CN103562724A - 用于测量内毒素的试剂 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于快速地且高灵敏度地测量内毒素的方法。使用包含下面的蛋白 (1) 至 (3) 的内毒素测量剂测量内毒素，所述蛋白质中的每一种是通过使用昆虫细胞作为宿主进行表达可得到的重组蛋白： (1) 源自东方鲎的因子 C ，该因子 C 在 C- 端处不具有 His- 标签序列； (2) 鲎 的因子 B ；和 (3) 鲎 的前凝固酶。

Description

用于测量内毒素的试剂

技术领域

本发明涉及内毒素测量剂、用于生产所述测量剂的方法、和用于测量样品中的内毒素的方法。

背景技术

内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜上的脂多糖，且已知是强致热原。此外，已知的是，即使少量的内毒素也会造成归因于细菌感染的不同疾病状态，诸如由巨噬细胞活化引起的炎症性细胞因子的释放和内毒素性休克的诱导以及发热。因此，药物（诸如注射用药）、水、医疗设备等中的内毒素的检测是重要的。此外，内毒素被认为是革兰氏阴性细菌感染中的休克的主要原因，因此，通过测量血液中的内毒素，可以判断感染和 / 或药物作用是否存在。

此外，已知的是，革兰氏阴性细菌对美洲鲎 (Limulus polyphemus) 的感染会造成血管内凝固，并且该现象已经被用于检测内毒素。

也就是说，已知使用鲎的血细胞提取物 ( 鲎变形细胞裂解物；在下文中也被称作“裂解物” ) 测量内毒素的方法 ( 例如，非专利文献 1) 。该方法被称作“鲎试验”，且使用存在于所述裂解物中的不同蛋白质的级联反应，该反应通过使内毒素与所述裂解物接触而发生。所述级联反应的示意图显示在图 1 中。

在使内毒素与裂解物接触后，存在于裂解物中的因子 C 被活化，以产生活化型因子 C 。该活化型因子 C 会活化存在于裂解物中的因子 B ，以产生活化型因子 B 。该活化型因子 B 然后活化存在于裂解物中的前凝固酶，以产生凝固酶。

该凝固酶会水解存在于裂解物中的凝固蛋白原分子的特定部分。由此产生凝固蛋白凝胶，以造成裂解物的凝固。因而，通过测量裂解物的凝固反应，可以测量内毒素。

此外，通过使凝固酶与合成底物反应以造成显色反应，也可以测量内毒素。例如，凝固酶会与合成底物叔丁氧羰基 - 亮氨酰基 - 甘氨酰基 - 精氨酰基 -pNA (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) 反应以水解它的酰胺键，并由此释放 pNA 。因而，通过最初在反应***中包括合成底物，可以通过测量着色物质 (pNA) 的吸光度 (405 nm) 来定量内毒素。

此外，已知的是，使用从日本鲎裂解物纯化出的因子 C 、因子 B 和前凝固酶，可以重构级联反应*** ( 非专利文献 2) 。

此外，已知这样的情况，其中使用源自东南亚鲎圆尾鲎（ Carcinoscorpius rotundicauda ）的重组因子 C 、以及源自日本鲎东方鲎（ Tachypleus tridentatus ）的重组因子 B 和重组前凝固酶来重构级联反应*** ( 专利文献 1) 。

此外，已知用于检测内毒素的***，其使用源自东南亚鲎圆尾鲎的重组因子 C 和可与活化型因子 C 反应以释放荧光物质的底物 ( 专利文献 2) 。该***可作为内毒素检测***商购得到 ( 商品名： PyroGene ( 注册商标 ) ； Lonza) 。

但是，为了使用裂解物或从其制备的天然存在的因子 C 、因子 B 和前凝固酶，必须捕获鲎并从其收集血液。因此，考虑到生物资源的保护等，难以无限地供给这些组分。因此，已经需要容易地且快速地以低成本生产用于检测内毒素的试剂的技术。

此外，在使用重组因子 C 、重组因子 B 和重组前凝固酶的情况下，任意上述情况需要 1 小时或更久来进行测量，并且尚未实现在 0.001 EU/mL 量级的检测灵敏度。因此，已经需要快速地且高灵敏度地测量内毒素的技术。

现有技术文件

专利文献

[ 专利文献 1] WO 2008/004674

[ 专利文献 2] US 6,849,426 B

非专利文献。

非专利文献 1] Iwanaga S., Curr Opin Immunol. 1993 Feb; 5(1): 74-82 。  

［非专利文献 2] Nakamura T. 等人 , J Biochem. 1986 Mar; 99(3): 847-57 。

发明内容

本发明目的在于，提供用于快速地且高灵敏度地测量内毒素的方法。本发明目的还在于，提供要在所述方法中使用的内毒素测量剂和用于生产所述试剂的方法。

本发明的发明人发现，通过使用源自日本鲎东方鲎并使用昆虫细胞作为宿主进行表达的重组因子 C ( 不含 His- 标签 ) 、重组因子 B 和重组前凝固酶，可以快速地且高灵敏度地测量内毒素，由此完成了本发明。

也就是说，本发明如下。  

［１］

一种内毒素测量剂，其包含下面的蛋白 (1) 至 (3) ，所述蛋白中的每一种是通过使用昆虫细胞作为宿主进行表达可得到的重组蛋白：

(1) 源自东方鲎的因子 C ，该因子 C 在 C- 端处不具有 His- 标签序列；

(2) 鲎的因子 B ；和

(3) 鲎的前凝固酶。  

［２］

根据 [1] 所述的测量剂，其中所述因子 B 和所述前凝固酶源自东方鲎。  

［３］

根据 [1] 或 [2] 所述的测量剂，其中所述因子 C 是下面的蛋白 (A) 或 (B) ；所述因子 B 是下面的蛋白 (C) 或 (D) ；且所述前凝固酶是下面的蛋白 (E) 或 (F) ：

(A) 蛋白，其包含在 SEQ ID NO:2 中所示的氨基酸序列；

(B) 蛋白，其包含在 SEQ ID NO:2 中所示的氨基酸序列，但是其包括一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、***或添加，所述蛋白具有因子 C 活性；

(C) 蛋白，其包含在 SEQ ID NO:4 中所示的氨基酸序列；

(D) 蛋白，其包含在 SEQ ID NO:4 中所示的氨基酸序列，但是其包括一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、***或添加，所述蛋白具有因子 B 活性；

(E) 蛋白，其包含在 SEQ ID NO:6 中所示的氨基酸序列；

(F) 蛋白，其包含在 SEQ ID NO:6 中所示的氨基酸序列，但是其包括一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、***或添加，所述蛋白具有前凝固酶活性。  

［４］

一种用于生产根据 [1] 至 [3] 中的任一项所述的测量剂的方法，所述方法包括下面的步骤 (A) 至 (C) ：

(A) 将下面 DNA(1) 至 (3) 中的每一种掺入病毒 DNA 中的步骤：

(1) DNA ，其编码源自东方鲎的因子 C ，该因子 C 在 C- 端处不具有 His- 标签序列；

(2) DNA ，其编码鲎的因子 B ；和

(3) DNA ，其编码鲎的前凝固酶；

(B) 用其中掺入了所述每种 DNA 的病毒感染昆虫细胞的步骤；和

(C) 使被所述每种病毒感染的昆虫细胞表达由所述每种 DNA 编码的蛋白的步骤。  

［５］

一种用于生产根据 [1] 至 [3] 中的任一项所述的测量剂的方法，所述方法包括下面的步骤 (A) 至 (C) ：

(A) 将下面 DNA(1) 至 (3) 中的每一种掺入载体中的步骤：

(1) DNA ，其编码源自东方鲎的因子 C ，该因子 C 在 C- 端处不具有 His- 标签序列；

(2) DNA ，其编码鲎的因子 B ；和

(3) DNA ，其编码鲎的前凝固酶；

(B) 将其中掺入了所述每种 DNA 的载体引入昆虫细胞中以使所述每种 DNA 掺入昆虫细胞的染色体中的步骤；和

(C) 使其中掺入了所述每种 DNA 的昆虫细胞表达由所述每种 DNA 编码的蛋白的步骤。  

［６］

根据 [4] 或 [5] 所述的方法，其中所述编码因子 C 的 DNA 是下面的 DNA (A) 或 (B) ；所述编码因子 B 的 DNA 是下面的 DNA (C) 或 (D) ；且所述编码前凝固酶的 DNA 是下面的 DNA (E) 或 (F) ：

(A) DNA ，其包含在 SEQ ID NO:1 中所示的核苷酸序列；

(B) DNA ，其在严谨条件下与 SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的全长或一部分的互补序列杂交，且编码具有因子 C 活性的蛋白。  

（Ｃ）　 DNA ，其包含在 SEQ ID NO:3 或 8 中所示的核苷酸序列；

(D) DNA ，其在严谨条件下与 SEQ ID NO:3 或 8 所示核苷酸序列的全长或一部分的互补序列杂交，且编码具有因子 B 活性的蛋白。  

（Ｅ）　 DNA ，其包含在 SEQ ID NO:5 或 9 中所示的核苷酸序列；

(F) DNA ，其在严谨条件下与 SEQ ID NO:5 或 9 所示核苷酸序列的全长或一部分的互补序列杂交，且编码具有前凝固酶活性的蛋白。  

［７］

一种用于测量试验样品中的内毒素的方法，所述方法包括：使根据 [1] 至 [3] 中的任一项所述的测量剂与试验样品混合的步骤，和测量级联反应的进展的步骤。  

［８］

根据 [7] 所述的方法，所述方法包括：将用于检测级联反应的进展的底物加入反应***中的步骤。  

［９］

根据 [8] 所述的方法，所述方法另外包括：基于所述底物的反应计算试验样品中的内毒素水平的步骤。

通过本发明，可以快速地且高灵敏度地测量内毒素。例如，在本发明的一个实施方案中，仅测量 30 分钟便可以实现 0.0005 EU/mL 量级的检测灵敏度。此外，在本发明中，表达的重组因子 C 、重组因子 B 和重组前凝固酶可以不经过纯化就使用，并且因此，可以简单地且快速地以低成本生产包含这些重组蛋白的内毒素测量剂。

附图说明

图 1 的简图显示了鲎试验中的级联反应***。  

图 2 的简图显示了载体 pIZ/V5-His 的结构和每个基因的***位置。在上部的箭头指示了基因的***位置。  

图 3 的照片显示了各个因子 C 的表达水平。  

图 4 的简图显示了各个因子 C 的活性。  

图 5 的照片显示了通过病毒方法表达的因子 C 的稳定性。  

图 6 的照片显示了通过稳定表达细胞方法表达的因子 C 的稳定性。  

图 7 的简图显示了中空纤维膜过滤处理对通过病毒方法表达的因子的反应性的影响。  

图 8 的简图显示了含有通过病毒方法表达的因子的内毒素测量剂的反应性。  

图 9 的简图显示了含有通过稳定表达细胞系方法表达的因子的内毒素测量剂的反应性。 (a) 在 0-0.1 EU/mL 的内毒素浓度时的反应性。 (b) 在 0-0.01 EU/mL 的内毒素浓度时的反应性。  

图 10 的照片显示了纯化的重组因子 C 和纯化的天然存在的因子 C 的纯度和浓度。  

图 11 的校正曲线显示了带强度和 BSA 的量之间的关联。  

图 12 的简图显示了纯化的重组因子 C 和纯化的天然存在的因子 C 的活性。

具体实施方式

在本发明中，下述的一系列反应可以被称作“级联反应”：其中内毒素活化因子 C 以产生活化型因子 C ；所述活化型因子 C 活化因子 B 以产生活化型因子 B ；和所述活化型因子 B 活化前凝固酶以产生凝固酶。

［１］本发明的内毒素测量剂

本发明的内毒素测量剂包含因子 C 、因子 B 和前凝固酶。在本发明的内毒素测量剂中包含的因子 C 、因子 B 和前凝固酶在下文中可以分别被称作“本发明的因子 C ”、“本发明的因子 B ”和“本发明的前凝固酶”。此外，因子 C 、因子 B 和前凝固酶可以共同地称作“因子”。

