MXPA03012032A - Metodos y reactivos para detectar endotoxina. - Google Patents

Abstract

Un reactivo que contiene un Factor C de cangrejo bayoneta purificado, en particular un Factor C producido de manera recombinante y un surfactante pueden ser usados en un ensayo sensible, rapido y reproducible para detectar endotoxina.

Description

METODOS Y REACTIVOS PARA DETECTAR ENDOTOXINA Esta solicitud reclama el beneficio de, e incorpora por referencia, la solicitud provisional co-pendiente serial no. 60/310,125, presentada el 28 de junio de 2001.

CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a reactivos y métodos para detectar endotoxina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La endotoxina bacteriana Gram negativa es un contaminante esparcido de una variedad de materiales, tal como agua, alimentos, productos farmacéuticos y preparaciones parenterales. Las pruebas más comúnmente usadas para contaminación de endotoxina emplean Usados de amebocitos derivados de hemolinfa de cangrejo bayoneta. Sin embargo, conforme las poblaciones de estos animales disminuyen, se vuelve cada vez más importante desarrollar métodos rápidos y confiables para detectar endotoxina que no se basen en la disponibilidad de hemolinfa de cangrejo bayoneta.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona reactivos y métodos para detectar endotoxina. Una modalidad de la invención es un reactivo para detectar endotoxina, comprendiendo una proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada y un surfactante. El surfactante puede ser un surfactante anfotérico representado por las siguientes fórmulas: (B) en donde R-¡ es un radical alquileno que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; Y y Y' son cada uno (1) hidrógeno, (2) alquilo inferior, o (3) hidroxi alquilo inferior; R2 y R3 son cada uno (1) alquilo inferior, o (2) hidroxi alquilo inferior; n es 0 o 1, cuando n es 0, R4 es alquilo conteniendo desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono; cuando n es 1, R4 es un radical alquileno teniendo de 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; R5 es un alquilo conteniendo desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono; y M es hidrógeno, sodio, potasio o amonio. El surfactante puede ser un surfactante aniónico representado por las siguientes fórmulas: (R6)n í.(Y)Ar(S03M)n2 (E) R5OS03M (F) en donde R5, Y y M tienen el mismo significado como se expone antes; R6 es un alquilo desde 8 hasta 24 átomos de carbono; n 1 es un entero desde 1 hasta 3; n2 es 1 o 2; y Ar es fenilo o naftilo. El surfactante puede ser un surfactante catiónico representado por la siguiente fórmula: R5 en donde R5, Y y Y' tienen el mismo significado como se expone antes. El surfactante puede ser un surfactante no iónico representado por la siguiente fórmula: R5R7R8N?0 (H) en donde R5, Y y Y' tienen el mismo significado como se expone antes y R7 y R8 son cada uno metilo o etilo. El surfactante puede ser aquéllos surfactantes no iónicos seleccionados del grupo que consiste del producto de condensación de aproximadamente 1 0 hsata 30 moles de óxido de etileno con el monoéster de un alcohol hexahídrico conteniendo 6 átomos de carbono con el grupo éster conteniendo 1 0 hasta 20 átomos de carbono. Incluso otra modalidad de la invención es un método para detectar endotoxina en una muestra de prueba. Una muestra de prueba es contactada con (1) un reactivo comprendiendo (a) una proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada y (b) un surfactante para formar una mezcla de muestra de prueba-reactivo y (2) un substrato de Factor C para formar una muestra de prueba contactada. El corte del substrato de Factor C genera una señal detectable. La muestra de prueba contactada es ensayada por la presencia o asuencia de la señal detectable. Una cantidad de la señal detectable que es incrementada en relación a una muestra de control que no contiene endotoxina indica una presencia de endotoxina en la muestra de prueba. Una modalidad adicional de la invención es un método para detectar endotoxina en una muestra de prueba. Una muestra de prueba es contactada con (1) un reactivo que comprende (a) una proteína de Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda recombinante y (b) un surfactante, y (2) N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina, para formar una muestra de prueba contactada. La proteína de Factor C es hecha mediante el método de cultivar una célula huésped comprendiendo un vector que codifica la proteína de Factor C en un sobrenadante bajo condiciones, de manera que la proteína de Factor C es expresada en el sobrenadante. La muestra de prueba contactada es ensayada por la presencia o ausencia de una señal fluorescente. Una cantidad de la señal detectable que es incrementada en relación a una muestra de control que no contiene endotoxina indica una presencia de endotoxina en la muestra de prueba. Otra modal idad de la i nvención es u n método para detectar endotoxina en una m uestra de prueba. Una muestra de prueba es contactada con un reactivo q ue comprende una proteína de Factor C de cang rejo bayoneta purificada y un surfactante com o se describe antes para form ar una mezcla de m uestra de prueba-reactivo . La mezcla de m uestra de prueba-reactivo es contactada con un substrato de Factor C, en donde el corte del substrato de Factor C genera una señal detectable. La mezcla de muestra de prueba-reactivo contactada es ensayada por la presencia o ausen cia de la señal detectable. Una cantidad de la señal detectable que es incrementada en relación a una muestra de control que no contiene endotoxina indica una presencia de endotoxina en la muestra de prueba. I ncl uso otra moda l idad de la invención es un método para detectar endotoxina en una muestra de prueba. U n a muestra de prueba es contactada con un reactivo q ue comprende u na proteína de Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda recom binante y un surfactante. La proteína de Factor C es hecha mediante el método para cu ltivar una célula h uésped que comprende un vector que codifica la proteína de Factor C en un sobrenadante bajo co ndiciones tales que la proteína de Factor C es expresada en el sobren adante. La mezcla de muestra de prueba-reactivo es contactada con N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Am ido-4-metil cumarina. La mezcla de muestra de prueba-reactivo contactada es ensayada por la presencia o ausencia de u na señal fluorescente. Una cantidad de la señal fl uorescente q ue es incrementada en relación a una m uestra de prueba q ue no contiene endotoxina indica una presencia de endotoxina en la muestra de prueba. Todavía otra modalidad de la invención es un conjunto para detectar endotoxina. El conjunto comprende un reactivo que comprende (a) una proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada y (b) un surfactante como se describe antes, junto con instrucciones para un método para detectar endotoxina en una muestra de prueba. El método comprende los pasos de (1) contactar una muestra de prueba con un reactivo que comprende (a) una proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada y (b) un surfactante como se describe antes para formar una mezcla de muestra de prueba-reactivo; (2) contactar la mezcla de muestra de prueba-reactivo con un substrato de Factor C, en donde el corte del substrato de Factor C genera una señal detectable; y (3) ensayar la mezcla de muestra de prueba-reativo contactada por la presencia o ausencia de la señal detectable, en donde una cantidad de la señal detectable que es incrementada en relación a una muestra de control que no contiene endotoxina indica una presencia de endotoxina en la muestra de prueba.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS FIG. 1. Gráfica que muestra el efecto de Zwittergent 3-14 y Tween 20 sobre la actividad de Factor C recombinante. FIG. 2. Gráfica que muestra el efecto de Zwittergente 3-14 y Tween 80 sobre la actividad de Factor C recombinante. FIG. 3. Gráfica que muestra el efecto de Zwittergent 3-14 y Tritón X-114 sobre la actividad de Factor C recombinante. FIG. 4. Gráfica que muestra la detección de endotoxina que usa un substrato de DPR (N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil)-cumarina.

FIG. 5. Gráfica que muestra la detección de endotoxina que usa un substrato de VPR (N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil)-cumarina. FIG. 6. Gráfica que muestra la actividad de Factor C de Limulus a diferentes concentraciones de Zwittergent. FIG. 7. Gráfica que muestra la sensibilidad de endotoxina en la presencia y ausencia de surfactante. FIG. 8. Gráfica que muestra los resultados de un ensayo de endotoxina de un paso, de una hora, usando DPR-cumarina como un substrato. FIG. 9. Gráfica que muestra el efecto de Zwittergent 3-14 y octiltiolglicósido sobre la actividad de Factor C recombinante. FIG. 10. Gráfica que muestra el efecto de Zwittergent 3-14 y Genapol C-100 sobre la actividad de Factor C recombinante. FIG. 11. Gráfica que muestra el efecto de Zwittergent 3-14 y TX-100 sobre la actividad de Factor C recombinante.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención es un reactivo para detectar endotoxina y un método para usar el reactivo. El reactivo comprende una proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada y un surfactante. Este reactivo puede ser usado en conjunción con un substrato para Factor C que, sobre el corte, genera una señal detectable para detectar endotoxina en una muestra de prueba. La presencia del surfactante intensifica la activación del Factor C purificado por endotoxina por tanco como 3-7 veces, permitiendo una medición más rápida y sensible de los niveles de endotoxina en una muestra de prueba. El reactivo contiene, de preferencia, un Factor C recombinante, eliminando así la necesidad de un suministro continuo de hemolinfa de cangrejo bayoneta.

