5％   ＞0.5％     /     627   非离子型
  Tween 20   0.001-0.5％   ＞0.5％   0.059     1228   非离子型
  Tween 80   0.001-0.25％   ＞0.25％   0.012     1310   非离子型
  第3组
  去氧胆酸     / ＞＝0.0004％   1.5     414.6    离子型
  SDS     / ＞＝0.0004％   2.3     288.5    离子型
还使用纯化的鲎属因子C测定了Zwittergent 3-14的增强/抑制作用(图6)。发现了相似的增强/抑制作用，但是相对因子C活性比例，增强和抑制去污剂浓度与重组因子C测定中的那些不同。
实施例11
抗鲎属因子C抗血清
我们从鲎属中分离到了因子C并且产生了抗这种蛋白质的抗血清。将鲎溶胞产物先用S-100凝胶进行过滤分离，接着用阳离子交换柱分离。使用N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素底物测定各级分的因子C活性。鲎属因子C被纯化73倍，同利用酶测定和SDS-PAGE所测定的结果具有80％的不相同性。通过非还原条件下SDS-PAGE测定，鲎属因子C的分子量是117kDa。还原SDS-PAGE表明存在79kDa和40kDa两个主带，相当于重链和轻链。胰蛋白酶肽测序表明鲎属因子C序列与亚洲人种密切匹配，序列同一性＞90％。在兔体内产生抗鲎属因子C的特异多克隆抗体。抗-因子C纯化的IgG抑制LPS对因子C的激活作用，但是因子C一旦被LPS激活，则对蛋白酶活性没有影响。因子C抗血清证明这种蛋白质在鲎属溶胞产物对LPS的最初识别中的重要性。
实施例12
在表面活性剂存在下内毒素测定灵敏性提高
在一步法中，进行1-小时终点测定。内毒素O55：B5，0.01，0.1，1，和10EU/ml被用于标准曲线。向96-孔板加空白对照物和内毒素标准物(每孔100微升)。以1∶4∶5的比例混合重组因子C上清液，测定缓冲液(150mMNaCl，150mM Tris，pH 8.0，和1.5％乳糖，有或没有0.0125％Zwittergent)和底物溶液(0.2mM水溶液)。向各空白对照物和内毒素标准物中加这种混合物。在零时和1小时读取荧光度。用空白对照物矫正荧光度差异(δ荧光度)。然后用标准化δ荧光度对内毒素浓度的log-log数值作图。各个数据点是双份测定的结果。
图7给出结果。当存在表面活性剂时内毒素测定灵敏度提高10-倍。
实施例13
一步法内毒素测定
使用100微升各种空白对照物和内毒素标准物在96-孔板中进行一步法内毒素测定。以1∶4∶5的比例向平板的各孔中加入100微升的重组因子C上清液(杆状病毒-感染的Sf9细胞培养基)，缓冲液(150mM Tri，pH 8.0，150mM NaCl，1.5％β乳糖和0.0125％Zwittergent3-14)与荧光基质(DPR香豆素，0.2mM)的混合物。平板在37℃下温育1小时。在荧光微量板读数器上分别在390和440nm读出激发光和发射光。
图8中给出一步法重组因子C内毒素测定的结果。
序列表
<110>Chen，Lin
     Pepe，Michael
<120>检测内毒素的方法和试剂
<130>02877.00008
<150>US 60/310,125
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<212>DNA
<213>Tachypleudus tridentata
<400>1
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cttagcgtcg tttttggtgt ctggtttagt tctagggata ctagcccaac aaatgcgtcc     120
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cttgactgag actctacgag ggaaaggtac tgataatgtt actgcaacct aagtagactt     1560
tattttagtc taagatatct tgtgtcaatt gttgacttgc tactcttact ttattgtaat     1620
aaaactgtta taaagtatta agtcttgttt attttattac tgtttaaagt atactacaag     1680
ggttacacct aaaaggaaat ttctatctga caatttcata aaaagtggat gttacttttg     1740
attttcgttg gttgttaaat gcacatccgg tttgtaaaca tctaagttcc cacaaacagg     1800
ctctgtggtc ttgtaaaaat ctaaactaat accactttta atatgtttta aacctttttt     1860
ttatgtatgc ttatcagaga ctaaaataaa ggtttttaat aactgt                    1906
<210>2
<211>498
<212>PRT
<213>Tachypleudus tridentata
<400>2
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu
 1               5                  10                  15
Ala Gln Gln Met Arg Pro Val Gln Ser Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu
            20                  25                  30
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
        35                  40                  45
Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
    50                  55                  60
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
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Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg
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Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145                 150                 155                 160
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
                165                 170                 175
Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro
            180                 185                 190
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu His Gly
        195                 200                 205
Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
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Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys
                245                 250                 255
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Gln
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Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn
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Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305                 310                315                  320
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
                325                 330                 335
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
            340                 345                 350
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
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Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
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Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
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Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
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   Ser Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Thr Asp Asn Val Thr