本发明的因子 C 、本发明的因子 B 和本发明的前凝固酶全部是通过使用昆虫细胞作为宿主进行表达可得到的重组蛋白。

本发明的因子 C 是源自日本鲎东方鲎的因子 C 。本发明的因子 C 的特征在于，它不具有在 C- 端处连接的 His- 标签。此外，本发明的因子 C 优选地在 C- 端处不具有 V5- 标签。此外，本发明的因子 C 更优选地不具有在 C- 端处连接的任何肽。此外，本发明的因子 C 特别优选地不具有在任一端处连接的任何肽。东方鲎的因子 C 的氨基酸序列显示在 SEQ ID NO:2 中。编码东方鲎的因子 C 的基因的核苷酸序列显示在 SEQ ID NO:1 中。

本发明的因子 C 可以是具有 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列的蛋白的变体，只要所述变体具有因子 C 活性。

“因子 C 活性”是指，因子 C 在有内毒素存在下变成活化型因子 C 以活化因子 B 的活性。例如，可以如下证实本发明的因子 C “具有因子 C 活性”的事实：使用与合适的因子 B 和合适的前凝固酶相组合的本发明的因子 C ，并在有内毒素存在下检测级联反应的进展。更具体地， SEQ ID NO:4 的蛋白可以用作合适的因子 B ， SEQ ID NO:6 的蛋白可以用作合适的前凝固酶。使用下面提及的底物进行检测，可以测量级联反应的进展。

本发明的因子 C 可以是这样的蛋白：其包含在 SEQ ID NO:2 中所示的氨基酸序列，但是其包括一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、***或添加，只要所述因子 C 具有因子 C 活性。术语“一个或几个”的含义随所述氨基酸残基在蛋白的三维结构中的位置和所述氨基酸残基的类型而变化，并且，更具体地，该术语优选是指 1-20 、更优选 1-10 、更优选 1-5 、特别优选 1-3 。上述的一个或几个氨基酸的置换、缺失、***或添加是维持蛋白的正常功能的保守突变。保守突变的代表性例子是保守置换。所述保守置换是例如这样的突变：其中，如果置换位点是芳族氨基酸，那么置换在 Phe 、 Trp 和 Tyr 之间相互发生；如果置换位点是疏水氨基酸，那么置换在 Leu 、 Ile 和 Val 之间相互发生；如果置换位点是极性氨基酸，那么置换在 Gln 和 Asn 之间相互发生；如果置换位点是碱性氨基酸，那么置换在 Lys 、 Arg 和 His 之间相互发生；如果置换位点是酸性氨基酸，那么置换在 Asp 和 Glu 之间相互发生；如果置换位点是具有羟基的氨基酸，那么置换在 Ser 和 Thr 之间相互发生。被视作保守置换的置换的例子具体地包括： Ser 或 Thr 对 Ala 的置换， Gln 、 His 或 Lys 对 Arg 的置换， Glu 、 Gln 、 Lys 、 His 或 Asp 对 Asn 的置换， Asn 、 Glu 或 Gln 对 Asp 的置换， Ser 或 Ala 对 Cys 的置换， Asn 、 Glu 、 Lys 、 His 、 Asp 或 Arg 对 Gln 的置换， Gly 、 Asn 、 Gln 、 Lys 或 Asp 对 Glu 的置换， Pro 对 Gly 的置换， Asn 、 Lys 、 Gln 、 Arg 或 Tyr 对 His 的置换， Leu 、 Met 、 Val 或 Phe 对 Ile 的置换， Ile 、 Met 、 Val 或 Phe 对 Leu 的置换， Asn 、 Glu 、 Gln 、 His 或 Arg 对 Lys 的置换， Ile 、 Leu 、 Val 或 Phe 对 Met 的置换， Trp 、 Tyr 、 Met 、 Ile 或 Leu 对 Phe 的置换， Thr 或 Ala 对 Ser 的置换， Ser 或 Ala 对 Thr 的置换， Phe 或 Tyr 对 Trp 的置换， His 、 Phe 或 Trp 对 Tyr ，和 Met 、 Ile 或 Leu 对 Val 的置换。此外，上述的置换、缺失、***、添加、倒位等还可以包括天然存在的突变，所述突变归因于衍生出所述基因的鲎的个体、品种或物种的差异。

此外，本发明的因子 C 可以是这样的蛋白：其与如上所述的因子 C 的全长氨基酸序列（例如， SEQ ID NO:2 所示的全长氨基酸序列）具有不小于 80% 、优选不小于 90% 、更优选不小于 95% 、更优选不小于 97% 、特别优选不小于 99% 的同源性或同一性，并且具有因子 C 活性。

编码本发明的因子 C 的基因没有特别限制，只要所述基因编码如上所述的本发明的因子 C 。编码本发明的因子 C 的基因可以是基于已知基因序列制备的探针，例如，这样的 DNA ：其在严谨条件下与 SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的全长或一部分的互补序列杂交，且编码具有因子 C 活性的蛋白。术语“严谨条件”在本文中是指这样的条件：在该条件下，形成所谓的特异性的杂交物，但是不形成非特异性的杂交物。所述条件的例子包括这样的条件：在该条件下，高度同源的 DNA 彼此杂交，例如，具有不小于 80% 同源性、优选不小于 90% 同源性、更优选不小于 95% 同源性、更优选不小于 97% 同源性、特别优选不小于 99% 同源性的 DNA 彼此杂交，而其同源性低于上述值的 DNA 不会彼此杂交；以及这样的条件：在该条件下，在与 60 ℃、 1 × SSC 和 0.1% SDS （优选 60 ℃、 0.1 × SSC 和 0.1% SDS ，更优选 68 ℃、 0.1 × SSC 和 0.1% SDS ，它们是在 DNA 杂交中的标准洗涤条件）相对应的盐浓度和温度，进行洗涤 1 次，更优选 2 次或 3 次。

此外，可以改变编码本发明的因子 C 的基因中的密码子组合，从而为在昆虫细胞中的表达而优化所述基因。所述优化可以如下进行，例如，使用通常可得到的协议服务。编码本发明的因子 C 的基因可以是 DNA 变体，其密码子组合为在昆虫细胞中的表达进行了优化。

上面关于基因和蛋白的变体的描述类似地适用于本发明的因子 B 和前凝固酶，并适用于编码它们的基因。

本发明的因子 B 是源自鲎的因子 B 。此外，本发明的前凝固酶是源自鲎的前凝固酶。鲎的例子包括日本鲎东方鲎、美洲鲎美洲鲎、东南亚鲎圆尾鲎和东南亚鲎马来鲎（ Tachypleus gigas ）。在这些鲎中，上述因子优选地源自日本鲎东方鲎。

东方鲎的因子 B 和前凝固酶的氨基酸序列分别显示在 SEQ ID NO:4 和 6 中。编码东方鲎的因子 B 和前凝固酶的基因的核苷酸序列分别显示在 SEQ ID NO:3 和 5 中。

本发明的因子 B 可以是上述任一种鲎的因子 B 的变体，例如，具有 SEQ ID NO:4 所示氨基酸序列的蛋白的变体，只要本发明的因子 B 具有因子 B 活性。此外，编码本发明的因子 B 的基因没有特别限制，只要所述基因编码如上所述的本发明的因子 B 。上面关于因子 C 的描述在细节上做必要的修正后也适用于基因和蛋白的变体。

“因子 B 活性”是指，因子 B 在活化型因子 C 存在下变成活化型因子 B 以将前凝固酶变成它的活性形式凝固酶的活性。例如，可以如下证实本发明的因子 B “具有因子 B 活性”的事实：使用与合适的因子 C 和合适的前凝固酶相组合的本发明的因子 B ，并在内毒素存在下检测级联反应的进展。更具体地， SEQ ID NO:2 的蛋白可以用作合适的因子 C ， SEQ ID NO:6 的蛋白可以用作合适的前凝固酶。使用下面提及的底物进行检测，可以测量级联反应的进展。

本发明的前凝固酶可以是上述任一种鲎的前凝固酶的变体，例如，具有 SEQ ID NO:6 所示氨基酸序列的蛋白的变体，只要本发明的前凝固酶具有前凝固酶活性。此外，编码本发明的前凝固酶的基因没有特别限制，只要所述基因编码如上所述的本发明的前凝固酶。上面关于因子 C 的描述在细节上做必要的修正后也适用于基因和蛋白的变体。

“前凝固酶活性”是指，前凝固酶在活化型因子 B 存在下变成凝固酶以与下面提及的用于检测的底物反应的活性。“与用于检测的底物反应的活性”是指，例如，与凝固蛋白原反应以造成凝固的活性，和与 Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 反应以释放 pNA 的活性。例如，可以如下证实本发明的前凝固酶“具有前凝固酶活性”的事实：使用与合适的因子 C 和合适的因子 B 相组合的本发明的凝固酶，并在内毒素存在下检测级联反应的进展。更具体地， SEQ ID NO:2 的蛋白可以用作合适的因子 C ， SEQ ID NO:4 的蛋白可以用作合适的因子 B 。使用下面提及的底物进行检测，可以测量级联反应的进展。

可以向本发明的因子 B 和 / 或本发明的前凝固酶添加任意肽等，只要所述因子分别具有因子 B 活性和前凝固酶活性。这样的肽的例子包括标签序列诸如 His- 标签和 V5- 标签。与本发明的因子 C 类似地，要使用的本发明的因子 B 和 / 或本发明的前凝固酶可以属于下述的任一种：其中在 C- 端没有添加 His- 标签的那些，其中在 C- 端没有添加 V5- 标签的那些，其中在 C- 端根本没有添加肽的那些，和其中在任一端根本没有添加肽的那些。

此外，可以改变编码本发明的因子 B 的基因和 / 或编码本发明的前凝固酶的基因中的密码子组合，从而为在昆虫细胞中的表达而优化所述基因。编码 SEQ ID NO:4 的因子 B 且具有为在昆虫细胞中的表达而优化的密码子组合的 DNA 的例子包括 SEQ ID NO:8 的 DNA 。编码 SEQ ID NO:6 的前凝固酶且具有为在昆虫细胞中的表达而优化的密码子组合的 DNA 的例子包括 SEQ ID NO:9 的 DNA 。每一个编码本发明的因子 B 的基因和 / 或编码本发明的前凝固酶的基因可以是 DNA 变体，其密码子组合为在昆虫细胞中的表达进行了优化。

本发明的内毒素测量剂可以由本发明的因子 C 、本发明的本发明的因子 B 和本发明的前凝固酶组成。

本发明的内毒素测量剂可以包含用于检测级联反应的进展的底物。在本发明中，这样的底物可以被称作“用于检测的底物”。

用于检测的底物的例子包括凝固蛋白原。由于凝固蛋白原与凝固酶的接触，发生凝固从而产生凝固蛋白。通过测量反应溶液的浊度，可以测定凝固反应的进程。可以从鲎血细胞提取物 ( 裂解物 ) 回收凝固蛋白原。并且，因为已经公开了编码凝固蛋白原的基因的核苷酸序列 (Miyata, 等人 , PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, 增刊 , 第 29 期 , 第 30-43 页 (1986)) ，可以根据常规方法通过基因工程生产凝固蛋白原。

