JP2016500443A - 強固な血餅形成をモニタリングするための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年12月7日出願の米国仮特許出願第61/734,579号;2013年6月20日出願の米国仮特許出願第61/837,290号;2013年8月9日出願の米国仮特許出願第61/864,322号;2013年8月28日出願の米国仮特許出願第61/870,952号の利益を主張するものであり、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、
本発明の方法を行うために、種々の技術を使用して凝固を開始することができる。クエン酸塩添加カオリン(CK)、エラグ酸及びセライトは、aPTT(活性化部分トロンボプラスチン時間)及び全血凝固時間のための一般的で世界的な開始剤である。例えば、凝固プロセスを開始するために、塩化カルシウム及びカオリンをクエン酸塩添加血液サンプルと混合する。CK活性化サンプルは、血小板及びフィブリンが血餅に寄与する血餅形成により特徴づけられる。あるいは、活性化因子RFを使用して、TRAP、エピネフリン、AA、コラーゲン又はADPなどの血小板活性化因子へ添加して又は添加しないで凝固を開始することができる。A活性化サンプルは、血小板よりもむしろフィブリンが主に血餅に寄与する血餅形成により特徴づけられる。あるいは、ADP(又はADP+RF)を使用して血餅を活性化してもよい。ADP活性化サンプルは、フィブリンが主に血餅に寄与し、血症板はより小さい程度に寄与する血餅形成により特徴づけられる。異なる活性化条件下で観察されるシグナル応答は、対象の止血状態の診断に役立つことができる。
核共鳴パラメータを決定するための標準的な高周波パルスシーケンスが当技術分野で知られており、例えば、緩和定数T2を決定しなければならない場合、Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)が伝統的に使用されている。シーケンスにおける高周波パルスの周波数、パルスパワー及びパルス長の選択を含む高周波パルスシーケンスの最適化は調査中のシステムに依存し、当技術分野で既知の手順を使用して行われる。
により定義される減衰指数関数曲線にフィットし得る。ここで論じる緩和現象については、検出されるシグナルは離散した数の成分(i=1、2、3、4・・・n)の和である。このような関数をそれぞれ単一、双、三、四又は多指数関数と呼ぶ。科学及び工学において、多指数関数プロセスを分析する必要性が広がっているために、各係数についてAi及び(T)iの推定値を迅速に得るためのいくつかの確立された数学的方法が存在する。うまく適用されてきた、本発明の方法を使用して得られた生データの処理に適用することができる方法には、ラプラス変換、代数法、図式解析、非線形最小二乗法(多くの変種が存在する)、分染法、関数変調法、積分法、モーメント法、有理関数近似、Pade-Laplace変換、及び最大エントロピー法が含まれる(Istratov, A. A.及びVyvenko, O. F. Rev. Sci. Inst. 70:1233(1999)参照)。低磁場NMRについて具体的に示されてきた他の方法には、特異値分解(Lupu, M.及びTodor, D. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 29:11(1995))及び因子分析法が含まれる。
本発明の方法は、例えば、凝固を開始する前に血液に添加される常磁性剤(例えば、マンガン、マンガン錯体、ガドリニウム、ガドリニウム錯体又は超常磁性粒子)の存在下で行うことができる。常磁性剤は遊離マンガン、マンガン錯体(例えば、マンガンのEDTA錯体)、遊離ガドリニウム、ガドリニウム錯体(例えば、ガドリニウムのDTPA若しくはDOTA錯体)又は超常磁性粒子であり得る。常磁性剤を使用して、凝固開始後のより早い時点で凝固サンプルを未凝固サンプルと識別することができる(図46参照)。
一実施形態では、本発明は、生の緩和NMRデータを止血状態特有のサイン曲線をもたらすフォーマットに変換するためのデータ処理ツールを特徴とする。好ましい変換には、ラプラス変換又は逆ラプラス変換(ILT)が含まれる。各T2測定についてのデータを、シグナル強度を時間に対してプロットする時間次元から「T2緩和」次元に変換することができる。ILTは、サンプル中に存在する異なる緩和率及びその相対的大きさについての情報だけでなく、これらのシグナルの分布の幅の報告も提供する。
