CN103290054A - 应用昆虫细胞表达重组的中国鲎c因子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域,具体是一种用于内毒素检测和去除的中国鲎C因子(Factor C from Tachypleus tridentatus)基因在昆虫细胞中重组表达的方法。包括含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒的制备及转染昆虫细胞,重组中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达检测等。通过本方法制备的重组中国鲎C因子为研究其内毒素结合活性提供了前提,更为其作为检测内毒素和去除内毒素的应用奠定了基础。
Description
技术领域:
本发明涉及生物工程领域,具体的说是制备含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒,并用于转染昆虫细胞,表达重组的中国鲎C因子。
背景技术:
临床输液反应以热原反应危害最大,发生率最高。内毒素(即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子,lipopolysaccharide,LPS)是研究最透彻也是最常见的生物热原,同时更是各大药厂必须面对的难题,因为注射时即使是pg级别的痕量LPS,也会导致病人严重的热原反应。因此,灵敏可靠的内毒素诊断技术是非常必须的。
海鲎的阿米巴样细胞(amoebocytes)对LPS具有超强敏感性,在革兰氏阴性细菌入侵时,它能通过一系列的酶促反应,对外来入侵的细菌产生级联凝集反应,使入侵的微生物失效(1,2)。这一过程包括酶原状态的C因子(Factor C)识别并结合内毒素而被激活,变成活性酶的状态后,将下游的B因子激活,活化的B因子将凝固酶原转化为凝固酶,凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白,凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶(3,4)。
利用海鲎血液阿米巴样细胞溶解物制成的鲎试剂,能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素。自上世纪70年代中期,这一内毒素测试方法开始用于医药领域,并且很快被世界各国广泛采用,中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法。经过几十年的发展和改良,鲎试剂内毒素检测法已应用于制药、医疗器械、非内服制剂、医药制品、生物制剂、水质、食品检测以及科研等各大领域(5)。
目前世界上仅有四种海鲎,即美国鲎(Limulus polyphemus),中国鲎(Tachypleustridentatus),马来鲎(Tachypleus gigas)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)。而能够用于鲎试剂生产的仅有美国鲎和中国鲎两种,对应的鲎试剂分别称之为LAL(Limulusamoebocyte lysate)和TAL(Tachypleus Amebocyte Lysate),二者反应原理及功效相同,但也存在理化特性的差别,如与内毒素反应的最适pH值等(6)。
虽然鲎试剂检测法(LAL/TAL)具有高灵敏度(可检测飞克级内毒素)、快速等优点,但是由于采用成分复杂的细胞裂解物作为反应原料,同样具有无法克服的缺陷。比如,非特异性干扰问题:鲎试剂除了能与内毒素反应外,还会与(1-3)-β-D-葡聚糖反应(1)。(1-3)-β-D-葡聚糖是在真菌、酵母、蘑菇、高等植物中广泛存在的一种多糖,是构成细胞壁的结构大分子。因此鲎试剂检测过程中很容易遇到(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性干扰,造成假阳性结果,这对于成分复杂的药物,尤其是中药,是一个很大的检测挑战(7)。再比如,批次稳定性问题:鲎试剂采用海鲎血液作为生产原料,由于季节、地域等差异,使得鲎试剂的批次差异成为常见现象。而且,由于环境污染、过度捕捞等原因海鲎的种群数量近年来急剧减少,接近灭绝(8),使得生产鲎试剂的原材料面临日益匮乏的危险。
鲎试剂的主要成分是一系列的丝氨酸蛋白酶原(9,10),其中C因子在内毒素检测方法中是关键分子,在内毒素介导的鲎血凝集反应***中,它特异性识别内毒素,并第一个被内毒素激活,从而启动整个鲎血细胞中的凝集级联反应(11,12)。因此,以鲎试剂的关键分子C因子作为基础,利用其识别并结合内毒素后,由蛋白酶原被激活为活性酶形式,从而能够水解发光底物的特点,结合化学/荧光发光定量技术,可以发展出以C因子作为单一成分的内毒素检测定量技术(13),与传统的LAL测定技术比较,重组C因子在相同的分析条件下对内毒素具有更低的背景、更高的灵敏度(14)。
基于C因子的内毒素检测技术成分单一,可以使用生物工程技术进行生产和严格的质量控制,从而避免了由原材料引起的批次不稳定性,同时保护了海鲎这一古老的“活化石”物种。尤为重要的是,这一新技术消除了传统鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性反应,可以大大增强内毒素检测的特异性,降低“假阳性”结果的发生概率。此外,通过与内毒素的特异结合,重组C因子还可以进一步应用于医药产品、生物制品等内毒素去除。
综上,利用生物工程的方法异源表达鲎C因子,以应用于内毒素检测试剂的产品开发,具有重要的临床意义和巨大的商业价值。