还可以使用合成底物作为用于检测的底物。所述合成底物没有特别限制，只要所述底物具有适合用于检测的性质，诸如使凝固酶的催化反应造成显色或发荧光的性质。合成底物的例子包括由通式 X-Y-Z ( 其中 X 代表保护基， Y 代表肽，且 Z 代表经由酰胺键与 Y 结合的染料 ) 代表的底物。在内毒素存在于反应***中的情况下，凝固酶（其作为级联反应的结果而产生）的催化反应会切割 Y 和 Z 之间的酰胺键，以释放染料 Z ，从而导致显色或发荧光。保护基 X 没有特别限制，可以适当地使用肽的已知保护基。这样的保护基的例子包括叔丁氧羰基和苯甲酰基。染料 Z 没有特别限制，且可以是在可见光下可检测的染料或荧光染料。染料 Z 的例子包括 pNA ( 对 - 硝基苯胺 ) 、 MCA (7- 甲氧基香豆素 -4- 乙酸 ) 、 DNP (2,4- 二硝基苯胺 ) 和丹磺酰基染料。肽 Y 的例子包括 Leu-Gly-Arg (LGR) 、 Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR) (SEQ ID NO:12) 和 Val-Pro-Arg (VPR) 。通过根据染料的性质选择的方法，可以测量释放的染料 Z 。

此外，本发明的内毒素测量剂还可以包含除了因子和用于检测的底物以外的组分，只要所述试剂可以用于测量内毒素。这样的组分没有特别限制，且可以考虑因子和用于检测的底物的储存性、操作容易度以及稳定性来选择。本发明的内毒素测量剂可以包含，例如， pH- 缓冲剂和 / 或盐。 pH- 缓冲剂的例子包括 HEPES 缓冲剂、 MES 缓冲剂、 Tris 缓冲剂和 GTA 宽范围缓冲剂。在本发明的内毒素测量剂中还可以包含诸如醇、酯、酮和酰胺等有机溶剂。

本发明的内毒素测量剂可以配制成任意形式，包括例如，固体形式、液体形式和凝胶形式。就制剂而言，可以使用通常用作制剂载体诸如媒介物、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂、稀释剂、表面活性剂和溶剂的添加剂。本发明的内毒素测量剂可以原样用于测量内毒素，或者在水、生理盐水、缓冲液等中进行稀释、分散或溶解。不言而喻，通过这样的稀释、分散或溶解得到的生成制剂也在本发明的内毒素测量剂的范围内。

在本发明的内毒素测量剂中，所述因子和所述其它组分可以作为混合物存在，或者可以分开存在。例如，所述因子可以以要配制的任意比例混合，或者可以分开配制。

在本发明的内毒素测量剂中的所述因子和所述其它组分的浓度没有特别限制，且优选地经过调节，使得当测量内毒素时，所述浓度是在下面提及的优选范围内。在本发明的内毒素测量剂 ( 以在与试验样品接触之前制备的溶液的方式 ) 中的每种因子的浓度是，例如，优选 20-100 μ g/mL 、更优选 40-80 μ g/mL 、特别优选约 60 μ g/mL 。

本发明的内毒素测量剂可以作为内毒素测量试剂盒来提供。内毒素测量试剂盒没有特别限制，只要所述试剂盒含有本发明的内毒素测量剂。

（２）用于生产本发明的内毒素测量剂的方法

通过使用昆虫细胞作为宿主进行表达，可以生产在本发明的内毒素测量剂中包含的因子。

所述昆虫细胞没有特别限制，只要所述细胞可以表达所述因子，并且可以适当地使用通常用于表达异源蛋白的细胞。这样的昆虫细胞的例子包括 Sf9 、 Sf21 、 SF+ 和 High-Five 。所述昆虫细胞优选地是 Sf9 。

用于培养昆虫细胞的培养条件没有特别限制，只要在所述条件下可以培养昆虫细胞，并且如果必要的话，可以在适当地修改后使用通常用于培养昆虫细胞的培养条件。例如，可以使用通常用于培养昆虫细胞的培养基作为培养基。这样的培养基的例子包括商购可得的用于昆虫细胞的无血清培养基。更具体地，可以适当地使用 Sf900 II 培养基 (Invitrogen) 等。例如，可以在 27 ℃至 28 ℃在摇动下进行培养。

使用昆虫细胞作为宿主来表达因子的方法没有特别限制，只要通过该方法可以表达所述因子，并且可以适当地使用通常用于表达异源蛋白的方法。例如，通过用其中掺入了编码所述因子的基因的病毒感染昆虫细胞，可以表达每种因子 ( 病毒方法 ) 。可替换地，通过将其中掺入了编码所述因子的基因的载体引入昆虫细胞中，由此将所述基因掺入宿主染色体中，可以表达每种因子 ( 稳定表达细胞系方法 ) 。

＜病毒方法 >

要在病毒方法中使用的病毒没有特别限制，只要该病毒可以感染昆虫细胞，并且由此可以表达所述因子，并且可以适当地使用通常用于在昆虫细胞中表达蛋白的病毒。这样的病毒的例子包括杆状病毒。所述杆状病毒优选地是核多角体病毒属 (NPV) 。 NPV 的例子包括 AcNPV ( 苜蓿银纹夜蛾 NPV) 和 BmNPV ( 家蚕 NPV) 。 NPV 优选地是 AcNPV 。

通过常规方法，例如，通过使用转移载体的同源重组，可以将核酸引入病毒中。转移载体的例子包括 pPSC8 (Protein Sciences) 、 pFastBac (Invitrogen) 和 pVL1393 (Pharmingen) 。转移载体优选地是 pPSC8 。

通过常规方法用其中掺入了编码每种因子的基因的病毒感染昆虫细胞，可以得到携带所述病毒并表达所述因子的昆虫细胞。

＜稳定表达细胞系方法 >

通过将编码每种因子的基因掺入昆虫细胞的染色体中，可以得到稳定表达细胞系，其稳定地表达所述因子。稳定表达细胞系的构建方法没有特别限制，并且可以通过常规方法进行构建。例如，根据手册使用 pIZ/V5-His 载体 (Invitrogen) ，可以构建稳定表达细胞系。

在任何情况下，构建表达细胞，使得表达的因子 C 具有没有连接 His 标签的 C- 端。此外，在没有添加任何肽（其不限于在因子 C 的 C- 端处的 His- 标签）而表达每种因子的情况下，可以构建表达细胞，使得不添加肽。

在任何情况下，所述因子可以由单一类型的表达细胞一起表达，或者可以为每种因子构建表达细胞以分别表达各种因子。

通过测量因子的活性，可以证实每种因子是否被表达。通过测量从编码因子的基因转录的 mRNA 的量，或者通过使用抗体通过蛋白质印迹法而检测因子，也可以证实每种因子是否被表达。

每种表达的因子可以作为含有因子的溶液回收，以用作本发明的内毒素测量剂的组分。含有因子的溶液可以是，例如，培养液、培养物上清液、或细胞提取物、或其混合物。每种因子可以在纯化后或不经过纯化地使用。在本发明中，即使不经过因子纯化而原样使用含有每种表达的因子的细胞培养物上清液，也可以提供具有足够高性能的内毒素测量剂。在要纯化每种因子的情况下，可以通过例如用于蛋白纯化的已知方法进行纯化。这样的方法的例子包括硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和羟磷灰石色谱法。在将诸如 His- 标签等标签与每种因子连接的情况下，使用针对所述标签的亲和力，通过亲和色谱法也可以纯化所述因子。

在通过病毒方法生产每种因子的情况下，优选地消除病毒。消除病毒的方法没有特别限制，并且可以通过常规方法进行消除。例如，通过具有 500 kDa 孔径的中空纤维过滤膜，可以消除病毒。

（３）本发明的测量内毒素的方法

通过将本发明的内毒素测量剂与试验样品混合，在试验样品含有内毒素的情况下，发生级联反应。通过测量级联反应的进展，可以测量试验样品中的内毒素。也就是说，本发明提供了一种用于测量试验样品中的内毒素的方法，所述方法包括：将本发明的内毒素测量剂与试验样品混合的步骤，和测量级联反应的进展的步骤 ( 在下文中被称作“第一实施方案” ) 。

在所述第一实施方案中，从将本发明的内毒素测量剂与试验样品混合的步骤开始，在本发明的内毒素测量剂中含有的每种因子可以已经被包含在反应***中，或者可以顺序地加入反应***中。

例如，将本发明的内毒素测量剂与试验样品混合的步骤可以包括下述步骤 (A) 至 (C) ：

(A) 将本发明的因子 C 加入反应***中的步骤；

(B) 将本发明的因子 B 加入反应***中的步骤；和

(C) 将本发明的前凝固酶加入反应***中的步骤。

步骤 (A) 至 (C) 可以分开地、部分同时地或完全同时地进行。步骤 (A) 至 (C) 可以以任意次序进行。例如，步骤 (A) 之后进行步骤 (B) ，然后进行步骤 (C) 。

在所述第一实施方案中，通过将用于检测的底物加入反应***中，然后测量底物的反应 ( 着色、凝固等 ) ，可以测量级联反应的进展。从将本发明的内毒素测量剂与试验样品混合的步骤开始，用于检测的底物可以已经被包含在反应***中，或者可以在进展过程中或在该步骤结束以后加入反应***中。当然，所述第一实施方案包括这样的情况：其中采用预先含有用于检测的底物的本发明的内毒素测量剂。

只要在试验物含有内毒素的情况下发生级联反应，本发明的因子 B 和前凝固酶本身可以不必与试验样品接触。也就是说，本发明的用于测量内毒素的方法的另一个实施方案 ( 在下文中被称作“第二实施方案” ) 是，用于测量试验物中的内毒素的方法，该方法包括下面的步骤 (A) 至 (D) 。  

（Ａ）将本发明的因子 C 与试验样品混合的步骤；

(B) 在步骤 A 中混合因子 C 以后，将本发明的因子 B 与因子 C 混合的步骤；

(C) 在步骤 B 中混合因子 B 以后，将本发明的前凝固酶与因子 B 混合的步骤；和

(D) 测量级联反应的进展的步骤。

在所述第二实施方案中，步骤 (A) 至 (D) 可以分开地、部分同时地或完全同时地进行。例如，在开始步骤 A 之后，可以在进展过程中或在该步骤结束以后将因子 B 和 / 或前凝固酶加入反应***中。可替换地，在开始步骤 B 之后，可以在进展过程中或在该步骤结束以后将前凝固酶加入反应***中。可替换地，从步骤 A 开始时，所有 3 种因子可以都被包含在反应***中。可替换地，例如，可以回收在步骤 A 中的接触以后的因子 C 用于步骤 B ，且可以回收在步骤 B 中的接触以后的因子 B 用于步骤 C 。

在所述第二实施方案中，通过将用于检测的底物加入反应***中，然后测量底物的反应 ( 着色、凝固等 ) ，可以测量级联反应的进展。从步骤 A 开始，用于检测的底物可以被包含在反应***中，或者可以在进展过程中或在每个步骤结束以后加入反应***中。

本发明的测量内毒素的方法可以包含其它任意步骤，只要在试验样品含有内毒素的情况下会发生级联反应即可。例如，本发明的测量内毒素的方法可以包括：将用于检测的底物加入反应***中的步骤，或将由级联反应产生的凝固酶与用于检测的底物混合的步骤。此外，例如，本发明的测量内毒素的方法可以包括：基于用于检测的底物的反应，计算试验样品中的内毒素水平的步骤。

在本发明的测量内毒素的方法中，所述反应优选地在水性溶剂诸如水或缓冲液中进行。

在本发明的测量内毒素的方法中，反应溶液中的每种因子的浓度没有特别限制，只要在试验样品中含有内毒素的情况下会发生级联反应即可，并且可以根据因子的性质和 / 或类似因素适当地设定。例如，以终浓度的方式，每种因子的浓度通常是 10-50 μ g/mL 、优选 20-40 μ g/mL 、更优选约 30 μ g/mL 。

在本发明的测量内毒素的方法中，反应溶液中的用于检测的底物的浓度没有特别限制，只要在试验样品中含有内毒素的情况下会发生级联反应即可，并且可以根据用于检测的底物的性质和 / 或类似因素适当地设定。例如，在用于检测的底物是合成底物的情况下，以终浓度的方式，用于检测的底物的浓度通常是 0.001 mM-100 mM 、优选 0.01 mM-10 mM 。

