CN104884616A - 在原生动物中重组制备鲎c因子蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法,所述方法使用表达所述C因子蛋白的寄生原生动物。具体地,本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞以及制备C因子蛋白的方法,该方法包括在使得所述细胞表达所述鲎C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。另外,本发明提供由所述新方法制备的重组C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的用途。
Description
技术领域
本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法,所述方法使用表达所述C因子蛋白的寄生原生动物。相应地,本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞以及制备C因子的方法,该方法包括在使得所述细胞表达所述鲎C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。本发明提供由所述新方法制备的重组鲎C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的用途。
背景技术
内毒素(也已知为脂多糖(LPS))是革兰氏阴性细菌细胞膜的一种基本成分,并造成许多(如果不是全部)发生在革兰氏阴性细菌败血症期间的毒性作用。
来自革兰氏阴性细菌的LPS引起鲎的变形细胞聚集和成颗粒状。据推测,LPS引起的凝聚级联代表鲎用来对抗革兰氏阴性细菌入侵的一种重要的防卫机制。几十年来,变形细胞溶解物作为鲎变形细胞溶解物(LAL)试验的组成已被用作检测溶液中痕量浓度的内毒素(LPS)的工具。鲎中凝聚的分子机制已经被建立了,并且它与蛋白酶的级联有关。这个级联是基于3种丝氨酸蛋白酶酶原、C因子、B因子、凝固酶原以及一种可凝结蛋白、凝固蛋白原。作为凝固级联的最初激活剂,C因子作为对LPS作出反应的生物传感器。一旦C因子被LPS“激活”,产生的活性部分具有激活B因子和水解合成的三肽底物的能力。
C因子活性是用于飞克水平内毒素的非常敏感的分析的基础,其应用于制药产品以及诸如此类的产品的质量控制中。因此,C因子在内毒素检测中的重要性导致了作为可替代来源的重组C因子(rFC)的表达,这种可替代来源应该减轻用传统的变形细胞溶解物的公认的缺点,像内毒素检测灵敏度的季节性变动。
为了内毒素的特异性分析,C因子蛋白已被纯化和克隆。当被LPS激活时,重组C因子对存在于分析混合物中的合成底物起作用以产生可检测的信号,由此指示在指定样品中LPS的存在。具体地,荧光底物产生与所述样品中的内毒素浓度成比例的荧光信号。C因子蛋白已经被纯化和克隆以用于其在内毒素-特异性分析中的应用。
Nakamura等(1986,Eur.J.Biochem.154:511-521)描述了来源于中国鲎(Tachypleustridentatus)的天然C因子蛋白的分离和特征。Muta等(1991,J.Biol.Chem.266:6554-6561)公布了编码来源于中国鲎(T.tridentatus)的C因子蛋白的cDNA序列。Ding等(1995,Molecular Marine Biology and Biotechnology 4:90-103)公布了编码来源于圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)的C因子蛋白的cDNA序列。Roopashree等(1995,Biochem.Mol.Biol.Intl.35:841-849)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子在大肠杆菌中的重组表达。在此,108kDa的酶原的表达以及78kDa和52kDa的激活形式由免疫检测显示出来。
Ding等(1996,US专利5,858,706)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的重组表达。Roopashree等(1997,Biotechnology Letters 19:1147-1150)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的重组表达。
Roopashree等(1997,Biotechnology Letters 19:357-361)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在哺乳动物COS-1细胞中的重组表达。在此,C因子蛋白被表达,具有132kDa、130kDa和63kDa分子量的蛋白条带被检测到。这些蛋白是非分泌、不可溶和无活性的,而是不溶的,与细胞碎片组分结合。
Wang等(2001,Biotechnology Letters 23:71-76)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在昆虫细胞(稳定转染的Sf9细胞)中的重组表达。在此,C因子蛋白被分泌到上清液中,具有132kDa分子量,其表明蛋白的糖基化。在它可以结合内毒素(LPS)的意义上,所获得的C因子是有功能活性的。然而,没有显示出向有酶促活性的蛋白酶的转变。Wang等(2002,J.Biol.Chem.277:36363-736372)也描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在昆虫细胞中的重组表达。在此,C因子被克隆并转染到果蝇S2细胞,并以糖基化的可溶性蛋白被表达,该糖基化的可溶性蛋白被分泌到培养物上清液中。重组C因子蛋白能结合LPS,但是不能***成有酶促活性的蛋白酶。来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在昆虫细胞中的重组表达在US 6,645,724中有进一步的描述,使用在Sf9细胞中表达的杆状病毒***。
C因子蛋白是一种复杂的真核蛋白,需要几个转变步骤和二级修饰以变为有活性的蛋白酶。在原核生物(如,大肠杆菌)中的重组表达不提供糖基化、***成H链和L链以及正确的二硫键的形成。在简单的真核表达***(如,酵母)中的细胞质表达提供C因子,该C因子能结合LPS,但在结合LPS时不被激活,即,没有从酶原形式转变到有活性的蛋白酶。当使用酵母细胞(毕赤酵母属或酵母菌属)用来表达时,不可能获得作为分泌蛋白的重组C因子。在哺乳动物细胞系中的表达也不提供有活性的分泌蛋白。此外,在稳定转化的昆虫细胞中的表达提供分泌蛋白,该分泌蛋白能够结合LPS。然而,被LPS激活在这个***中没有显示。最后,在使用杆状病毒表达***的昆虫细胞中的表达提供了分泌C因子蛋白,该分泌C因子蛋白能够结合LPS,并在结合LPS时转变成有活性的丝氨酸蛋白酶酶原。
从到目前为止所获得的所有经验,在昆虫细胞中成功表达有活性的C因子蛋白的专家推断出“在昆虫细胞中的表达,而不是在原核或简单的真核表达***中的表达,适于制备具有完全生物活性的rFC。此外,鲎和昆虫属于相同的门(节肢动物门),因而在它们的生理和生化上,昆虫细胞比酵母细胞更近似于鲎的细胞。因此,在昆虫细胞中制备的rFC可能更近似于从鲎中纯化的蛋白,并且保留了具有被LPS激活的丝氨酸蛋白酶活性的生物活性”(见WO 99/15676第2页,“发明摘要”)。
从那时起,即,WO 99/15676公开后的13年多,关于有活性的C因子蛋白的重组制备没有做进一步尝试。显然,从经历多年的在各种宿主***中的重组表达所获得的结果看,以及从在WO 99/15676中的本领域顶级专家给出的明确评估来看,昆虫宿主细胞中的杆状病毒表达***被认为是重组制备有活性的C因子蛋白的金标准。
发明内容
本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法,所述方法使用表达所述C因子蛋白的寄生原生动物。具体地,本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞以及制备C因子蛋白的方法,所述方法包括在使得所述细胞表达所述鲎C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。此外,本发明提供由所述新方法制备的重组C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的应用。
具体地,本发明的方面为:
(1)一种寄生原生动物,其特征是含有编码C因子蛋白的多聚核苷酸。
(2)根据(1)的寄生原生动物,其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的核酸分子组成,优选为由引入至寄生原生动物宿主细胞的载体组成。
(3)根据(1)或(2)的寄生原生动物,其中所述寄生原生动物为锥体虫目下的成员。
(4)根据(1)至(3)任一项所述的寄生原生动物,其中所述寄生原生动物为利什曼虫属的成员。
(5)根据(1)至(4)任一项所述的寄生原生动物,其中所述寄生原生动物为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)。
(6)根据(1)至(5)任一项所述的寄生原生动物,其中所述多聚核苷酸编码来自美洲鲎(Limulus polyphemus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)、中国鲎(Tachypleustridentatus)或南方鲎(Tachypleus gigas)的C因子蛋白。
(7)根据(1)至(6)任一项所述的寄生原生动物,其中所述多聚核苷酸编码具有SEQID No:4的氨基酸序列的C因子蛋白。
(8)一种制备C因子蛋白的方法,其包括步骤:(a)在使得细胞表达由所述多聚核苷酸编码的C因子蛋白的条件下培养(1)至(7)任一项所述的寄生原生动物;和(b)从细胞培养物中回收在步骤(a)制备的C因子蛋白。
(9)根据(7)或(8)所述的方法,其中所述C因子蛋白在细胞培养基中积累。
(10)根据(8)或(9)的方法,其中制备的C因子蛋白在结合内毒素时呈现出丝氨酸蛋白酶活性。
(11)由(8)的方法获得的C因子蛋白。
(12)由(8)至(10)任一项所述的方法制备的C因子蛋白在内毒素检测方法或在内毒素清除方法中的用途。
(13)(11)的C因子蛋白在内毒素检测方法或在内毒素清除方法中的用途。
(14)用于内毒素检测或内毒素清除的分析或试剂盒,其包含由(8)至(10)任一项所述的方法制备的C因子蛋白,或(11)的C因子蛋白。
(15)一种产生制备C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的方法,其包括步骤:(a)将含有编码C因子蛋白的多聚核苷酸的核酸分子,优选为载体,引入至寄生原生动物,优选为锥体虫目的寄生原生动物,更优选为利什曼虫属的成员,最优选为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae);和(b)选择一个或多个在步骤(a)制备的表达所述C因子蛋白的宿主细胞。
(16)由(15)的方法获得的寄生原生动物宿主细胞,其包含编码C因子蛋白的多聚核苷酸,其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的核酸分子(优选为载体)组成。
附图说明
图1:显示了在37℃下底物转换15分钟后测得的依赖于rFC浓度的LPS激活的重组C因子(rFC)的rfu值的图。用于计算比活的rFC浓度被标示出。
具体实施方式
充分建立了用于在内毒素的检测和清除中使用的来源于鲎的C因子。在过去人们尝试了通过重组表达制备作为传统的变形细胞溶解物(来源于鲎的血细胞(变形细胞)的水提取物)的可替代来源的C因子。本领域中关于C因子的重组表达的许多尝试都失败了,因为在各种宿主细胞中制备的重组C因子(rFC)没有表现出在内毒素检测方法中使用所需要的生物活性。本领域所采用的宿主细胞为原核细胞、简单的真核细胞以及更高等的真核细胞,并且在数年的集中研究后,本领域的专家推断在昆虫细胞中的表达,而不是在原核或简单的真核表达***中的表达,适合于制备具有完全生物活性的rFC。与此相关的,本领域的专家解释鲎和昆虫属于相同的门——节肢动物门,因而在它们的生理和生化上,昆虫细胞比酵母细胞可能更近似于鲎的细胞。因此,在昆虫细胞中制备的rFC可能更近似于从鲎纯化的蛋白,并且保留了具有被LPS激活的丝氨酸蛋白酶活性的生物活性。
本发明提供一种重组制备来源于鲎的C因子蛋白的新方法,所述方法使用表达所述C因子蛋白的寄生原生动物。具体地,本发明提供含有编码来源于鲎的异源C因子蛋白的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞,以及制备来源于鲎的重组C因子蛋白的方法,所述方法包括在使得所述细胞表达所述重组C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。此外,本发明提供由所述新方法制备的重组C因子蛋白以及它在内毒素的检测和/或清除中的用途。
原生动物是简单的单细胞真核有机体。本发明的主题对于技术人员来说是非显而易见的,因为,如在上文所解释的,本领域已指引远离了使用简单的真核表达***来成功制备有活性的C因子蛋白。另外,令人惊讶的是,原生动物的基本伴侣***提供重组C因子的正确折叠,注意的是,为了得到C因子蛋白,多于20个二硫键必需被适当地连接。人们不能预期本发明的原生动物宿主细胞提供重组的鲎C因子,该原生动物宿主细胞使得前酶原和酶原正确裂解成由重(H)链和轻(L)链组成的有活性的蛋白酶。另外,使用由本发明提供的原生动物表达重组鲎C因子蛋白具有如下优势:
首先,由于需要昂贵的专用培养基的事实,使用昆虫细胞重组制备C因子蛋白的成本高,而使用原生动物是廉价的,因为所需要的培养基是便宜的,并且设备和培养条件与细菌的发酵相似。此外,原生动物的培养是生长相对快的(快的增代时间),并且易于按比例增加。另外,一旦被克隆,重组表达宿主是稳定的,并且不需要连续制备传染性病毒库。在本发明的原生动物培养物中制备的重组C因子蛋白已显示出以好的产量和可溶形式被分泌,并且能容易地从培养物上清液中纯化。具体来说,只有一种活性形式的C因子从上清液中纯化得到,没有降解产物。值得注意的是,所表达的重组蛋白是稳定的,并且不需要添加剂来保护酶原形式。
宿主细胞
本发明提供一种寄生原生动物,其特征在于含有编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸。由本发明提供的寄生原生动物被用于重组制备来源于鲎的C因子。因此,本发明提供一种用于重组制备鲎C因子的寄生原生动物宿主细胞,其中所述寄生原生动物宿主细胞的特征在于含有编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸。
本发明的用于重组制备鲎C因子的宿主细胞为寄生原生动物宿主细胞。优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为动质体寄生原生动物宿主细胞。这些宿主细胞的共有分类学特征为具有浓密核外DNA的单一线粒体。含有所述DNA的线粒体区域被称为“动质体”,所述DNA被称为“动质体DNA”。小亚基rRNA-基础和保守的蛋白质基础的种系发生支持了动质体***成5个目:原动质体目(Prokinetoplastida)、Neobodonida、Parabodonida、Eubodonida和锥体虫目(Trypanosomatida)。因此,本发明的优选的动质体寄生原生动物为寄生的原动质体目(Prokinetoplastida)、Neobodonida、Parabodonida、Eubodonida或锥体虫目(Trypanosomatida)。优选地,本发明的动质体寄生原生动物为寄生锥体虫(即,寄生锥体虫目)。由于锥体虫的所有成员为寄生的,本文简单地用术语“锥体虫”来描述寄生锥体虫(即,寄生锥体虫目)。