Factor C purificado Un componente del reactivo de esta invención comprende una proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada. El Factor C natura! purificado de cualquiera de las cuatro especies de cangrejo bayoneta conocidas, Limu!us polyphemus, Carcinoscorpius rotundicauda, Tachypleudus tridentata o Tachypleudus gigas, puede usarse en la práctica de la invención. El Factor C natural puede ser un bioquímicamente purificado o el Factor C purificado puede ser producido de manera recombinante. "Factor C purificado", como se usa en la presente, significa una composición de una proteína de Factor C como se define más adelante, que contiene menos de 30% en peso de componentes de lisado de amebocitos naturales no de Factor C de cualquiera de las cuatro especies de cangrejo bayoneta conocidas. La composición incluye específicamente un sobrenadante de cultivo celular, que comprende proteína de Factor C recombinante (ver más adelante). Los métodos para purificar Factor C de cangrejo bayoneta a partir de su fuente natural son conocidos y se describen, por ejemplo, en Nakamura et al., Eur. J. Biochem. 154, 511-21, 1986; Navas et al., Biochem. Intl. 21, 805-13, 1990; Tokunaga et al., J. Biochem. 109, 150-157, 1991; patente estadounidense 5,985,590 y patente estadounidense 5,716,834. Cualquiera de estos métodos o sus equivalentes pueden ser usados para obtener un Factor C purificado. Ver además el Ejemplo 11. La pureza de una preparación de Factor C puede ser valorada mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel de SDS. De preferencia, el Factor C purificado es producido de manera recombinante. Las secuencias de aminoácidos para Factor C natural de Tachypleus tridentata y Carcinoscorpius Rotundicauda son conocidas, ya que son secuencias de codificación que ocurren de manera natural para estas proteínas. SEQ ID NOS:1 y 3 proporcionan secuencias de codificación para las secuencias de aminoácidos de Factor C Tachypleus tridentata mostradas en SEQ ID NOS:2 y 4, respectivamente. SEQ ID NOS:5 y 7 proporcionan secuencias de codificación para las secuencias de aminoácidos de Factor C de Carcionscorpius rotundicauda mostradas en SEQ ID NOS:6 y 8, respectivamente. Debido a la degeneración del código genético, pueden preverse muchas otras secuencias que codificarán cada una de estas proteínas de Factor C naturales, y la invención contempla específicamente el uso de cualquiera de estas secuencias de codificación para producir un Factor C purificado. La invención también abarca el uso de variantes de Factor C purificadas que ocurren de manera natural y no natural, es decir, producidas de manera recombinante, siempre que las variantes retengan una actividad enzimática de Factor C. La actividad enzimática de Factor C puede ser valorada usando cualquier ensayo para actividad enzimática de Factor C conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Tokunaga et al., J.

Biochem. 109, 150-57 (191) y Nakamura et al., Eur. J. Biochem. 176, 89-94, 1988. Los ensayos de endotoxina descritos en los Ejemplos 1 y 13, más adelante, también pueden ser usados. Las variantes de Factor C que ocurren de manera natural incluyen, por ejemplo, productos de variantes de empalme de mRNA de Factor C o genes de Factor C mutados. Las variantes de Factor C que ocurren de manera no natural pueden ser construidas usando substituciones, adiciones o supresiones de bases para producir proteínas teniendo actividad de Factor C. Las variantes de Factor C que ocurren de manera no natural pueden diferir de Factor C que ocurre de manera natural por tanto como 50, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 o 99%, como se determina usando el programa de alineación Blast2 (Blosum62, Expect 10, códigos genéticos estándares). Los fragmentos de Factor C natural y producido recombinantemente que retienen actividad de Factor C también pueden ser usados en la práctica de la invención. De esta manera, "Factor C" como se usa en la presente incluye proteínas que ocurren de manera natural y no natural y fragmentos de proteína que tienen las propiedades descritas antes. Los métodos para producir proteínas recombinantemente son bien conocidos en la técnica y generalmente involucran cultivar una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica la proteína de Factor C en un sobrenadante bajo condiciones, de manera que la proteína es expresada. La proteína expresada puede ser recuperada o, de preferencia, el sobrenadante comprendiendo la proteína expresada es usado directamente como la fuente de Factor C recombinante. De esta manera, el "Factor C purificado" incluye específicamente un sobrenadante, el cual comprende Factor C recombinante. Las células huésped útiles para la producción de Factor C recombinante incluyen, sin limitación, células de levadura y células de insecto. La producción recombinante de Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda en células huésped de Plchia pastoris y Saccharomyces cerevisiae se describe específicamente en la patente estadounidense 5,985,590. Un método particularmente preferido para obtener el Factor C recombinante es producir la proteína en un sistema de baculovirus, como se describe en los Ejemplos 2-5. Brevemente, una secuencia de codificación de Factor C es clonado en pFASTBAd. El plásmido recombinante resultante es transformado en células competentes DH10BAC que contienen un bácmido con un sitio objetivo mini-attTn7 y un plásmido ayudante. En la presencia de proteínas de transposición provistas por el plásmido ayudante, el elemento transponible mini-Tn7 en el plásmido pFASTBAC puede transponerse al sitio objetivo mini-attTn7 en el bácmido. Las colonias que contienen bácmidos recombinantes son identificadas mediante ruptura del gene lacZ . DNA de alto peso molecular es preparado a partir de clones DH10BAC seleccionados conteniendo el bácmido recombinante. Este DNA es usado entonces para transfectar células de insecto S9, las cuales secretarán entonces el Factor C recombinante. Un descubrimiento particularmente sorprendente de la presente invención que el medio de cultivo conteniendo el Factor C secretado, el cual ha sido separado de las células cultivadas, puede usarse junto con un surfactante (descrito antes) como un reactivo en ensayos de endotoxina sin purificación adicional.