在任何实施方案中，反应***可以含有除了内毒素测量剂（在第一实施方案中）或因子（在第二实施方案中）、用于检测的底物和试验样品以外的一种或多种任意组分，只要在试验样品中含有内毒素的情况下会发生级联反应即可。例如，反应***可以含有 pH- 缓冲剂和 / 或盐。 pH- 缓冲剂的例子包括 HEPES 缓冲剂、 MES 缓冲剂、 Tris 缓冲剂和 GTA 宽范围缓冲剂。在反应***中还可以包含诸如醇、酯、酮和酰胺等有机溶剂。

反应溶液的 pH 没有特别限制，只要在试验样品中含有内毒素的情况下会发生级联反应即可，且可以根据每种因子的性质适当地设定。例如，反应溶液的 pH 通常是 5-10 、优选 7-8.5 。

反应温度没有特别限制，只要在试验样品中含有内毒素的情况下会发生级联反应即可，且可以根据每种因子的性质适当地设定。反应温度通常是，例如， 10 ℃至 80 ℃、优选 20 ℃至 50 ℃。例如，反应温度可以是室温。

反应时间没有特别限制，且可以根据诸如每种因子的性质和反应温度等条件适当地设定。反应时间通常是，例如， 5 分钟至 1 小时、优选 15 分钟至 45 分钟。例如，反应时间可以是 30 分钟。

在任何实施方案中，在反应过程中，可以向反应***中额外地单独地或以任意组合加入试验样品、因子和其它组分。这些组分可以一次性加入，或者分多次加入，或者可以连续加入。从反应开始至反应结束可以采用恒定条件，或者可以在反应过程中改变条件。

通过测量用于检测的底物的反应 ( 着色、凝固等 ) ，可以测量由内毒素的存在引起的级联反应的进展，并因此可以测量试验物中的内毒素。通过依赖于采用的用于检测的底物的方法，可以测量用于检测的底物的反应 ( 着色、凝固等 ) 。

在定量测量内毒素的情况下，可以使用已知其浓度的内毒素标准样品来得到内毒素水平和用于检测的底物的反应程度 ( 着色、凝固等的程度 ) 之间的关联数据，并且，基于关联数据，可以定量在试验样品中存在的内毒素。关联数据可以是，例如，校正曲线。定量可以通过动力学方法或通过终点法来进行。

要进行内毒素测量的试验样品没有特别限制，其例子包括医用水、药物、输注溶液、血液制品、医疗设备、医疗仪器、化妆品、食品和饮料、环境样品 ( 例如，空气、河水和土壤 ) 、生物组分 ( 例如，血液、体液和组织 ) 、天然存在的蛋白、重组蛋白、核酸和碳水化合物。通过在反应***中混合、分散或溶解试验样品原样或试验样品的提取物或洗涤溶液，可以对试验样品进行内毒素测量。

实施例

现在将通过实施例更具体地描述本发明。但是，这些仅仅是本发明的实施例，并且本发明的范围不限于这些。

实施例 1: 本发明的内毒素测量剂的生产

(1-1) 使用病毒的方法 ( 在下文中被称作“病毒方法” )

在本实施例中，使用其中掺入了编码每种因子 C 、因子 B 和前凝固酶的基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达所述因子，并由此生产内毒素测量剂。

（１－１－１）重组杆状病毒的制备

使用通常可得到的协议服务 (TAKARA BIO INC.) ，完全合成了 SEQ ID NO:7 的 DNA ，作为编码 His- 标签连接的因子 C 的 DNA(His- 标签连接的因子 C 基因 ) 。 His- 标签连接的因子 C 是在 SEQ ID NO:2 中显示的日本鲎的因子 C ，其中 6 × His- 标签连接至 C- 端。将所述 DNA ***在转移载体 pPSC8 (Protein Sciences) 的限制性酶 Nru I 和 Sma I 的识别位点之间，以得到用于重组的载体。使用用于重组的载体，将 His- 标签连接的因子 C 基因掺入杆状病毒 AcNPV 中，以制备重组杆状病毒。

此外，使用引物 FC-N-Pst (SEQ ID NO:10) 和引物 FC-notag-R-Bam (SEQ ID NO:11) 并使用上述的编码 His- 标签连接的因子 C 的 DNA 作为模板，进行 PCR 以制备编码因子 C 的 DNA ，其中编码在 3'- 末端处的 His- 标签序列的核苷酸序列被除去 ( 不含 His- 标签的因子 C 基因 ) 。该 DNA 编码在 SEQ ID NO:2 中显示的日本鲎因子 C ，其中在 C- 端处没有连接 His 标签。对于不含 His- 标签的因子 C 基因，也通过如上所述的相同方法制备重组杆状病毒。

使用通常可得到的协议服务 (TAKARA BIO INC.) ，完全合成了 SEQ ID NO:8 的 DNA ，作为编码因子 B 的 DNA( 因子 B 基因 ) 。该 DNA 编码在 SEQ ID NO:4 中显示的日本鲎因子 B ( 不含 His- 标签 ) ，并且它的密码子组合为在昆虫细胞中的表达进行了优化。对于因子 B 基因，也通过如上所述的相同方法制备重组杆状病毒。但是，在 pPSC8 载体中的***位置是在限制性酶 Pst I 和 Kpn I 的识别位点之间。

使用通常可得到的协议服务 (TAKARA BIO INC.) ，完全合成了 SEQ ID NO:9 的 DNA ，作为编码前凝固酶的 DNA( 前凝固酶基因 ) 。该 DNA 编码在 SEQ ID NO:6 中显示的日本鲎前凝固酶 ( 不含 His- 标签 ) ，并且它的密码子组合为在昆虫细胞中的表达进行了优化。对于前凝固酶基因，也通过如上所述的相同方法制备重组杆状病毒。但是，在 pPSC8 载体中的***位置是在限制性酶 XbaI 和 BglII 的识别位点之间。

（１－１－２）用重组杆状病毒感染昆虫细胞 (Sf9 细胞 )

以 1.5 × 10⁶ 细胞 /mL ，将 Sf9 细胞 (Novagen) 接种在培养基中，并将在其中引入了编码 His- 标签连接的因子 C 的 DNA 的重组杆状病毒加入培养基中，以用所述病毒感染所述细胞。使用补充了抗生素 ( 抗生素 - 抗真菌剂 ( × 100) ； Invitrogen) ( 终浓度 , × 1) 的 Sf900 II 培养基 (Invitrogen) (1 L) ，作为 Sf9 细胞的培养基。将病毒的感染复数 (MOI) 设定为 1.0 。此后，将得到的细胞在摇动下在 28 ℃培养 48 小时。

类似地，用在其中引入了编码不含 His- 标签的因子 C 的 DNA 的病毒感染 Sf9 细胞。

此外，还用下述每种病毒感染 Sf9 细胞：向其中引入了编码因子 B 的 DNA 的病毒，和向其中引入了编码前凝固酶的 DNA 的病毒。在这些情况下，将 MOI 设定为 0.5 ，培养时间为 72 小时。

（１－１－３）表达的重组蛋白的溶液的回收

将上述培养以后得到的每种培养液在 4 ℃在 3000 × g 离心 30 分钟以得到上清液，然后将上清液在 -80 ℃保存。

（１－１－４）从重组蛋白溶液除去杂质和病毒

将已经如上所述冷冻保存的每种上清液融化，并应用于具有 0.1 μ m 孔径的滤器 (Cup Filter (Millipore)) 。在抽吸下进行过滤，并回收已经穿滤器的溶液。将每种回收的上清液应用于具有 500 kDa 孔径的中空纤维过滤膜 ( 聚醚砜中空纤维膜 ; Spectrum Labs) ，并使用 Kros Flow TFF 泵过滤*** (Spectrum Labs) 过滤。回收已经穿过膜的每种溶液。

（１－１－５）试剂的制备

在 4 ℃，将 560 mL 在上面 (1-1-4) 得到的每种溶液 ( 其中含有因子 C 、因子 B 或前凝固酶 ) 、 134 mL 蒸馏水、 126 mL 6.66 mM 的合成底物 (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) 的水溶液 ( 终浓度 , 0.3 mM) 和 560 mL 15% 的葡聚糖水溶液 ( 终浓度 , 3%) 混合到一起。将该混合物以 5 mL 体积等分分进管形瓶中并冷冻干燥，以得到内毒素测量剂 1 。

（１－２）使用质粒的方法 ( 在下文中也被称作“稳定表达细胞系方法” )

在本实施例中，将编码每种因子 C 、因子 B 和前凝固酶的基因掺入昆虫细胞的染色体中以构建稳定表达细胞系，然后表达每种因子，由此生产内毒素测量剂。

（１－２－１）稳定表达细胞系的制备和培养

使用 pIZ 载体试剂盒 (Invitrogen) ，将在上述的病毒方法中使用的每种不含 His- 标签的因子 C 基因，因子 B 基因 (SEQ ID NO:8) 和前凝固酶基因 (SEQ ID NO:9) 引入 Sf9 细胞 (Invitrogen) 中。

更具体地，首先将每种 DNA 掺入在试剂盒所含的载体 pIZ/V5-His 的 Eco RV 和 Mlu I 识别位点之间，并将得到的每种载体与试剂盒所含的 Cellfectin 混合，随后将所述载体引入 Sf9 细胞中。 DNA 在 pIZ/V5-His 中的掺入位置等显示在图 2 中。在图 2 的顶部所示的厚箭头指示的区域中，掺入了每种 DNA 。使用补充了抗生素 ( 抗生素 - 抗真菌剂 ( × 100) ； Invitrogen) ( 终浓度 , × 1) 和 Zeocin 抗生素 (Invitrogen) ( 终浓度 , 50 μ g/mL) 的 Sf900 III 培养基 (Invitrogen) 作为 Sf9 细胞的培养基。在培养基中将如此得到的细胞系（其中引入了每种 DNA ）的密度调至 6 × 10⁵ 细胞 /mL (1L) ，并将所述细胞在摇动下在 28 ℃培养 96 小时。

应当指出，尽管在 pIZ/V5-His 中含有 His 标签序列，所有上述的 DNA 具有终止密码子，从而在没有添加 His- 标签的情况下表达所有因子 C 、因子 B 和前凝固酶。

（１－２－２）重组蛋白溶液的回收、杂质的除去和试剂的制备

以与关于病毒方法的“ (1-1-3) 表达的重组蛋白的溶液的回收”、“ (1-1-4) 从重组蛋白溶液除去杂质和病毒”和“ (1-1-5) 试剂的制备”中所述的相同方式，处理在上述培养以后得到的每种培养液。但是，没有进行“ (1-1-4) 从重组蛋白溶液除去杂质和病毒”中的使用中空纤维过滤膜的过滤过程。将如此得到的测量剂作为内毒素测量剂 2 提供。

实施例 2: 表达的蛋白质的性能等

(2-1) 因子 C 的表达水平的对比

在通过病毒方法和稳定表达细胞系方法得到的不含 His- 标签的因子 C 和通过病毒方法得到的 His- 标签连接的因子 C 之间，对比了表达水平。

如下评价了表达水平：取 0.5 、 1.5 、 5 或 15 μ L 与在实施例 1 中过滤以后且在制备试剂之前的溶液相对应的溶液，并对取样的溶液进行在有 SDS 存在下的 5-20% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( 在非还原条件下 ) ，然后使用抗 - 因子 C 抗体 (2C12 ，得自 Shun-ichiro Kawabata 教授 , Department of Biology, Graduate School of Sciences, Kyushu University) 进行蛋白质印迹法。

结果显示在图 3 中。结果指示，不含 His- 标签的因子 C 的表达水平低于 His- 标签连接的因子 C 的表达水平。此外，使用光密度计测量了图 3 中的蛋白质印迹上的带的强度，并且，基于测得的强度的相对值，计算用于得到相等因子 C 浓度的每种溶液的体积比。通过病毒方法得到的不含 His- 标签因子 C 的体积比为 50 ，通过稳定表达细胞系方法得到的不含 His- 标签因子 C 的体积比为 17 ，通过病毒方法得到的 His- 标签连接的因子 C 的体积比为 7 。