凝固プロセス又は溶解プロセスを生じているサンプルのT2データの3D表現を、本発明の方法(例えば、実施例18に記載する方法)を使用して作成することができる。一定の実施形態では、作成した3Dプロットの次元は緩和時間(例えば、T2又は1/T2)次元、強度若しくは振幅次元、及び時間次元に相当する。時間次元は、凝固プロセスが進行した又は進行している時間を表す。凝固血液サンプルから得られた3Dプロットは、サンプル中の異なる物理的及び/又は化学的環境中の別々の水集団と一致する種々の3D表面特徴を示す。3Dプロット及び3Dプロットを作成するために使用するデータは、血液サンプルと関連する指標又は凝固挙動に利用することができる(例えば、ヘマトクリット、血餅強度(MA)、凝固時間(R)、血小板活性、フィブリノーゲン活性、線溶等)。3Dプロット又は3Dデータプロットを作成するために使用するデータを使用して新たな指標を発見することもできる。
本発明の方法及び装置を使用して患者の止血状態のポイントオブケア評価を提供することができる(例えば、外科手術を受けている患者の凝固管理のため、血栓性合併症のリスクがある患者を同定するため、抗血小板療法に抵抗性の患者を同定するため、患者における抗凝固療法をモニタリングするため、患者における抗血小板療法をモニタリングするため、及び/又は患者における凝血促進療法をモニタリングするため、外傷に関連する異常な凝固障害、例えば外傷誘発性凝固障害、急性凝固障害の同定のためである。このような測定を用いて輸血の決定についての情報を提供することができる)。
凝固が起こるためには、トロンビンのフィブリノーゲンへの作用を介したフィブリン沈着に達する凝固カスケードの活性化がなければならない。凝固システムは、全プロセスの抑制と均衡を維持するための優雅なフィードバック規制機構を備えた初期刺激を増幅するタンパク分解性カスケードで構成される。凝固活性化の二つの相互接続した経路が存在する:(i)接触活性化(内因性経路);及び(ii)組織因子活性化(外因性経路)。両経路は、種々の凝固因子に依存している。プロトロンビンは第II凝固因子であり、トロンビンは第IIa凝固因子であり、フィブリノーゲンは第I凝固因子であり、フィブリンは第Ia凝固因子である。凝固因子に加えて、血小板は十分な血餅の誘導及び形成の両方にとって極めて重要である。血小板は、プロトロンビナーゼ複合体が形成されるリン脂質表面として作用し、血餅を発達させるための物理的足場として作用する。
本明細書に記載する本発明の方法及び装置は、凝固、血栓状態及び以下の疾患の結果としての血栓障害の診断のための、種々の液体、特に血液サンプルのレオロジー変化を検出するために使用することができる:例えば、敗血症及び播種性血管内血液凝固(DIC)、血友病A、血友病B、血友病C、他の凝固因子の先天的欠損、第XIII因子欠乏症、フォンヴィルブランド病、内因性抗凝固による出血性障害、脱線維素症候群、後天性凝固因子欠乏症、凝固欠損、他の、紫斑病、及び他の出血状態、アレルギー性紫斑病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、血小板減少症、免疫性血小板減少性紫斑病、突発性血小板減少性紫斑病、続発性血小板減少症、鎌状赤血球貧血及び非特異性出血状態。
本発明の方法及び装置を使用して、敗血症又は播種性血管内凝固を患っている対象の止血状態を評価することができる。
本発明の方法を使用して正常及び異常止血プロファイルを有する対象を識別することができる。例えば、正常及び異常止血プロファイル特有のNMR緩和パラメータ値及び/又はT2サインを決定し、対象(例えば鎌状赤血球貧血を有する対象)の差次的診断に使用することができる。異常止血プロファイルには、一つ以上の凝固因子、凝固補助因子及び/又は調節タンパク質(例えば、特に第XII因子、第XI因子、第IX因子、第VII因子、第X因子、第II因子、第VIII因子、第V因子、第III因子(組織因子)、フィブリノーゲン、第I因子、第XIII因子、フォンヴィルブランド因子、プロテインC、プロテインS、トロンボモジュリン及びアンチトロンビンIII)における共通の欠乏を共有する対象についてのプロファイルが含まれ得る。正常対象と異常対象との区別は、因子欠乏によるものではない疾患状態の指標となりうる。