锥体虫由单性生殖属(比如短膜虫属(Crithidia)、细滴虫属(Leptomonas)和Blastocrithidia和复殖属(比如利什曼虫属和锥体虫属)组成。在本发明中,优选的动质体寄生原生动物为复殖的锥体虫(即,锥体虫目的复殖成员)。更优选地,本发明的宿主细胞为利什曼虫属的成员。更优选地,本发明的宿主细胞为硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)或蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)。在本发明中,最优选的宿主细胞为蜥蜴利什曼原虫。在多种实施方式中,本发明的宿主细胞为锥体虫属的成员。在优选的实施方式中,本发明的宿主细胞选自布氏锥虫(Trypanosoma brucei)和提氏锥虫(Trypanosomatheileri)。
虽然锥体虫为人和动物疾病的重要起因,但是许多种类是非致病性的。本发明的锥体虫原生动物优选为非致病性的动质体寄生原生动物(非致病性的动质体目),更优选为非致病性的锥体虫原生动物(非致病性的锥体虫科),更优选的为非致病性的利什曼虫属。优选的动质体目的非致病性的种类包括(但不限于)蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)、束形短膜虫(Crithidia fasciculata)、Wallaceina inconstans(从前的Proteomonasinconstans)、Leptomonas collos、Leptomonas sp.和Leptomonas seymouri。本发明最优选的非致病性的原生动物为蜥蜴利什曼原虫。在多种实施方式中,本发明的寄生原生动物宿主细胞为减弱的致病性原生动物宿主细胞,即,它们的致病性已被减弱了。优选为遗传减弱的。减弱病原体的一种方法为目标基因的删除。因此,遗传减弱的锥体虫寄生物(即,锥体虫寄生原生动物)能通过选择的基因(如,编码毒力因子的基因)的删除获得。基因删除利用了该寄生物能经历内源和人工引入到细胞中的外源DNA序列间的同源重组的事实。在本发明中所用的减弱的寄生原生动物(优选为减弱的锥体虫寄生物)具有减弱的毒力,特别是对人的减弱的毒力。
应当理解的是,贯穿说明书和权利要求书,像“非致病性的动质体目”或“非致病性的锥体虫科”的术语的使用涉及的不只是包含在前述种类中的有机体/宿主,也包括那些可替代分类学体系中的那些种类,这些种类具有上面定义的同样的形态和培养特性或特征,并且可以是“非致病性的动质体目”和“非致病性的锥体虫科”的同义词。
如在本文中所用的,术语非致病性包括(但不限于)对人非致病性的意思。在多种实施方式中,“非致病性”由正在讨论的有机体分类学定义为生物安全等级1级。
在多种实施方式中,所述原生动物宿主细胞包含选择标记,优选为选择标记基因。
表达***
本发明提供含有编码来源于鲎的异源C因子蛋白的多聚核苷酸的原生动物宿主细胞。如在本文中所用的,异源蛋白是指对宿主细胞来说是非天然的蛋白。本发明的原生动物宿主细胞代表重组制备鲎C因子蛋白的表达***。因此,本发明提供包含寄生原生动物宿主细胞和编码来源于鲎的异源C因子蛋白的多聚核苷酸的表达***,也提供所述表达***在来源于鲎的异源C因子蛋白的表达中的用途。虽然在多种实施方式中,本发明提供的表达***可以包含作为分离方式的宿主细胞和多聚核苷酸,优选地,由本发明提供的表达***包含寄生原生动物宿主细胞,其已经含有编码异源鲎C因子蛋白的多聚核苷酸。
在多种实施方式中,编码异源鲎C因子蛋白的多聚核苷酸可操作地连接到合适的启动子序列上,并且(如果合适)连接到转录后信号序列,所述转录后信号序列能够指导编码C因子蛋白的多聚核苷酸在本发明的宿主细胞中表达。优选地,所述启动子为动质体寄生原生动物的活跃转录的基因的启动子。更优选地,所述启动子为锥体虫目的成员的活跃转录的基因的启动子;更优选地,所述启动子为利什曼虫属的成员的活跃转录的基因的启动子;最优选地,所述启动子为蜥蜴利什曼原虫的活跃转录的基因的启动子。
在多种实施方式中,所述启动子为强转录起始异源启动子。
在本发明中所用的编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸为异源多聚核苷酸,具体为编码异源鲎C因子蛋白的异源多聚核苷酸。如在本文中所用的,异源多聚核苷酸指对于宿主细胞来说不是天然的多聚核苷酸。在多种实施方式中,在本发明中所用的异源多聚核苷酸的转录由与被包含的和被表达的阻遏基因相连的阻遏应答元件控制。
在多种实施方式中,至少一个拷贝的所述异源多聚核苷酸被置于本发明的原生动物宿主细胞的活跃转录的基因簇中。优选地,所述活跃转录的基因簇为rRNA基因簇。
在多种实施方式中,所述编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸侧翼连接动质体寄生原生动物的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR(未翻译区或非翻译区)。优选地,所述编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸侧翼连接锥体虫目的成员的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR;更优选地,侧翼连接利什曼虫属的成员的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR;更优选地,侧翼连接蜥蜴利什曼原虫的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR。
在多种实施方式中,所述编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸侧翼连接一个或多个信号序列,这些信号序列提供了,比如,动质体寄生原生动物的活跃转录的基因的有效分泌、剪接和/或多聚腺苷酸化,即,所述信号序列为动质体寄生原生动物的活跃转录基因的信号序列。优选地,所述异源C因子蛋白侧翼连接锥体虫目的成员的活跃转录基因的一个或多个信号序列;更优选地,侧翼连接利什曼虫属的成员的活跃转录基因的一个或多个信号序列;更优选地,侧翼连接蜥蜴利什曼原虫的活跃转录基因的一个或多个信号序列。
在多种实施方式中,所述异源C因子蛋白侧翼连接来源于墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)的酸性磷酸酶的信号序列(Wiese等.1995,EMBO J.14:1067-1074)。
在多种实施方式中,本发明的表达***实质上不产生宿主细胞的蛋白酶、毒素和大量其他内源合成以及分泌的蛋白。
C因子的核酸和氨基酸序列及其变体
由在本发明中所使用的多聚核苷酸编码的C因子蛋白是一种异源C因子蛋白。在本发明中所使用的多聚核苷酸包含编码C因子的核酸序列,所述核酸序列呈现出像来源于鲎的C因子的酶活性。本发明的范围包括编码C因子的多聚核苷酸的用途,所述C因子具有如在它的自然来源中发现的氨基酸序列,即,从鲎中获得的C因子的氨基酸序列,也包括编码如在本文中描述的C因子氨基酸序列的变体的多聚核苷酸的用途。本发明的范围也包括含有如在它的自然来源中发现的C因子核酸序列的多聚核苷酸的用途,即,从鲎中获得的C因子的核酸序列,也包括含有如在本文中描述的变体C因子核酸序列的多聚核苷酸的用途。不管怎样,在本发明中所使用的多聚核苷酸编码C因子蛋白,当用内毒素激活时该蛋白显示出C因子样的酶活性。在本文其它地方给出“C因子样的酶活性”的定义。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的编码C因子蛋白的多聚核苷酸通过***、删除、添加和/或取代一个或更多个核酸进行修饰,条件是在根据本发明的寄生原生动物宿主细胞中从这样修饰的多聚核苷酸的表达获得的C因子蛋白在用内毒素、胰凝乳蛋白酶(特别是α-胰凝乳蛋白酶)或脂质A激活时显示出C因子样的酶活性。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸为编码来源于中国鲎(Tachypleustridentatus)或南方鲎(Tachypleus gigas)的C因子的多聚核苷酸。在多种实施方式中,所述多聚核苷酸编码来源于圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)的C因子。在多种实施方式中,所述多聚核苷酸编码来源于美洲鲎(Limulus polyphemus)的C因子。在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸包含序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸与编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸至少具有75%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。优选地,所述多聚核苷酸呈现出与编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸具有至少85%或至少95%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。更优选地,所述多聚核苷酸呈现出与编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸具有至少96%或至少97%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。甚至更优选地,所述多聚核苷酸呈现出与编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸具有至少98%或至少99%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸编码一种多肽,所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列有至少75%同一性并且呈现出C因子样的酶活性。优选地,所述多聚核苷酸编码一种多肽,所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列有至少85%或至少95%同一性并且呈现出C因子样的酶活性。更优选地,所述多聚核苷酸编码一种多肽,所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列有至少96%或至少97%同一性并且呈现出C因子样的酶活性。甚至更优选地,所述多聚核苷酸编码一种多肽,所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列有至少98%或至少99%同一性并且呈现出C因子样的酶活性。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸为在严格条件下与在本文中所描述的任意多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸,其中所述杂交多聚核苷酸编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少75%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。优选地,在本发明中所使用的多聚核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少85%或至少95%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。更优选地,在本发明中所使用的多聚核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少96%或至少97%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。甚至更优选地,在本发明中所使用的多聚核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少98%或至少99%的同一性,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸含有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少75%的同一性的多聚核苷酸的核苷酸序列的一部分,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽,其中所述部分编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物,并且其中所述片段、类似物或功能衍生物呈现出C因子样的酶活性。优选地,所述多聚核苷酸含有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少85%或至少95%的同一性的多聚核苷酸的核苷酸序列的一部分,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽,其中所述部分编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物,并且其中所述片段、类似物或功能衍生物呈现出C因子样的酶活性。更优选地,所述多聚核苷酸含有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少96%或至少97%的同一性的多聚核苷酸的核苷酸序列的一部分,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽,其中所述部分编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物,并且其中所述片段、类似物或功能衍生物呈现出C因子样的酶活性。甚至更优选地,所述多聚核苷酸含有与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的核苷酸序列有至少98%或至少99%的同一性的多聚核苷酸的核苷酸序列的一部分,并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽,其中所述部分编码具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物,并且其中所述片段、类似物或功能衍生物呈现出C因子样的酶活性。
在多种实施方式中,在本发明中所使用的多聚核苷酸为在本文中描述的并且在本发明中可使用的任意多聚核苷酸的全长的互补,其中所述互补多聚核苷酸编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。
本发明特别包含编码如在WO 99/15676中描述的来源于圆尾鲎(Carcinoscorpiusrotundicauda)的C因子的核酸序列的用途。具体地,本发明通过引用方式包括以WO99/15676的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3形式表示的代表性核苷酸序列的用途。同样地,WO 99/15676的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列(分别表示由WO 99/15676的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码的氨基酸序列)的用途明确地通过引用的方式包括在本发明中。