（２－２）因子 C 的活性的对比

使用等量的因子 C ，研究了每种因子 C 溶液的前凝固酶活化能力。

更具体地，将每种通过病毒方法得到的 His- 标签连接的因子 C 溶液 (0.7 μ L 或 5 μ L) 、通过病毒方法得到的不含 His- 标签的因子 C 溶液 (5 μ L) 和通过稳定表达细胞系方法得到的不含 His- 标签的因子 C 溶液 (1.7 μ L) 放入 96- 孔板的孔中。此后，向每个孔中加入含有因子 B 的溶液 (5 μ L) 和含有前凝固酶的溶液 (5 μ L) （在实施例 1 的病毒方法中在 (1-1-4) 中穿过 0.1 μ m 滤器过滤以后得到）、以及 Boc-Leu-Gly-Arg-pNA ( 终浓度 , 0.3 mM) 、 Tris-HCl (pH 8.0) ( 终浓度 , 100 mM) 和 50 μ L 内毒素 ( 产品名“ USP- 参比标准内毒素” (USP-Reference Standard Endotoxin ，（ USP-RSE) ；可商购得自 Seikagaku Biobusiness Corporation) ( 样品浓度： 0 、 0.05 或 0.5 EU/mL) ，使得孔中的总体积变为 100 μ L ，并混合到一起，随后在 37 ℃温育 3 小时，在这期间，随着时间测量在 405 nm 的吸光度。使用蒸馏水作为阴性对照。吸光度的增加速率 ( 吸光度变化速率 ) 反映了前凝固酶活化能力。术语“ EU ”是指“内毒素单位”，它是代表内毒素的量的单位 ( 这也适用于下文中 ) 。

结果显示在图 4 中。在图 4 中，“ DW ”是指蒸馏水；“病毒 + His 标签 (x1) ”是指通过病毒方法得到的 His- 标签连接的因子 C 溶液 (0.7 μ L) ；“病毒 + His 标签 (x7) ”是指相同的溶液 (5 μ L) ；“病毒且无标签 (x1) ”是指通过病毒方法得到的不含 His- 标签因子 C 溶液；和“稳定的 Sf9 且无标签 (x1) ”是指通过稳定表达细胞系方法得到的不含 His- 标签因子 C 溶液。

结果，在含有等量的因子 C 的 His- 标签连接的因子 C 溶液 (0.7 μ L) 中，并且甚至在含有约 7 倍量的因子 C 的溶液 (5 μ L) 中，没有观察到或几乎没有观察到前凝固酶的活化。另一方面，不含 His- 标签的因子 C 表现出显著的前凝固酶活化能力，不论它是通过病毒方法得到还是通过稳定表达细胞系方法得到。

上述结果表明，与在添加 His- 标签序列的情况下表达的重组因子 C 分子相比，在没有添加 His- 标签序列的情况下表达的重组因子 C 分子具有强得多的前凝固酶活化能力。此外，表明了每种表达的蛋白质可以以在培养物上清液中含有的蛋白质的状态不经纯化地使用。

（２－３）表达的因子 C 的稳定性的对比

(2-3-1) 通过病毒方法表达的因子 C 的稳定性

在实施例 1 的病毒方法中在 (1-1-2) 中在摇动下在 28 ℃培养病毒感染的细胞的步骤中，在培养 48 小时、 72 小时和 96 小时以后回收上清液，并对每种回收的上清液进行在有 SDS 存在下的 5-20% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( 在非还原条件下 ) ，然后使用抗 - 因子 C 抗体 (2C12 ，其与上面使用的相同 ) 通过蛋白质印迹法评价因子 C 的剩余量。此外，以相同的方式对通过在病毒感染 24 小时后向培养液中加入蛋白酶抑制剂 ( 终浓度为 0.5 μ g/mL 的亮抑酶肽 + 终浓度为 0.7 μ g/mL 的抑胃酶肽 A) 得到的上清液分别进行取样和分析。

结果显示在图 5 中。结果表明，通过病毒方法表达的因子 C 在培养期间随着时间而分解。此外，表明了在加入蛋白酶抑制剂的情况下，也发生某种程度的因子 C 的分解。

（２－３－２）通过稳定表达细胞系方法表达的因子 C 的稳定性

类似地，在实施例 1 的稳定表达细胞系方法中在 (1-2-1) 中在摇动下在 28 ℃培养稳定表达细胞系的步骤中，在培养 72 小时、 96 小时、 120 小时、 144 小时和 168 小时以后回收上清液，并对每种回收的上清液进行在有 SDS 存在下的 5-20% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( 在非还原条件下 ) ，然后使用抗 - 因子 C 抗体 (2C12 ，其与上面使用的相同 ) 通过蛋白质印迹法评价因子 C 的剩余量。此外，还将通过病毒方法培养 48 小时以后得到的上清液上样。

结果显示在图 6 中。结果，在没有蛋白酶抑制剂存在下，即使在培养 168 小时以后，通过稳定表达细胞系方法表达的因子 C 也没有分解。由此表明，稳定表达细胞系方法的应用可以防止因子 C 的分解。

（２－４）关于中空纤维膜过滤处理是否必要的研究

研究了在病毒方法中在 (1-1-4) 中的中空纤维过滤膜处理是否是必要的。使用在 (1-1-4) 中穿过中空纤维膜过滤之前取样的每种溶液和在 (1-1-4) 中穿过中空纤维膜过滤之后取样的每种溶液 (3 批 ) ，通过加入内毒素 (USP-RSE) 至 0 或 0.05 EU/mL 的终浓度，以与上面 (2-2) 相同的方式测量了吸光度的增加速率 ( 吸光度变化速率 ) 。

结果显示在图 7 中。在图 7 中，“未过滤的溶液”是指没有过滤的保留在中空纤维膜筒中的溶液。在使用穿过中空纤维膜过滤后取样的每种溶液的情况下，当内毒素的浓度为 0 EU/mL 时，前凝固酶的活化度较低 ( 换而言之，在内毒素测量后的空白值较低 ) ，也就是说，得到了优良结果。相反，表明了在使用穿过中空纤维膜过滤之前取样的每种溶液 ( “过滤前”或“未过滤的溶液” ) 的情况下，即使在 0 EU/mL 内毒素的情况下，前凝固酶的活化程度也较高，这会导致在内毒素测量后的高空白值。

相反，通过稳定表达细胞系方法，即使没有这样的穿过中空纤维过滤膜的过滤过程，在 0 EU/mL 内毒素的情况下前凝固酶的活化程度 ( 在内毒素测量后的空白值 ) 保持较低 ( 图 4) 。

这些结果表明，尽管在使用病毒方法的情况下，穿过中空纤维过滤膜的过滤是必不可少的，但是在使用稳定表达细胞系方法的情况下，这样的过滤不是必需的。

实施例 3: 使用本发明的内毒素测量剂测量内毒素

(3-1) 使用内毒素测量剂 1 的测量

向内毒素测量剂 1 ( 冷冻干燥产品 ) 中，加入 3.3 mL 100 mM Tris 缓冲液 (pH 8.0) ，以溶解该试剂。在该溶液中，含有因子 C 、因子 B 和前凝固酶的每种培养物上清液的蛋白浓度为约 60 μ g/mL 。  

在 96- 孔微孔滴定板的每个孔中，加入 50 μ L 浓度为 0 、 0.001 、 0.01 或 0.1 EU/mL 的内毒素溶液的等分试样，并将 50 μ L 通过溶解所述试剂制备的内毒素测量剂溶液加入每个孔中，随后混合得到的混合物。然后将混合物在 37 ℃温育 30 分钟，并根据反应速率方法测量内毒素浓度，其中在温育过程中随时间测量在 405 nm 的吸光度。在该反应溶液中，含有因子 C 、因子 B 和前凝固酶的每种培养物上清液的蛋白浓度为约 30 μ g/mL 。

结果显示在图 8 中。结果表明，在使用通过病毒方法表达的因子的情况下，吸光度变化速率随着内毒素浓度增加而在 0.001-0.10 EU/mL 范围内线性地增加。

（３－２）使用内毒素测量剂 2 的测量

向内毒素测量剂 2( 冷冻干燥产品 ) 中，加入 3.3 mL 100 mM Hepes 缓冲液 (pH 7.6) ，以溶解该试剂。在该溶液中，含有因子 C 、因子 B 和前凝固酶的每种培养物上清液的蛋白浓度为约 60 μ g/mL 。  

在 96- 孔微孔滴定板的每个孔中 ，加入 50 μ L 浓度为 0 、 0.0005 、 0.001 、 0.005 、 0.01 或 0.1 EU/mL 的内毒素溶液的等分试样，并将 50 μ L 通过溶解所述试剂制备的内毒素测量剂溶液加入每个孔中，随后混合得到的混合物。然后将混合物在 37 ℃温育 30 分钟，并根据反应速率方法测量内毒素浓度，其中在温育过程中随时间测量在 405 nm 的吸光度。在该反应溶液中，含有因子 C 、因子 B 和前凝固酶的每种培养物上清液的蛋白浓度为约 30 μ g/mL 。

结果显示在图 9 中。结果表明，在使用通过稳定表达细胞方法表达的因子的情况下，吸光度变化速率随着内毒素浓度增加而在 0.0005-0.1 EU/mL 范围内线性地增加。

基于上述结果，利用任一种内毒素测量剂，在 30 分钟内可实现 0.001 EU/mL 浓度的内毒素的定量。此外，利用内毒素测量剂 2 ，能够在 30 分钟内测量 0.0005 EU/mL 浓度的内毒素。因而，表明了与常规方法 ( 其测量需要不小于 1 小时，且尚未实现 0.001 EU/mL 的检测灵敏度 ) 相比，本发明的内毒素测量剂能够更快速地且灵敏地定量内毒素。此外，表明了在任一种情况下，表达的因子可以不经过纯化而原样用于测量剂中。

实施例 4: 重组因子 C 蛋白和天然存在的因子 C 蛋白之间的活性差异

(4-1) 重组因子 C 蛋白和天然存在的因子 C 蛋白的纯化

通过使 2 mg 抗 - 因子 C 抗体 (2C12 ，其与上面使用的相同 ) 与 1ml 琼脂糖柱 (GE Healthcare) 共价连接，制备了 2 个因子 -C 抗体柱。根据在所附的说明书中描述的方法，进行所述制备。向 76 mL 含有通过稳定表达细胞方法制备的重组因子 C 蛋白（其通过与上面“ (1-2-2) 重组蛋白的回收”中所述相同的方法制备）的培养物上清液中，加入等量的 20 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0) （其含有 2 M 氯化钠和 2 mM EDTA ）以稀释所述培养物上清液，随后将得到的稀释液应用于因子 -C 抗体柱之一。类似地，向 76 mL 鲎血细胞提取物中，加入等量的 20 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0) （其含有 2 M 氯化钠和 2 mM EDTA ）以稀释所述提取物，随后将得到的稀释液应用于因子 -C 抗体柱中的另一个。顺序地用 20 mL 各自含有 200 mM 或 450 mM 氯化钠的 20 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0) 洗涤 2 个柱，然后用 50 mM 甘氨酸缓冲液 (pH 2.5) 进行洗脱。在预先放入了 0.025 mL 1M 氨丁三醇碱 (Sigma) 的 1.5 mL 试管中，收集 1 mL 每个洗脱的级分，以使洗脱的溶液的 pH 恢复至中性。

（４－２）纯化的重组的和天然存在的因子 C 蛋白之间的浓度对比

对纯化的重组的和天然存在的因子 C 蛋白的洗脱级分进行在有 SDS 存在下的 5-20% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ( 在非还原条件下 ) 。在该过程中，已知浓度的纯化的牛血清白蛋白 (=BSA) 作为浓度参照物样品也在相同的凝胶上进行分离 ( 图 10) 。用光密度计定量在考马斯亮蓝染色的凝胶上的 BSA 带的强度，并相对于 BSA 蛋白的浓度绘图，以制备校正曲线 ( 图 11) 。基于纯化的因子 C 蛋白的带强度和校正曲线，估测出纯化的因子 C 蛋白的浓度。结果表明，关于纯化的样品，天然存在的因子 C 蛋白的浓度是重组因子 C 蛋白的浓度的约 4 倍。