                   485                 490                 495
   Ala Thr
   <210>3
   <211>3467
   <212>DNA
   <213>Tachypleudus tridentata
   <400>3
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gtagcggtga atgtcaatgt aagaatggag gtatctgtga ccagaggaca ggagcttgta     420
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gctgtgaggt tctccactac ctcagtggaa ctgagaccgt aacttgtaca acaaatggca     1920
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<210>4
<211>1019
<212>PRT
<213>Tachypleudus tridentata
<400>4
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu
 1               5                  10                  15
Ala Gln Gln Met Arg Pro Val Gln Ser Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu
            20                  25                  30
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
        35                  40                  45
Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
    50                  55                  60
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
            100                 105                 110
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg
        115                 120                 125
Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145                 150                 155                 160
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
                165                 170                 175
Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro
            180                 185                 190
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu His Gly
        195                 200                 205
Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
    210                 215                 220
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225                 230                 235                 240
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys
                245                 250                 255
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Gln
            260                 265                 270
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
        275                 280                 285
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn
    290                 295                 300
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305                 310                 315                 320
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
                325                 330                 335
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg lle His Cys Pro Ala
            340                 345                 350
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
        355                 360                 365
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
    370                 375                 380
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
385                 390                 395                 400
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
                405                 410                 415
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly
            420                 425                 430
Arg Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Glu Glu Asn Cys Val
        435                 440                 445
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Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
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Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
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Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
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Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
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Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
945                 950                 955                 960
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
                965                 970                 975
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
            980                 985                 990
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
        995                 1000                1005
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
    1010                1015
<210>5
<211>4182
<212>DNA
<213>Carcinoscorpius rotundicauda
<400>5
gtatttaatg tctcaacggt aaaggtttca ttgtagctaa tatttaactt cctccctgtg    60
ccccaaatcg cgagtatgac gtcagttaag acttcgtatt ttaagagtta aacacgagcc    120
ttaaagagcg atattttttt tgttaaacac ttccaactta atacaattgg caaactttca    180
aaaataaagt ggaaaaggag gtaaaaaaga tgaaaaaaat tcgcatacaa tagaatacaa    240
taaaatgtgt tgtctttact gtcaacactt actgttcgtt cggtcacagc tgtgaatcgg    300