WO 99/15676的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的序列不对应于本说明书的序列表的SEQID NO:1至SEQ ID NO:4。无论何时在本发明中涉及SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的任意序列,是指本说明书的序列表的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的任意序列。相反地,如在前面段落中所示的,WO 99/15676的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的序列通过明确引用WO99/15676而在本文中表述。
本发明的范围包括重组制备由在本文描述的任意多聚核苷酸和核酸分子编码的C因子多肽。当然,本发明的范围也包括从任意这种制备过程获得的重组C因子多肽。
在多种实施方式中,本发明的C因子蛋白的氨基酸序列由***、删除、添加和/或取代一个或多个氨基酸残基进行修饰,条件是在根据本发明的寄生原生动物宿主中重组表达后的具有这样修饰的氨基酸序列的C因子蛋白在用内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活时显示出C因子样的酶活性。
前面句子中的术语“一个或多个氨基酸残基”的意思随着C因子蛋白的三维结构中氨基酸残基的位置和氨基酸残基的类型而变化。更具体地,所述术语指优选为1-20个氨基酸残基,更优选为1-10个氨基酸残基,更优选为1-5个氨基酸残基,并且甚至更优选为1-3个氨基酸残基。在多种实施方式中,上述描述的***、删除、添加和/或取代一个或多个氨基酸是保持了由内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A以酶原形式激活的C因子蛋白的酶活性的保守突变。示例性的保守突变为保守取代。保守取代为,比如,如果取代位点为芳香族氨基酸,在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸间互相发生取代的突变;如果取代位点为疏水性氨基酸,在亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸间互相发生取代的突变;如果取代位点为极性氨基酸,在谷氨酰胺和天冬酰胺间互相发生取代的突变;如果取代位点为碱性氨基酸,在赖氨酸、精氨酸和组氨酸间互相发生取代的突变;如果取代位点为酸性氨基酸,在天冬氨酸和谷氨酸间互相发生取代的突变;以及如果取代位点为含有羟基基团的氨基酸,在丝氨酸和苏氨酸间互相发生取代的突变。被认为是保守取代的取代的例子具体包括用丝氨酸或苏氨酸取代丙氨酸,用谷氨酰胺、组氨酸或赖氨酸取代精氨酸,用谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸或天冬氨酸取代天冬酰胺,用天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺取代天冬氨酸,用丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸,用天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺,用甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或天冬氨酸取代谷氨酸,用脯氨酸取代甘氨酸,用天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或酪氨酸取代组氨酸,用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代异亮氨酸,用异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代亮氨酸,用天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸取代赖氨酸,用异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代甲硫氨酸,用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸,用苏氨酸或丙氨酸取代丝氨酸,用丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸,用苯丙氨酸或酪氨酸取代色氨酸,用组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸,以及用甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代缬氨酸。
本发明包含对SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的任意的上面描述的***、删除、添加和/或取代。
上面描述的***、删除、添加和/或取代也包括由于C因子基因来源的鲎之间个体的品系或种类的不同而自然发生的突变。此外,上面描述的***、删除、添加和/或取代也包括在单独的宿主细胞中C因子蛋白的重组表达过程中自然发生的突变。
在多种实施方式中,由本发明的方法制备的C因子蛋白具有来源于中国鲎(Tachypleustridentatus)或南方鲎(Tachypleus gigas)的C因子的氨基酸序列。在多种实施方式中,由本发明的方法制备的C因子蛋白具有来源于圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)的C因子的氨基酸序列。在多种实施方式中,由本发明的方法制备的C因子蛋白具有来源于美洲鲎(Limulus polyphemus)的C因子的氨基酸序列。在多种实施方式中,由本发明的方法制备的C因子蛋白具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在多种实施方式中,在本发明中所用的多聚核苷酸编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列多肽或其片段、类似物或功能衍生物,其中所述片段、类似物或功能衍生物呈现出C因子样的酶活性。本发明包括本文描述的任意C因子多肽的片段、类似物和/或功能衍生物,只要这种片段、类似物和/或功能衍生物在用内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活时显示出C因子样的酶活性。
为了根据本发明的鲎C因子的重组制备,所述寄生原生动物包含编码来源于鲎的重组C因子蛋白的多聚核苷酸。因此,编码在本发明中所使用的来源于鲎的C因子蛋白的多聚核苷酸为一种异源多聚核苷酸,更具体地为一种编码来源于鲎的异源C因子蛋白的异源多聚核苷酸。
为了清楚起见,在本文中描述的鲎C因子蛋白的任意变体仍被认为是鲎C因子蛋白,并不考虑在本文中描述的任意变体被定义为呈现出鲎C因子样的酶活性的事实。
C因子样的酶活性
酶原是酶的前体。虽然酶原有时被称为酶的非活性前体,在它(由于不同的因素)已失去其活性的意义上,酶原不是“非活性”的,而是一种需要被激活而成为有活性的酶的分子。
来源于鲎的C因子仍然是一种酶原直至遇到痕量的内毒素。当被内毒素(或胰凝乳蛋白酶或脂质A)激活时,鲎C因子明确地呈现出完全的酶活性,通过水解合成的C因子底物指示(比如,在待分析内毒素的样品中)内毒素的存在,所述合成的C因子底物形成可测量/可检测的产物。本发明的重组C因子(rFC)以像从其自然来源的C因子一样的酶原进行制备。此外,本发明的rFC也仍然为一种酶原直至它遇到痕量的内毒素。当被内毒素(或胰凝乳蛋白酶或脂质A)激活时,本发明的rFC明确地呈现出像从其自然来源的鲎C因子一样的完全的酶活性。
从上面看,并且仅为了清楚起见,需要注意的是“C因子样的酶活性”是指如为激活形式测得的来源于鲎的C因子的酶活性。换句话说,“C因子样的酶活性”是指被内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活的鲎C因子的酶活性。因此,如果由本发明的方法制备的重组C因子蛋白在本文中被描述为具有或呈现出C因子样的蛋白酶活性,应当清楚的是它是指激活的酶原的酶活性。换句话说,如在本文中所使用的“来源于鲎的C因子的酶活性”是指“来源于鲎的激活的C因子的酶活性”或“来源于鲎的激活的C因子酶原的酶活性”。
在多种实施方式中,术语“本发明的(重组)C因子”和“本发明的酶原(重组)C因子”可以交替地使用。虽然从本发明的方法直接获得的rFC为C因子酶的前体,在它(因为不同因素)已经失去其活性的意义上,本发明的酶原rFC不是“非活性”的。相反地本发明的酶原rFC是需要被激活以成为有活性的酶的分子。
来源于鲎的C因子的酶活性具体为水解活性,更具体为蛋白水解活性,并且更具体为丝氨酸蛋白酶活性。因此,如在本文中描述的C因子样的酶活性具体是指鲎C因子样的水解活性,更具体为鲎C因子样的蛋白水解活性,并且更具体为鲎C因子样的丝氨酸蛋白酶活性。
鲎C因子蛋白的酶活性可以通过如发色或荧光分析来测量。具体地,鲎C因子的酶活性可以通过如可检测的发色或荧光信号来证实,该信号是由于被激活的C因子***/水解C因子底物产生的。用于检测C因子活性的合适的分析在本领域中有描述,并且本领域普通技术人员在进行指定的C因子蛋白的酶活性的检测/测量分析时不会有任何问题。C因子的底物在本领域中也有描述并且可以利用。本发明的范围包括发色或荧光C因子底物的用途,所述发色或荧光C因子底物包括但不限于,发色的肽基对硝基苯胺底物和荧光的肽基-AMC,肽基-AFC以及肽基-MCA底物。示例性的C因子底物包括但不限于,N-t-Boc-DPR-AMC、N-t-Boc-VPR-MCA、N-t-Boc-VPR-AMC、Mu-VPR-AFC以及Boc-VPR-pNA。
在多种实施方式中,由本发明提供的rFC呈现出具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的鲎C因子的酶活性,更具体为具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的鲎C因子的水解活性,更具体为具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的鲎C因子的蛋白水解活性,并且甚至更具体为具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的鲎C因子的丝氨酸蛋白酶活性。
双链酶原形式的C因子
酶原形式的鲎的C因子已知含有一条重(H)链和一条轻(L)链(因此叫做双链形式)。本发明的重组C因子也以双链酶原形式制备。具体地,从由本发明提供的方法获得的酶原C因子也包含一条H链和一条L链。因此,如在上文所提及的,术语“本发明的C因子”和“本发明的酶原C因子”可以交替使用。或者,“本发明的酶原(zymogen)(重组)C因子”可以命名为“本发明的酶原(proenzyme)(重组)C因子”。无论如何,从本发明的方法直接获得的重组C因子的特征为含有一条重(H)链和一条轻(L)链的双链酶原形式。
在主要氨基酸序列的基础上计算的SEQ ID NO:4的C因子蛋白的分子量为110kDa(109.7kDa)。本发明的范围包括其中本发明的重组C因子具有修饰的主要氨基酸序列(如,N或C末端的截短)的实施方式。在这种情况下,在主要序列的基础上计算的分子量被改变了。因此,本发明的范围包括具有在主要氨基酸序列的基础上计算的以下分子量的重组C因子蛋白:在90至130kDa之间范围内的任意分子量,优选地在95至125kDa之间范围内的任意分子量,更优选地在100至120kDa之间范围内的任意分子量,并且更优选地在105至115kDa之间范围内的任意分子量。甚至更优选地,本发明的重组C因子蛋白具有在主要氨基酸序列的基础上计算的在108至112kDa范围内的分子量。
令人惊讶的是,用SDS-PAGE测定的酶原形式的C因子的分子量结果低于在主要氨基酸序列的基础上计算的分子量。具体地,由根据本发明的方法制备的酶原形式的C因子具有在非还原条件下通过SDS-PAGE测定的102kDa的分子量。此外,由根据本发明的方法制备的酶原形式的C因子具有在还原条件下通过SDS-PAGE测定的106kDa(包括糖基化)的分子量,其产生于H链测定的69kDa的分子量和L链测定的37kDa的分子量。因此,本发明包括具有在非还原条件下通过SDS-PAGE测定的约102kDa的分子量的重组C因子蛋白,以及具有在还原条件下通过SDS-PAGE测定的约106kDa(包括糖基化)的分子量的重组C因子蛋白。
当在内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A的存在下激活C因子时(C因子自身催化转变成激活形式),L链中发生***,导致出现两个新片段,一条B链和一条A链。因此,本发明的重组C因子进一步的特征为通过内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活从本发明的方法直接获得的酶原形式(C因子自身催化转变成激活形式)导致由于酶原C因子的L链的***而产生含有一条B链和一条A链的激活C因子。
载体和质粒
在多种实施方式中,编码根据本发明的异源鲎C因子蛋白的多聚核苷酸由引入寄生原生动物宿主细胞的核酸分子(优选为载体)组成。换句话说,在多种实施方式中,编码根据本发明的异源鲎C因子蛋白的多聚核苷酸包含在载体或质粒中。在多种实施方式中,使用两种或更多种这样的载体或质粒。在多种实施方式中,所述载体或质粒为线性载体或线性质粒。在多种进一步的实施方式中,所述载体或质粒可以是环形载体或环形质粒。
本发明提供含有在本发明所使用的异源多聚核苷酸(即,编码来源于鲎的异源C因子蛋白的异源多聚核苷酸)的载体或质粒。在多种实施方式中,所述异源多聚核苷酸侧翼连接动质体寄生原生动物的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR(未翻译区或非翻译区)。优选地,编码异源C因子蛋白的异源多聚核苷酸侧翼连接锥体虫目的成员的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR;更优选地,连接利什曼虫属的成员的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR;并且更优选地,连接蜥蜴利什曼原虫的活跃转录基因的5’UTR和3’UTR。
在多种实施方式中,本发明的所述载体或质粒包含位于所述异源多聚核苷酸的上游的启动子。
在多种实施方式中,除了所述3’UTR和5’UTR,本发明的所述载体或质粒包含位于所述异源多聚核苷酸的上游的启动子。
在多种实施方式中,由本发明提供的所述载体或质粒含有一个或多个用于异源C因子蛋白的有效分泌、剪接和/或多腺苷酸化的信号序列,所述异源C因子蛋白产生于原生动物宿主细胞中异源多聚核苷酸的表达。在多种实施方式中,所述信号序列来源于动质体寄生原生动物。优选地,所述信号序列来源于锥体虫目的成员;更优选地,来源于利什曼虫属的成员;并且更优选地,来源于蜥蜴利什曼原虫。最优选地,所述信号序列具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。本文也公开了所述信号序列的如片段和/或功能衍生物的变体,特别是SEQID NO:5的信号序列的如片段和/或功能衍生物的变体。
在多种实施方式中,由本发明提供的载体或质粒含有一种或多种选择标记基因。
本发明提供由本发明提供的所述载体或质粒在将编码来自于鲎的异源C因子蛋白的异源多聚核苷酸传递到本发明的原生动物宿主细胞中的用途。优选地,所述传递是所述原生动物宿主细胞的转染。
本发明的范围包括由本发明提供的载体或质粒在本文描述的任意表达***中的用途。
所述宿主细胞种类的转染可以通过用在1至100μg之间范围的DNA的量进行。可以使用对于抗生素选择而言合适的平板培养技术和条件或使用任意稀释技术进行选择。转染效率随着所选种类变化很大,对于利什曼虫种类最高。
在多种实施方式中,单个细胞能含有和/或保留几种表达构造。优选地,所有的这几种表达构造携带不同的选择标记。表达水平随着所选的宿主和构造变化显著,其中附加体质粒处于所述范围的低端,但仍然能产生上至总细胞蛋白的1%的重组蛋白。