Surfactante Los reactivos de la invención también comprenden un surfactante. Los surfactantes útiles en la práctica de la presente invención incluyen aquéllos descritos en la patente estadounidense 4,322,217, aunque también pueden usarse otros surfactantes. Los surfactantes útiles incluyen surfactantes anfotéricos que contienen tanto un grupo amónico como uno catiónico en su estructura. Son ilustrativas las sulfobetaínas representadas por la Fórmula A: Ri es un radical alquilo que tiene de 1 hasta aproximadamente 4 átomos de carbono, Y es cualquier substituyente químicamente adecuado, no perjudicial, que incluye (1) hidrógeno, (2) alquilo inferior substituido o no substituido, por ejemplo, que contiene 1 a 4 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo o hidroxi, etc.; R2 y R3 son seleccionados cada uno de alquilo inferior substituido o no substituido conteniendo 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, tales como, metilo, etilo, propilo, hidroxi etilo, hidroxi metilo, hidroxi propilo, etc. n=0 o 1 , cuando n=0, R4 es alquilo substituido o no substituido, por ejemplo, conteniendo aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono, y cuando n = 1, R4 es un radical alquileno que tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono, R5 es un alquilo substituido o no substituido, por ejemplo, conteniendo aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono. El término "alquileno" abarca tanto radicales de polimetileno como otros radicales alifátícos saturados divalentes. De esta manera, puede haber ramificación en el enlace provisto por el radical alquileno. El término "inferior" significa un radical conteniendo 1 hasta 4 átomos de carbono. Las sulfobetaínas que pueden ser usadas en el reactivo de la presente invención son conocidas en la técnica y han sido descritas como surfactantes zwitteriónicos. La preparación de tales compuestos es descrita, por ejemplo, en Fernley, J. Am. Oil Chem. Soc. 55, 98-103 (1978) y la patente estadounidense 3,280,179. En los surfactantes de sulfobetína preferidos, R2 y R3 en la estructura anterior son metilo. También se prefiere que R-i sea propileno. Un tipo de surfactante de sufobetaína útil que tiene la estructura anterior, en donde n es igual a 0 y R4 es un radical alquilo teniendo desde aproximadamente 8 hasta 18 átomos de carbono, de preferencia un radical alquilo de cadena lineal. Para estos surfactantes de sulfobetaína, una fuente conveniente del componente R4 es alcohol graso de sebo, el cual consiste de una mezcla de varias longitudes de cadena, siendo una composición normal aproximadamente 66 por ciento de C 8, 30 por ciento de Cíe y 4 por ciento C y otros. Otra fuente conveniente es el corte central de alcohol graso de coco destilado, el cual también consiste de una mezcla de varias longitudes de cadena, siendo una composición normal aproximadamente 6 por ciento de C12, 23 por ciento de C1 , 9 por ciento de C 6 y 2 por ciento de C 0. Los surfactantes de sulfobetaína específicos de la estructura anterior, en donde n es igual a 0, son expuestos en la patente estadounidense 3,539,521. Un surfactante particularmente preferido de este tipo es N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amoni-1 -propanosulfonato, el cual está comercialmente disponible de Calbiochem-Behring Corporation bajo la marca comercial ZWITTERGENT 3-14. Otro tipo de surfactante de sulfobetaína útil tiene la estructura anterior, en donde n es igual a 1 y R4 es un radical alquileno teniendo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono. En estas sulfobetaínas, en donde n es igual a 1, R5 es un radical alquilo teniendo desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono. Se prefiere que R5 sea una cadena lineal. Como se discute previamente, fuentes convenientes de radicales alquilo teniendo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono son alcohol graso de sebo y alcohol graso de coco. Los surfactantes de sulfobetaína específicos de la estructura anterior, en donde n es igual a 1 se exponen en la patente estadounidense 3,280,179. Los surfactantes de sulfobetaína particularmente preferidos son 3-(N,N-dimetil-N-acilamidopropilamonio)-2-hidroxi-propano-1 -sulfonatos, en donde el grupo acilo es derivado de alcohol graso de sebo o alcohol graso de coco, con el alcohol graso de coco siendo preferido. Los expertos en la técnica reconocerán que, en la preparación normal de estos derivados de alcoholes grasos de sebo o coco, resultará una mezcla de sulfobetaínas con longitudes de cadena de carbono variantes para los grupos acilo. Como se discute previamente, estos alcoholes grasos contienen, para la mayor parte, longitudes de cadena de carbono que proporcionarán grupos acilo con el número deseado de átomos de carbono, es decir, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono. Así, estas mezclas obtenidas a partir de alcoholes grasos de sebo o coco son útiles para proporcionar el surfactante de sulfobetaína para reactivos de la presente invención. Un material de este tipo particularmente preferido para uso en reactivos de la presente invención es N-cocoamido-propil-N, N-dimetil-N-2-hidroxipropil sulfobetaína. Un ejemplo de este es LONZAINE CS, el cual está comercialmente disponible de Lonza, Inc., Fair Lawn, N.J. Otros surfactantes anfotéricos incluyen los ácidos N-alquilo de cadena larga aminocarboxílicos ilustrados por la Fórmula B: O) ácidos N-alquilo de cadena larga iminodicarboxílicos ilustrados por la Fórmula C: alquilo de cadena larga o amido betaínas ¡lustradas por la Fórmula D donde R-,, R2, R3, R4, Y y n tienen el mismo significado que tiene en la Fórmula A, M es hidrógeno o un metal formador de sal, y Y' tiene el mismo significado que Y en la Fórmula A. Y y Y' pueden ser iguales o diferentes.

Ejemplos de detergentes anfotéricos específicos son ácido N-alquilbeta-aminopropiónico, ácido N-alquil-beta-iminodipropiónico y N-alquil-?,?-dimetil glicina; el grupo alquilo puede ser, por ejemplo, aquél derivado de alcohol graso de coco, alcohol laurílico, alcohol miristílico (o una mezcla de laurílico-miristílico), alcohol de sebo hidrogenado, cetílico, estearílico o mezclas de tales alcoholes. Los ácidos aminopropiónicos e iminodipropiónicos substituidos son frecuentemente suministrados en las formas de sodio u de otras sales, las cuales también pueden usarse en reactivos de la invención. Ejemplos específicos incluyen cocobetaína vendida por Witco Chemical Corporation bajo el nombre EMCOL CC 37-18, cocoamidopropil betaína vendida por Lonza Inc. bajo el nombre LONZAINE CO y N-sebo-beta-iminodipropionato disódico vendido por Henkel Corporation bajo el nombre de DERIPHAT 160. Ejemplos de otros detergentes anfotéricos son las imidazolinas grasas, tales como aquéllas hechas al reaccionar un ácido graso de cadena larga (por ejemplo, de 10 hasta 20 átomos de carbono) con dietilen triamina y ácidos monohalocarboxílicos teniendo 2 hasta 6 átomos de carbono, por ejemplo, 1-coco-5-hidroxietil-5-carboximetilimidazolina.