（４－３）纯化的重组的和天然存在的因子 C 蛋白之间的活性对比

使用纯化的重组的和天然存在的因子 C 蛋白，进行了活性对比。在该对比中，基于 (4-2) 的结果，在纯化的因子 C 之间平衡蛋白浓度。在 96- 孔微孔滴定板的每个孔中，加入 50 μ L 浓度为 0 、 0.05 、 0.1 或 0.5 EU/mL 的内毒素溶液的等分试样。将试剂和培养物上清液加入每个孔中，使得反应溶液中含有 50 mM Tris 缓冲液 (pH 8.0) 、 0.2 μ g/mL 的纯化的因子 C 蛋白、 30 μ g/mL 的含有重组因子 B 和重组前凝固酶的每种培养物上清液的蛋白、和 0.3 mM 的合成底物 Boc-Leu-Gly-Arg-pNA ，通过加入注射用水将所述反应溶液的总体积调至 100 μ L 。将反应溶液在 37 ℃温育 30 分钟，并根据反应速率方法进行分析，其中在温育过程中随时间测量在 405 nm 的吸光度。

结果表明，纯化的重组因子 C 蛋白的活性是纯化的天然存在的因子 C 蛋白的活性的约 2 倍 ( 图 12) 。上述结果提示，重组因子 C 具有比天然存在的因子 C 更高的比活性。

工业适用性

通过本发明，可以快速地且高灵敏度地测量内毒素。此外，通过本发明，可以简单地且快速地以低成本生产内毒素测量剂。因此，本发明可以非常有效地用于内毒素的检测。

序列表的描述

SEQ ID NO:1 日本鲎的因子 C 基因的 DNA 序列

SEQ ID NO:2 日本鲎的因子 C 的氨基酸序列

SEQ ID NO:3 日本鲎的因子 B 基因的 DNA 序列

SEQ ID NO:4 日本鲎的因子 B 的氨基酸序列

SEQ ID NO:5 日本鲎的前凝固酶基因的 DNA 序列

SEQ ID NO:6 日本鲎的前凝固酶的氨基酸序列

SEQ ID NO:7 His- 标签连接的因子 C 基因的 DNA 序列

SEQ ID NO:8 其密码子为在昆虫细胞中的表达进行了优化的因子 B 基因的 DNA 序列

SEQ ID NO:9 其密码子为在昆虫细胞中的表达进行了优化的前凝固酶基因的 DNA 序列

SEQ ID NO:10 用于制备不含 His- 标签的因子 C 基因的引物

SEQ ID NO:11 用于制备不含 His- 标签的因子 C 基因的引物

SEQ ID NO:12 肽序列

CPCH1362272P

序列表

<110> SEIKAGAKU CORPORATION

<120> 用于测量内毒素的试剂

<130> OP-11070-PCT

<150> US61/447,556

<151> 2011-02-28

<160> 12

<170> PatentIn 3.1版

<210> 1

<211> 3060

<212> DNA

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<221> CDS

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atg gtc tta gcg tcg ttt ttg gtg tct ggt tta gtt cta ggg ata cta 48

Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu

1 5 10 15

gcc caa caa atg cgt cca gtt cag tcc aga gga gta gat ctg ggc ttg 96

Ala Gln Gln Met Arg Pro Val Gln Ser Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu

20 25 30

tgt gat gaa acg agg ttc gag tgt aag tgt gga gat cca ggc tat gtg 144

Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val

35 40 45

ttc aac gtc cct atg aaa caa tgc acg tac ttc tat cga tgg agg cct 192

Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro

50 55 60

tat tgt aaa cca tgt gat gac ctg gag gct aag gac att tgt cca aag 240

Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys

65 70 75 80

tac aaa cga tgt caa gag tgt aag gct ggt ctt gat agt tgt gtt act 288

Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr

85 90 95

tgt cca cct aac aaa tat ggt act tgg tgt agc ggt gaa tgt caa tgt 336

Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys

100 105 110

aag aat gga ggt atc tgt gac cag agg aca gga gct tgt acc tgt cgt 384

Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg

115 120 125

gac aga tat gaa gga gcg cac tgt gaa att ctc aaa ggt tgt cct ctt 432

Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu

130 135 140

ctt cca tcg gat tct caa gtt cag gaa gtc aga aac cca cca gat aat 480

Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn

145 150 155 160

ccc caa act att gac tac agc tgt tca cca ggg ttc aag ctt aaa ggc 528

Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly

165 170 175

gtg gca cga att agc tgt ctc cca aat gga cag tgg agt agc ttt cca 576

Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro

180 185 190

ccc aaa tgt att cga gaa tgt gcc aag gtt tca tct cca gaa cac ggg 624

Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu His Gly

195 200 205

aaa gtg aat gct cct agt ggc aat atg ata gaa ggg gct act tta cgg 672

Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg

210 215 220

ttc tca tgt gat agt ccc tac tac ttg att ggt caa gaa aca tta acc 720

Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr

225 230 235 240

tgc cag ggt aat ggt cag tgg agt gga caa ata cca caa tgt aag aag 768

Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys

245 250 255

ttg gtc ttc tgt cct gac ctt gat cct gta aac cat gct gaa cac cag 816

Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Gln

260 265 270

gtt aaa att ggt gtg gaa caa aaa tat ggt cag ttt cct caa ggc act 864

Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr

275 280 285

gaa gtg acc tat acg tgt tcg ggt aac tac ttc ttg atg ggt ttt aac 912

Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn

290 295 300

acc tta aaa tgt aac cct gat ggg tcc tgg tca gga tca cag cca tcc 960

Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser

305 310 315 320

tgt gtt aaa gtg gca gac aga gag gtc gac tgt gac agt aaa gct gta 1008

Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val

325 330 335

gac ttc ttg gat gat gtt ggt gaa cct gtc agg atc cac tgt cct gct 1056

Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala

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ggc tgt tct ttg aca gct ggt act gtg tgg ggt aca gcc ata tac cac 1104

Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His

355 360 365

gaa ctt tcc tca gtg tgt cgt gca gcc atc cat gct ggc aag ctt cca 1152

Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro

370 375 380

aac tct gga ggg gcg gtg cat gta gtg aac aat ggc ccc tac tcg gac 1200

Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp

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ttt ctg ggt agt gac ctg aat ggg ata aaa tcg gaa gag ttg aag tct 1248

Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser

405 410 415

ctt gcc cgc agt ttt cga ttt gat tat gtc agt tca tcc aca gca ggt 1296

Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly

420 425 430

aga tca gga tgt cct gat gga tgg ttt gag gta gaa gag aac tgt gtg 1344

Arg Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe Glu Val Glu Glu Asn Cys Val

435 440 445

tac gtt aca tca aaa cag aga gcc tgg gaa aga gct caa ggt gtg tgt 1392

Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys

450 455 460

acc aat atg gct gct cgt ctt gct gtg cta gac aaa gat cta att ccg 1440

Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val Leu Asp Lys Asp Leu Ile Pro

465 470 475 480

agt tcc ttg act gag act cta cga ggg aaa ggg tta aca acc aca tgg 1488

Ser Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp

485 490 495

ata gga ttg cac aga cta gat gct gag aag ccc ttt gtt tgg gag cta 1536

Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu Lys Pro Phe Val Trp Glu Leu

500 505 510

atg gat cgt agt aat gtg gtt ctg aat gat aac cta aca ttc tgg gcc 1584

Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala

515 520 525

tct ggc gaa cct gga aat gaa act aac tgt gta tat ctg gac atc cga 1632

Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Leu Asp Ile Arg

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gat cag ctg cag cct gtg tgg aaa acc aag tca tgt ttt cag ccc tca 1680

Asp Gln Leu Gln Pro Val Trp Lys Thr Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser

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agc ttt gct tgc atg atg gat ttg tca gac aga aat aaa gcc aaa tgc 1728

Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys

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gat gac cct gga cca ctg gaa aat gga cac gcc aca ctt cat gga caa 1776

Asp Asp Pro Gly Pro Leu Glu Asn Gly His Ala Thr Leu His Gly Gln

580 585 590

agt att gat ggg ttc tat gct ggt tct tct ata agg tac agc tgt gag 1824

Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu

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Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn

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ggc aca tgg agt gct cct aaa cct cga tgt atc aaa gtc atc acc tgc 1920

Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys

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caa aac cct cct gta cca tca tat ggt tct gtg gaa atc aaa ccc cca 1968

Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro

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agt cgg aca aac tcg atc agt cgt gtt ggg tca cct ttc ttg agg ttg 2016

Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu

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cca cgg tta ccc ctc cca tta gcc aga gca gcc aaa cct cct cca aaa 2064

Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys

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cct aga tcc tca caa ccc tct act gtg gac ttg gct tct aaa gtt aaa 2112

Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys

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Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys

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Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp

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Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser

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Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn

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Ala Glu Ile Ile Asp Pro Ser Gln Phe Lys Ile Tyr Leu Gly Lys Tyr

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Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg

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Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn Cys Val Tyr Leu Asp Ile Arg

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Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys

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Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys

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<223>

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Gly Lys Arg Lys Val Lys Ile Asp Ile Thr Thr Val Gly Arg Ser Gly

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Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Pro Gln Asn Ser Thr Gly Gly

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gac gtg att atc cat cct cat tat gta gaa aag gag aac tac aat gat 720

Asp Val Ile Ile His Pro His Tyr Val Glu Lys Glu Asn Tyr Asn Asp

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Ile Ala Ile Ile Glu Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val

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Asn Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Thr Val Thr Asp Pro Leu Lys

260 265 270

gac aga att gtg act gca gcg gga tgg ggc gat ctg gat ttc tcc ggt 864

Asp Arg Ile Val Thr Ala Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ser Gly

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cca cgg agc caa gtt cta cgt gag gta agc atc cca gtt gtt cca gtt 912

Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Val

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gat aaa tgt gat caa gcc tat gag aaa ctc aac acc cct tca cta aaa 960

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aat ggg ata acg aat aac ttc ctt tgc gct gga ttg gaa gaa gga ggg 1008

Asn Gly Ile Thr Asn Asn Phe Leu Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly

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aaa gac gct tgc caa ggc gat tct ggt gga ccg ttg atg cta gtg aac 1056

Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn

340 345 350

aac act agg tgg ata gta gta gga gtt gtg tcg ttc ggg cac aag tgt 1104

Asn Thr Arg Trp Ile Val Val Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys

355 360 365

gcc gag gaa gga tat cct ggt gtg tac tcg cgc gta gcg agt tac cta 1152

Ala Glu Glu Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Ala Ser Tyr Leu

370 375 380

gac tgg atc gcg aaa gtt acg aac tcg tta gat cat gcc gtc act aac 1200

Asp Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp His Ala Val Thr Asn

385 390 395 400

taa 1203

<210> 4

<211> 400

<212> PRT

<213> 东方鲎

<400> 4

Met Thr Trp Ile Cys Val Ile Thr Leu Phe Ala Leu Ala Ser Ala Thr

1 5 10 15

Leu Gly Asn Lys Val Ser Arg Val Gly Val Leu Phe Pro Lys Thr Arg

20 25 30

Asn Asp Asn Glu Cys Thr Ala Arg Gly Gly Leu Lys Gly Ser Cys Lys

35 40 45

Ser Leu Ile Asp Cys Pro Ser Val Leu Ala Thr Leu Lys Asp Ser Phe

50 55 60

Pro Val Val Cys Ser Trp Asn Gly Arg Phe Gln Pro Ile Val Cys Cys

65 70 75 80

Pro Asp Ala Ile Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Ala Val Thr Val