本文提供的实验结果清楚地显示了动质体锥体虫属宿主细胞能够表达能被内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活而变为活化酶的重组异源鲎C因子蛋白。应该理解的是,这种能力不限于锥体虫目(动质体锥体虫属)的成员,而是动质体寄生原生动物作为一个整体的特性。本领域技术人员将意识到,除了利什曼虫属的成员,动质体锥体虫属也能用于异源C因子的重组表达。
在多种实施方式中,本发明的载体或质粒进一步包含编码与由本发明的方法制备的C因子蛋白融合的一种或多种蛋白的核酸序列。这些实施方式提供由本发明的方法得到的C因子蛋白的融合蛋白或嵌合蛋白的制备。
本发明的范围包括包含编码一种或多种重组C因子蛋白的一种或多种核酸序列的载体和质粒。
制备C因子的方法
本发明提供制备来源于鲎的C因子的方法,该方法包括以下步骤:(a)在使得寄生原生动物的细胞表达由多聚核苷酸编码的C因子的条件下培养本发明的寄生原生动物细胞,和(b)从细胞培养物中回收在步骤(a)制备的C因子。在制备根据本发明的鲎C因子的方法中所使用的细胞为如在本文中所描述的宿主细胞。因此,应当清楚的是,在制备根据本发明的鲎C因子的方法中所使用的宿主细胞包含编码如在本文中所描述的鲎C因子的多聚核苷酸。
在多种实施方式中,用于制备根据本发明的鲎C因子的方法包括用本发明的载体或质粒转染寄生原生动物宿主细胞的步骤。明显地,这个步骤在使得所述重组因子C被表达的条件下培养所述宿主细胞的步骤之前。优选地,寄生原生动物宿主细胞为一种动质体寄生原生动物宿主细胞。更优选地,所述动质体寄生原生动物宿主细胞为复殖的锥体虫(即,锥体虫目的复殖成员)。更优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为锥体虫目的细胞。甚至更优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为利什曼虫属的细胞。最优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为蜥蜴利什曼原虫。
在多种实施方式中,在根据本发明的宿主细胞或表达***中制备鲎C因子蛋白的方法包括在用于组成性异源基因表达的选择培养基中/上培养本发明的稳定转染的宿主细胞,其中所述稳定转染的宿主细胞包含(a)编码选择标记基因的DNA序列和(b)编码鲎C因子蛋白的异源DNA序列,所述异源DNA序列可操作地连接于并整合入活跃转录基因。
在多种实施方式中,用于在根据本发明的宿主细胞或表达***中制备鲎C因子蛋白的方法包括在用于组成性异源基因表达的选择培养基中/上培养本发明的稳定转染的宿主细胞,其中所述稳定转染的宿主细胞包含(a)编码选择标记基因的DNA序列和(b)编码鲎C因子蛋白的异源DNA序列,所述异源DNA序列可操作地连接于具有活跃启动子的附加保留的质粒DNA。
在多种实施方式中,用于在根据本发明的宿主细胞或表达***中制备鲎C因子蛋白的方法包括培养本发明的稳定转染的宿主细胞,其中所述稳定转染的宿主细胞包含:(a)整合入活跃转录基因簇的编码异源RNA聚合酶的DNA序列;(b)整合入活跃转录基因簇的编码选择标记的DNA序列;(c)整合入活跃转录基因簇的编码转录阻遏物基因的DNA序列;和(d)以异源RNA聚合酶启动子和阻遏物应答元件为起始的编码鲎C因子蛋白的异源DNA序列,并且,其中所述稳定转染的宿主细胞用选择标记进行培养,并且用所述异源阻遏物的抑制剂诱导所述异源基因的表达。
本发明的范围包括制备根据本发明的C因子的方法的实施方式,其中重组鲎C因子在宿主细胞内积累。本发明的范围也包括制备根据本发明的C因子的方法的实施方式,其中由于所表达蛋白的分泌,重组鲎C因子在细胞培养基中积累。因此,在多种实施方式中,从细胞培养物回收在步骤(a)中产生的C因子的步骤是指从所表达的C因子蛋白在其中积累的宿主细胞中回收C因子。从所表达的C因子蛋白在其中积累的宿主细胞中回收C因子包括但不限于宿主细胞溶解的步骤。用于细胞溶解的示例性技术包括但不限于,超声波降解、弗式压碎(French press)和酶解。从所表达的C因子蛋白在其中积累的宿主细胞中回收C因子可以包括在宿主细胞溶解后提取所表达的C因子蛋白的单独步骤。
在多种其它实施方式中,从细胞培养物回收在步骤(a)中产生的C因子的步骤是指从细胞培养基中回收C因子,其中由于所表达的蛋白的分泌,C因子在细胞培养基中积累。从细胞培养基回收C因子(由于所表达的蛋白的分泌,C因子蛋白积累),可以进一步包括从细胞培养基提取所表达的C因子蛋白的单独步骤。
在多种实施方式中,从细胞培养物回收在步骤(a)中产生的C因子的步骤是指同时从宿主细胞和细胞培养基中回收C因子。此处,回收C因子的步骤包括但不限于宿主细胞的溶解步骤。
在多种实施方式中,上面描述的回收C因子蛋白的步骤可以被认为是从细胞培养物分离C因子蛋白的步骤,具体地,是分别从宿主细胞和细胞培养基分离C因子蛋白的步骤。
在多种实施方式中,从根据本发明的方法直接获得的C因子可以被认为是纯化的C因子,所述纯化的C因子直接应用于内毒素的检测和/或内毒素的清除。然而,在多种实施方式中,制备根据本发明的C因子的方法可以包括纯化从制备过程直接获得的C因子的单独步骤。优选地,制备根据本发明的C因子的方法可以包括用层析的方式纯化C因子的步骤。示例性的层析的方式包括但不限于,离子交换层析、凝胶过滤、疏水性相互作用层析、反相层析和亲和层析。明显地,这种用层析的方式纯化C因子蛋白的单独步骤跟随在如上面描述的回收/分离C因子蛋白的任意步骤之后。
在多种实施方式中,制备根据本发明的C因子的方法可以包括浓缩和/或稳定在C因子蛋白回收后得到的C因子蛋白的步骤。在多种实施方式中,制备根据本发明的C因子的方法可以包括浓缩和/或稳定由层析的方式纯化C因子蛋白后得到的C因子蛋白的步骤。所述稳定C因子蛋白的步骤可以包括蛋白稳定剂的使用。示例性的蛋白稳定剂包括但不限于,还原剂、高的单价或二价盐浓聚物、疏水性添加剂、两性添加剂以及丙三醇。在多种实施方式中,浓缩C因子蛋白的步骤包括产生于生产过程的培养物上清液的浓缩,即,所述浓缩步骤在如上面描述的回收/分离步骤之前进行。在多种其它实施方式中,浓缩C因子蛋白的步骤包括C因子蛋白溶液的浓缩,该C因子蛋白溶液在进行如在此上文所述的C因子蛋白的回收/分离步骤之后获得,即,浓缩步骤在如上文所述的回收/分离步骤之后进行。浓缩C因子蛋白的方式和方法包括但不限于,过滤、层析捕捉和洗提以及冻干。
如在实施例4中描述的,由本发明的方法制备的鲎的C因子蛋白已经被证实当与内毒素或胰凝乳蛋白酶结合时是具有酶促活性的。这样制备的C因子保留了具有C因子样的酶活性的生物活性的事实是由本发明提供的重组C因子的特有技术特征,因为,如在此上文所讨论的,在本领域为了在多种宿主细胞中制备具有酶促活性的C因子的许多尝试已经失败了。本发明人惊奇地发现来源于鲎的C因子在原生动物宿主细胞中的重组制备提供C因子蛋白,当被内毒素(或胰凝乳蛋白酶或脂质A)激活时该C因子蛋白是具有酶促活性的。这不能从现有技术中的教导预期到,因为根据现有技术中的教导,在原核生物和低等的真核生物中的酶促活性的C因子蛋白的制备不能提供有酶促活性的因子,而且根据现有技术中的教导,应利用高等的真核表达***来制备具有完整生物学活性的rFC,而不是利用原核或像酵母一样的简单的真核表达***。如在背景部分所描述的,与昆虫细胞比酵母细胞在它们的生理和生化上更近似于鲎的细胞的知识相联系,昆虫细胞的成功使用已经导致了这种教导。因此,本领域认为重组C因子在细胞中制备,更近似于从其天然来源(即,鲎)纯化的蛋白,并保留了被内毒素激活后具有丝氨酸蛋白酶活性的生物活性。
本发明的范围包括在本文描述的制备重组C因子的方式和方法的基础上在发酵培养物中的重组鲎C因子的制备。本发明的范围也包括在本文描述的制备重组C因子的方式和方法的基础上工业规模的重组鲎C因子的发酵制备。本发明的范围包括任意种类发酵器,包括实验室规模的发酵器和工业规模的发酵器的使用。在根据本发明的发酵制备中,在培养期间优选地尤其控制碳源的浓度至使得在重组C因子蛋白的制备中基本没有引起副反应的浓度。
由本发明的方法制备的C因子
由本发明的方法制备的C因子包括具有如在其自然来源中发现的(即,如从鲎中获得的)C因子的氨基酸序列的C因子蛋白以及在本文中描述的其变体。相似地,由本发明的方法制备的C因子包括由核酸序列编码的C因子蛋白以及在本文中描述的其变体,所述核酸序列与编码如在其自然来源中发现的(即,如从鲎中获得的)C因子的核酸序列相同。不管怎样,由本发明的方法制备的C因子蛋白在用内毒素(或胰凝乳蛋白酶或脂质A)激活时显示C因子样的酶活性。
在本发明中,术语“由本发明的方法制备的C因子”包括“从本发明的方法获得的(或可得到的)C因子”。所述术语可以交替地使用。
在原生动物宿主细胞,特别是在以利什曼虫属的细胞为示例的锥体虫宿主细胞(即,锥体虫目的宿主细胞)中的来源于鲎的C因子的制备,提供了C因子的特异糖基化,该糖基化与由在原核有机体、酵母和像昆虫细胞一样的高等真核表达***中的C因子的表达所提供的糖基化类型不同。因此,从本发明的方法获得的C因子在结构上不同于从在本领域描述的方法获得的C因子蛋白。因此,制备由本发明提供的C因子的方法提供了对于在现有技术中描述的C因子来说是新的产品,即,重组C因子。因此,本发明提供一种新的C因子蛋白,所述C因子蛋白由根据本发明的制备鲎C因子的方法获得。
如在本文中所使用的,对于“可获得的”的一种等价的表述用术语“获得的”或“直接获得的”代表。
优选地,由本发明的方法制备的C因子具有与来源于中国鲎的C因子的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列;更优选地,由本发明的方法制备的C因子含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。来源于中国鲎的C因子的重组制备在以前没有描述。具体地,在寄生原生动物宿主(特别是在以利什曼虫属的细胞为示例的锥体虫宿主细胞(即,锥体虫目的宿主细胞))中的来源于中国鲎的C因子的制备以前没有描述过。
可以通过本领域已知的技术(包括但不限于:溶解、层析、过滤和离心)从含有或表达本发明的重组C因子蛋白的本发明的原生动物宿主细胞分离和纯化得到所述重组C因子蛋白。在所表达的蛋白被分泌和积累在细胞培养基的情况下,针对从细胞培养基分离和纯化本发明的重组C因子应用相同方式。如在本文上面描述的,在多种实施方式中,从本发明的方法直接获得的C因子可以被认为是纯化的C因子,即,没有使用通过层析方式的C因子的特异纯化。具体地,对于C因子的某些应用,可以在没有进行包括层析方式的单独的纯化步骤的情况下从宿主细胞(在C因子蛋白是在细胞内积累的情况下)或从细胞培养基(在C因子蛋白是被分泌到细胞培养基的情况下)分离所述蛋白。在多种实施方式中,甚至含有分泌的和积累的C因子蛋白的细胞培养基可以用于内毒素的检测或内毒素的清除的某些应用。本发明的范围包括含有C因子的细胞培养基的用途,其中在使用所述细胞培养基前,所述细胞培养基已经被浓缩和/或细胞培养基中的C因子蛋白已经被稳定。用于浓缩细胞培养基的方式和方法包括但不限于:过滤、层析捕捉和洗提,以及冻干。此外,在细胞培养基中含有的C因子蛋白可以包括蛋白稳定剂的使用。示例性的蛋白稳定剂包括但不限于:还原剂、高的单价和双价盐浓聚物、疏水性添加剂、两性添加剂以及丙三醇。
在多种实施方式中,所述分离和/或纯化的由本发明制备的重组C因子蛋白是被标记的。优选地,所述标记选自由酶标记、放射性同位素、荧光标记和生物素组成的组。
由本发明的方法制备的重组C因子也包含在本发明中,所述重组C因子与免疫球蛋白(IgG)的恒定区的部分相结合,得到由本发明提供的嵌合的C因子。这些融合蛋白可以促进根据本发明的方法提供的C因子的分离和/或纯化。
本发明的范围包括重组C因子的融合蛋白,所述融合蛋白可以由制备本发明的C因子蛋白的方法制备得到。
本发明进一步提供含有根据本发明的方法制备的C因子的嵌合蛋白以及一种或多种异源蛋白。
如在上文所描述的,本发明的重组C因子以酶原制备,所述酶原被痕量内毒素的存在所诱导。具体地,由本发明的方法获得的C因子在内毒素的存在下(自身)催化地转变成其活性形式。由本发明的方法制备的C因子可以通过将所制备的C因子与稳定剂(比如,DMSO、2-丙醇或蛋白酶抑制剂,以及,任选的,螯合剂)接触保护其不被内毒素激活以及不发生的L链的自身催化***。如果所述表达的C因子蛋白是在根据本发明的原生动物宿主细胞内进行细胞内积累,所述接触可以通过在DMSO的存在和任选的螯合剂的存在下溶解所述宿主细胞进行。如果本发明的C因子蛋白是被分泌到细胞培养基中,所述接触可以在分离和/或进一步纯化C因子蛋白之前通过添加DMSO和任选的螯合剂到细胞培养基中进行。当然,在多种实施方式中,所述接触可以在分离和/或进一步纯化C因子蛋白之后通过添加DMSO和任选的螯合剂到细胞培养基中进行。基本上,DMSO可以添加到在分离和/或纯化过程期间所用的溶液中。通过同样将有效螯合二价金属离子的试剂添加到所述分离/纯化溶液中获得了由根据本发明的方法制备的C因子的甚至更大的保护。
在多种实施方式中,本发明的C因子蛋白在根据本发明的原生动物宿主细胞内进行细胞内积累。在多种其它实施方式中,本发明的C因子蛋白在根据本发明的原生动物宿主细胞培养物的细胞培养基中积累。C因子蛋白在细胞培养基中积累通常是由于所表达的蛋白的分泌。然而,本发明的范围也包括其中由于宿主细胞的溶解而C因子蛋白在细胞培养基中积累的实施方式,其中所述C因子蛋白首先在细胞内积累。C因子蛋白的表达和细胞内积累后进行的用于细胞溶解的示例性技术包括但不限于:超声波降解、弗式压碎(Frenchpress)和酶解。
向蛋白加上亲和标签,使得使用亲和技术从其粗制的生物来源纯化得到这些蛋白。本发明的范围包括由本发明的方法制备的C因子,其中所制备的C因子包含用于纯化的亲和标签。这样的纯化标签包括但不限于:HIS、CBP、CYD(共价且易离解的NorpD肽)、StrepII、FLAG以及HPC(蛋白C的重链)氨基酸和肽标签,以及GST和MBP蛋白融合标签***。
本发明也包括由本发明制备的带有化学标签的C因子蛋白。一种示例性的化学标签为生物素,其提供通过紧密结合链霉亲和素-琼脂糖或链霉亲和素-珠的纯化。本发明的C因子的生物素化也包括用于将C因子固定到表面的生物素化的C因子。生物素标签可以用在亲和层析中,所述亲和层析使用结合有抗生物素蛋白(也可以是链霉亲和素或中和亲和素)的柱子。所述生物素标签也可以用于C因子的检测,所述检测通过抗生物素抗体或抗生物素蛋白/链霉亲和素标签的检测策略,比如酶报告物(如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)或荧光探针。这可以用在包括但不限于ELISA分析的免疫分析方法中。
纯化的C因子
如在本文中所描述的,本发明提供由根据本发明的方法制备的C因子。从根据本发明的方法获得的C因子可以直接应用于内毒素的检测或内毒素的清除方法,不需要通过层析的方式的任何单独的纯化。因此,如在本文其它地方已经描述的,从根据本发明的方法直接获得的C因子可以因此被认为是纯化的C因子。本发明也包括用层析的方式进一步纯化的C因子,即,由根据本发明的方法制备的C因子或从根据本发明的方法直接获得的C因子通过层析的方式进一步纯化。层析的方式的应用包括但不限于:离子交换层析、凝胶过滤、疏水性相互作用层析、反相层析和亲和层析。
在多种实施方式中,根据本发明的纯化的C因子包括但不限于:分离的、浓缩的和/或稳定的C因子。所述分离的C因子包括但不限于,从根据本发明的培养用于制备C因子的原生动物宿主细胞所获得的细胞培养物或细胞培养基中分离的C因子。所述浓缩的C因子包括但不限于,从根据本发明的培养用于制备C因子的原生动物宿主细胞所获得的细胞培养物或细胞培养基中浓缩的C因子。相应地,用于浓缩所述因子的方式和方法包括但不限于:过滤、层析捕捉和洗提以及冻干。所述稳定的C因子包括但不限于,用蛋白稳定剂稳定的C因子。示例性的蛋白稳定剂包括但不限于:还原剂、高的单价和二价盐浓聚物、疏水性添加剂、两性添加剂以及丙三醇。
在多种实施方式中,根据本发明的纯化的C因子包括但不限于,中间纯化的C因子,其是指从大部分的大量杂质(比如其它蛋白和核酸)中纯化的C因子。
在多种实施方式中,根据本发明的纯化的C因子包括但不限于,高纯C因子,其是指从任何保留的痕量杂质或紧密相关的物质中纯化的C因子。