Ejemplos específicos incluyen cocoimidazolina, la cual está comercialmente disponible bajo el nombre A PHOTERGE -2 de Lonza, Inc., y cáprico dicarboxi ímidazolina, la cual está comercialmente disponible bajo el nombre AMPHOTERGE KJ-2 de Lonza, Inc. Otros ejemplos de surfactantes útiles incluyen surfactantes sintéticos aniónicos, generalmente descritos como aquéllos compuestos que contienen grupos hidrofíücos y lipofílicos en su estructura molecular y que ionizan en un medio acuoso, para dar aniones conteniendo tanto el grupo lipofílico como el grupo hidrofílico. Los alquil aril sulfonatos, los alcano sulfatos y los alquil fenoles oxietilados sulfatados son ilustrados del tipo amónico de compuestos de superficie activa. Los alquil aril sulfonatos son una clase de agentes de superficie activa aniónicos sintéticos representados por la Fórmula E: (R6)ní.(Y)Ar(S03M)n2 (E) En la Fórmula E, R6 es un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada teniendo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono, al menos un R6 teniendo al menos 8 átomos de carbono; n1 es desde 1 hasta 3; n2 es desde 1 hasta 2; Ar es un radical fenilo o uno nafticlo, y Y y M tiene el mismo significado que en la Fórmula B. Rs puede ser, por ejemplo, metilo, etilo, hexilo, octilo, tetraoctilo, iso-octilo, nonilo, decilo, dodecilo, octadecilo y similares. Los compuestos ilustrativos de los alquil aril sulfonatos incluyen dodecilbenceno sulfonato de sodio, decilbenceno sulfonato de sodio, metil dodecilbenceno sulfonato de amonio, dodecilbenceno sulfonato de amonio, octadecilbenceno sulfonato de sodio, nonilbenceno sulfonato de sodio, dodecilnaftaleno sulfonato de sodio, hetadecilbenceno sulfonato de sodio, eicososil naftaleno sulfonato de potasio, undecilnaftaleno sulfonato de etilamina y docosilnaftaleno sulfonato de sodio. Los alquil sulfatos son una clase de agentes de superficie activa amónicos sintéticos representados por la Fórmula F: R5OSO3M (F) donde R5 y tienen el mismo significado que en la Fórmula B. Los compuestos ilustrados de clase de surfactantes anionicos de alquil sulfato incluyen octadecil sulfato de sodio, hexadecil sulfato de sodio, dodecil sulfato de sodio, nonil sulfato de sodio, decil sulfato de amonio, tetradecil sulfato de potasio, dietanolamino octil sulfato, octadecil sulfato de trietanolamina y nonil sulfato de amonio. Los alquilfenoles oxietilados sulfatados son una clase de agentes de superficie activa anionicos sintéticos representados por la Fórmula G: donde A es ya sea oxígeno, azufre, un grupo carbonamida, un grupo tiocarbonamida, un grupo carboxílico o un grupo de éster tiocarboxílico, 2 es un entero desde 3 hasta 8 y R5 y tienen el mismo significado que en la Fórmula B. Los compuestos ilustrativos de la clase de surfactantes aniónicos de alquil fenol oxietilado sulfatado incluyen nonilfenoxil tetraetilenoxi sulfato de amonio, dodecilfenoxi trietilenoxi sulfato de sodio, decilfenoxi tetraetilenoxi sulfato de etanolamina y octilfenoxi trietilenoxi sulfato de potasio. Otros ejemplos de surfactantes útiles incluyen compuestos de superficie activa no iónnicos, los cuales pueden ser descritos ampliamente como compuestos que no ionizan pero adquieren características hidrof ílicas de una cadena lateral oxigenada, tal como poiioxietileno; la parte lipofílica de la molécula puede venir de ácidos grasos, fenol, alcoholes, amidas o aminas. Los compuestos se hacen normalmente al reaccionar un óxido de aiquileno, tal como óxido de etileno, óxido de butileno, óxido de propileno y similares, con ácidos grasos, alcoholes de cadena lineal o ramificada conteniendo uno o más grupos hidroxilo, fenoles, tiofenoles, amidas o aminas para formar polioxialquilen glicoéteres y ésteres, polioxialquilen alquilfenoles, polioxialquilen tiofenoles, polioxialquilen amidas y similares. Generalmente se prefiere reaccionar desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 30, más preferiblemente 1 0 hasta 30, moles de óxido de aiquileno por mol de los ácidos grasos, alcoholes, fenoles, tiofenoles, am idas o am inas. I lustrativos de estos surfactantes no iónicos son los productos obtenidos de la reacción de óxido de aiquileno con un alcohol alifático teniendo desde 8 hasta 18 átomos de carbono, tales como octilo, nonilo, decilo, octadecilo, dodecilo, tetradecilo y similares, con monoésteres de alcoholes hexahídricos, conteniendo el grupo éster 10 hasta 20 átomos de carbono, tales como monolaureato de sorbitán, monooleato de sorbitán y monopalmitato de sorbitán, con un alquil fenol, en el cual el grupo alquilo contiene entre 4 y 20 átomos de carbón, tales como, butilo, dibutilo, amilo, octilo, dodecilo, tetradecilo y similares, o con una alquil amina en la cual el grupo alquilo contiene entre 1 hasta 8 átomos de carbono. Los compuestos ilustrativos de surfactantes no iónicos sintéticos incluyen los productos obtenidos a partir de condensar óxido de etileno u óxido de propileno con los siguientes: propilen glicol, etilen diamina, dietilen glicol, dodecil fenol, nonil fenol, alcohol tetradecílico, N-octadecil dietanolamida, N-dodecil monoetanolamida, monooleato de sorbitán de polioxietileno (20) vendido bajo el nombre TWEEN 80 y monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20) vendido bajo el nombre TWEEN 20. Otros surfactantes no iónicos incluyen óxidos de amina terciaria de cadena larga que corresponden a la Fórmula H: R5 7 8N?0 (H) en donde R5 tiene el mismo significado que en la Fórmula A, y R7 y R8 son cada uno radicales metilo o etilo. La flecha en la fórmula es una representación convencional de un enlace semi-polar. Ejemplos de óxidos de amina adecuados para uso en esta invención incluyen óxido de dimetildodecilamina, óxido de dimetiloctilamina, óxido de dimetildecilamina, óxido de dimetiltridecilamina y óxido de dimetilhexadecilamina, Los agentes de superficie activa catiónicos también pueden ser usados como surfactantes. Tales agentes son aquéllos compuestos de superficie activa, los cuales contienen un grupo hidrofóbico orgánico y un grupo solubilizante catiónico. Los grupos solubilizantes cationicos normales son grupos amina y cuaternarios. Tales agentes de superficie activa cationicos son representados por la Fórmula I : en donde R5, Y y Y' tienen el mismo significado que en la Fórmula C. Otros ejemplos de surfactantes cationicos incluyen las diaminas, tales como aquéllas de Fórmula J: en donde R es un grupo alquilo de aproximadamente 12 hasta 22 átomos de carbono, tales como ?-2-aminoetil estearil amina y ?-2-aminoetil miristil amina; y aminas enlazadas a am ida, tales como aquéllas de Fórmula K: tales como ?-2-amino etilestearil amida y N-amino etil miristil amida; compuestos de amonio cuaternario, en donde normalmente uno de los grupos enlazados al átomo de nitrógeno son grupos alquilo, los cuales contienen 1 a 3 átomos de carbono, incluyendo tales como grupos alquilo de 1 a 3 carbonos soportando substituyentes inertes, tales como grupos fenilo y está presente un anión, tal como halógeno, acetato, metilsulfato, etc. Los compuestos de amonio cuaternario normales son cloruro de etil-dimetilestearil amonio, cloruro de bencil-dimetil-estearll amonio, cloruro de bencildimetil-estearil amonio, cloruro de trimetil estearil amonio, bromuro de trimeti Icetil amonio, cloruro de dimetiletil dilaurilamonio, cloruro de dimetil-propil-miristil amonio y los metosulfatos y acetatos correspondientes. Otro surfactante catiónico adecuado es representado por la Fórmula L: en donde R5 tiene el mismo significado que en la Fórmula A y cada a es un entero desde 1 hasta 15. Un ejemplo es la polietilen glicol amina de sebo hidrogenado, en donde R5 representa el radical de sebo y a+a tiene un valor promedio de 5. Otros surfactantes útiles para uso en el reactivo de Factor C-surfactante incluyen Tritón X-100, Tritón X-114, octil-beta-D-tioglucósido (OTG, Amresco #J575), Genapol C-100 (un alquil polioxietilen C12E10; Calbiochem #345794), Tween 20 y Tween 80.

Reactivo de Factor C-surfacante Para formar un reactivo de la invención, se combinan Factor C purificado y un surfactante en una solución acuosa. Una solución de amortiguador adecuada para este propósito contiene 30 m Tris, pH 8.0, 30 mM NaCI y 0.3% de lactosa. La concentración de Factor C purificado en un reactivo de la invención de preferencia varía desde 0.03-3 g/ml. La concentración de surfactante en el reactivo de la invención varía, de preferencia, desde 0.001-0.003%. Las concentraciones óptimas de Factor C purificado y del surfactante variarán, dependiendo, por ejemplo, de la pureza del Factor C y el surfactante particular. Las concentraciones óptimas de Factor C purificado y de surfactante pueden ser determinadas usando pruebas de rutina. En el ensayo ejemplificado en los Ejemplos 1 y 13, la concentración óptima del surfactante ZWITTERGENT 3-14 es 0.0025%.