85 90 95

Ile Ser Thr Lys Glu Pro Lys Leu Pro Arg Leu His Ile Ser Gly Cys

100 105 110

Gly Lys Arg Lys Val Lys Ile Asp Ile Thr Thr Val Gly Arg Ser Gly

115 120 125

Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Pro Gln Asn Ser Thr Gly Gly

130 135 140

Arg Gly Ile Ile Ala Gly Gly Val Glu Ala Lys Ile Gly Ala Trp Pro

145 150 155 160

Trp Met Ala Ala Val Phe Val Lys Asn Phe Gly Ile Gly Arg Phe His

165 170 175

Cys Ala Gly Ser Ile Ile Ser Asn Lys Tyr Ile Leu Ser Ala Ala His

180 185 190

Ala Phe Leu Ile Gly Gly Arg Lys Leu Thr Pro Thr Arg Leu Ala Val

195 200 205

Arg Val Gly Gly His Tyr Ile Lys Arg Gly Gln Glu Tyr Pro Val Lys

210 215 220

Asp Val Ile Ile His Pro His Tyr Val Glu Lys Glu Asn Tyr Asn Asp

225 230 235 240

Ile Ala Ile Ile Glu Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val

245 250 255

Asn Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Thr Val Thr Asp Pro Leu Lys

260 265 270

Asp Arg Ile Val Thr Ala Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ser Gly

275 280 285

Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Val

290 295 300

Asp Lys Cys Asp Gln Ala Tyr Glu Lys Leu Asn Thr Pro Ser Leu Lys

305 310 315 320

Asn Gly Ile Thr Asn Asn Phe Leu Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly

325 330 335

Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn

340 345 350

Asn Thr Arg Trp Ile Val Val Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys

355 360 365

Ala Glu Glu Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Ala Ser Tyr Leu

370 375 380

Asp Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp His Ala Val Thr Asn

385 390 395 400

<210> 5

<211> 1128

<212> DNA

<213> 东方鲎

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1128)

<223>

<400> 5

atg ttg gtg aat aac gtg ttt tca cta ctg tgt ttc cca ctc ttg atg 48

Met Leu Val Asn Asn Val Phe Ser Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu Met

1 5 10 15

tct gtg gtt aga tgc agt act ctc agc aga cag cgt aga cag ttt gtt 96

Ser Val Val Arg Cys Ser Thr Leu Ser Arg Gln Arg Arg Gln Phe Val

20 25 30

ttc cct gac gag gaa gaa ctt tgc tca aac cga ttt act gaa gaa gga 144

Phe Pro Asp Glu Glu Glu Leu Cys Ser Asn Arg Phe Thr Glu Glu Gly

35 40 45

aca tgc aaa aat gtc ttg gat tgt aga ata ctt tta caa aaa aat gat 192

Thr Cys Lys Asn Val Leu Asp Cys Arg Ile Leu Leu Gln Lys Asn Asp

50 55 60

tat aat tta ctc aaa gaa tca ata tgc ggc ttt gaa ggc ata aca ccc 240

Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Ser Ile Cys Gly Phe Glu Gly Ile Thr Pro

65 70 75 80

aaa gtt tgt tgt ccg aaa tca agc cat gta att tca agt aca cag gca 288

Lys Val Cys Cys Pro Lys Ser Ser His Val Ile Ser Ser Thr Gln Ala

85 90 95

cct cca gaa acc act acg act gaa cgc cca cca aaa cag ata cca ccc 336

Pro Pro Glu Thr Thr Thr Thr Glu Arg Pro Pro Lys Gln Ile Pro Pro

100 105 110

aat ctt cat gaa gtg tgt gga att cac aat act aca act acc agg att 384

Asn Leu His Glu Val Cys Gly Ile His Asn Thr Thr Thr Thr Arg Ile

115 120 125

att gga ggt cgg gaa gca cct att gga gcc tgg ccg tgg atg act gct 432

Ile Gly Gly Arg Glu Ala Pro Ile Gly Ala Trp Pro Trp Met Thr Ala

130 135 140

gtc tac ata aaa caa gga gga atc aga agt gtt cag tgt ggt ggc gca 480

Val Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Ile Arg Ser Val Gln Cys Gly Gly Ala

145 150 155 160

ctt gtc act aac agg cac gtg att aca gct tcg cac tgt gtt gta aac 528

Leu Val Thr Asn Arg His Val Ile Thr Ala Ser His Cys Val Val Asn

165 170 175

agt gca gga aca gat gtg atg cca gct gat gta ttc tcg gtt cgt ctg 576

Ser Ala Gly Thr Asp Val Met Pro Ala Asp Val Phe Ser Val Arg Leu

180 185 190

ggt gaa cac aat tta tac agt acc gat gac gat tcg aat cca ata gat 624

Gly Glu His Asn Leu Tyr Ser Thr Asp Asp Asp Ser Asn Pro Ile Asp

195 200 205

ttt gca gtt acg tcg gtg aaa cat cac gaa cac ttt gta ctc gcg acg 672

Phe Ala Val Thr Ser Val Lys His His Glu His Phe Val Leu Ala Thr

210 215 220

tat ttg aat gac atc gca att cta acg tta aat gac aca gtt acg ttt 720

Tyr Leu Asn Asp Ile Ala Ile Leu Thr Leu Asn Asp Thr Val Thr Phe

225 230 235 240

aca gac aga att cga ccc att tgt cta cct tat cgt aag ttg aga tac 768

Thr Asp Arg Ile Arg Pro Ile Cys Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Arg Tyr

245 250 255

gat gat cta gca atg aga aaa ccg ttt atc act gga tgg gga aca aca 816

Asp Asp Leu Ala Met Arg Lys Pro Phe Ile Thr Gly Trp Gly Thr Thr

260 265 270

gca ttt aac ggc cca tct agt gca gtg ttg aga gaa gta cag tta cca 864

Ala Phe Asn Gly Pro Ser Ser Ala Val Leu Arg Glu Val Gln Leu Pro

275 280 285

ata tgg gaa cac gag gcc tgt aga cag gcc tac gag aag gat tta aat 912

Ile Trp Glu His Glu Ala Cys Arg Gln Ala Tyr Glu Lys Asp Leu Asn

290 295 300

att aca aac gtg tat atg tgt gct ggc ttt gca gat ggc ggg aag gat 960

Ile Thr Asn Val Tyr Met Cys Ala Gly Phe Ala Asp Gly Gly Lys Asp

305 310 315 320

gct tgc cag ggt gat tct gga ggt cca atg atg ttg cct gtt aaa acc 1008

Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Met Leu Pro Val Lys Thr

325 330 335

gga gag ttt tat ctc att gga att gtg tct ttc gga aag aaa tgc gca 1056

Gly Glu Phe Tyr Leu Ile Gly Ile Val Ser Phe Gly Lys Lys Cys Ala

340 345 350

ttg cct gga ttt cct ggg gtt tac aca aaa gtg aca gag ttt tta gat 1104

Leu Pro Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Glu Phe Leu Asp

355 360 365

tgg att gca gaa cat atg gtg tag 1128

Trp Ile Ala Glu His Met Val

370 375

<210> 6

<211> 375

<212> PRT

<213> 东方鲎

<400> 6

Met Leu Val Asn Asn Val Phe Ser Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu Met

1 5 10 15

Ser Val Val Arg Cys Ser Thr Leu Ser Arg Gln Arg Arg Gln Phe Val

20 25 30

Phe Pro Asp Glu Glu Glu Leu Cys Ser Asn Arg Phe Thr Glu Glu Gly

35 40 45

Thr Cys Lys Asn Val Leu Asp Cys Arg Ile Leu Leu Gln Lys Asn Asp

50 55 60

Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Ser Ile Cys Gly Phe Glu Gly Ile Thr Pro

65 70 75 80

Lys Val Cys Cys Pro Lys Ser Ser His Val Ile Ser Ser Thr Gln Ala

85 90 95

Pro Pro Glu Thr Thr Thr Thr Glu Arg Pro Pro Lys Gln Ile Pro Pro

100 105 110

Asn Leu His Glu Val Cys Gly Ile His Asn Thr Thr Thr Thr Arg Ile

115 120 125

Ile Gly Gly Arg Glu Ala Pro Ile Gly Ala Trp Pro Trp Met Thr Ala

130 135 140

Val Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Ile Arg Ser Val Gln Cys Gly Gly Ala

145 150 155 160

Leu Val Thr Asn Arg His Val Ile Thr Ala Ser His Cys Val Val Asn

165 170 175

Ser Ala Gly Thr Asp Val Met Pro Ala Asp Val Phe Ser Val Arg Leu

180 185 190

Gly Glu His Asn Leu Tyr Ser Thr Asp Asp Asp Ser Asn Pro Ile Asp

195 200 205

Phe Ala Val Thr Ser Val Lys His His Glu His Phe Val Leu Ala Thr

210 215 220

Tyr Leu Asn Asp Ile Ala Ile Leu Thr Leu Asn Asp Thr Val Thr Phe

225 230 235 240

Thr Asp Arg Ile Arg Pro Ile Cys Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Arg Tyr