在多种实施方式中,由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少75%或至少80%的纯度,即,C因子组成总蛋白的至少75%或至少80%。在多种实施方式中,由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少85%或至少90%的纯度,即,C因子组成总蛋白的至少85%或至少90%。在多种实施方式中,由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少95%或至少96%的纯度,即,C因子组成总蛋白的至少95%或至少96%。在多种实施方式中,由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少97%或至少98%的纯度,即,C因子组成总蛋白的至少97%或至少98%。在多种实施方式中,由本发明提供的或由本发明的方法制备的C因子具有至少99%或甚至100%的纯度,即,C因子组成总蛋白的至少99%或甚至100%。
抗体
本发明也提供与由本发明提供的或从本发明的方法获得的C因子蛋白或其片段特异结合的抗体或其片段。优选地,所述抗体与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的全长C因子特异结合。
在多种实施方式中,本发明的抗体选自由单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、Fab片段、F(ab’)2片段以及scFV片段组成的组。在多种实施方式中,根据本发明的所述抗体是被标记的。优选地,所述标记选自由酶标记、放射性同位素、荧光标记和生物素组成的组。本发明的C因子蛋白可以用于引起由本发明提供的多克隆或单克隆抗体。本发明的所述抗体可以通过本领域可获得的以及本领域普通技术人员已知的各种方法中的任意一种进行制备。
由本发明提供的抗体片段(无论是否与其它序列连结)也可以包括具体区域或特定氨基酸残基的***、删除、替换或其它选择的修饰,条件是与非修饰的抗体或抗体片段相比,所述抗体片段的活性没有显著的改变或减弱。这些修饰可以提供一些另外的性质,比如去除/添加能够二硫键合的氨基酸。不管怎样,根据本发明的抗体片段必须具有生物活性性质,比如与其同源的抗原特异结合。
本发明的抗体或抗体片段的功能或活性区域可以通过对蛋白的特定区域进行突变、随后表达并对所表达的多肽进行测试而确定。这种方法对于本领域的技术从业者来说是十分明显的并且可以包括编码抗体或抗体片段的核酸的定点突变。
组合物和溶液
本发明提供含有根据本发明的方法制备的重组C因子蛋白的组合物。本发明也提供含有本发明的多聚核苷酸或核酸分子的组合物。本发明也提供含有本发明的载体或质粒的组合物。本发明进一步提供含有根据本发明的寄生原生动物宿主细胞的组合物。本发明进一步提供含有根据本发明的融合蛋白或嵌合蛋白的组合物。
在多种实施方式中,根据本发明的组合物是诊断组合物。
在多种实施方式中,根据本发明的组合物是用于检测内毒素的组合物,优选为用于检测样品中的内毒素的组合物。在多种实施方式中,所述样品为环境样品。在多种实施方式中,所述样品为生物样品。在多种实施方式中,所述样品为测试样品,优选为生物或环境测试样品。优选地,所述生物样品或生物测试样品是从哺乳动物获得的生物样品或生物测试样品。优选地,所述哺乳动物为人类。本发明的范围包括样品中的内毒素的检测,所述样品从动物(包括但不限于:狗、猫、猪、马、鸟和爬行动物)获得。
本发明提供含有本发明的重组C因子蛋白的溶液,优选为诊断性溶液。本发明也提供含有根据本发明的方法制备的重组C因子的用于清除内毒素的溶液。
在多种实施方式中,由根据本发明的方法制备的或从本发明的方法获得的C因子可以被指定为用于测量/检测内毒素的试剂(内毒素-测量/检测试剂)。在多种实施方式中,由根据本发明的方法制备的或从本发明的方法获得的C因子可以被指定为用于清除内毒素的试剂(内毒素-清除试剂)。
除了由本发明的方法制备的重组C因子,含有本发明的C因子的本发明的组合物和溶液可以进一步含有一种组分。具体地,所述试剂可以进一步含有用于检测的C因子底物,只要所述试剂可以用于内毒素的测量/检测。
本发明的含有C因子的组合物和溶液也可以含有,比如,pH缓冲剂和/或盐,优选螯合盐。pH缓冲剂的例子包括但不限于:HEPES缓冲液、MES缓冲液以及Tris缓冲液。有机溶剂(比如酒精、酯类、酮类以及酰胺类)也可以包含在本发明的组合物和溶液中。
本发明的内毒素-测量/检测试剂和/或内毒素-清除试剂可以被配制成任何随意的形式规定,该随意的形式包括但不限于:固体形式、液体形式以及凝胶形式。添加剂可以用作配方载体,其包括但不限于:赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、调节剂和稀释液以及溶剂。
在多种实施方式中,含有本发明的重组C因子的本发明的组合物和溶液可以进一步含有表面活性剂。因此,本发明提供用于检测内毒素的试剂,所述试剂含有根据本发明的方法制备的或从本发明的方法获得的鲎C因子蛋白的以及表面活性剂。在多种实施方式中,所述表面活性剂为两性表面活性剂。在多种其它实施方式中,所述表面活性剂为阳离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂。在多种其它实施方式中,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。优选地,所述表面活性剂选自由ZWITTERGENT 3-14、Triton X-100、TritonX-114、辛基-β-D-硫代葡萄糖苷、Genapol C-100、吐温20以及吐温80组成的组。优选地,所述表面活性剂在本发明的组合物或溶液中的浓度为0.001至0.5%,更优选为0.001至0.025%的浓度,更优选为0.001至0.01%的浓度。在多种实施方式中,所述表面活性剂在本发明的组合物或溶液中的浓度为0.004至0.006%。
本发明的C因子蛋白可以以其原样用于测量/检测内毒素,或在被稀释、分散或溶解在水、生理盐水、缓冲液或类似物中后被使用。“以其原样的C因子蛋白”包括从本发明的方法直接获得的任何形式的C因子蛋白,包括从本发明的方法获得的分离的、浓缩的和/或纯化的C因子。本发明的范围也包括通过层析的方式纯化后获得的“以其原样的C因子蛋白”。这种实施方式也在本发明的范围内。
内毒素检测方法
由本发明提供的重组C因子形成用于内毒素的高通量筛选的内毒素诊断分析的基础。内毒素激活的重组C因子酶原催化地水解合成的底物以形成可测量的产物,因此定量内毒素。
本发明提供通过根据本发明制备C因子的方法制备的C因子蛋白在用于内毒素检测的方法中的用途。在多种实施方式中,本发明的C因子用于内毒素检测的方法中,所述方法包括将待检测内毒素(LPS)或脂质A的存在的样品(优选为测试样品)与根据本发明的重组C因子接触,并测量重组C因子的酶活性(即,丝氨酸蛋白酶活性)。所述重组C因子的酶活性反映了其活性,由于其结合内毒素或脂质A,或结合本领域已知的另一种与鲎的C因子结合的内毒素。C因子酶活性(特别是丝氨酸蛋白酶活性)通过本领域已知的任何已知方法方便地测得,但优选地是通过发色或荧光的方法测量。这样的方法包括测量产物的形成,该产物由重组C因子的蛋白酶活性***C因子底物而引起。所述测量是以由底物的***引起的颜色(在发色底物的情况下)或荧光发射(在荧光底物的情况下)的变化为基础的。本发明的范围包括发色和荧光C因子底物的应用,所述发色和荧光C因子底物包括但不限于,发色的肽基对硝基苯胺底物和荧光的肽基-AMC、肽基-AFC以及肽基-MCA底物。用于这种发色或荧光分析的优选底物为N-t-Boc-VPR-MCA、N-t-Boc-VPR-AMC、Mu-VPR-AFC以及Boc-VPR-pNA。
本发明进一步的实施方式包括用于分析样品(优选为测试样品)中内毒素或脂质A存在的免疫方法。本发明的这些方法是以抗体与重组C因子特异结合、随后进行C因子-抗体复合体的检测和/或量化为基础的。在一种优选的实施方式中,待测样品同与内毒素或脂质A特异结合的被固定的抗体接触。被固定的配体(即,被固定的内毒素或脂质A)然后与根据本发明的重组C因子接触,形成被固定的重组C因子(rFC)。所述被固定的rFC然后同与被固定的rFC特异结合的第二抗体接触。然后可以用本领域已知的任何技术测定含有与第二抗体结合的rFC的被固定的复合体的存在和/或量,比如,通过应用如经由抗体的Fc部分与第二抗体特异结合的第三抗体。在一种可选的实施方式中,被固定的rFC的酶活性不是采用第二抗体测量的。
在本发明的另一种实施方式中,内毒素或脂质A与本发明的rFC的特异结合是应用于商业可得的分析中,比如,BIACORETM分析(Pharmacia生物技术)。通过将rFC固定在这种仪器的底物板上,可以检测样品中内毒素或脂质A的存在。本领域普通技术人员能够优化对于样品中内毒素的指定载量的待固定的rFC的量。
在多种实施方式中,根据本发明的检测内毒素的方法在测试样品上进行,所述测试样品优选为从哺乳动物获得的测试样品。优选地,所述哺乳动物为人类。本发明的范围也包括测试样品中内毒素的检测,所述测试样品从动物(包括但不限于:狗、猫、猪、马、鸟和爬行动物)获得。
在多种实施方式中,本发明的用于内毒素检测的方法包括内毒素选择性的、预包被的固体负载的使用。具体地,内毒素(LPS)的选择性捕捉用噬菌体来源的受体蛋白实现,所述噬菌体来源的受体蛋白针对于LPS的内核部分(即,内核低聚糖)或LPS的脂质A部分。LPS的内核结构,连同脂质A部分,是高度保守的结构。外核结构有稍微变化,并且O-抗原是高度异源的。优选地,将在本发明中使用的噬菌体来源的受体蛋白对于内毒素的保守区域呈现出高亲和性和高特异性。被所述噬菌体来源的受体蛋白结合的内毒素的高度保守区域既包括核心区域也包括脂质A。因此,所述噬菌体来源的受体蛋白与内核区域(即,内核低聚糖)和/或脂质A结合。在多种实施方式中,所述噬菌体来源的受体蛋白为噬菌体尾蛋白、有尾噬菌体的噬菌体头蛋白或无尾噬菌体的噬菌体外壳蛋白。优选地,所述噬菌体来源的受体蛋白为噬菌体尾蛋白。优选地,所述噬菌体尾蛋白为短的噬菌体尾纤维的蛋白。在多种实施方式中,所述短的噬菌体尾纤维选自K3、T2、T4、Ox2、RB32-33、AR1、PP01和RB69。在多种实施方式中,所述噬菌体尾蛋白被修饰以用于根据本发明的内毒素的检测。在多种实施方式中,所述噬菌体尾蛋白可以连接到活性蛋白上。
在样品内毒素(LPS)结合到用所述噬菌体来源的受体蛋白预包被的固体支撑物后,将原始样品基质洗掉,由此除掉可能干扰检测反应的组分。接着,在包括C因子和C因子底物的反应过程中通过本发明的C因子检测内毒素。在多种实施方式中,所述底物为发色或荧光底物。
在多种实施方式中,用噬菌体来源的受体蛋白预包被的固体支撑物为微量滴定板、珠子(比如,硅珠或有机聚合物珠)、箔或膜。因此,本发明的用于内毒素检测的包括内毒素选择性的、预包被的固体支撑物的使用的方法包括三个步骤:第一个步骤包括将样品内毒素(即,样品中含有的内毒素)与固体支撑物结合,所述固体支撑物用对LPS的保守核心区域呈现出高亲和性和高特异性的噬菌体来源的受体蛋白预包被。所述第一个步骤提供样品内毒素的固定。第二个步骤是用于洗去原始样品基质的清洗步骤。第三个步骤包括用本发明的C因子蛋白检测被固定的内毒素。所述第三个步骤包括C因子与针对C因子的底物的反应,其形成可检测的信号。在多种实施方式中,在被固定的内毒素已经与C因子蛋白接触后加入所述C因子的底物。在多种实施方式中,在C因子蛋白加入之前所述C因子底物已经存在于分析中。这个三步骤分析形式的特异的技术效果是其具有从0.05EU/ml上至500EU/ml的检测范围。进一步地,对于已建立的异源检测方法,该分析形式呈现出明显的优势,包括:较少的由比如β-葡聚糖、蛋白酶或磷脂引起的假阳性结果,较少的由样品的抑制性成分引起的假阴性结果,较少的需要重新测试的无效结果,复杂样品中的较少干扰以及因此的较高的灵敏性和宽的动态范围。
由本发明提供的三步骤分析形式在人体的流体(比如,血液、血清和血浆)的内毒素的检测中特别有用。优选地,上面描述的三步骤分析是用于分析临床生物样品。该分析不直接应用在病人上,而是应用在从病人获得的测试样品上。
在多种实施方式中,本发明提供检测样品中内毒素的方法,包括步骤(i)将待分析样品与本发明的内毒素检测试剂接触以形成测试样品和内毒素检测试剂的混合物;(ii)向所述混合物中加入C因子底物,其中C因子底物的***产生可检测的信号;以及(iii)分析所述混合物中可检测信号的有或无,其中相对于不含有内毒素的对照样品增加的可检测信号的量表明测试样品中内毒素的存在。
在由本发明提供的内毒素分析中,C因子底物优选为发色或荧光C因子底物。在多种实施方式中,所述C因子底物为发色的肽基对硝基苯胺底物。在多种其它实施方式中,所述C因子底物为荧光的肽基-AMC、肽基-AFC或肽基-MCA底物。进一步示例性的C因子底物包括但不限于:N-t-Boc-DPR-AMC、N-t-Boc-VPR-AMC、Mu-VPR-AFC以及Boc-VPR-pNA。
在多种实施方式中,本发明提供检测样品中内毒素的方法,包括步骤(i)将待分析样品与本发明的内毒素检测试剂以及C因子底物接触以形成测试样品、内毒素检测试剂和C因子底物的混合物,其中C因子底物的***产生可检测的信号,和(ii)分析所述混合物中可检测信号的有或无,其中相对于不含有内毒素的对照样品增加的可检测信号的量表明测试样品中内毒素的存在。
本发明也提供内毒素的分析,其包括:(i)将待分析的样品同与内毒素(LPS)或脂质A特异结合的被固定的抗体接触以形成所述抗体和所述样品中内毒素间的复合体;(ii)将所述复合体与由本发明的方法制备的重组C因子接触以形成含有所述抗体、内毒素和重组C因子的被固定的复合体,(iii)将(ii)的所述被固定的复合体同与所述重组C因子特异结合的抗体接触,以及(iv)测定与所述重组C因子特异结合的所述抗体的量。
在本发明中,像“内毒素的检测方法”或“检测内毒素的方法”的术语可以与术语“内毒素分析”交替地使用。
清除内毒素的方法
本发明提供由根据本发明的方法制备的C因子蛋白在清除内毒素的方法中的用途。本发明的C因子在这些方法中的用途包括但不限于,从水、缓冲液以及细胞培养基中清除内毒素。关于本发明的C因子在清除内毒素的方法中的用途的多种其它实施方式包括但不限于:从生物和非生物制品中清除内毒素,优选从生物制品中清除内毒素,更优选从用于动物研究、细胞培养、移植、干细胞技术、细胞分选以及其它哺乳动物细胞治疗的生物制品中清除内毒素。关于本发明的C因子在清除内毒素的方法中的应用的多种进一步的实施方式包括但不限于,从医疗设备、医疗器械、化妆品、食物和饮料中清除内毒素。
本发明的C因子可以用于制备无内毒素的制品,特别是无内毒素的生物和非生物制品。本发明提供C因子在用于从(如,蛋白、抗体、疫苗、核酸、缓冲液和/或多种其它物质的)生物制品中清除内毒素(LPS)的方法中的用途。优选地,根据本发明的生物制品是液体生物制品,更优选为水性生物制品。液体或水性生物制品可以被认为是液体或水性生物溶液,或是液体或水性生物组合物。
在本发明的多种实施方式中,术语“生物制品”、“生物溶液”和“生物组合物”可以交替地使用。
在多种实施方式中,根据本发明的清除内毒素的方法包括固定到固体支撑物的本发明的C因子的用途。优选地,所述固体支撑物为层析树脂。根据本发明的清除内毒素的方法可以应用在通过重力流的柱或批量模式中,或应用在全自动液体层析***上。
当考虑到用于制药用途的生物产品必须毫不含有内毒素以能够施用于人的事实时,从生物制品清除内毒素是特别重要的。因此,本发明提供本发明的C因子在制备不含内毒素的制品(特别是用于制药用途的不含内毒素的制品)的方法中的用途。含有用于制药用途的生物产品的制品可以直接产生于制药过程,即,所述制品为制药过程制品。因此,在多种实施方式中,本发明提供用于从制药过程制品中清除内毒素的方法,其包括用本发明的重组C因子处理制药过程制品。这样的制药过程制品可以含有药物或疫苗物质。在多种实施方式中,所述药物或疫苗物质包括多肽,优选为糖蛋白。在多种实施方式中,所述药物或疫苗物质为疫苗抗原。