Ensayo de endotoxina El reactivo descrito antes puede ser usado en un ensayo para detectar endotoxina en una muestra de prueba. La muestra de prueba puede ser cualquier muestra en la cual sería útil para detectar endotoxina, incluyendo agua, soluciones acuosas, tales como amortiguadores, preparaciones farmacéuticas (por ejemplo, vacunas, fluidos intravenosos, preparaciones de medicamentos), reactivos biomédicos de formación de imágenes (por ejemplo, tintas, soluciones radioactivas), preparaciones de enzimas (por ejemplo, colagenasa), medios de cultivo de tejido, bebidas, sangre, orina, fluido cerebroespinal, linfa, suero y soluciones formadas al incubar agua o una solución acuosa con una muestra sólida, tal como un alimento o un guante quirúrgico. Puede realizarse ya sea un ensayo de dos pasos o uno de un paso. Para realizar el ensayo de dos pasos (Ejemplo 1) se incuba una muestra de prueba con un reactivo conteniendo Factor C purificado y un surfactante, entonces se adiciona un substrato de Factor C que generará una señal detectable sobre el corte. Para realizar el ensayo de un paso (Ejemplo 13), endotoxina, el reactivo que contiene Factor C purificado y un surfactante y un substrato son adicionados juntos. Los substratos que generarán una señal fluorescente sobre el corte son particularmente preferidos, tales como N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina ("DPR", Bachem 1-1560.0050) y N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina ("VPR", Bachem 1-1120-0050). Las concentraciones de DPR generalmente variarán desde aproximadamente 10-100 mM, 25-100 mM, 5-100 mM, 75-100 mM, 25-75 mM, 50-75 m , 25-50 mM o 50-75 mM. La concentración de VPR generalmente varía desde aproximadamente 50-200 mM, 50-150 mM, 50-100 mM, 50-75 mM, 75-150 mM o 75-100 mM. La concentración óptima para un substrato particular varía. Por ejemplo, la concentración óptima de DPR es 50 mM, mientras que la concentración óptima para VPR es 100 mM. Más aún, el substrato particular puede ser elegido dependiendo de los niveles de endotoxina que se espera que estén presentes en la muestra de prueba. El substrato de VPR tiene un mejor rango lineal a mayores concentraciones de endotoxina y el substrato de DPR tiene un mejor rango lineal a menores concentraciones de endotoxina. De esta manera , el DPR puede ser usado en ensayos en los cuales se desea mayor sensibilidad , mientras que VP R es el s ubstrato preferido cuando se espera que estén presentes mayores niveles de endotoxina y se req uiere un a menor sensibilidad . La fluorescencia puede med irse usando cualquier medio conocido en la técnica . Si se usa u n fluorímetro con los substratos de DP R o VPR descritos antes, la excitación es expuesta a 360, 380, 390 o 395 nm (ancho de hend idura de 5-40 nm) y la emis ión es med ida a 440 o 460 nm (ancho de hendidura de 2.5-40 nm) . La medición puede ser ya sea cualitativa o cuantitativa, por referencia a una curva de concentración de endotoxina estándar. El ensayo puede ser realizado en un recipiente claro, tal como una placa de cultivod e tejido de poliestireno o vidrio, o puede realizarse en un recipiente neg ro (por ejem plo , una m icroplaca de 96 cavidades negra). Si se desea , el ensayo puede ser adaptado para clasificación de alto rend imiento de m ú ltiples m uestras usando, por ejem plo, placas de m icrotítulo de 96 cavidades.

Conjuntos La invención también proporciona un conjunto para uso para detectar endotoxina. El conj unto com prende una proteína de Factor C de cang rejo bayoneta purificada y un surfactante, como se describe antes. Las instrucciones para usar el reactivo para detectar endotoxina pueden ser incluidas. Los conj untos también pueden incluir un substrato de Factor C para usarse en el ensayo.

Todas las patentes, solicitudes de patentes y referencias citadas en esta descripción son incorporadas expresamente en la presente por referencia. La descripción anterior generalmente describe la presente invención. Un entendimiento más completo puede ser obtenido por referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales son provistos para fines de ilustración solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Ensayo de endotoxina de dos pasos La endotoxina fue pre-incubada con medio de cultivo conteniendo Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda recombinante obtenido a partir de células Sf9 que producen Factor C recombinante durante 1 hora en amortiguador de ensayo (30 mM Tris, pH 8.0, 30 mM NaCI, 0.3% de lactosa y 0.0025% de Zwittergent 3-14). El substrato N-t-Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina (DPR-cumarina) se adicionó a la mezcla a una concentración final de 50 mM. La fluorescencia generada del corte del substrato por Factor C activado fue medida después de 15-20 minutos. Los resultados son mostrados en la FIG. 4. Los resul.tados de un ensayo similar realizados usando el substrato N-t-Boc-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina a una concentración final de 100 mM son mostrados en FIG.5.

EJEMPLO 2 Transfección de DNA de bácmido-Factor C en células Sf9 y recolección de sobrenadante viral recombinante Las células Sf9 son sembradas a una densidad de 5 x 106 por cavidad de 35 mm en una placa de tejido de 6 cavidades en medio de cultivo de células de insecto (ICCM) conteniendo 50 U/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina. Insect-Xpress (BioWhittaker Cat. #04-10270) o SF-900 SFM son medios adecuados; sin embargo, cualquier medio comparable en el cual crezcan las células SF9 puede ser usado. Las placas son incubadas a 27°C durante 1 hora para permitir que las células se asienten. Mientras tanto, se preparan los siguientes (cada uno por cavidad): (1) 7 mg de DNA de Factor C-bácmido en 100 mi de ICCM (sin antibióticos) y (2) 6 mi de CELLFECTIN (Gibco-BRL) más 100 mi de ICCM (sin antibióticos). Las soluciones (1) y (2) se mezclan suavemente y se ¡ncubana temperatura ambiente durante una hora. A esta mezcla, se adiciona 0.8 mi de ICCM (sin antibióticos). Las células Sf9 adheridas son lavadas suavemente con 2 mi de ICCM (sin antibióticos). Un mi de complejo CELLFECTIN-DNA se adiciona a cada cavidad y se incuba a 27°C durante 5 horas. Las mezclas de transfeccion son removidas completamente y se adicionan 2 mi de ICCM conteniendo antibióticos. Después de la incubación a 27°C durante 96 horas, el sobrenadante de cultivo celular es recolectado. El sobrenadante es clarificado mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos en un rotor de balanceo SIGMA 3K10, Nr. 11133. El sobrenadante, conteniendo el baculovirus recombinante, es almacenado a 4°C.

EJEMPLO 3 Amplificación de stock viral recombinante La amplificación de virus puede hacerse con células Sf9 ya sea en una monocapa o en suspensión. Para cultivo de monocapa, el medio es decantado de un cultivo de 80% células Sf9 de un día de edad, confluentes, en un matraz de cultivo de tejido de 75 cm2. La monocapa celular es infectada con 1 mi de virus (Ejemplo 2) usando un MOl de 0.1-1. El stock de virus es filtrado con esterilización usando un filtro Millipore GV millex (amarillo; unión de proteína baja). El cálculo del inoculo viral es como sigue: Volumen de inoculo = MOl x número de células total Título de virus en pfu/ml De esta manera, para 1 x 107 células, a un título de virus de 2 x 107 pfu/ml, el volumen del inoculo es 0.5 mi. El volumen del inoculo es ajustado a 1 mi con ICCM antes de que sea introducido a las células. El matraz es mecido varias veces para asegurar que la monbcapa celular esté cubierta completamente por el inoculo viral de 1 mi. El matraz es incubado entonces a 27°C durante una hora sin mecerse. Después de la incubación, el matraz es colocado vertical y se adicionan 14 mi de ICCM fresco. El matraz es incubado entonces durante 3 días a 27°C. El sobrenadante de cultivo es recolectado en tubos libres de pirógeno, estériles, y es centrifugado a 2000 rpm durante 10 minutos a 4°C usando un rotor de balanceo Sigma 3K10. Para uso inmediato, el stock viral es almacenado a 4°C. Para almacenamiento a largo plazo, el stock viral es colocado a -80°C.

Para cultivo en suspensión, usar células Sf9 cultivadas en fase logarítmica con viabilidad >95% para amplificación viral. La densidad celular y viabilidad son determinadas. Las células Sf9 son diluidas con InsectXPRESS fresco a 1 x 10s células por mi. El virus a ser amplificado es adicionado al cultivo de Sf9, a una MOI de 0.02 (virus/célula), como sigue: Vol. de stock de = (células totales/ml) x (vol. total de cultivo) X (MOI) virus de inoculo (mi) (título de virus en pfu/ml) Los matraces de centrífuga son incubados durante tres días a 27°C +/-2°C, con agitación constante a 90-120 rpm. El cultivo celular es transferido a botellas de centrífuga estériles y es centrifugado a 2000 rpm durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante es recolectado en un recipiente estéril y se desecha la pella celular. El sobrenadante es filtrado a través de un filtro de 0.45 µ?t? en un recipiente estéril. El sobrenadante es filtrado adicionalmente a través de un filtro de 0.2 µ?? estéril en un recipiente estéril. El stock de virus terminado es almacenado protegido de la luz a 2-8°C. Se realiza una determinación de título como se explica en el Ejemplo 4.