本発明の方法及び装置を使用して、血小板機能を測定し、血小板凝集測定法と比較することができる(例えば、Harrisら、Thrombosis Research 120:323(2007)参照)。現在、血小板凝集測定法を行うためにFDAクリアランスと共に二つの検出方法が装置に使用されている:光学及びインピーダンス測定法。例えば、本発明の方法を使用して血小板凝集測定法により測定され得る対象の任意の血小板活性を同定する又は任意の血小板機能障害を診断することができる。血小板凝集測定法は、全血又は多血小板血漿サンプルに行う機能検査である。一般的に、血小板凝集法は、血小板活性化因子をサンプルに添加するステップと、誘導された血小板凝集を測定するステップとを含む。血小板凝集は、電極を、検査をする血液サンプルに浸漬することにより行うことができる。プローブに接着した血小板は安定な単層を形成する。活性化因子を添加すると、血小板凝集体が電極上に形成し、電極に印加されている電流に対する抵抗を増加させる。装置は、血小板凝集反応を反映する電気インピーダンスの変化をモニタリングする。凝集測定法はまた、凝集している血小板からのATPの放出を発光によりモニタリングすることに基づく技術を含む。血小板凝集の光学検出は、血小板が大きな凝集塊に凝集するにつれて、光透過率が増加するという知見に基づく。異なる凝集誘導剤が異なる活性化経路を刺激し、異なる様式の凝集が観察される。光学法の主な欠点は、これが典型的にはPRPに行われ、血小板を赤血球から分離すること及び血小板数を標準化値に調節することを要するということである。
他の止血測定ツールとは異なり、T2MRは、別個の性質が異なるプラットフォームに関する単一アッセイとして通常は分析される種々の止血パラメータに関する多重の止血測定を可能にする。これらの多重の測定は、特にポイントオブケアの際に、単一の機器又はアッセイパネルでは可能でない診断アッセイの新規な組合せを可能にする。T2MRに基づくアッセイパネルは、好都合に、ポイントオブケアの際に病院検査室において使用することができる。
(i)凝固時間、ヘマトクリット、及び包括的な血小板活性を、単一のチャネル使い捨ての管を使用して、単一の活性化因子から測定することができる。これは凝固時間に関する同一の活性化因子を使用して血小板を活性化することができるので、可能である。これは、アプロチニンなどの線溶阻害因子と組み合わせてもよいし又は組み合わせなくてもよい。
本明細書に記載する本発明のNMRに基づく方法は、物質又は物質の混合物が凝固プロセス又は溶解プロセスを生じている又は生じた種々の用途に使用することができる。本発明の方法を使用して、プロセスを生じている材料中の変化、又はプロセスを既に受けた材料の状態についての情報を得ることができる。
本発明の方法は、血小板誘導血餅収縮の観察を通して止血性の状態及びパラメータを評価するための測定を含む。これらは、数ある中で、血小板活性、凝固亢進及び凝固低下状況、並びに血餅溶解を含む。これらの反応と関連している動態及びシグナルは、変数の少なくとも3つのカテゴリーに依存している:(1)血小板活性、因子欠損、及び治療薬などの、サンプル内の固有の生物学的特徴、(2)サンプル中の凝固を開始するために使用される特異的な活性化因子の種類及び濃度、並びに(3)どのように血餅が形成し、サンプル管内で収縮するかの変動性。本発明の方法の1つの目標は、観察された実験値における変動性が、サンプルの固有の生物学的特徴(カテゴリー1)における変動性のみを反映していることを保証することである。この目的を達成するために、標準試薬製剤を使用して、任意の所与のサンプル測定に関する、血餅開始の所定の状態(カテゴリー2)から生じる変動性を調節及び減少させることができる。我々は、サンプル管の内部表面へのフィブリン接着(カテゴリー3)における変動性が、本発明の方法の感度及び再現性を減少し得るサンプル測定における変動性を導入することがあることを観察した(実施例23参照)。この変動性源を減少させるために、本発明の方法を、フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管において行うことができる。フィブリン接着を制御するサンプル管の使用は、より頑強な、感度の良い、再現性のある血餅収縮に基づくアッセイを生じることができ、それによって参照方法及び臨床転帰とより良好に相関するより正確なデータが生成される。