245 250 255

Asp Asp Leu Ala Met Arg Lys Pro Phe Ile Thr Gly Trp Gly Thr Thr

260 265 270

Ala Phe Asn Gly Pro Ser Ser Ala Val Leu Arg Glu Val Gln Leu Pro

275 280 285

Ile Trp Glu His Glu Ala Cys Arg Gln Ala Tyr Glu Lys Asp Leu Asn

290 295 300

Ile Thr Asn Val Tyr Met Cys Ala Gly Phe Ala Asp Gly Gly Lys Asp

305 310 315 320

Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Met Leu Pro Val Lys Thr

325 330 335

Gly Glu Phe Tyr Leu Ile Gly Ile Val Ser Phe Gly Lys Lys Cys Ala

340 345 350

Leu Pro Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Glu Phe Leu Asp

355 360 365

Trp Ile Ala Glu His Met Val

370 375

<210> 7

<211> 3078

<212> DNA

<213> 东方鲎

<400> 7

atggtcttag cgtcgttttt ggtgtctggt ttagttctag ggatactagc ccaacaaatg 60

cgtccagttc agtccagagg agtagatctg ggcttgtgtg atgaaacgag gttcgagtgt 120

aagtgtggag atccaggcta tgtgttcaac gtccctatga aacaatgcac gtacttctat 180

cgatggaggc cttattgtaa accatgtgat gacctggagg ctaaggacat ttgtccaaag 240

tacaaacgat gtcaagagtg taaggctggt cttgatagtt gtgttacttg tccacctaac 300

aaatatggta cttggtgtag cggtgaatgt caatgtaaga atggaggtat ctgtgaccag 360

aggacaggag cttgtacctg tcgtgacaga tatgaaggag cgcactgtga aattctcaaa 420

ggttgtcctc ttcttccatc ggattctcaa gttcaggaag tcagaaaccc accagataat 480

ccccaaacta ttgactacag ctgttcacca gggttcaagc ttaaaggcgt ggcacgaatt 540

agctgtctcc caaatggaca gtggagtagc tttccaccca aatgtattcg agaatgtgcc 600

aaggtttcat ctccagaaca cgggaaagtg aatgctccta gtggcaatat gatagaaggg 660

gctactttac ggttctcatg tgatagtccc tactacttga ttggtcaaga aacattaacc 720

tgccagggta atggtcagtg gagtggacaa ataccacaat gtaagaagtt ggtcttctgt 780

cctgaccttg atcctgtaaa ccatgctgaa caccaggtta aaattggtgt ggaacaaaaa 840

tatggtcagt ttcctcaagg cactgaagtg acctatacgt gttcgggtaa ctacttcttg 900

atgggtttta acaccttaaa atgtaaccct gatgggtcct ggtcaggatc acagccatcc 960

tgtgttaaag tggcagacag agaggtcgac tgtgacagta aagctgtaga cttcttggat 1020

gatgttggtg aacctgtcag gatccactgt cctgctggct gttctttgac agctggtact 1080

gtgtggggta cagccatata ccacgaactt tcctcagtgt gtcgtgcagc catccatgct 1140

ggcaagcttc caaactctgg aggggcggtg catgtagtga acaatggccc ctactcggac 1200

tttctgggta gtgacctgaa tgggataaaa tcggaagagt tgaagtctct tgcccgcagt 1260

tttcgatttg attatgtcag ttcatccaca gcaggtagat caggatgtcc tgatggatgg 1320

tttgaggtag aagagaactg tgtgtacgtt acatcaaaac agagagcctg ggaaagagct 1380

caaggtgtgt gtaccaatat ggctgctcgt cttgctgtgc tagacaaaga tctaattccg 1440

agttccttga ctgagactct acgagggaaa gggttaacaa ccacatggat aggattgcac 1500

agactagatg ctgagaagcc ctttgtttgg gagctaatgg atcgtagtaa tgtggttctg 1560

aatgataacc taacattctg ggcctctggc gaacctggaa atgaaactaa ctgtgtatat 1620

ctggacatcc gagatcagct gcagcctgtg tggaaaacca agtcatgttt tcagccctca 1680

agctttgctt gcatgatgga tttgtcagac agaaataaag ccaaatgcga tgaccctgga 1740

ccactggaaa atggacacgc cacacttcat ggacaaagta ttgatgggtt ctatgctggt 1800

tcttctataa ggtacagctg tgaggttctc cactacctca gtggaactga gaccgtaact 1860

tgtacaacaa atggcacatg gagtgctcct aaacctcgat gtatcaaagt catcacctgc 1920

caaaaccctc ctgtaccatc atatggttct gtggaaatca aacccccaag tcggacaaac 1980

tcgatcagtc gtgttgggtc acctttcttg aggttgccac ggttacccct cccattagcc 2040

agagcagcca aacctcctcc aaaacctaga tcctcacaac cctctactgt ggacttggct 2100

tctaaagtta aactacctga aggtcattac cgggtagggt ctcgagccat ttacacgtgc 2160

gagtcgagat actacgaact acttggatct caaggcagaa gatgtgactc taatggaaac 2220

tggagtggtc ggcccgctag ctgtattcca gtttgtggac ggtcagactc tcctcgttct 2280

cctttcatct ggaatgggaa ttctacagaa ataggtcagt ggccgtggca ggcaggaatc 2340

tctcgatggc ttgcagacca caatatgtgg tttctccagt gtggaggatc cctattgaat 2400

gagaaatgga tcgtcactgc tgcccactgt gtcacctact ctgctactgc tgagataatt 2460

gatcccagtc agtttaaaat ctatctgggc aagtactacc gtgatgacag tagagacgat 2520

gactacgtac aagtaagaga ggctctcgag atccacgtaa atcctaacta cgaccccggc 2580

aatctcaact ttgacatagc cctaattcaa ctgaaaactc ctgttacttt gacaacacga 2640

gtccaaccaa tctgtctgcc tactgacatc acaacaagag aacacttgaa ggagggaaca 2700

ttagcagtgg tgacaggttg gggtttgaat gaaaacaaca catattcaga gatgattcaa 2760

caagctgtgc tacctgttgt tgcagcaagc acctgtgaag aggggtacaa ggaagcagac 2820

ttaccactga cagtaacaga gaacatgttc tgtgcaggtt acaagaaggg acgttatgat 2880

gcctgcagtg gggacagtgg aggaccatta gtgtttgctg atgattcccg taccgaaagg 2940

cggtgggtct tggaagggat tgtcagctgg ggcagtccca gtggatgtgg caaggctaac 3000

cagtatgggg gcttcactaa agttaacgtt tttctatcat ggattaggca gttcattcat 3060

catcaccatc accattga 3078

<210> 8

<211> 1203

<212> DNA

<213> 东方鲎

<400> 8

atgacctgga tctgcgtgat caccctgttc gctctggctt ccgctaccct gggcaacaag 60

gtgtcccgtg tgggtgtcct gttccccaag acccgtaacg acaacgagtg caccgctcgt 120

ggtggtctga agggctcctg caagtccctg atcgactgcc cctccgtgct ggctaccctg 180

aaggactcct tccccgtcgt gtgctcctgg aacggtcgtt tccagcccat cgtgtgctgc 240

cccgacgcta tcgctccccc ccctgtgacc accaccgctg tgaccgtgat ctccaccaag 300

gagcccaagc tgccccgtct gcacatctcc ggttgcggca agcgcaaggt caagatcgac 360

atcaccaccg tgggccgttc cggttccccc atcctgcccc ccatctccac cccccagaac 420

tccactggtg gtcgtggtat catcgctggc ggtgtcgagg ctaagatcgg tgcttggccc 480

tggatggctg ctgtgttcgt gaagaacttc ggtatcggtc gcttccactg cgctggttcc 540

atcatctcca acaagtacat cctgtccgct gctcacgctt tcctcatcgg tggtcgcaag 600

ctgaccccca cccgtctggc tgtgcgtgtg ggtggtcact acatcaagcg tggccaggag 660

taccccgtca aggacgtgat catccacccc cactacgtgg agaaggagaa ctacaacgac 720

atcgccatca tcgagctgaa ggaggagctg aacttcaccg acctggtcaa ccccatctgc 780

ctgcccgacc ccgagactgt gaccgaccct ctgaaggacc gtatcgtgac cgctgctggc 840

tggggcgacc tggacttctc cggtccccgt tcccaggtgc tgcgtgaggt gtccatcccc 900

gtggtgcccg tggacaagtg cgaccaggct tacgagaagc tgaacacccc ctccctgaag 960

aacggtatta ccaacaactt cctctgcgcc ggactcgagg agggtggcaa ggacgcttgc 1020

cagggcgact ccggtggtcc cctgatgctg gtcaacaaca cccgttggat cgtcgtgggt 1080

gtcgtgtcct tcggtcacaa gtgcgctgag gagggttacc ccggcgtcta ctcccgtgtg 1140

gcttcctacc tggactggat cgctaaggtc accaactccc tggaccacgc tgtcaccaac 1200

taa 1203

<210> 9

<211> 1128

<212> DNA

<213> 东方鲎

<400> 9

atgctggtca acaacgtgtt ctccctgctg tgcttccccc tgctgatgtc cgtcgtgcgt 60

tgctccaccc tgtcccgtca gcgtcgtcag ttcgtgttcc ccgacgaaga ggagctgtgc 120

tccaaccgtt tcaccgagga gggcacttgc aagaacgtgc tggactgccg tatcctgctg 180

cagaagaacg actacaacct cctgaaggag tccatctgcg gtttcgaggg tatcactccc 240

aaggtctgct gccccaagtc ctcccacgtg atctccagca cccaggctcc ccccgagact 300

accaccaccg agcgtccccc caagcagatc ccccccaacc tccacgaggt ctgcggtatc 360

cacaacacca ccaccacccg tatcatcggt ggtcgcgagg ctcccatcgg tgcttggccc 420

tggatgaccg ctgtgtacat caagcagggt ggtatccgtt ccgtgcagtg cggaggtgct 480

ctggtcacca accgtcacgt gatcaccgct tcccactgcg tggtcaactc cgctggcacc 540

gacgtgatgc ccgctgacgt gttctctgtg cgtctgggcg agcacaacct gtactccacc 600

gacgacgact ccaaccccat cgacttcgct gtgacctccg tgaagcacca cgagcacttc 660

gtgctggcta cctacctgaa cgacatcgct atcctgactc tgaacgacac cgtgaccttc 720

accgaccgta tccgtcccat ctgcctgccc taccgcaagc tgcgttacga cgacctggct 780

atgcgcaagc ccttcatcac cggctggggc accaccgctt tcaacggtcc ctcctccgct 840

gtgctgcgtg aggtgcagct gcccatctgg gagcacgagg cttgccgtca ggcttacgag 900

aaggacctga acatcaccaa cgtgtacatg tgcgctggtt tcgctgacgg tggcaaggac 960

gcttgccagg gcgactccgg tggtcccatg atgctgcccg tcaagaccgg cgagttctac 1020

ctgatcggta tcgtgtcctt cggcaagaag tgcgctctgc ccggtttccc cggtgtctac 1080

accaaggtca ccgagttcct cgactggatc gccgagcaca tggtgtaa 1128

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物FC-N-Pst

<400> 10

caactgcaga tggtcttagc gtcgtttttg 30

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物FC-无标签-R-Bam

<400> 11

caggatcctc aaatgaactg cctaatccat gat 33

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<400> 12

Ile Glu Gly Arg

1

Claims (9)

1.一种内毒素测量剂，其包含下面的蛋白(1)至(3)，该蛋白中的每一种是通过使用昆虫细胞作为宿主进行表达可得到的重组蛋白：

(1) 源自东方鲎（Tachypleus tridentatus）的因子C，该因子C在C-端处不具有His-标签序列；

(2) 鲎的因子B；和

(3) 鲎的前凝固酶。

2.根据权利要求1所述的测量剂，其中所述因子B和所述前凝固酶源自东方鲎。

3.根据权利要求1或2所述的测量剂，其中所述因子C是下面的蛋白(A)或(B)；所述因子B是下面的蛋白(C)或(D)；且所述前凝固酶是下面的蛋白(E)或(F)：

(A) 蛋白，其包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；

(B) 蛋白，其包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，但是其包括一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、***或添加，该蛋白具有因子C活性；

(C) 蛋白，其包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列；

(D) 蛋白，其包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，但是其包括一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、***或添加，该蛋白具有因子B活性；

(E) 蛋白，其包含在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；

(F) 蛋白，其包含在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，但是其包括一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、***或添加，该蛋白具有前凝固酶活性。

4.一种用于生产根据权利要求1至3中的任一项所述的测量剂的方法，该方法包括下面的步骤(A)至(C)：

(A) 将下面DNA(1)至(3)中的每一种掺入病毒DNA中的步骤：

(1) DNA，其编码源自东方鲎的因子C，该因子C在C-端处不具有His-标签序列；

(2) DNA，其编码鲎的因子B；和

(3) DNA，其编码鲎的前凝固酶；

(B) 用其中掺入了所述每种DNA的病毒感染昆虫细胞的步骤；和

(C) 使被所述每种病毒感染的昆虫细胞表达由所述每种DNA编码的蛋白的步骤。

5.一种用于生产根据权利要求1至3中的任一项所述的测量剂的方法，该方法包括下面的步骤(A)至(C)：

(A) 将下面DNA(1)至(3)中的每一种掺入载体中的步骤：

(1) DNA，其编码源自东方鲎的因子C，该因子C在C-端处不具有His-标签序列；

(2) DNA，其编码鲎的因子B；和

(3) DNA，其编码鲎的前凝固酶；

(B) 将其中掺入了所述每种DNA的载体引入昆虫细胞中以使所述每种DNA掺入昆虫细胞的染色体中的步骤；和

(C) 使其中掺入了所述每种DNA的昆虫细胞表达由所述每种DNA编码的蛋白的步骤。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述编码因子C的DNA是下面的DNA (A)或(B)；所述编码因子B的DNA是下面的DNA (C)或(D)；且所述编码前凝固酶的DNA是下面的DNA (E)或(F)：

(A) DNA，其包含在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；

(B) DNA，其在严谨条件下与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全长或部分的互补序列杂交，且编码具有因子C活性的蛋白；

(C) DNA，其包含在SEQ ID NO:3或8中所示的核苷酸序列；

(D) DNA，其在严谨条件下与SEQ ID NO:3或8所示核苷酸序列的全长或部分的互补序列杂交，且编码具有因子B活性的蛋白；

(E) DNA，其包含在SEQ ID NO:5或9中所示的核苷酸序列；

(F) DNA，其在严谨条件下与SEQ ID NO:5或9所示核苷酸序列的全长或部分的互补序列杂交，且编码具有前凝固酶活性的蛋白。

7.一种在试验样品中测量内毒素的方法，该方法包括：使根据权利要求1至3中的任一项所述的测量剂与试验样品混合的步骤，和测量级联反应的进展的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，该方法包括：将用于检测级联反应的进展的底物加入反应***中的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，该方法另外包括：基于所述底物的反应计算试验样品中的内毒素水平的步骤。

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