EJEMPLO 4 Titulación de baculovirus El título de virus (unidades formadoras de placa (PFU) por mi) puede ser determinado con ensayo de placa, dilución de punto final, u otros conjuntos de título viral (por ejemplo, BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit por Clontech #K1599-1). El ensayo de placa es realizado en cultivo de monocapa inmovilizado. Los ensayos de placa a ser realizados son determinados como sigue: Número de ensayo de placa = número de dilución viral x 4 (cuadruplicados) + 2 controles positivos y 2 negativos Por ejemplo, 105, 10s, 107, 108 para dilución viral, cada dilución en cavidades por cuadruplicado, sería un ensayo de placas de 16 cavidades. Incluyen dos controles positivos y dos controles negativos en el ensayo de placa, durante un total de 20 cavidades. Preparar una suspensión celular de 5 x 105 células por mi de densidad en 10% medio de suero de FBS. Sembrar placas de 6 cavidades a 2 mi por cavidad con suspensión celular anterior. Se permite que las células se unan dos horas antes de los experimentos. Las células son -80% confluentes. Preparar diluciones virales seriales de 10 veces usando 4.5 mi de medio y 0.5 mi de stock viral en tubos estériles de 15 mi. Aspirar el medio de cada cavidad. Adicionar 1 mi de dilución viral por cavidad e incubar a 27°C durante 2 horas. Calentar 1.3x SF-900I (Gibco-BRL #10967-032) a 27°C. Fundir 4% agarosa (Gibco 18300-012) y mantener en un baño de agua de 50°C. Adicionar 1.3x medio y 4% agarosa en proporción de 3:1 para hacer 1% agarosa en medio de cultivo. Mantener este agar en un baño de agua de 40°C (por ejemplo, en un matraz que puede llevarse a una campana). Trabajar rápidamente de manera que la mezcla de agarosa no solidifique, aspirar la solución viral de las monocapas celulares. Adicionar 2 mi de 1% agarosa a cada cavidad. Dejar las placas asentarse en la campana con las cubiertas ligeramente abiertas durante 10 minutos. Invertir las placas y ponerlas en una caja sellada con toallas de papel humedecidas para proporcionar humedad. Incubar a 27°C durante 5-7 días, o hasta que las placas se formen bien. En el día 7 de post-infección, adicionar 0.5 mi de 0.033% rojo neutral (en agua), incubar 3 minutos y desechar. De manera alternativa, adicionar 0.5 mi de 0.1% azul tripano (en agua), mecer para cubrir, asentar 3 minutos y desechar. Incubar las placas durante 2 horas. Con la ayuda de una caja ligera y un amplificador, contar las placas en cada placa. El título de virus es calculado usando la siguiente fórmula: Título de virus (pfu/ml) = # de placas x dilución viral EJEMPLO 5 Infección de células Sf9 para producción de Factor C recombinante en cultivos libres de suero Se usan células Sf9 de alta viabilidad (por ejemplo, viabilidad de 95-100% en condiciones libres de suero). Las células Sf9 de fase logarítmica de cultivo a una densidad celular de entre 1.5 x 106 y 2.5 x 106 células por mi en cultivo de suspensión. La producción de Factor C recombinante también puede ser realizada al infectar células Sf9 cultivadas en cultivo de monocapa. Determinar la densidad celular y viabilidad. Diluir células Sf9 con I nsectXPRESS fresco a 1 .5 x 1 06 células por mi. Adicionar stock de título alto de baculovirus recombinante para el cultivo de Sf9, a una MOI de 1 (virus/célula) , como sigue: Vol. de inoculo = (células totales/ml) x (volumen total de cultivo) x (MOI) HTS (mi) (título de virus en pfu/ml) Recolectar el sobrenadante de cultivo setenta y dos horas post-infección. Transferir el cultivo celular a botellas de centrífuga estériles y centrifugar a 2000 rpm durante 1 0 minutos a 4°C. Recolectar el sobrenadante en un recipiente estéril y desechar la pella celular. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0.45 µ?? en un recipiente estéril. Filtrar adicionalmente el sobrenadante a través de un filtro de 0.2 µp?, estéril, en un recipiente estéril. Este sobrenadante de cultivo, el cual contiene el Factor C recombinante, puede ser almacenado a 4°C durante hasta un año y puede ser usado directamente para formar un reactivo para detección de endotoxina de acuerdo con la presente invención.

EJEMPLO 6 Cultivo y subcultivo de células Sf9 adaptadas en medio libre de suero Las células Sf9 se cultivan a 27°C sin C02. Se prefiere aereación máxima. Si se usan botellas de cultivo de centrífuga, aflojar las tapas de tornillo laterales para aumentar la aereación. Las células Sf9 adaptadas para cultivarse en medio libre de suero deberían ser subcultivadas a intervalos de 4-5 días en una base de rutina. Subcultivar a 5.0 x 105 células/ml en un matraz de centrífuga o agitación de 250 mi conteniendo 100 mi de medio con tapas aflojadas para proporcionar aereación máxima. Agitar el cultivo a 90-100 rpm. La viabilidad celular debería estar por arriba de 90%. Remover los cultivos de 4-5 días de edad del incubador de 27°C y limpiar con alcohol al 70%. Tomar una alícuota de suspensión celular para determinar la viabilidad celular y la cuenta de células totales usando tinta azul tripano. Determinar la dilución celular necesaria para obtener 5 x 105 células/ml. Remolinear el matraz de cultivo de stock varias veces y remover el volumen apropiado de suspensión celular con base en el cálculo. Inocular un nuevo matraz de centrífuga de 250 mi conteniendo suficiente medio fresco pre-calentado necesario para llevar el volumen de cultivo final a 100 mi. Colocar los cultivos nuevamente en el incubador. Ajusfar a la velocidad de agitación a 90-100 rpm.

EJEMPLO 7 Crioconservación de cultivos libres de suero de células Sf9 Cultivar células Sf9 ya sea en una monocapa o en suspensión. Recolectar las células a fase media-logarítmica de crecimiento (aproximadamente 2 días) a una viabilidad de >90%. Mantener ei medio acondicionado en hielo y filtro-estéril. Determinar la viabilidad celular usando el método de exclusión de tinte de azul tripano. Calcular el volumen requerido de medio de crioconservación (7.5% DMSO en 50% medio ICCM libre de suero fresco y 50% medio acondicionado; filtrado por esterilización) para producir una densidad final de 1-2 x 107 células/ml. Mantener la mezcla de crioconservación en hielo. Mientras tanto, centrifugar las células de la suspensión durante 3 minutos a 800 rpm/500 x g. Desechar la muestra si muchas células no forman pella y están en el sobrenadante. Resuspender la pella celular en el volumen determinado de mezcla de crioconservación enfriada para obtener 1-2 x 107 células/ml. Rápidamente, dispensar alícuotas de 1-1.5 mi de suspensión celular en criofrascos. Congelar las células a -70 hasta -90°C durante 4 horas en la fase gaseosa superior de nitrógeno líquido. Tapar los frascos en nitrógeno líquido.

EJEMPLO 8 Recuperación de células Sf9 libres de suero crioconservadas Descongelar el frasco mediante agitación rápida en un baño de agua de 37°C justo hasta que se funda. Remover el frasco del baño de agua y limpiar con isopropanol al 70% estéril. Abrir el frasco, remover los contenidos del frasco en un tubo de centrífuga estéril de tamaño apropiado; y diluir la suspensión celular con 5 volúmenes de medio InsectXPRESS (o equivalente) que ha sido equilibrado a 27°C +/- 2°C en un incubador. Centrifugar la suspensión diluida a 125 x G durante 10 minutos. Desechar el fluido y resuspender las células en un volumen de medio de cultivo igual a fluido desechado. Determinar la cuenta celular y la viabilidad. Ajustar la densidad celular viable hasta entre 2 x 105 células por mi y 3 x 105 células por mi usando medio libre de suero. Transferir el matraz en un incubador de 27°C +/- 2°C en un equipo agitador de plataforma rotatoria para agitación continua y 1 00-125 revoluciones por minuto. Cuando la cuenta celular viable del cultivo se duplica al menos cada 26 horas, el cultivo puede ser expandido como se describe en el Ejemplo 6.