本発明は、(a)凝固開始剤を、血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管において血液サンプルに添加するステップと、(b)プロセス中に血餅が形成したかどうかを決定するステップとを含む、血液サンプル中の凝固プロセスをモニタリングするための方法を特徴とする。例えば、ステップ(b)は、T2磁気共鳴測定(又は本明細書に記載する任意の他の磁気共鳴技法)などの核磁気共鳴測定を含むことができる。或いは、ステップ(b)は、光学的、トロンボエラストグラフィー、ターボデンシトメトリー、発色性、免疫性、比濁法、比濁分析、凝集、インピーダンス、機械的血餅検出、血小板凝集、電気化学的検出、凝固時間、フォトメカニカル、及び/又は電気機械的測定を含むことができる。血餅形成をモニタリングするための計測手段及び方法は、当技術分野で周知であり、それだけに限らないが、光学的又はターボデンシトメトリー測定のための方法(例えば、American Labor/Lab A.C.M. Inc.製のCD2000又はCoaData機器、Helena Laboratories製のAggRAM、Cascade M-4、又はCascade M機器、LABiTec GmbH製のCoaLAB 1000機器、又はSiemens Healthcare Diagnostics製のBFT II、Sysmex CA-530、Sysmex CA-560、Sysmex CA-1500、又はSysmex CA-7000機器を使用して)、発色性測定のための方法(例えば、Beckman Coulter Inc./Instrumentation Laboratory製のACL TOP 300 CTS、ACL TOP 500 CTS、ACL ELITEシリーズ、及びACL TOP 700シリーズ機器を使用して、又はSiemens Healthcare Diagnostics製のBCS XP機器を使用して)、血小板凝集のための方法(例えば、Chrono-Log Corp.製のPlatelet Aggregation Profiler、Model-PAP 8E機器を使用して、又はAccumetrics製のVerifyNow機器を使用して)、機械的血餅検出のための方法(例えば、Diagnostica Stago Inc.製のKC1Δ、KC4Δ、STart 4 Hemostasis Analyzer、STA Satellite、Destiny Plus、STA Compact Homeostasis System、STA Compact CT、STA Compact Plus、STA-R Evolution Expert Series、又はDestiny Max機器を使用して)、蛍光に基づく血餅検出のための方法(例えば、Diagnostica Stago Inc.製のCalibrated Automated Thrombogram機器を使用して)、トロンボエラストグラフィーに基づく血餅検出のための方法(例えば、Hemonetics製のTEG-5000機器を使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、機械的血餅検出のための方法(例えば、ITC製のProTime Microcoagulation System、Hemochron Signature Elite、Hemochron Signature+、又はHemochron Response機器を使用して、Medtronic Cardiac Surgery製のHMS Plus又はACT Plus機器を使用して、Instrumentation Laboratory製のGEM PCL Plus機器を使用して、CoaguSense製のCoag-Sense PT/INR Monitoring System機器を使用して)、電流測定血餅検出のための方法(例えば、Roche Diagnostics製のCoaguChek XS PT Test System、CoaguChek XS Plus PT Test System、又はCoaguChek XS Pro PT Test Systemを使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、電気機械的血餅検出のための方法(例えば、Helena Point of Care製のActalyke XL、又はActalyke Mini II機器を使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、電気化学的血餅検出のための方法(例えば、Alere製のINRatio/INRatio2 PT INR Monitor機器を使用して、又はROTEM製のROTEM機器を使用して)、血小板活性化に基づく血餅検出による開口(aperature)閉鎖のための方法(例えば、Siemens Healthcare Diagnostics製のPFA-100装置を使用して)、起電性に基づく血餅検出のための方法(例えば、Abbott Point of Care製のi-STAT機器を使用して)、及びフォトメカニカルに基づく血餅検出のための方法(例えば、Helena Point of Care製のCascade POC機器を使用して)を含むことができる。