ggtgacttta tgtttgtagt ggtcttaaaa acgggtactt ggttgttttg aaaattttaa    360
aacctacata tgattctcct aaaattttgt ttataaatta gcaccatttg cgacctaaat    420
cttttttgta gtcttaagtt tagttgacat aaaaacaaaa tttgtaacaa cacacggtat    480
aaactaaata gcttcagatg ggtcgtatga caaggaaact tttaaataat tatgaaagtt     540
tttttaaaat ttgactaagg tttagattat gtgggtgaca tgcttcgaca cgtttctttt     600
tgtttgtgaa agttcagttt tctgtttgtt gtgtgtgtgg aggtttggtt tctgtaggtg     660
gcgtgttttc tacagttttc cattcgttaa gtcaacagtt gttttattac agtgttacca     720
ttactctctc cacaatacct caaagttcta ctctgtgaat cctgacaagc cagagtacat     780
tctttcaggt ttagttctag ggctactagc ccaaaaaatg cgcccagttc agtccaaagg     840
agtagatcta ggcttgtgtg atgaaacgag gttcgagtgt aagtgtggcg atccaggcta     900
tgtgttcaac attccagtga aacaatgtac atacttttat cgatggaggc cgtattgtaa     960
accatgtgat gacctggagg ctaaggatat ttgtccaaag tacaaacgat gtcaagagtg     1020
taaggctggt cttgatagtt gtgttacttg tccacctaac aaatatggta cttggtgtag     1080
cggtgaatgt cagtgtaaga atggaggtat ctgtgaccag aggacaggag cttgtgcatg     1140
tcgtgacaga tatgaagggg tgcactgtga aattctcaaa ggttgtcctc ttcttccatc     1200
ggattctcag gttcaggaag tcagaaatcc accagataat ccccaaacta ttgactacag     1260
ctgttcacca gggttcaagc ttaagggtat ggcacgaatt agctgtctcc caaatggaca     1320
gtggagtaac tttccaccca aatgtattcg agaatgtgcc atggtttcat ctccagaaca     1380
tgggaaagtg aatgctctta gtggtgatat gatagaaggg gctactttac ggttctcatg     1440
tgatagtccc tactacttga ttggtcaaga aacattaacc tgtcagggta atggtcagtg     1500
gaatggacag ataccacaat gtaagaactt agtcttctgt cctgacctgg atcctgtaaa     1560
ccatgctgaa cacaaggtta aaattggtgt ggaacaaaaa tatggtcagt ttcctcaagg     1620
cactgaagtg acctatacgt gttcgggtaa ctacttcttg atgggttttg acaccttaaa     1680
atgtaaccct gatgggtctt ggtcaggatc acagccatcc tgtgttaaag tggcagacag     1740
agaggtcgac tgtgacagta aagctgtaga cttcttggat gatgttggtg aacctgtcag     1800
gatccactgt cctgctggct gttctttgac agctggtact gtgtggggta cagccatata     1860
ccatgaactt tcctcagtgt gtcgtgcagc catccatgct ggcaagcttc caaactctgg     1920
aggagcggtg catgttgtga acaatggccc ctactcggac tttctgggta gtgacctgaa     1980
tgggataaaa tccgaagagt tgaagtctct tgcccggagt ttccgattcg attatgtcag     2040
ttcctccaca gcaggtaaat caggatgtcc tgatggatgg tttgaggtag acgagaactg     2100
tgtgtacgtt acatcaaaac agagagcctg ggaaagagct caaggtgtgt gtaccaatat     2160
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ctttatttgg gagttaatgg atcgtagtaa tgtggttctg aatgataacc taacattctg     2340
ggcctctggc gaacctggaa atgaaactaa ctgtgtatat atggacatcc aagatcagtt     2400
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tctgtcagac agaaataaag ccaaatgcga tgatcctgga tcactggaaa atggacacgc     2520
cacacttcat ggacaaagta ttgatgggtt ctatgctggt tcttctataa ggtacagctg     2580
tgaggttctc cactacctca gtggaactga aaccgtaact tgtacaacaa atggcacatg     2640
gagtgctcct aaacctcgat gtatcaaagt catcacctgc caaaaccccc ctgtaccatc     2700
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acctttcttg aggttgccac ggttacccct cccattagcc agagcagcca aacctcctcc     2820
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acttggatct caaggcagaa gatgtgactc taatggaaac tggagtggtc ggccagcgag     3000
ctgtattcca gtttgtggac ggtcagactc tcctcgttct ccttttatct ggaatgggaa     3060
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aaataaatat agaacaaatc tattataaaa aaaaaaaaaa aa                       4182
<210>6
<211>1083
<212>PRT
<213>Carcinoscorpius rotundicauda
<400>6
Met Trp Val Thr Cys Phe Asp Thr Phe Leu Phe Val Cys Glu Ser Ser
 1               5                  10                  15
Val Phe Cys Leu Leu Cys Val Trp Arg Phe Gly Phe Cys Arg Trp Arg
            20                  25                  30
Val Phe Tyr Ser Phe Pro Phe Val Lys Ser Thr Val Val Leu Leu Gln
        35                  40                  45
Cys Tyr His Tyr Ser Leu His Asn Thr Ser Lys Phe Tyr Ser Val Asn
    50                  55                  60
Pro Asp Lys Pro Glu Tyr Ile Leu Ser Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ala Gln Lys Met Arg Pro Val Gln Ser Lys Gly Val Asp Leu Gly Leu
                85                  90                  95
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
            100                 105                 110
Phe Asn Ile Pro Val Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
        115                 120                 125
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
    130                 135                 140
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
145                 150                 155                 160
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
                165                 170                 175
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Ala Cys Arg
            180                 185                 190