优选地,根据本发明的制药过程制品为液体制药过程制品,更优选为水性制药过程制品。在本发明的多种实施方式中,术语“制药过程制品”和“制药过程组合物”可以交替地使用。
本发明的范围也包括在任何种类的样品上实施根据本发明的用于清除内毒素的方法。具体地,本发明提供用于从样品中清除内毒素或脂质A的方法,其包括:(i)将被固定的从本发明的方法制备的或获得的重组C因子与所述样品接触,使得所述样品中的内毒素或脂质A与所述被固定的重组C因子结合,和(ii)从所述样品分离与所述内毒素或脂质A结合的所述被固定的重组C因子。
样品
在包括内毒素的定量测量的应用中,可以使用具有已知浓度的内毒素标准样品以产生与内毒素水平和用于检测的底物的反应程度(比如,着色程度、荧光发射等等)相关的数据。在所获得的相关数据的基础上,这能够定量在根据本发明的待测样品中的内毒素。
根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品没有特别限制,所述样品的例子包括水样品、缓冲液样品以及来自细胞培养基的样品。在多种实施方式中,所述样品为测试样品。在多种实施方式中,所述样品为在本文其它地方描述的生物制品的测试样品。在多种实施方式中,所述样品包括但不限于:来自在本文其它地方描述的医疗设备、医疗器械、化妆品、食物和饮料的测试样品。
在多种实施方式中,根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品为从哺乳动物获得的测试样品。优选地,所述从哺乳动物获得的测试样品包括但不限于:血液样品、血清样品或唾液样品。优选地,所述哺乳动物为人。在多种实施方式中,所述测试样品因此为人的血液样品、人的血清样品或人的唾液样品,优选为人的血液样品。
在多种实施方式中,进行内毒素的检测和/或清除的测试样品包括但不限于,从下面任何获得的测试样品:医疗用水、药物、输液剂、血液制品。优选地,所述血液制品从哺乳动物获得,更优选地,从人获得。在多种实施方式中,所述测试样品为环境样品。
在多种实施方式中,根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品包括但不限于:来自比如蛋白、抗体、疫苗、核酸、缓冲液和/或多种其它物质的生物制品的样品。在多种其它实施方式中,根据本发明的进行内毒素的检测和/或清除的样品包括但不限于:来自在本文其它地方描述的制药过程制品来的样品。
分析和试剂盒
如在上文所描述的,像“内毒素的检测方法”或“检测内毒素的方法”的术语可以与术语“内毒素分析”交替地使用。因此,本发明提供一种根据在本文其它地方描述的用于内毒素的检测的方法的用于内毒素的分析,其包括由本发明的方法制备的重组C因子的应用。基本上,根据本发明的用于内毒素的分析包括如根据本发明的用于内毒素的检测方法一样的方法步骤。
进一步地,本发明提供内毒素的检测的试剂盒,其包括本发明的重组C因子,即,由根据本发明的方法制备的C因子。优选地,所述试剂盒进一步包括用于本发明的内毒素检测的方法或内毒素的分析的操作指南。优选地,所述操作指南为以手册的形式。
在多种实施方式中,所述试剂盒进一步包括增加内毒素检测灵敏性的表面活性剂。所述表面活性剂和所述C因子蛋白可以以分离的容器存在于所述试剂盒中。
在多种实施方式中,所述试剂盒包含一个含有本发明的组合物或溶液的单独的容器,所述组合物或溶液包含本发明的重组C因子和如在本文其它地方描述的表面活性剂。
在多种实施方式中,包含在试剂盒中的所述表面活性剂为两性表面活性剂。在多种其它实施方式中,所述表面活性剂为阴离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。在多种其它实施方式中,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。优选地,所述表面活性剂选自由ZWITTERGENT 3-14、Triton X-100、Triton X-114、辛基-β-D-硫代葡萄糖苷、Genapol C-100、吐温20以及吐温80组成的组。优选地,所述表面活性剂在试剂盒中的浓度为0.001至0.5%,更优选为0.001至0.025%的浓度,更优选为0.001至0.01%的浓度。在多种实施方式中,所述表面活性剂在试剂盒中的浓度为0.004至0.006%。这包括在分开的容器或本发明的组合物或溶液中存在的表面活性剂,所述组合物或溶液既包含本发明的重组C因子也包含所述表面活性剂。
在多种实施方式中,包含所述表面活性剂的容器是包含含有另外的表面活性剂的缓冲液的容器。
在多种实施方式中,所述试剂盒进一步包含C因子底物。具体地,通过激活的C因子(即,如在本文其它地方描述的在内毒素或脂质A的存在下自身催化的激活)的水解活性***C因子底物产生可检测的信号。优选地,所述试剂盒包含发色和/或荧光C因子底物。在多种实施方式中,所述C因子底物为发色的肽基对硝基苯胺底物。在多种其它实施方式中,所述C因子底物为荧光的肽基-AMC、肽基-AFC或肽基-MCA底物。进一步地,示例性的C因子底物包括但不限于:N-t-Boc-DPR-AMC、N-t-Boc-VPR-AMC、N-t-Boc-VPR-MCA、Mu-VPR-AFC以及Boc-VPR-pNA。
产生制备重组C因子的寄生原生动物宿主细胞的过程
本发明提供一种用于产生制备重组C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的方法,包括步骤:(a)将含有编码异源鲎C因子的多聚核苷酸的核酸分子(优选为载体或质粒)引入至寄生原生动物宿主细胞,和(b)选择一个或多个在步骤(a)中制备的表达所述C因子蛋白的宿主细胞。优选地,将根据本发明的载体或质粒引入至寄生原生动物宿主细胞,即,含有编码异源鲎C因子蛋白的核酸分子的载体或质粒。此外,所述寄生原生动物宿主细胞优选为动质体寄生原生动物宿主细胞。更优选地,所述动质体寄生原生动物宿主细胞为复殖的锥体虫(即,锥体虫目的复殖成员)。更优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为锥体虫目的细胞。甚至更优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为利什曼虫属的细胞。最优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为蜥蜴利什曼原虫。
本发明也提供由上述用于产生制备重组C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的方法获得的寄生原生动物宿主细胞,其中所述寄生原生动物宿主细胞含有编码异源鲎C因子的多聚核苷酸,其中所述多聚核苷酸由引入至所述寄生原生动物宿主细胞的核酸分子(优选为载体或质粒)组成。优选地,所述寄生原生动物宿主细胞含有根据本发明的载体或质粒,即,含有编码异源鲎C因子蛋白的核酸分子的载体或质粒。此外,所述寄生原生动物宿主细胞优选为动质体寄生原生动物宿主细胞。更优选地,所述动质体寄生原生动物宿主细胞为复殖的锥体虫(即,锥体虫目的复殖成员)。更优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为锥体虫目的细胞。甚至更优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为利什曼虫属的细胞。最优选地,所述寄生原生动物宿主细胞为蜥蜴利什曼原虫。
细胞系
本发明也提供由公开的载体和/或质粒获得的稳定转染的细胞系。优选地,所述转染的细胞系为从动质体寄生原生动物细胞的稳定转染获得的细胞系。更优选地,所述转染的细胞系为从锥体虫目的细胞的稳定转染获得的细胞系。更优选地,所述转染的细胞系为从利什曼虫属的细胞的稳定转染获得的细胞系。更优选地,所述转染的细胞系为从蜥蜴利什曼原虫种类的细胞的稳定转染获得的细胞系。
其它一般定义
总体来说,在本文中无论何时涉及根据本发明的方法制备的C因子,或“根据本发明的方法获得的C因子”,或仅是“本发明的C因子”,这样的涉及包括本发明的所述C因子的任何片段、类似物或功能衍生物,所述任何片段、类似物或功能衍生物具有C因子样的酶活性,即,类似于在本文其它地方描述的来源于鲎的C因子的酶活性。
在本发明中,“序列同一性的百分比(%)”是通过在比较窗(comparison window)上比较两条最优排列的序列所测定的,其中对于两条序列的最优排列,在比较窗里多聚核苷酸序列的部分可能包括与对照序列(不包括添加或删除)相比的添加或删除(即,间隔)。通过测定同样的核酸碱基或氨基酸残基在两条序列中均出现的位置的数量以产生配对位置的数量,将配对位置的数量除以比较窗中位置的总数量以及将该结果乘以100以产生序列同一性的百分比计算得到所述百分比。在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中,术语“同一性”或“同一性”百分比是指当在比较窗中比较和排列出最大相应性时,相同的两条或更多条序列或子序列,或者具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两条或更多条序列或子序列,或者具有使用下面的序列比较运算法则的一种或通过人工排列和肉眼检查测量的选定区域的序列或子序列。这样的序列之后被叫作“基本同一的”。该定义也指测试序列的互补序列。任选地,所述同一性存在于长度上至少大约50个氨基酸或核苷酸的区域,或更优选地存在于长度上为75-100个氨基酸或核苷酸的区域。
为了序列比较,通常一条序列作为对照序列,测试序列与其相比较。当使用序列比较运算法则时,将测试序列和对照序列输入计算机中,(如果需要)选定子序列坐标,并选定序列运算法则程序参数。可以用默认的程序参数,或可以选定可选参数。基于程序参数,序列对比运算法则之后计算测试序列相对于对照序列的百分比序列同一性。术语核酸分子和核酸序列可以在本文中可交替地使用。
如在本文中所讨论的,存在本发明的蛋白和多肽的大量变体。蛋白变体和衍生物对于本领域技术人员来说是很好理解的,并且可以包括氨基酸序列修饰。比如,氨基酸序列修饰通常落入三类中的一种或多种:取代的、***的或删除的变体。***包括氨基和/或羧基末端融合,也包括单个或多个氨基酸残基的序列内***。删除的特征在于从蛋白序列去除一个或多个氨基酸残基。通常,根据本发明,删除在蛋白分子内的任何一个位点的不多于大约2至6个残基。这些变体一般通过编码蛋白的多聚核苷酸的DNA中的核苷酸的定点突变制备,由此制备编码变体的DNA,并且之后根据本发明在重组细胞培养物中表达所述DNA。
用于在具有已知序列的DNA的预定位点进行取代突变的技术对于本领域的技术人员是熟知的。氨基酸取代通常为单个残基的,但可以一次发生在多个不同位点上;***通常会按照大约1至10个氨基酸残基的规则;删除会在大约1至30个残基的范围。删除或***优选地在邻近对进行,比如,2个残基的删除或2个残基的***。取代、删除、***或其任何结合可以联合起来以得到一个最终的构造。突变必须不能位于源自读码框的序列,并且优选地不能制造出可能产生二级mRNA结构的互补区域。取代变体是其中至少一个氨基酸残基已被去除并且一个不同的氨基酸残基***到该位置因此获得保守取代的那些。保守取代的意思对于本领域的技术人员是熟知的。
某些翻译后修饰是本发明的重组宿主细胞在所表达的多肽上进行的结果。谷氨酰胺酰残基和天门冬酰氨酰基残基常常翻译后脱酰胺基成对应的谷氨酰残基和天门冬酰残基。或者,这些残基在适度酸性条件下脱酰胺基。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化,丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化,赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的O-氨基的甲基化,N末端氨基的乙酰化,以及,在某些情况下,C末端羧基的酰胺化。这种翻译后修饰也考虑在本发明中。
术语“蛋白”和“多肽”在本发明中可交替地使用。术语“C因子蛋白”和“C因子多肽”相应地可以在本文中交替地使用。
当在本文中描述本发明的具体实施方式时,说明书的相应的段落/文本的段落总是引用在说明书中其它地方描述的方式和/或方法。在这种语境下,使用像“根据本发明”、“本发明的”以及“由本发明提供的”这些术语。这是指当在某个段落或文本段落中描述本发明的具体实施方式时,引用在本说明书中其它地方描述的“根据本发明”或“本发明的”方式和/或方法。对于所描述的一种具体实施方式,这种引用意于包括对于所述的具体实施方式的所有方式和/或方法,这些方式和/或方法在本说明书的其它地方描述,并且由本发明提供以及因此成为本发明的部分范围。例如,如果一种具体实施方式的描述涉及“根据本发明的C因子”或“本发明的C因子”,或“由本发明的方法制备或获得的C因子”,这是指在说明书中其它地方描述的、由本发明提供的并因此形成本发明的部分范围的所有C因子蛋白可以应用于那种具体的实施方式。这特别应用于(比如)根据本发明的C因子蛋白的片段和变体中,所述片段和变体在本发明中定义,并且其可应用于遍及申请文本所描述的多种实施方式中。
上面的原则应用于使用像“根据本发明”、“本发明的”和/或“由本发明提供的”术语的所有实施方式。不言而喻,不是在本文描述的每个实施方式都可以特定涉及本发明的所有方式和/或方法,这些方式和/或方法已经在说明书的其它地方定义,并且其可应用于遍及申请文本所描述的多种实施方式中。否则,每一个专利申请会包括几百页的说明书。
此外,像“在多种实施方式中”和“在多种其它/进一步的实施方式中”的术语明显是指“在本发明的多种实施方式中”和“在本发明的多种其它/进一步的实施方式中”。
本发明由下面的实施例进行举例说明,这些实施例仅是解释型且不应该理解为用任何方式或以任何程度限制本发明的范围。
实施例
实施例1、将C因子基因克隆到表达载体并转化E.coli DH 5α
将C因子基因克隆到表达载体的起点是来源于中国鲎(Tachypleus tridentatus)的C因子序列(NCBI登录号P28175.1;其中参考文献1:Muta等.1991,J.Biol.Chem.266(10):6554-6561)。如在登录号P28175.1下显示的来源于中国鲎的野生型C因子蛋白的氨基酸序列具有1019个氨基酸残基的长度。在蛋白的表达和分泌后分离下来的前导序列具有25个氨基酸残基的长度(在登录号P28175.1下显示的氨基酸序列的第1至25个残基)。没有前导序列的来源于中国鲎的野生型C因子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码如SEQ ID NO:2所示的来源于中国鲎的野生型C因子蛋白的核苷酸序列以SEQ ID NO:1给出。
为了在利什曼虫属中表达,对中国鲎SEQ ID NO:1的序列进行密码子优化。所产生的密码子优化的序列如SEQ ID NO:3所示。由密码子优化过的SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。密码子优化不引起原始野生型C因子蛋白的氨基酸序列的改变。因此,SEQ ID NO:4的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列一样。
将密码子优化的SEQ ID NO:3的序列克隆到表达载体中,并且将所得到的质粒随后转化到E.coli DH 5α。
实施例2、利什曼虫属的转染和克隆的选择
用于转染的表达载体的制备
制备含有密码子优化的SEQ ID NO:3序列以及用于目标蛋白在利什曼虫属宿主细胞中的分泌表达的信号肽序列的利什曼虫属宿主细胞特异性表达载体。来源于蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)的分泌信号肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。利什曼虫属前导序列在蛋白的表达和分泌后分离下来。
利什曼虫属细胞的转染