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14.Ding,J.L.,and Ho,B.(2001)Trends Biotechnol 19,277-281
发明内容:
本发明目的在于提供一种用昆虫细胞重组表达中国鲎C因子的方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
1)含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒供体质粒pFASTBacHTA-FC转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac;
2)筛选和鉴定含有C因子的重组杆粒(FC-Bacmid);
3)抽提重组了C因子的重组杆粒DNA;
4)重组了C因子的重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞;
5)检测C因子在昆虫细胞中的表达,确定最佳表达时间和感染复数(MOI)。
本发明具有以下优点:
1.本发明首次将中国鲎C因子基因整合到杆状病毒基因组中,制备含中国鲎C因子的重组杆粒。
2.本发明首次在昆虫细胞中表达中国鲎C因子,为得到大量有活性的重组C因子奠定了基础。
附图说明:
下面结合附图和实施例对本专利进行进一步说明。
图1是重组了中国鲎C因子的杆粒的抽提和菌落PCR鉴定的结果。-为以蓝色菌落为模板,以M13 Primer F和M13 Primer R作为引物,此为负对照;1为以白色菌落作为模板,以M13Primer F和FC Primer R作为引物;2为以白色菌落作为模板,以M13 Primer R和FC PrimerF作为引物;3-6,以白色菌落作为模板,以M13 Primer F和M13 Primer R作为引物;最后两道为提纯的重组杆粒样品。m为核酸分子量标签,自上到下分别为5kb,3kb,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp,100bp。
图2是重组了中国鲎C因子的杆粒PCR鉴定的结果。+为以pFASTBACHTA-FC质粒为模板,此为阳性对照;1-4为以提纯的重组杆粒(FC-Bacmid)为模板,以FC Primer F和FC PrimerR作为引物PCR得到的条带;m为核酸分子量标签,自上到下分别为5kb,3kb,2kb,1.5kb,1kb,750bp和500bp。
图3是重组了中国鲎C因子的杆粒DNA转染Sf9细胞后检测细胞内重组C因子的表达。泳道1为未转染杆粒DNA的Sf9细胞,此为阴性对照;2为转染了阳性对照杆粒DNA的细胞(重组蛋白分子量~90kDa);3为转染了5μg重组杆粒DNA(FC-Bacmid)的细胞;4为转染了10μg重组杆粒DNA(FC-Bacmid)的细胞。转染细胞72小时后,通过Western Blot的方法用anti-His抗体检测重组中国鲎C因子的表达。
具体实施方式:
实施实例1含有中国鲎C因子的重组质粒pFASTBacHTA-FC转化DH10Bac感受态细胞:
取2μl浓度为0.1μg/μl的pFASTBacHTA-FC质粒转化100μl大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,冰上放30min,42℃热激90s,迅速放冰上5min,加入1ml LB,37℃复苏3.5hr后涂三抗性LB平板。37℃培养40hr后观测菌落的颜色。
其中三抗性LB平板含有50μg/ml Kanamycin,7μg/ml Gentamicin和10μg/mlTetracycline,100μg/ml Bluo-gal和40μg/ml IPTG,平板放4℃避光保存。
实施实例2含有中国鲎C因子的重组杆粒(FC-Bacmid)的筛选和鉴定:
挑如实例1中所述的白色单菌落,重新划LB平板培养,连续划两至三次,直到不产生蓝色菌落为止。挑连续划几次后仍然是白色的菌落到含有三抗性的LB试管中37℃培养4小时后,以菌液为模板用PCR法鉴定阳性克隆。
PCR体系:F:100pmol,R:100pmol,dNTPs:各50pmol,5×Prime star DNA聚合酶buffer:10μl,Prime star DNA聚合酶:5U,无菌水补足50μl。
PCR反应条件:将上述PCR反应体系混匀,第一阶段95℃预变性3min;第二阶段95℃,1min;54℃,1min;72℃,3min20s;共进行30个循环;第三阶段72℃延伸10min。
引物为:
FC Primer F:5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’
FC Primer R:5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’
M13 Primer F:5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’
M13 Primer R:5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
实施实例3含有中国鲎C因子基因的重组杆粒DNA(FC-Bacmid)的抽提:
挑经过PCR鉴定为阳性的单菌落至含有50μg/ml Kanamycin,7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline的5ml LB培养基试管中,37℃振荡培养24小时;取1.5ml菌液,12000rpm,室温离心2min,去上清;用300μl溶液I(15mM Tris-HCl,pH 8.0,10mMEDTA,100μg/ml RNase A)轻轻重悬菌体,再加入300μl溶液II(0.2N NaOH,1% SDS),轻柔旋转混匀,室温放置5min;慢慢加入300μl浓度为3M的乙酸钾(pH 5.5),边加边轻轻混匀,然后置冰上5-10min;12000rpm离心10min,将800μl上清小心转移至已加入800μl异丙醇的EP管中,轻轻混匀,然后置冰上5-10min;12000rpm,室温离心15min;弃去上清,加入500μl 70%的乙醇,翻转几次以清洗沉淀,12000rpm,室温离心15min;重复一次;仔细弃去上清,让沉淀在空气中干燥5-10min,然后用40μl TE缓冲液溶解沉淀。此为重组了C因子的杆粒DNA,冻于-20℃备用。
实施实例4含有中国鲎C因子基因的重组杆粒DNA(FC-Bacmid)转染Sf9昆虫细胞的方法:
Sf9细胞预分至六孔板中(9×105细胞/孔),27℃预培养2hr;分别取5μl或者10μl(1μg/μl)FC-bacmid与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀;取6μl转染试剂Cellfectin与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀;将上述稀释好的质粒及转染试剂混匀,室温孵育20min;同时以2ml无添加成分的Grace’s培养基洗六孔板细胞并弃去洗液。取0.8ml无添加成分的Grace’s培养基加入洗涤后的六孔板细胞中,再加入质粒和转染试剂的混合物,轻轻摇匀。同时设一个阳性对照和阴性对照。转染5小时候后换含血清及抗生素的培养基,27℃培养72小时,低速离心收集培养上清,即获得了重组中国鲎C因子的P1病毒样品。
将所得的P1病毒液依次稀释2-3个梯度加到弃去培养基的Sf9单层细胞上,作用1hr,吸去上清,将含血清的完全培养基和2.2%低熔点琼脂糖按1∶1比例混合,加X-gal至众浓度为150μg/ml,立即快速加到细胞上,等胶凝固后,倒置6孔板,置于27℃培养箱中培养,直到噬斑出现。计算噬斑数,通过公式滴度(pfu/ml)=(1/稀释度)×噬斑数,以此确定病毒滴度。
实施实例5确定中国鲎C因子的在昆虫细胞内的最佳表达时间和感染复数(MOI):
将P1病毒感染2×106处于对数生长期的Sf9细胞,置于27℃培养箱中培养,直到细胞完全裂解,低速离心去除细胞碎片,制备高滴度病毒液;以10倍的梯度将高滴度病毒液稀释至10-6和10-7,分别做噬斑分析,计算噬斑数,通过公式滴度(pfu/ml)=(1/稀释度)×噬斑数,以此确定病毒滴度;
再根据公式接种所需高滴度病毒液的体积(ml)=MOI(pfu/cell)×细胞数÷滴度(pfu/ml),计算出MOI为5、7、10时,需要接种高滴度病毒液的体积;同时设不接种病毒液的Sf9细胞的负对照;在感染72hr后收细胞,制备聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品。
实施实例6用Western Blot的方法检测中国鲎C因子在昆虫细胞内的表达:
当Sf9昆虫细胞处于对数生长期时,取适量高滴度的含有中国鲎C因子基因的重组杆粒(FC-Bacmid)感染细胞,27℃培养72hr后,把细胞吹起来,500g低速离心5min,弃上清,细胞沉淀加入1ml PBS重悬,取300μl,500g离心5min,吸净上清,加入100μl 1×SDSloading buffer,涡旋混匀至澄清,100℃煮10min,离心,取10μl上清上样,进行SDS-PAGE,凝胶密度为12%。电泳后用湿转方法转膜,恒压100V,2小时。将膜从电转槽中取出,去离子水稍加漂洗,浸没于5%脱脂牛奶封闭液中室温缓慢摇荡一小时。加入anti-His一抗稀释液,室温下轻摇孵育1小时。一抗孵育结束后,用PBST缓冲液漂洗膜三次,每次10分钟。然后加入二抗,室温轻摇一小时。二抗孵育结束后,用PBST漂洗膜后再浸洗三次。然后用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法检测。湿转使用电转液配置方法为:Tris-base 3.0g,甘氨酸14.4g,甲醇200mL,加去离子水至1000mL。PBST:1×PBS,Tween-200.01%。封闭液与抗体稀释液均为含5%脱脂奶粉的PBST。
Claims (4)
1.中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法,其特征在于:
1)含中国鲎C因子基因的重组杆状病毒供体质粒pFASTBacHTA-FC转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac;
2)含有C因子基因的重组杆粒(FC-Bacmid)的筛选和鉴定;
3)含有C因子基因的重组杆粒DNA的抽提;
4)含有C因子基因的重组杆粒转染昆虫细胞;
5)检测C因子在昆虫细胞中的表达,确定最佳表达时间和感染复数。
2.按权利要求1所述的中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法,其特征是:
a)所述含有C因子基因的重组表达质粒pFASTBacHTA-FC转化DH10Bac的方法,其特征是:取2μl浓度为0.1μg/μl的pFASTBacHTA-FC质粒转化100μl大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,冰上放30min,42℃热激90s,迅速放冰上5min,加入1ml LB,37℃复苏3.5hr后涂三抗性LB平板(50μg/ml Kanamycin,7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline),37℃培养40hr后观测菌落的颜色;
b)所述含有C因子基因的重组杆粒的筛选和鉴定方法,其特征是:挑如a)中所述的白色单菌落,重新划平板培养,连续划两至三次,直到不产生蓝色菌落为止,挑连续划几次后仍然是白色的菌落到含有三抗性的LB试管中37℃培养4小时后,用PCR法鉴定阳性克隆;
PCR体系:F:100pmol,R:100pmol,dNTPs:各50pmol,5×Prime star DNA聚合酶buffer:10μl,Prime star DNA聚合酶:5U,无菌水补足50μl;
PCR反应条件:将上述PCR反应体系混匀,第一阶段95℃预变性3min;第二阶段95℃,1min;54℃,1min;72℃,3min20s;共进行30个循环;第三阶段72℃延伸10min;
引物为:
FC Primer F:5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’
FC Primer R:5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’
M13 Primer F:5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’
M13 Primer R:5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
c)所述含有C因子基因的重组杆粒DNA的抽提,其特征是:挑经过PCR鉴定为阳性的单菌落至含有50μg/ml Kanamycin,7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline的5ml LB培养基的试管中,37℃培养 24小时;取1.5ml菌液离心去上清,用300μl溶液I(15mM Tris-HCl,pH 8.0,10mM EDTA,100μg/ml RNase A)轻轻重悬菌体,再加入300μl溶液II(0.2N NaOH,1%SDS),轻柔旋转混匀,室温放置5min;慢慢加入300μl浓度为3M的乙酸钾(pH 5.5),边加边轻轻混匀,然后置冰上10min;12000rpm离心10min,将800μl上清小心转移至已加入800μl异丙醇的EP管中,轻轻混匀,然后置冰上10min;12000rpm,室温离心15min;弃去上清,加入500μl 70%的乙醇,翻转几次以清洗沉淀,12000rpm,室温离心15min;重复一次;仔细弃去上清,让沉淀在空气中干燥10min,然后用40μl TE缓冲液溶解沉淀。此为重组了C因子的杆粒DNA,冻于-20℃备用。
3.按权利要求1所述的中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法,其特征是:含有中国鲎C因子基因的重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞及噬斑分析确定病毒滴度的方法,其操作方法是:Sf9细胞预分至六孔板中(9×105细胞/孔),27℃预培养2hr;分别取5μl或者10μl(1μg/μl)FC-bacmid与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀;取6ul转染试剂Cellfectin与100μl不含血清和添加剂的Grace’s培养基混匀;将上述稀释好的质粒及转染试剂混匀,室温孵育20min;同时以2ml无添加成分的Grace’s培养基洗六孔板细胞并弃去洗液;取0.8ml无添加成分的Grace’s培养基加入洗涤后的六孔板细胞中,再加入质粒和转染试剂的混合物,轻轻摇匀。同时设一个阳性对照和阴性对照;转染5小时后换含血清及抗生素的培养基,27℃培养72小时,低速离心收集培养上清,即获得了重组中国鲎C因子的P1病毒样品;
将所得的P1病毒液依次稀释2-3个梯度加到弃去培养基的Sf9单层细胞上,作用1hr,吸去上清,将含血清的完全培养基和2.2%低熔点琼脂糖按1∶1比例混合,加X-gal至众浓度为150μg/ml,立即快速加到细胞上,等胶凝固后,倒置6孔板,置于27℃培养箱中培养,直到噬斑出现;计算噬斑数,通过公式滴度(pfu/ml)=(1/稀释度)×噬斑数,以此确定病毒滴度。
4.按权利要求1所述的中国鲎C因子在昆虫细胞中的表达方法,其特征是:确定C因子的最佳表达时间和感染复数(MOI)的操作方法:
a)将P1病毒感染2×106处于对数生长期的Sf9细胞,置于27℃培养箱中培养,直到细胞完全裂解,低速离心去除细胞碎片,制备高滴度病毒液;以10倍的梯度将高滴度病毒液稀释至10-6和10-7,分别做噬斑分析,计算噬斑数,通过公式滴度(pfu/ml)=(1/稀释度)×噬斑数,以此确定病毒滴度;
再根据公式接种所需高滴度病毒液的体积(ml)=MOI(pfu/cell)×细胞数÷滴度(pfu/ml),计算出MOI为5、7、10时,需要接种高滴度病毒液的体积;同时设不接种病毒液的Sf9细胞的负对照;在感染72hr后收细胞,制备聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白样品。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130911 |