本発明の方法を実行するためのシステムは、1つ以上のNMRユニットを含むことができる。バイアス磁石は、サンプルを通してバイアス磁界B0を樹立する。RFコイル及びRFオシレーターは、バイアス磁界B0の一次関数である、ラーモア周波数でのRF励起を提供する。一実施形態では、RFコイルは、サンプルウェルの周りに巻かれている。励起RFは、水プロトン(又は非水性溶媒中の遊離プロトン)のスピンにおける非平衡分布を生み出す。RF励起が遮断された場合、プロトンは、それらの元の状況に「緩和し」、血液サンプル中の水集団に関する情報を抽出するために使用することができるRFシグナルを放射する。コイルは、RFアンテナとして働き、シグナルを検出し、適用されたRFパルスシーケンスに基づいて、材料の種々の特性、例えばT2緩和を探索する。技術のいくつかの場合に関する興味のあるシグナルは、スピン-スピン緩和(一般的に10〜2000ミリ秒)であり、T2緩和と称される。コイルからのRFシグナルは、増幅及び処理されて、バイアス磁場B0における励起へのT2(減衰時間)応答を決定する。ウェルは、血液サンプルを含めたナノリットルからマイクロリットルのサンプル及びその周りに巻かれた適切なサイズのコイルを有する小さい毛細管又は他の管とすることができる。コイルは、典型的にサンプルの周りに巻かれており、サンプルの量に応じたサイズになっている。例えば(それだけに限らないが)、約10mlの量を有するサンプルに関して、長さが約50mmで直径が10から20mmのソレノイドコイルを使用することができ、約40μLの量を有するサンプルに関して、長さが約6から7mmで直径が3.5から4mmのソレノイドコイルを使用することができ、約0.1nlの量を有するサンプルに関して、長さが約20μmで直径が約10μmのソレノイドコイルを使用することができる。或いは、コイルを、ウェル又はサンプル管内、その周り、又は近くに設定することができる。NMRシステムは、多重(マルチプレックス)目的の検出のための複数のRFコイルを含むこともできる。いくつかの実施形態では、RFコイルは、6mm×6mm×2mmの寸法の円錐体の形状を有する。
全血サンプルを使用した血液凝固プロセスのモニタリング
新鮮なクエン酸塩添加又はヘパリン添加全血サンプルを使用して凝固プロセスをモニタリングした。いくつかの異なる活性化経路を調査した。
サンプル中の血液凝固を解釈するためのアルゴリズムを使用したデータ抽出
実施例1のT2リーダーからのデータ出力を、双指数関数フィットを行い、プロット及びチェックし、特徴抽出する三段階法を使用して処理した。
読出し時間を、NDXClientにより登録した。複合yデータを大きさに変換し、正規化した。最初の25msのx及びyを除いた。各緩和曲線を、デフォルト非線形最小二乗法を使用してフィットした。曲線を最初の五つの時点について使用した固定シード(fixed seeds)を有するAmpA、AmpB、T2A及びT2Bについての開始点(例えば、シード)を使用して双指数関数方程式にフィットさせた。6番目の時点のためのシードを最初の五つの時点の平均から得た。一般的に、時点は前の時点からの出力を用いてシード値を与えた。パラメータに対する負値は許可しなかった。あるいは、データを端と類似に働く、時系列の中央に最初にフィットすることができる。適合度の項を、フィット残差の二乗の和をとり、SSEと呼ばれる負でない値を除外することにより計算した(図1A及び1C参照)。パラメータAmpA、AmpB、T2A及びT2Bをそれぞれのカテゴリーにビニングしてテキストファイルを作成した。
SSE基準を満たさなかったフィットにフラグを付け、除去した。加重LLS及び一次の多項式を使用した局所回帰に基づく単純なスムージング機能を行い、外れ値データを処分した。各フィットパラメータを時間に対してプロットした(スムージング及び非スムージング)。データシフト及び反映を行い、TEGトレーシングを模倣し、T2凝固曲線を作成した。T2凝固曲線は、線形変換を抽出した磁気共鳴パラメータに適用することにより作成することができる。特に、T2凝固曲線は、データ点の各々から最小T2A値を減じ、各得られたデータ点の負を取り、x軸についての曲線を有効に反映することによりT2Aデータから得ることができるだろう。同様に、T2凝固曲線は、データ点の各々から最大T2B値を減じ、各得られたデータ点の負を取り、x軸についての曲線を有効に反映することによりT2Bデータから得ることができるだろう。振幅データAmpA及びAmpBを同様の方法によりT2凝固曲線に変換することができるだろう。