Asp Arg Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
    210                 215                 220
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
225                 230                 235                 240
Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Asn Phe Pro
                245                 250                 255
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val Ser Ser Pro Glu His Gly
            260                 265                 270
Lys Val Asn Ala Leu Ser Gly Asp Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
        275                 280                 285
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
    290                 295                 300
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Asn
305                 310                 315                 320
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Lys
                325                 330                 335
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
            340                 345                 350
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asp
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
    370                 375                 380
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
385                 390                 395                 400
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
                405                 410                 415
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
            420                 425                 430
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
        435                 440                 445
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
    450                 455                 460
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
465                 470                 475                 480
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly
                485                 490                 495
Lys Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Asp Glu Asn Cys Val
            500                 505                 510
Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys
        515                 520                 525
Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Val Ile Pro
    530                 535                 540
Asn Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp
545                 550                 555                 560
Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Ile Trp Glu Leu
                565                 570                 575
Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala
            580                 585                 590
Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Met Asp Ile Gln
        595                 600                 605
Asp Gln Leu Gln Ser Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser
    610                 615                 620
Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys
625                 630                 635                 640
Asp Asp Pro Gly Ser Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln
                645                 650                 655
Ser lle Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser lle Arg Tyr Ser Cys Glu
            660                 665                 670
Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn
        675                 680                 685
Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys
    690                 695                700
Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro
705                 710                 715                 720
Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu
                725                 730                 735
Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys
            740                 745                 750
Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
        755                 760                 765
Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
    770                 775                 780
Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
785                 790                 795                 800
Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
                805                 810                 815
Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
            820                 825                 830
Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu
        835                 840                 845
Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
    850                 855                 860