EJEM PLO 9 Adaptación de células Sf9 a cultivo de suspensión Se requieren seis a diez matraces T de monocapa de 75 cm2 confluentes de células Sf9 para iniciar un cultivo de suspensión de 1 00 mi. Descargar las células del fondo de los matraces al sujetar un matraz en una mano y darle golpecitos contra la palma de la otra mano. Depositar la suspensión celular y realizar una cuenta de viabilidad. Diluir la suspensión celular hasta aproximadamente 5 x 1 05 células viables/ml a temperatura ambiente usando medio de crecimiento libre de suero o complementado con suero completo contenido en un matraz de centrífuga de 250 mi. La parte superior de la cuchilla de agitador puede estar ligeramente arriba de la suspensión celular. Esto proporciona aereación adicional. Las tapas de brazo lateral deberían ser aflojadas por un cuarto de vuelta. Incubar las células a 27°C a una velocidad de agitación constante de 1 00 rpm. Subcultivar cuando la cuenta de células viable alcanza 1 -2 x 1 06 células/ml (3-7 días post-sembrado), incrementar la velocidad de agitación por 5 rpm por paso hasta que la viabilidad de cultivo sea >80%. Repetir hasta que se alcance una velocidad de agitación de 100 rpm para el matraz de centrífuga o se alcancen 130-140 rpm para los cultivos de matraz de agitador. En este punto, reducir la densidad de sembrado a 3 x 105 células/ml durante el subcultivo. Si persisten grumos de células grandes (por ejemplo, >10 células por grumo), dejar el matraz de centrífuga/agitador 2-3 minutos sin agitación antes de subcultivar. Esto permite que los grumos más grandes se asienten en el fondo. Depositar el tercio superior de las células de suspensión para contar y sembrar en nuevos cultivos. Este procedimiento selecciona una población celular que crece como células simples. Puede ser necesario repetir este paso 2-3 veces hasta que se reduzcan los grumos.

EJEMPLO 10 Efecto de diferentes detergentes y diferentes concentraciones de detergentes en el ensayo de Factor C recombinante Materiales y métodos Los siguientes reactivos fueron comprados de los fabricantes indicados: Zwittergent 3-14 (Calbiochem, Cat# 693017), Tween 20 (ICN, Cat# 194841), Tween 80 (ICN, Cat# 194842), Tritón X-114 (ICN, Cat# 193971), n-Octil-beta-D-trioglicopiranósido (OTG, Amresco, Cat# J575) y Tritón X-100 (ICN, Cat# 194854). El ensayo de Factor C recombinante (rFC) fue realizado usando 20 µ? de cada detergente (-10 X de concentración final), 150 µ? de 1 EU/ml EC-6, 10 µ? de rFC sobrenadante 0319011, 20 µ? de 300 mM Tris, pH 8.0 y 20 µ? de 0.55 mM substrato de DPR-cumarina. Los resultados del ensayo se leyeron a 38°C usando un equipo lector Cytofluor a 390/440 nm, 5 minutos por ciclo, durante 1 hora. Los datos fueron graficados después de 30 minutos.

Resultados Como se muestra en las FIGS. 1-3 y 9-11, bajas concentraciones de Zwittergent 3-14, Tween 20, Tween 80, Tritón X-114, OTG, Genapol C-100 y Tritón X- 00 intensificaron el ensayo de rFC 2-7 veces. El rango de concentración de intensificación para Zwittergent 3-14, Tritón X-114, OTG y Tritón X-100 es estrecho, mientras que el rango de concentración de intensificación para Tween 20, Tween 80 y Genapol C-100 es amplio. La Tabla 1 resume los resultados obtenidos al probar nueve detergentes. Estos detergentes pueden ser divididos en tres grupos: los detergentes que tienen un rango de concentración estrecho para intensificar la actividad de Factor C recombinante, detergentes que tienen un rango de concentración amplio para intensificar la actividad de Factor C recombinante y detergentes que inhiben la actividad de Factor C recombinante.

Tabla 1 Detergentes Rango de concentración de detergente para CMC MW Categoría intensificar rFC inhibir rFC (mM) Grupo I 5 Zwittergent 0.001-<0.004% >=0.004% 0.1-0.4 363.6 ZW Tritón X-100 0.001-<0.008% >=0.008% 0.2-0.9 631 No iónico Tritón X-114 0.001-<0.016& >=0.016% 0.35 537 No iónico OTG 0.031-<0.5% >=0.5% 9 308.4 No iónico Grupo 2 10 Genapoi C-100 0.001-0.5% >0.5% / 627 No iónico Tween 20 0.001-0.5% >0.5% 0.059 1228 No iónico Tween 80 0.001-0.25% >0.25% 0.012 1310 No iónico Grupo 3 Acido deoxicólico / > = 0.0004% 1.5 414.6 Iónico SDS / >=0.0004% 2.3 288.5 Iónico El efecto ¡ntensificador/inhibidor de Zwittergent 3-14 también fue probado usando el Factor C de Limulus purificado (FIG. 6). Un efecto ¡ntensificador/inhibidor similar fue observado, aunque la proporción de actividad de Factor C relativa, las concentraciones de detergente intensificadoras e inhibidoras fueron diferentes de aquéllas en el ensayo de Factor C recombinante.

EJEMPLO 11 Aintisuero contra Factor C de Limulus Aislamos el Factor C de Limulus y generamos antisuero contra la proteína. El lisado de Limulus se separó primero con una filtración en gel S-100 seguida por columna de intercambio de cationes-iones. Las fracciones fueron ensayadas por actividad de Factor C usando el substrato de N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-Am¡do-4-metil cumarina. El factor C de Limulus se purificó 73 veces con 80% de homogeneidad como se determina mediante ensayo de enzimas y SDS-PAGE. El peso molecular de Factor C de Limulus fue 117 kDa mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras. La SDS-PAGE reducida mostró dos bandas mayores de 79 kDa y 40 kDa, correspondientes a la cadena pesada y ligera. La secuenciacion de péptido tríptico reveló que la secuencia de Factor C de Limulus igualó estrechamente la especie asiática, con > 90% de identidad de secuencia. Un anticuerpo policlonal contra el factor C de Limulus fue generado en conejos. La IgG purificada anti-Factor C inhibió la activación de Factor C por LPS, pero no tuvo efecto sobre la actividad de proteasa una vez que el Factor C fue activado por LPS. El antisuero de Factor C demostró la Importancia de esta proteína en el reconocimiento inicial de LPS por lisado de Limulus.

EJEMPLO 12 Aumento en la sensibilidad en la detección de endotoxina en la presencia de surfactante Se realizó un ensayo de punto final de 1 hora, de un paso. La endotoxina 055:B5, 0.01, 0.1, 1 y 10 EU/ml se usaron para la curva estándar. El blanco y estándares de endotoxina (100 µ? dé cada uno) se adicionaron a una placa de 96 cavidades. El sobrenadante de Factor C recombinante, amortiguador de ensayo (150 mM NaCI, 150 mM Tris, pH 8.0 y 1.5% lactosa, con o sin 0.0125% Zwittergent) y solución de substrato (0.2 mM en agua) se mezclaron en proporciones de 1:4:5. Esta mezcla se adicionó en cada blanco y estándar de endotoxina. La fluorescencia se registró en el tiempo cero y tiempo de 1 hora. La diferencia en fluorescencias (fluorescencia delta) se normalizaron con el blanco. La fluorescencia delta normalizada se gráfico entonces contra concentración de endotoxina en una escala log-log. Cada punto de dato es el resultado de ensayos por duplicado. Los resultados son mostrados en la FIG. 7. La sensibilidad de detección de endotoxina aumentó 10 veces cuando se incluyó surfactante.

EJEMPLO 13 Ensayo de endotoxina de un paso Puede realizarse un ensayo de endotoxina de un paso en una placa de 96 cavidades, usando 100 µ? de cada uno de blanco y estándares de endotoxina. Cien microlitros de una mezcla de sobrenadante de Factor C recombinante (medio de cultivo de células Sf9 infectadas con baculovirus), amortiguador (150 mM Tri, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1.5% beta-lactosa y 0.0125% Zwittergent 3-14) y substrato fluorogénico (DPR-cumarina, 0.2 mM) a una proporción de 1:4:5 se adicionan a cavidades de la placa. La placa es incubada a 37°C durante 1 hora. La excitación y emisión son leídas a 390 y 440 nm, respectivamente, en un lector de microplata de fluorescencia. Los resultados de un ensayo de endotoxina de Factor C recombinante de un paso se muestran en la FIG.8.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un reactivo para detectar endotoxina, que comprende: una proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada; y un surfactante.