プロットした曲線を測定して凝固挙動「R」、「MA」及び「角度」に関連する値を抽出した。データ抽出は、当技術分野で既知の種々の方法のいずれかを使用して行うことができる。例えば、メトリクスを、結果として生じるデータの曲線形状から得る及び/又は一つ以上のNMRパラメータの値から計算することができる。
凝固挙動を測定するための毛細管法の使用
毛細管を使用して患者から血液サンプル2〜5μLを収集した。血液サンプルは、ランスを使用してフィンガースティックから収集し、サンプルをヘパリン添加毛細管に収集し粘土でキャップした。あるいは、血液をパイレックス(登録商標)管に収集し、粘土でキャップした。あるいは、血液サンプルをガラス製Dagan毛細管に収集し、粘土でキャップしたが、これは活性化因子を含有しなかった。T2 NMR緩和率についてのデータを、T2リーダーを使用して毛細管サンプルから記録した。収集データが単一指数関数であること、及びこれは標準的CK曲線中に存在するのとは異なる血餅構造を反映し得ることが決定された。おそらく、毛細管の表面が血液凝固を誘導する。
ナノ粒子による血液の処理
血液に超常磁性ナノ粒子をドーピングすることにより、血液中のバルク水の磁化率(susceptibility)の変化がもたらされる。同様の現象は、マンガンを血液に添加してバルク水のT2値を変化させ、使用可能な化学シフトが赤血球の内側及び外側の水の測定を交換することを可能にすることにより以前に使用されてきた。単一患者からの血液サンプルを実施例1に示すプロトコルに基づく実験に使用した。さらに、血液サンプルを非官能化800nm直径ナノ粒子で処理した。2種の異なる濃度のナノ粒子を試験した。2種の異なる濃度は、ナノ粒子10μL又はナノ粒子20μLのいずれかを添加することにより得た。T2データを、T2リーダーを使用して記録した。記録したT2データを、実施例2に記載するアルゴリズムを使用して処理した。ナノ粒子を含有するサンプルについてのAmpA及びAmpBの一連のプロットから、ナノ粒子が曲線中に観察されるノイズを減少させ、AmpA及びAmpBをより容易に識別することを可能にすることが認められた。ナノ粒子を含有するサンプルについてのT2A及びT2Bの一連のプロットから、ナノ粒子がT2Aのより大きな変化をもたらすことが認められた。超常磁性ナノ粒子は、(i)サンプル中のレオロジー変化に応じたシグナル変化(若しくはNMRパラメータの値の変化)を増加させる、及び/又は(ii)凝固若しくは溶解プロセスを生じているサンプル中のレオロジー変化のより早期の検出を可能にするために、本発明の方法に有用となり得る。
ドナー血液サンプルからの磁気共鳴パラメータの決定
データ抽出に使用した磁気共鳴パラメータは、ドナーから得た血液サンプルを使用して得た。血液サンプルを、TEG法とT2凝固法の両方を使用して評価した。いくつかの異なる種類のアッセイを実行した。T2凝固データは、いくつかのT2リーダーの一つを使用して収集した。
ドナー血液サンプルを、本発明の方法及びTEG法を使用して評価した。実施例1に記載するように、いくつかの異なる全血凝固アッセイを使用した。
特徴抽出のためのプロセス
相当な努力を行ってT2凝固とTEG曲線との間の特徴相関を決定した。相関を探したTEG曲線中の二つの主要な特徴はR及び最大振幅(MA)であった。全特徴抽出は、全曲線の1/15又は40個のデータ点ごとにスムージングしたT2A、T2B、AmpA及びAmpB曲線を使用して行った。
特徴抽出の一つの例では、T2A及びT2B曲線を組み合わせて、T2凝固曲線とTEG MA値との間の相関を探すのに有用であったT2A+部分T2Bを得ることができる。この複合曲線を「T2A+pT2B」と命名し、T2Bが最大である時点を同定し、そのT2B値とすべてのその後のT2B値との間の差の絶対値からなるベクトルを作り出すことにより計算する。次いで、このベクトルを同一時間記録器でT2Aに加える。図6は、どのようにT2A+pT2B曲線を計算するかの例を示している。T2A+pT2B曲線はTEG曲線の上半分を模倣している。