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Ala Glu Ile Ile Asp Pro Asn Gln Phe Lys Met Tyr Leu Gly Lys Tyr
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Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
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Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe
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Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
945                 950                 955                 960
Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn
                965                 970                 975
Asn Thr Tyr Ser Glu Thr Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala
            980                 985                 990
Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr
        995                 1000                1005
Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
    1010                1015                1020
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
1025                1030                1035               1040
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
                1045                1050                1055
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
            1060                1065                1070
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
        1075                1080
<210>7
<211>3438
<212>DNA
<213>Carcinoscorpius rotundicauda
<400>7
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tactagccca aaaaatgcgc ccagttcagt ccaaaggagt agatctaggc ttgtgtgatg    120
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cgtggatagg attgcacaga ctagatgctg agaagccctt tatttgggag ttaatggatc    1560
gtagtaatgt ggttctgaat gataacctaa cattctgggc ctctggcgaa cctggaaatg    1620
aaactaactg tgtatatatg gacatccaag atcagttgca gtctgtgtgg aaaaccaagt    1680
catgttttca gccctcaagt tttgcttgca tgatggatct gtcagacaga aataaagcca    1740
aatgcgatga tcctggatca ctggaaaatg gacacgccac acttcatgga caaagtattg    1800
atgggttcta tgctggttct tctataaggt acagctgtga ggttctccac tacctcagtg    1860
gaactgaaac cgtaacttgt acaacaaatg gcacatggag tgctcctaaa cctcgatgta    1920
tcaaagtcat cacctgccaa aacccccctg taccatcata tggttctgtg gaaatcaaac    1980
ccccaagtcg gacaaactcg ataagtcgtg ttgggtcacc tttcttgagg ttgccacggt    2040
tacccctccc attagctaga gcagccaaac ctcctccaaa acctagatcc tcacaaccct    2100
ctactgtgga cttggcttct aaagttaaac tacctgaagg tcattaccgg gtagggtctc    2160
gagccatcta cacgtgcgag tcgagatact acgaactact tggatctcaa ggcagaagat    2220
gtgactctaa tggaaactgg agtggtcggc cagcgagctg tattccagtt tgtggacggt    2280
cagactctcc tcgttctcct tttatctgga atgggaattc tacagaaata ggtcagtggc    2340
cgtggcaggc aggaatctct agatggcttg cagaccacaa tatgtggttt ctccagtgtg    2400
gaggatctct attgaatgag aaatggatcg tcactgctgc ccactgtgtc acctactctg    2460
ctactgctga gattattgac cccaatcagt ttaaaatgta tctgggcaag tactaccgtg    2520
atgacagtag agacgatgac tatgtacaag taagagaggc tcttgagatc cacgtgaatc    2580
ctaactacga ccccggcaat ctcaactttg acatagccct aattcaactg aaaactcctg    2640
ttactttgac aacacgagtc caaccaatct gtctgcctac tgacatcaca acaagagaac    2700
acttgaagga gggaacatta gcagtggtga caggttgggg tttgaatgaa aacaacacct    2760
attcagagac gattcaacaa gctgtgctac ctgttgttgc agccagcacc tgtgaagagg    2820
ggtacaagga agcagactta ccactgacag taacagagaa catgttctgt gcaggttaca    2880
agaagggacg ttatgatgcc tgcagtgggg acagtggagg acctttagtg tttgctgatg    2940
attcccgtac cgaaaggcgg tgggtcttgg aagggattgt cagctggggc agtcccagtg    3000
gatgtggcaa ggcgaaccag tacgggggct tcactaaagt taacgttttc ctgtcatgga    3060
ttaggcagtt catttgaaac tgatctaaat attttaagca tggttataaa cgtcttgttt    3120
cctattattg ctttactagt ttaacccata agaaggttaa ctgggtaagg cacaaggatc    3180
attgtttctg tttgttttta caaatggtta ttttagtcag tgaatgagaa tagtatccat    3240
tgaagactgt taccttttat tctacctttt tatattacta tgtaagtatt tgggatatct    3300
tctacacatg aaaattctgt cattttacca taaatttggt ttctggtgtg tgctaagtcc    3360
accagtagag aacgatgtaa ttttcactag cacatgaaat aaatatagaa caaatctatt    3420
ataaactacc ttaaaaaa                                                  3438
<210>8
<211>1019
<212>PRT
<213>Carcinoscorpius rotundicauda
<400>8
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
 1               5                  10                  15
Ala Gln Lys Met Arg Pro Val Gln Ser Lys Gly Val Asp Leu Gly Leu
            20                  25                  30
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
        35                  40                  45
Phe Asn Ile Pro Val Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
    50                  55                  60
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
            100                 105                 110
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Ala Cys Arg
        115                 120                 125