2. El reactivo de la reivindicación 1, en donde el surfactante es seleccionado del grupo que consiste de: (I) surfactantes anfotéricos representados por las siguientes fórmulas (B) en donde R<¡ es un radical alquileno que tiene de 1 hasta 4 átomos de carbono; Y y Y' son cada uno (1) hidrógeno, (2) alquilo inferior, o (3) hidroxi alquilo inferior; R2 y R3 son cada uno (1) alquilo inferior o (2) hidroxi alquilo inferior; n es 0 o 1, cuando n es 0, R4 es alquilo conteniendo desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono; cuando n es 1, R es un radical alquileno que tiene desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; R5 es un alqulo conteniendo desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono; y es hidrógeno, sodio, potasio o amonio; (II) surfactantes aniónicos representados por las siguientes fórmulas: (R6)„?-(Y)Ar(S03M)n2 (E) R5OS03M (F) en donde R5, R y tienen el mismo significado como se expone antes; R6 es un alquilo desde 8 hasta 24 átomos de carbono; n1 es un entero desde 1 hasta 3; n2 es 1 o 2; y Ar es fenilo o naftilo; (III) surfactantes catiónicos representados por la siguiente fórmula: en donde R5, Y y Y' tienen el mismo significado como se expone antes; (IV) surfactantes no iónicos representados por la siguiente fórmula: R5R7 8N- 0 (H) en donde R5 tiene el mismo significado como se expone antes; R7 y R8 son cada uno metilo o etilo; y (V) aquéllos surfactantes no iónicos seleccionados del grupo que consiste del producto de condensación de aproximadamente 10 hasta 30 moles de óxido de etileno con el monoéster de un alcohol hexahídrico conteniendo 6 átomos de carbono con el grupo éster conteniendo 10 hasta 20 átomos de carbono.

3. El reactivo de la reivindicación 1, en donde el cangrejo bayoneta es Limulus polyphemus.

4. El reactivo de la reivindicación 1, en donde el cangrejo bayoneta es Carcinoscorpius rotundicauda.

5. El reactivo de la reivindicación 1, en donde el cangrejo bayoneta es Tachypleus trídentatus.

6. El reactivo de la reivindicación 1, en donde el cangrejo bayoneta es Tachypleus gigas.

7. El reactivo de la reivindicación 1, en donde la proteína de Factor C está hecha mediante el método de cultivar una célula huésped comprendiendo un vector que codifica la proteína de Factor C en un sobrenadante bajo condiciones tales que la proteína de Factor C es expresada en el sobrenadante.

8. El reactivo de la reivindicación 7, en donde la célula huésped es una célula Sf

9. 9. El reactivo de la reivindicación 7, en donde el cangrejo bayoneta es Carcinoscorpius rotundicauda. 1 0. El reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el surfactante es seleccionado del g rupo q ue consiste de ZWITTE GENT 3- 14, Tritón X-1 00 , Tritón X- 1 14, octil-beta-D-tioglucósido, Genapol C-1 00, Tween 20 y Tween 80. 1 1 . Un método para detectar endotoxina en una muestra de prueba, que comprende los pasos de: contactar una m uestra de prueba con ( 1 ) un reactivo que comprende (a) una prote ína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada y (b) un surfactante, y (2) un s ubstrato de Factor C, en donde el corte del substrato de Factor C genera una señal detectable para formar una m uestra de prueba contactada para formar una m ezcla de muestra de prueba-reactivo-substrato ; y ensayar la muestra de prueba contactada por la presencia o ausen cia de la señal detectable, en donde una cantidad de la señal detectable que es incrementada en relación a una muestra de control que no contiene endotoxina indica la presencia de endotoxina en la muestra de prueba. 12. El reactivo de la reivind icación 1 1 , en donde el cangrejo bayoneta es Limulus polyphemus. 13. El reactivo de la reivind icación 1 1 , en donde el cangrejo bayoneta es Carcinoscorpius rotundicauda. 14. El reactivo de la reivindicación 1 1 , en donde el cangrejo bayoneta es Tachypleus tridentatus. 15. El reactivo de la reivindicación 11, en donde el cangrejo bayoneta es Tachypleus gigas. 16. El método de la reivindicación 11, en donde la proteína de Factor C está hecha mediante el método de: cultivar una célula huésped que comprende un vector que codifica la proteína de Factor C en un sobrenadante bajo condiciones tales que la proteína de Factor C es expresada en el sobrenadante. 17. El método de la reivindicación 16, en donde la célula huésped es una célula Sf9. 18. El método de la reivindicación 15, en donde el cangrejo bayoneta es Carcinoscorpius rotundicauda. 19. El método e cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en donde el surfactante es seleccionado del grupo que consiste de ZWITTERGENT 3-14, Tritón X-100, Tritón X-114, octil-beta-D-tioglucósido, Genapol C-100, Tween 20 y Tween 80. 20. El método de la reivindicación 11, en donde el substrato de Factor C es seleccionado del grupo que consiste de N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina y N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina. 21. Un método para detectar endotoxina en una muestra de prueba, comprendiendo los pasos de: contactar una muestra de prueba con (1) un reactivo que comprende (a) una proteína de Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda recombinante, en donde la proteína de Factor C es hecha mediante el método para cultivar una célula huésped que comprende un vector que codifica la proteína de Factor C en un sobrenadante bajo condiciones tales que la proteína de Factor C es expresada en el sobrenadante y (b) un surfactante, y (2) N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Am ido-4-metil cuminarina para form ar una m uestra de prueba contactada; y ensayar la m uestra de prueba contactada por la presencia o ausencia de una señal fluorescente, en donde una cantidad de la señal fluorescente que es incrementada en relación a una m uestra de control que no contiene endotoxina, indica la presencia de endotoxina en la m uestra de prueba. 22. El método de la reivindicación 21 , en donde la célula huésped es una cél ula Sf9. 23. U n conjunto para detectar endotoxina, q ue comprende: un reactivo que com prende (a) u na proteína de Factor C de cangrejo bayoneta purificada y (b) un surfactante; e instrucciones para realizar el método de la reivindicación 1 1 . 24. El conjunto de la reivind icación 23 , q ue comprende además un substrato de Factor C , en donde el corte del substrato de Factor C genera una señal detectable. 25. El conjunto de la reivindicación 24, en donde el substrato de Factor C es seleccionad o del grupo que consiste de N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-.Arg- 7-Am ido-4-metil cumarina y N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-Am ido-4-metil cumarina. 26. El conju nto de la reivindicación 23 , en donde el Factor C purificado es hecho mediante el método para cultivar u na cél ula huésped q ue comprende un vector que cod ifica la proteína de Factor C en un sobrenadante bajo condiciones tales que la proteína de Factor C es expresada en el sobrenadante . 27. El conjunto de la reivindicación 26 , en donde la célula huésped es una célu la Sf9. 28. U n método para detectar endotoxina en una muestra de prueba , que com prende los pasos de: contactar una m uestra de prueba con un reactivo que com prende (a) una proteína de Factor C de cang rejo bayoneta purificada y (b) un surfactante para formar una mezcla de muestra de prueba-reactivo ; contactar la mezcla de m uestra de prueba-reactivo con un substrato de Factor C, en donde el corte del substrato de Factor C genera una señal detectable; y ensayar la mezcla de m uestra de prueba-reactivo contactada por la presencia o asuencia de la señal detectable , en donde una cantidad de la señal detectable que es incrementada en relación a una muestra de control que no contiene endotoxina, ind ica la presencia de endotoxina en la m uestra de prueba . 29. U n método para detectar endotoxina en una muestra de prueba , q ue comprende los pasos de: contactar u na m uestra de prueba con un reactivo que comprende (a) una proteín a de Factor C de Carcinoscorpius rotundicauda recombina nte, en donde la proteína de Factor C es hecha med iante el método para cultivar una célula h uésped que comprende un vector que codifica la proteína de Factor C en un sobren adante bajo condiciones tales que la proteína de Factor C es expresada en el sobrenadante y (b) u n surfactante para formar una mezcla de m uestra de prueba-reactivo; contactar la mezcla de m uestra de prueba-reactivo con N-t-BOC-Asp(Obzl)-Pro-Arg-7-Amido-4-metil cumarina; y ensayar la mezcla de m uestra de prueba-reactivo contactada por la presencia o ausencia de una señal fluorescente, en donde una cantidad de la señal fluorescente que es incrementada en relación a una muestra de control q ue no contiene endotoxina , indica la presencia de endotoxina en la m uestra de prueba .