血液サンプルのヘマトクリットは、凝固前にサンプル中の単一の初期水集団から計算することができるだろう。血餅形成前、この単一の水集団は実施例2に記載する双指数関数あてはめ法を使用して確立されたT2A値に対応する。サンプルの初期T2A値は、当技術分野で知られている標準的な方法を使用して測定されるヘマトクリットとほぼ逆の線形相関を有することが分かった。較正曲線は、単一患者から採取した血液を使用して異なる希釈で4種の標準のセットを作成することにより確立した。凝固開始前に水集団Aについて観察されたヘマトクリット及び初期緩和率を互いに対してプロットして較正曲線を作成した。血液サンプルを10人の患者から採取し、較正曲線に対して照会した。未凝固血液についてのT2シグナルは、ヘマトクリット(HCT)レベルと逆に変化することが分かった。図8aに示すように、広範囲のHCT基準値にまたがる別個の患者サンプルがこれを一般的に証明する。図8bに示すように、較正法を一定範囲のHCTにわたり希釈した単一の患者サンプルに適用することにより、HCTへの一次従属性が示される。図8a及び8bは、本発明の方法を使用して血液サンプルのヘマトクリットを計算することが可能であることを示している。
抽出磁気共鳴パラメータとTEGにより決定される凝固挙動との間の相関
測定した平均NMR緩和率データから抽出した磁気共鳴パラメータは、TEGにより決定される凝固挙動と相関し得る。表1は、抽出したT2A値と、TEG Hemostasis Analyzerを使用して測定した凝固時間パラメータ「R」との間の相関を示している。
凝固時間(R)をT2凝固特徴と相関させる方法を、上記のように、自動的にT2Aの二次数値導関数を得ることに基づいて開発した。25回の実行にわたり、0.80のR2(図9)がR(全血凝固時間)値についてT2とTEGとの間で観察された。この相関に使用したT2凝固曲線はカオリン実行(SSE≧2)であった。三つの外れ値実行を、そのT2A曲線を右に示して図9に強調する。三つのケース全てで、T2A曲線はR TEG時間前に最大加速(T2A''=0)を達成する。
カオリン実行を使用してTEG MA時間及びT2凝固特徴を相関させるためにいくつかの特徴を探索した。カオリン実行について見られた最も顕著な相関は、時間0と最小T2値との間のT2凝固特徴であり、これはT2 R特徴の直前である。これは、T2A曲線の典型的な初期減少である。時間0と最小T2値との間のT2Aシグナルの勾配はTEG MAPLATELET値と相関する。TEGは血小板活性を直接測定することはできないので、血餅強度へのトロンビン誘導血小板寄与は、活性化因子若しくはA実行からMA項(MAA)、又はカオリン実行からMA項(MATHROMBINとも呼ぶ)を減算することにより導出される。図10は、14 T2凝固実行についてのTEG項MATHROMBIN-MAA、又はCK実行からのMA−A実行からのMAと28 TEG実行との間の相関を示す。R相関と同様に、SSE≧2を使用した。TEGを用いてMAPLATELET項を得るために、2種の異なるTEG曲線を得なければならず、使用者は手動演算を行って血餅強度への血小板寄与を決定しなければならない。しかしながら、T2凝固を用いれば、この情報は単一T2凝固実行の最初の6分以内に入手可能であり、セットアップがはるかに早い。
NMR緩和データを収集する前に添加剤を血液サンプルに含めることにより、凝固挙動を決定することができる。フィブリノーゲンをサンプルに添加してMA値の範囲を有効に滴定することができる。図11は、機能性フィブリノーゲン滴定についてのT2凝固曲線及びFF実行のMAとT2凝固曲線からの特徴との間の相関についての明確な証拠を示している。このT2凝固特徴は、初期と最終T2凝固AmpA値の間の差(ΔAmpA)として計算した。フィブリノーゲンを3種の異なる濃度で(0.63、1.25及び2.5mg/mL)サンプルに添加した。図11(c)に見られるように、添加フィブリノーゲンを含有しないサンプルと比較して、これらの機能性フィブリノーゲン(FF)(MAFF)実行についてのΔAmpAとTEG MAとの間に強い相関が存在した。フィブリノーゲン滴定を2人の他の患者サンプルについて行ったところ、0.9より上及び0.98もの相関が得られた。このプロトコルでは、クエン酸塩添加全血をその元の濃度の50%まで希釈した。