广泛范围的锥体虫的稳定的DNA转染(包括用电穿孔的利什曼虫属的转染)在本领域中已有描述(Beverly和Clayton 1993,Methods Mol.Biol.21:333-348;Coburn等.1991,Mol.Biochem.Paras itol.46:169-179)。此处,采用用于转染的高压方案(JenaBioscience GmbH,Jena,Germany)进行利什曼虫属细胞的培养和转染。具体地,培养从预培养获得的利什曼虫属细胞(蜥蜴利什曼原虫)直至达到大约6×107个细胞/ml的细胞密度(OD 1.4)。通过显微镜确保细胞是活的并且是滴样的形状。将预冷的细胞加入至含有0.1-5μg的转化DNA试管中(冰上),混合,并转移到电穿孔小管中(冰上)。使用用脉冲控制器的基因脉冲(genepulser),在1500V,25μF下脉冲2次,脉冲间隔10秒(脉冲时间约0.3毫秒)。将小管放回冰上10分钟,并将电穿孔的细胞转移到通风的组织培养瓶中,随后以静态悬浮培养在26℃孵育过夜(大约20小时,O.D.0.3-0.4)。
克隆的选择
通过在添加有选择性抗生素的固体培养基上铺平板完成克隆的选择。单克隆之后在选择性培养基中扩增。为了此目的,上至10个克隆在每个培养瓶中以10ml进行培养。这些培养物用于评价。
分离基因组DNA,用特异针对重组C因子基因的寡聚核苷酸通过PCR确认重组C因子基因的***。
通过用含有用于表达诱导的10μg/ml的四环素的新鲜培养基以1:10稀释培养物分析基因表达。培养物在26℃黑暗生长3至4天。收获细胞(3000×g,4℃,10分钟)。通过三氯乙酸(TCA)沉淀浓缩上清液中的蛋白,并用SDS-PAGE分析。
实施例3、重组C因子蛋白的表达和纯化
在锥体虫原生动物(特别在利什曼虫属)中重组蛋白的表达在本领域中已有描述(Breitling等.2002,Protein Expression and Purification 25:209-218;Basile和Peticca 2009,Mol.Biotechnol.43:273-278)。此处,用由Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany提供的基因表达试剂盒进行用于C因子蛋白的表达和纯化的利什曼虫属的培养和工程操作。
3.1生产株的维持
生产株以10ml的体积在培养瓶中26℃黑暗培养。将生产株每2至3天以1:20或1:50连续稀释到含有用于选择被***基因的所有添加剂和抗生素的新鲜培养基中。
3个月之后,丢弃所培养的株,从新鲜丙三醇储备物中开始新的培养。
3.2表达
通过用新鲜培养基以1:50稀释生产株以及在培养瓶中26℃黑暗培养2至3天建立预培养物。
向锥形烧瓶中的1.5l的含有用于表达诱导的四环素的培养基中接种30ml预培养物。表达发生在26℃下黑暗和105rpm振荡68至72小时时。当培养基中的葡萄糖浓度降到650mg/L以下时,加入血晶素和葡萄糖,并将培养物另外培养86至72小时。
收获细胞(4000×g,4℃,30分钟)。将上清液在-20℃冷冻或直接用于重组C因子的纯化。
3.3纯化
3.3.1阳离子交换层析
来自表达的上清液直接使用或渐渐解冻。在加入2mM EDTA之后,用pH 5的20mM乙酸钾、2mM EDTA稀释上清液直至达到pH5.0至5.5且电导率<5.5mS/cm。
用阳离子交换层析进行纯化。采用SP650M柱,以pH 5的25mM乙酸钾、2mM EDTA作为平衡缓冲液,并以pH 5的25mM乙酸钾、2mM EDTA、1mM氯化钾作为洗提缓冲液。
在上样上清液后,首先用平衡缓冲液洗柱,然后用10%洗提缓冲液洗柱。洗提发生在50%洗脱缓冲液时。
3.3.2蛋白分析
使用凝胶过滤和SDS PAGE分析含有蛋白的组分的浓度和纯度。
对于凝胶过滤,将50μl各组分以0.75ml/min上样到TSK3000 PW柱。在220nm跟踪吸收。rFC在7.4+/-0.4分钟的保留时间处以峰最大值洗脱。
仅将满足下面标准的组分合并:
1)保留时间为6.4+/-0.4分钟的峰的峰面积必须不超过rFC峰面积的10%。
2)保留时间为10.3+/-0.5分钟的峰的峰面积必须不超过rFC峰面积的350%。
3)rFC峰和保留时间为10.3+/-0.5分钟的峰之间的最小值必须在9和10分钟之间,并且最小吸收值必须不超过rFC峰的最大吸收值的30%。
每个组分中rFC的浓度在rFC标准曲线的帮助下通过峰面积测定。最终合并物的浓度必须为至少50μg/ml rFC。
3.3.3透析
将1mM PMSF加入到rFC合并物中,并在室温下培养4小时。随后加入0.1%的F-127,将溶液用pH 5的5升5mM乙酸钾、100mM氯化钾、0.1%F-127、0.05mM EDTA在4℃透析。透析进行3次每次12小时。
第三次透析后,将rFC溶液离心(4000×g,4℃,1小时),将上清液用pH5的5升5mM乙酸钾、100mM氯化钾、0.1%F-127、0.05mM EDTA在4℃再次透析至少12小时。
3.3.4贮存
透析的rFC溶液进行无菌过滤,并且通过凝胶过滤测定浓度,并用SDS凝胶测定纯度。溶液在4℃贮存。
实施例4、在利什曼虫属中制备的C因子蛋白的比活的测定
根据Ding等.1993(Biochimica et Biophysica Acta 1202:149-156)中描述的分析测定C因子的比活。这个文献已经在美国专利US 5,712,144中引用用于分析,其用于测定从圆尾鲎(C.rotundicauda)分离的C因子蛋白的比活。
具体地,首先用反应缓冲液加LPS稀释在利什曼虫属中制备的C因子蛋白的系列稀释。该反应缓冲液含有50mM Tris、100mM NaCl以及50mM MgCl2,并用无内毒素的超纯水制备。
LPS从LPS储存液(溶解在无内毒素的超纯水中的LPS)加入到反应缓冲液。
用制备的稀释液装载微量滴定板,并在37℃培养1小时。随后,将C因子蛋白的底物加入孔中,之后将微量滴定板在37℃培养15分钟。所用的底物为Boc-Val-Pro-Arg-AMC,其是C因子蛋白的荧光底物。Boc-VPR-AMC溶解在无内毒素的超纯水中以制备底物溶液,该底物溶液用于制备底物溶液的稀释液,该稀释液应用于分析。
在通过加入冰醋酸停止反应后测量荧光(RFU)。在37℃下底物转换15分钟后测得的rfu值总结在下面表1中。
表1:在37℃下底物转化15分钟后测得的rfu值
表1显示了在减去背景rfu值后具有高于背景的信号的LPS激活的rFC样品的rfu值。
图1显示了在37℃下底物转换15分钟后测得的依赖于rFC浓度的rfu值的图。在描述的实验条件下测定的荧光团(AMC)的特异荧光为6667rfu/nmol。
为了计算rFC的比活,采用0.331μg/ml的rFC浓度。这相当于微量滴定板中每孔0.0662μg的rFC。据此,测得4360rfu/(15min×0.0662μg rFC)。这相当于290.67rfu/(min×0.0662μg rFC)。这进而相当于4390735rfu/(min×mg rFC)。这进一步相当于658nmol/(min×mg rFC),其进而相当于0.658μmol/(min×mg rFC)。
根据Ding等.(1993),一个单位被定义为37℃下每分钟水解的1μmol的AMC。根据这个定义及上面的计算,在所描述的分析条件下,重组C因子具有0.658单位/mg蛋白的比活。当用胰凝乳蛋白酶激活C因子蛋白时,也得到了一样的比活(数据没有显示)。
如从分析设置变得清楚,使用由LPS激活的C因子蛋白测定比活。因此,这个实验显示了在利什曼虫属中制备的C因子可以被LPS激活,并且所述激活的C因子蛋白为有酶促活性的,即,呈现出水解活性。
实施例5、在非还原和还原条件下在SDS-PAGE上测定C因子蛋白的分子量
在利什曼虫属中制备的C因子蛋白的分子量已经在非还原和还原条件(SDS-PAGE)下测定。将均为50μl的还原和非还原rFC样品以及20μl的分子量标准品上样到10泳道的VarioGel(4-12%)上。在垂直凝胶电泳槽中完成电泳后,根据厂商的实验方案用即时可用的PageBlueTM蛋白染色溶液(Fermentas)对胶染色。
通过用蛋白条带的迁移距离(单位为cm)除以从胶的前端的总的迁移距离(单位为cm)计算Rf值。针对标记蛋白的分子量绘制标记蛋白的Rf值的图。用对数拟合算法对得到的曲线进行拟合。根据产生的标准曲线拟合等式,分别计算在非还原和还原条件下的纯化的C因子蛋白的分子量。根据所述等式,计算对于C因子的下面的分子量。
表2:在非还原和还原SDS PAGE工作条件下的纯化的C因子的Rf值
在非还原条件下通过SDS-PAGE测得,所述双链形式的C因子蛋白(rFC ox)具有102kDa的分子量。在还原条件下,已经测定H链(rFC red 1)具有69kDa的分子量,L链(rFCred 2)具有37kDa的分子量。
还原条件下的H链和L链的分子量(rFC red 1+rFC red 2)合起来为106kDa(包括糖基化)。
序列表
SEQ ID NO:1:编码无前导序列的来源于中国鲎(Tachypleus tridentatus)的野生型C因子蛋白的基因的核苷酸序列,长度:2982个核苷酸。
SEQ ID NO:2:无前导序列的来源于中国鲎(Tachypleus tridentatus)的野生型C因子蛋白的氨基酸序列,长度:994个氨基酸残基。
rgvdlglcdetrfeckcgdpgyvfnvpmkqctyfyrwrpyckpcddleakdicpkykrcqeckagldscvtcppnkygtwcsgecqcknggicdqrtgactcrdryegahceilkgcpllpsdsqvqevrnppdnpqtidyscspgfklkgvarisclpngqwssfppkcirecakvsspehgkvnapsgnmiegatlrfscdspyyligqetltcqgngqwsgqipqckklvfcpdldpvnhaehqvkigveqkygqfpqgtevtytcsgnyflmgfntlkcnpdgswsgsqpscvkvadrevdcdskavdfIddvgepvrihcpagcsItagtvwgtaiyhelssvcraaihagklpnsggavhvvnngpysdflgsdlngikseelkslarsfrfdyvssstagrsgcpdgwfeveencvyvtskqraweraqgvctnmaarlavldkdlipssltetlrgkgltttwiglhrldaekpfvwelmdrsnvvlndnltfwasgepgnetncvyldirdqlqpvwktkscfqpssfacmmdlsdrnkakcddpgplenghatlhgqsidgfyagssiryscevlhylsgtetvtcttngtwsapkprcikvitcqnppvpsygsveikppsrtnsisrvgspflrlprlplplaraakpppkprssqpstvdlaskvklpeghyrvgsraiytcesryyellgsqgrrcdsngnwsgrpascipvcgrsdsprspfiwngnsteigqwpwqagisrwladhnmwflqcggsllnekwivtaahcvtysataeiidpsqfkiylgkyyrddsrdddyvqvrealeihvnpnydpgnlnfdialiqlktpvtlttrvqpiclptdittrehlkegtlavvtgwglnenntysemiqqavlpvvaastceegykeadlpltvtenmfcagykkgrydacsgdsggplvfaddsrterrwvlegivswgspsgcgkanqyggftkvnvflswirqfi
SEQ ID NO:3:用于在利什曼虫属中表达的密码子优化过的、无前导序列的来源于中国鲎(T.tridentatus)的C因子的核苷酸序列,长度:2982个核苷酸。
aggggtgtggacctgggcctgtgcgacgagacccgcttcgagtgcaagtgcggcgacccgggctacgtgttcaacgtgccgatgaagcagtgcacgtacttctaccgctggcgcccgtactgcaagccgtgcgacgacctggaggcgaaggacatctgcccgaagtacaagcgctgccaggagtgcaaggcgggcctggacagctgcgtgacgtgcccgccgaacaagtacggcacgtggtgcagcggcgagtgccagtgcaagaacggtggcatctgcgatcagcgcacgggcgcgtgcacatgccgcgatcgctacgagggcgcgcactgcgagatcctgaagggctgcccgctgctgccgagcgacagccaggtgcaggaggtgcgcaacccgccggacaacccgcagacgatcgactactcgtgcagccccggcttcaagctcaagggcgtggcgcgcatcagctgcctcccgaacggtcagtggtcgagcttcccgccgaagtgcatccgcgagtgcgcgaaggtgagcagcccggagcacggcaaggtgaacgcgccgagcggcaacatgatcgagggcgcgacgctgcgcttcagctgcgacagcccgtactacctgatcggccaggagaccctgacctgccagggcaacggccagtggagcggccagatcccgcagtgcaagaagctggtcttctgcccggacctggacccggtgaaccacgcggagcaccaggtgaagatcggcgtggagcagaagtacggccagttcccgcagggcacggaggtgacgtacacgtgcagcggcaactacttcctgatgggcttcaacacgctgaagtgcaacccggacggtagctggtcgggcagccagccgtcctgcgtgaaggtggcggaccgcgaggtggactgcgacagcaaggcggtggacttcctggacgacgtgggcgagccggtgcgcatccactgcccggctggctgcagcctgacagcgggcacggtgtggggcacggcgatctaccacgagctgtcgagcgtgtgccgcgctgcgatccacgcgggcaagctgccgaacagcggcggtgcggtgcacgtggtgaacaacggcccgtacagcgacttcctgggcagcgacctgaacggcatcaagagcgaggagctgaagagcctggcccgcagcttccgcttcgactacgtgagcagcagcacggctggtcgcagcggctgcccggacggctggttcgaggtggaggagaactgcgtctacgtcacgagcaagcagcgcgcgtgggagcgcgcgcagggcgtgtgcacgaacatggcggctcgcctggccgtgctggacaaggacctgatcccgagcagcctgacggagaccctgcgcggcaagggcctgacgacgacgtggatcggcctgcaccgcctggacgcggagaagccgttcgtgtgggagctgatggaccgcagcaacgtggtgctgaacgacaacctgacgttctgggcgagcggcgagccgggcaacgagaccaactgcgtgtacctggacatccgcgaccagctgcagccggtgtggaagacgaagagctgcttccagccgagctccttcgcgtgcatgatggacctgagcgaccgcaacaaggcgaagtgcgacgacccgggtccgctggagaacggccacgcgacgctgcacggccagagcatcgacggcttctacgcgggcagcagcatccgctacagctgcgaggtgctgcactacctgagcggcacggagaccgtgacgtgcacgacgaacggcacgtggtccgcgccgaagccgcgctgcatcaaggtgatcacgtgccagaacccgccggtgccgagctacggcagcgtggagatcaagccgccgtcgcgcacgaactcgattagccgcgtgggctcgccgttcctgcgtctgccacgcctcccactgccgctggctcgtgcggccaagccgccaccgaagccacgcagcagccagccgagcacggtggacctggccagcaaggtgaagctgccggagggccactaccgcgtgggctcgcgcgcgatctacacgtgcgagagccgctactacgagctgctgggcagccagggtcgtcgctgcgacagcaacggcaactggagcggtcgcccggctagctgcatcccggtgtgcggtcgcagcgactccccgcgctcgccgttcatctggaacggcaacagcacggagatcggtcagtggccctggcaggcgggcatcagccgctggctggccgaccacaacatgtggttcctccagtgcggcggcagcctgctgaacgagaagtggattgtgacggcggctcactgcgtgacgtactcggcgacggccgagatcatcgacccgagccagttcaagatctacctgggcaagtactaccgcgacgacagccgcgacgacgactacgtgcaggtgcgcgaggcgctggagatccacgtgaacccgaactacgacccgggcaacctgaacttcgatatcgcgctgatccagctcaagacgccggtgacgctgacgacgcgcgtgcagccgatctgcctgccgacggacatcacgacgcgcgagcacctgaaggagggcacgctggccgtcgtgacgggctggggcctgaacgagaacaacacgtacagcgagatgatccagcaggcggtgctgccggtggtggcggcgagcacgtgcgaggagggctacaaggaggcggacctgccgctgacggtgacggagaacatgttctgcgcgggctacaagaagggccgctacgacgcctgcagcggtgacagcggcggtccgctggtgttcgcggacgacagccgcacggagcgccgctgggtgctggagggcatcgtgagctggggcagcccgagcggttgcggcaaggcgaaccagtacggcggcttcacgaaggtgaacgtgttcctcagctggatccgccagtttatc