Asp Arg Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145                 150                 155                 160
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
                165                 170                 175
Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Asn Phe Pro
            180                 185                 190
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val Ser Ser Pro Glu His Gly
        195                 200                 205
Lys Val Asn Ala Leu Ser Gly Asp Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
    210                 215                 220
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225                 230                 235                 240
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Asn
                245                 250                 255
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Lys
            260                 265                 270
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
        275                 280                 285
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asp
    290                 295                 300
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305                 310                 315                 320
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
                325                 330                 335
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
            340                 345                  350
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
        355                 360                 365
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
    370                 375                 380
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
385                 390                 395                 400
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
                405                 410                 415
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Arg Ser Ser Thr Ala Gly
            420                 425                 430
Lys Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Asp Glu Asn Cys Val
        435                 440                 445
Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys
    450                 455                 460
Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Val Ile Pro
465                 470                 475                 480
Asn Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp
                485                490                  495
Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Ile Trp Glu Leu
            500                 505                 510
Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala
        515                 520                 525
Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Met Asp Ile Gln
    530                 535                 540
Asp Gln Leu Gln Ser Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser
545                 550                 555                 560
Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys
                565                 570                 575
Asp Asp Pro Gly Ser Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln
            580                 585                 590
Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu
        595                 600                 605
Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn
    610                 615                 620
Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys
625                 630                 635                 640
Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro
                645                 650                 655
Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu
            660                 665                 670
Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys
        675                 680                 685
Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
    690                 695                 700
Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
705                 710                 715                 720
Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
                725                 730                 735
Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
            740                 745                 750
Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
        755                 760                 765
Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu
    770                 775                 780
Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
785                 790                 795                 800
Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr
                805                 810                 815
Ala Glu lle lle Asp Pro Asn Gln Phe Lys Met Tyr Leu Gly Lys Tyr
            820                 825                 830
Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
        835                 840                 845
Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe
    850                 855                 860
Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg
865                 870                 875                 880
Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
                885                 890                 895
Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn
            900                 905                 910
Asn Thr Tyr Ser Glu Thr Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala
        915                 920                 925
Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr
    930                 935                 940
Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
945                 950                 955                 960
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
                965                 970                 975
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
            980                 985                 990
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
        995                 1000                1005
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
    1010                1015

Claims (29)

1.一种检测内毒素的试剂，含有：纯化的鲎因子C蛋白；和表面活性剂。
2.权利要求1的试剂，其中所述表面活性剂选自：(I)下式代表的两性表面活性剂：
Figure A028142960002C1
其中R1是具有1-4个碳原子的亚烷基；
Y和Y′各自是(1)氢，(2)低级烷基，或(3)羟基低级烷基；
R2和R3各自是(1)低级烷基或(2)羟基低级烷基；
n是0或1，当n是0时，R4是具有大约8至大约18个碳原子的烷基；
当n是1时，R4是具有1至大约6个碳原子的亚烷基；
R5是具有大约8至大约18个碳原子的烷基；和
M是氢，钠，钾或铵；
(II)下式代表的阴离子表面活性剂：
(R6)n1-(Y)Ar(SO3M)n2      (E)
R5OSO3M         (F)
其中R5，Y，和M具有上面给出的相同的定义；
R6是8-24个碳原子的烷基；
nl是1-3的整数；
n2是1或2；和
Ar是苯基或萘基；
(III)下式代表的阳离子表面活性剂：
Figure A028142960003C1
其中R5，Y，和Y′具有上面给出的相同的定义；
(IV)下式代表的非离子型表面活性剂：
R5R7R8N→O    (H)
其中
R5具有上面给出的相同的定义，
R7和R8各自是甲基或乙基；和
(V)选自大约10-30摩尔的环氧乙烷与具有6个碳原子的六元醇和具有10-20个碳原子的酯基的单酯的缩合产物的那些非离子型表面活性剂。
3.权利要求1的试剂，其中所述鲎是Limulus polyphemus。
4.权利要求1的试剂，其中所述鲎是Carcinoscorpiusrotundicauda。
5.权利要求1的试剂，其中所述鲎是Tachypleus tridentatus。
6.权利要求1的试剂，其中所述鲎是Tachypleus gigas。
7.权利要求1的试剂，其中所述因子C蛋白通过在将因子C蛋白表达到上清液中的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的载体的宿主细胞的方法来制备。
8.权利要求7的试剂，其中所述宿主细胞是Sf9细胞。
9.权利要求7的试剂，其中所述鲎是Carcinoscorpiusrotundicauda。
10.权利要求1-9的任一项的试剂，其中所述表面活性剂选自ZWITTERGENT 3-14，Triton X-100，TritonX-114，辛基-β-D-硫代糖苷，Genapol C-100，Tween 20和Tween80。
11.一种测定试验样品中内毒素的方法，包括步骤：
使试验样品接触(1)含有(a)纯化鲎因子C蛋白和(b)表面活性剂和(2)因子C底物的试剂，其中因子C底物的裂解产生可检测信号，从而形成接触过的试验样品，形成试验样品-试剂-底物混合物；和
测定接触过的试验样品存在或不存在可检测信号，其中可检测信号的量相对于不含有内毒素的对照样品有所增加从而表明试验样品中存在内毒素。
12.权利要求11的方法，其中所述鲎是Limulus polyphemus。
13.权利要求11的方法，其中所述鲎是Carcinoscorpiusrotundicauda。
14.权利要求11的方法，其中所述鲎是Tachypleus tridentatus。
15.权利要求11的方法，其中所述鲎是Tachypleus gigas。
16.权利要求11的方法，其中所述因子C蛋白通过下面的方法制备：
在因子C蛋白被表达到上清液中的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的载体的宿主细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述宿主细胞是Sf9细胞。
18.权利要求15的方法，其中所述鲎是Carcinoscorpiusrotundicauda。
19.权利要求11-18中任一项的方法，其中所述表面活性剂选自ZWITTERGENT 3-14，Triton X-100，TritonX-114，辛基-β-D-硫代糖苷，Genapol C-100，Tween 20和Tween80。
20.权利要求11的方法，其中所述因子C底物选自N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素和N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
21.一种检测试验样品中的内毒素的方法，包括步骤：
使试验样品接触(1)一种试剂，该试剂含有(a)重组Carcinoscorpiusrotundicauda因子C蛋白，其中所述因子C蛋白通过在将因子C蛋白表达到上清液中的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的载体的宿主细胞的方法来制备和(b)表面活性剂和(2)N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素，从而形成接触过的试验样品；和
测定接触过的试验样品存在或不存在荧光信号，其中荧光信号的量相对于不含有内毒素的对照样品有所增加从而表明试验样品中存在内毒素。
22.权利要求21的方法，其中所述宿主细胞是Sf9细胞。
23.一种检测内毒素的试剂盒，包括：
一种试剂，其含有(a)纯化的鲎因子C蛋白和(b)表面活性剂，
和对实施权利要求11的方法的说明书。
24.权利要求23的试剂盒，进一步包括因子C底物，其中因子C底物的裂解产生可检测信号。
25.权利要求24的试剂盒，其中所述因子C底物选自N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素和N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
26.权利要求23的试剂盒，其中所述纯化的因子C通过在将因子C蛋白表达到上清液中的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的载体的宿主细胞的方法来制备。
27.权利要求26的试剂盒，其中所述宿主细胞是Sf9细胞。
28.一种测定试验样品中内毒素的方法，包括步骤：
使试验样品接触一种试剂，该试剂含有(a)纯化的鲎因子C蛋白和(b)表面活性剂，从而形成试验样品-试剂混合物；
试验样品-试剂混合物与因子C底物接触，其中因子C底物的裂解产生可检测信号；和
测定接触过的试验样品-试剂混合物测定存在或不存在可检测信号，其中可检测信号的量相对于不含有内毒素的对照样品有所增加从而表明试验样品中存在内毒素。
29.一种测定试验样品中内毒素的方法，包括步骤：
使试验样品接触一种试剂，该试剂含有(a)重组Carcinoscorpiusrotundicauda因子C蛋白，其中所述因子C蛋白通过在将因子C蛋白表达到上清液中的条件下在上清液中培养包含编码因子C蛋白的载体的宿主细胞的方法来制备，和(b)表面活性剂，从而形成试验样品-试剂混合物；
接触试验样品-试剂混合物与N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素；和
测定接触过的试验样品-试剂混合物存在或不存在荧光信号，其中荧光信号的量相对于不含有内毒素的对照样品有所增加从而表明试验样品中存在内毒素。
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