SEQ ID NO:4:由如SEQ ID NO:3所示的无前导序列的来源于中国鲎(Tachypleustridentatus)的C因子蛋白的密码子优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列,长度:994个氨基酸残基。
RGVDLGLCDETRFECKCGDPGYVFNVPMKQCTYFYRWRPYCKPCDDLEAKDICPKYKRCQECKAGLDSCVTCPPNKYGTWCSGECQCKNGGICDQRTGACTCRDRYEGAHCEILKGCPLLPSDSQVQEVRNPPDNPQTIDYSCSPGFKLKGVARISCLPNGQWSSFPPKCIRECAKVSSPEHGKVNAPSGNMIEGATLRFSCDSPYYLIGQETLTCQGNGQWSGQIPQCKKLVFCPDLDPVNHAEHQVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYTCSGNYFLMGFNTLKCNPDGSWSGSQPSCVKVADREVDCDSKAVDFLDDVGEPVRIHCPAGCSLTAGTVWGTAIYHELSSVCRAAIHAGKLPNSGGAVHVVNNGPYSDFLGSDLNGIKSEELKSLARSFRFDYVSSSTAGRSGCPDGWFEVEENCVYVTSKQRAWERAQGVCTNMAARLAVLDKDLIPSSLTETLRGKGLTTTWIGLHRLDAEKPFVWELMDRSNVVLNDNLTFWASGEPGNETNCVYLDIRDQLQPVWKTKSCFQPSSFACMMDLSDRNKAKCDDPGPLENGHATLHGQSIDGFYAGSSIRYSCEVLHYLSGTETVTCTTNGTWSAPKPRCIKVITCQNPPVPSYGSVEIKPPSRTNSISRVGSPFLRLPRLPLPLARAAKPPPKPRSSQPSTVDLASKVKLPEGHYRVGSRAIYTCESRYYELLGSQGRRCDSNGNWSGRPASCIPVCGRSDSPRSPFIWNGNSTEIGQWPWQAGISRWLADHNMWFLQCGGSLLNEKWIVTAAHCVTYSATAEIIDPSQFKIYLGKYYRDDSRDDDYVQVREALEIHVNPNYDPGNLNFDIALIQLKTPVTLTTRVQPICLPTDITTREHLKEGTLAVVTGWGLNENNTYSEMIQQAVLPVVAASTCEEGYKEADLPLTVTENMFCAGYKKGRYDACSGDSGGPLVFADDSRTERRWVLEGIVSWGSPSGCGKANQYGGFTKVNVFLSWIRQFI
SEQ ID NO:5:来源于蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)的分泌信号肽序列的氨基酸序列,长度:23个氨基酸残基。
MASRLVRVLAAAMLVAAAVSVDA
Claims (16)
1.一种寄生原生动物,其特征在于:含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸。
2.根据权利要求1所述的寄生原生动物,其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的核酸分子组成,优选所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的载体组成。
3.根据权利要求1或2所述的寄生原生动物,其中所述寄生原生动物为锥体虫目的成员。
4.根据权利要求1至3任一项所述的寄生原生动物,其中所述寄生原生动物为利什曼虫属的成员。
5.根据权利要求1至4任一项所述的寄生原生动物,其中所述寄生原生动物为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)。
6.根据权利要求1至5任一项所述的寄生原生动物,其中所述多聚核苷酸编码来自美洲鲎(Limulus polyphemus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)、中国鲎(Tachypleustridentatus)或南方鲎(Tachypleus gigas)的C因子蛋白。
7.根据权利要求1至6任一项所述的寄生原生动物,其中所述多聚核苷酸编码具有SEQ ID No:4的氨基酸序列的C因子蛋白。
8.一种制备鲎C因子蛋白的方法,其包括步骤:
(a)在使得细胞表达由所述多聚核苷酸编码的所述C因子蛋白的条件下培养权利要求1至7任一项所述的寄生原生动物;和
(b)从细胞培养物中回收在步骤(a)中制备的C因子蛋白。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述C因子蛋白在细胞培养基中积累。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其中所制备的所述C因子蛋白在结合内毒素时呈现出丝氨酸蛋白酶活性。
11.由权利要求8的方法获得的鲎C因子蛋白。
12.由权利要求8至10任一项所述的方法制备的鲎C因子蛋白在内毒素检测方法或在内毒素清除方法中的用途。
13.根据权利要求11的鲎C因子蛋白在内毒素检测方法或在内毒素清除方法中的用途。
14.一种用于内毒素检测或内毒素清除的分析或试剂盒,其包括由权利要求8至10任一项所述的方法制备的鲎C因子蛋白,或权利要求11的鲎C因子蛋白。
15.一种产生制备鲎C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的方法,其包括步骤:
(a)将含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的核酸分子,优选为载体,引入到寄生原生动物,优选为锥体虫目的寄生原生动物,更优选为利什曼虫属的成员,最优选为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae);和
(b)选择一个或多个在步骤(a)中制备的表达所述鲎C因子蛋白的宿主细胞。
16.一种由权利要求15的方法获得的寄生原生动物宿主细胞,其含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸,其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的核酸分子组成,优选由载体组成。
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Cited By (6)
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---|---|---|---|---|
CN106119271A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-11-16 | 长春理工大学 | 一种基因重组表达中国鲎c因子特异性检测内毒素增强比浊法 |
CN108866087A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-23 | 广东医科大学 | 一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法 |
CN108913707A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-30 | 广东医科大学 | 一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法 |
CN110095600A (zh) * | 2019-05-16 | 2019-08-06 | 无锡市人民医院 | 一种细菌内毒素的检测试纸及试剂盒 |
CN110366592A (zh) * | 2017-03-01 | 2019-10-22 | 生化学工业株式会社 | 鲎b因子改变体 |
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1015609B1 (en) * | 1997-09-19 | 2004-09-01 | National University Of Singapore | A novel generation of cloned horseshoe crab recombinant factor c for detection and removal of endotoxin |
CN1529711A (zh) * | 2001-06-28 | 2004-09-15 | ά | 检测内毒素的方法和试剂 |
EP1242602B1 (en) * | 1999-11-05 | 2008-02-13 | Jena Bioscience GmbH | Protein expression systems in non-pathogenic kinetoplastidae |
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Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5716834A (en) | 1994-08-19 | 1998-02-10 | National University Of Singapore | Cloned factor C cDNA of the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda and purification of factor C proenzyme |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1015609B1 (en) * | 1997-09-19 | 2004-09-01 | National University Of Singapore | A novel generation of cloned horseshoe crab recombinant factor c for detection and removal of endotoxin |
EP1242602B1 (en) * | 1999-11-05 | 2008-02-13 | Jena Bioscience GmbH | Protein expression systems in non-pathogenic kinetoplastidae |
CN1529711A (zh) * | 2001-06-28 | 2004-09-15 | ά | 检测内毒素的方法和试剂 |
WO2012118226A1 (en) * | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Seikagaku Corporation | An agent for measuring endotoxin |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
AKIHIRO USAMI等: "Comparison of recombinant protein expression in a baculovirus system in insect cells (Sf9) and silkworm", 《J. BIOCHEM.》 * |
GIANCARLO BASILE等: "Recombinant Protein Expression in Leishmania tarentolae", 《MOL BIOTECHNOL》 * |
JING WANG等: "Modular Arrangement and Secretion of a Multidomain Serine Protease", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106119271A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-11-16 | 长春理工大学 | 一种基因重组表达中国鲎c因子特异性检测内毒素增强比浊法 |
CN110366592A (zh) * | 2017-03-01 | 2019-10-22 | 生化学工业株式会社 | 鲎b因子改变体 |
CN110366592B (zh) * | 2017-03-01 | 2024-01-23 | 生化学工业株式会社 | 鲎b因子改变体 |
CN108866087A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-23 | 广东医科大学 | 一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法 |
CN108913707A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-30 | 广东医科大学 | 一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法 |
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CN110095600A (zh) * | 2019-05-16 | 2019-08-06 | 无锡市人民医院 | 一种细菌内毒素的检测试纸及试剂盒 |
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