線溶を検出するために使用するLY30項について相関が認められた。5人の異なる健常患者サンプルを使用してT2凝固が線溶に感受性であるかどうかを試験した。2種のレベルの組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を健常患者血液に添加することにより、TPAの添加を使用して線溶を刺激した。フィブリンが形成するとTPAがフィブリンを切断する。線溶をT2凝固の10分以内に検出することができることが認められたが、これはTEGの検出に必要とされる時間の半分未満である。全5人の患者について、健常と線溶サンプルとの間の明確な差が存在した。図12は、非線溶(実線)サンプル及び線溶サンプル(破線)についてのT2A及びT2B曲線に関するT2凝固データを示している。
T2MRの血液及び血漿中での血餅形成に対する感度(感受性)を使用して、PT/INR、aPTT及びTEG Rなどの凝固時間を測定することができる。
T1緩和測定
T2測定を測定することができることに加えて、T2リーダーは、T1測定を測定することができるよう構成され得る。T1はサンプル中の水素原子スピン系の異なる物理的特性を測定する。そのため、T1データは、T2データと比べて、血液凝固についての代替及び相補的情報を提供する。従来のT1測定はT1シグナルを得る段階的性質のために時間を消費していたが(2〜3分)、z-リフォーカスエコー(z-refocused echo)(ZRE)法を使用して5秒未満以内にT1が得られた。天然及び凝固全血についてのT1緩和曲線の測定を行ったところ、T1の血液凝固に対する感度(感受性)が認められた(未凝固全血T1=787ms;凝固全血T1=860ms)。
T1/T2ハイブリッド検出法
T1/T2ハイブリッド検出法は当技術分野で既知である(これにより参照により組み込まれる、Edzes、J. Magn. Reson. 17:301〜313、1975;Sezginerら、J. Magn. Resn. 92:504〜527、1991)。これらの方法及び関連する方法を本発明に使用して磁気共鳴パラメータ値を評価及び/又はT2凝固曲線を確立することができる。
R12=(1-p)R1+pR2 (11)
[式中、p=τc/τr]
により関連する。この関係から、pが0になると、R12がR1になることが分かる。
である。
アクリルアミド合成凝固対照
アクリルアミドゲル重合をT2凝固測定のための合成対照として使用した。表2に列挙する量の脱イオン水、40%アクリルアミド、0.5M Tris pH6.8緩衝液、及び10%過硫酸アンモニウムを使用して混合物のセットを形成することにより、アクリルアミドゲルのセットを調製した。混合物を室温で30分間インキュベートした。各混合物36μLを、対照として使用するために別々のPCT管のセットに保存した。テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)2μLを各混合物に添加した。30分後、各対照のT2測定及び重合反応を行った。
細菌内毒素の検出
本発明の方法及び装置を使用して細菌内毒素、すなわち、グラム陰性菌の細胞壁物質を検出する。内毒素は、ヒトに高熱をもたらすことができ、結果として、血液に接触する注射用薬物及び医療機器は内毒素の存在について頻繁に試験されている。内毒素を検出するための凝固ベースアッセイは、細菌内毒素とアッセイに使用する特定の溶菌液との間の反応によるものである。カブトガニ、アメリカカブトガニ(Limulus polyphemus)の循環アメーバ様細胞から得られる溶菌液が使用することができる具体的な溶菌液である。アッセイでは、溶菌液を、内毒素の存在について試験するサンプルに導入する。凝固プロセスを介してゲルが形成すると、内毒素が存在するとみなされる。このようなゲルの形成及び特性を、本明細書に記載するNMRに基づく方法のいずれかによりモニタリングする。
T2サイン曲線
NMRデータを処理して、血液サンプル中の個々の水集団を表す別個のシグナル(すなわち、最大値)を示すT2サイン曲線を作成する。数学的変換(すなわち、ラプラス変換又は逆ラプラス変換)を凝固イベント中の時点でT2に関連する減衰曲線に適用することにより、T2サイン曲線を作成する。図15は、T2減衰曲線及び対応するT2サイン曲線を示している。三つのシグナルは、血液サンプル中の三つの水集団を表す。図15はまた、シグナルが経時的に変化し得る一つの様式を示している。
血餅中の水集団の3Dプロット
T2緩和率データを健常患者から採取したCK血液サンプルから収集した。各サンプルについて、一連のT2減衰曲線を50分の期間にわたって測定した。減衰曲線を逆ラプラス変換(ILT CONTIN)を使用して各々処理して、T2時間の関数としてT2強度を示す一通りの曲線を得た。逆ラプラス変換曲線を凝固時間次元の持続時間にわたって積み重ねてどのようにサンプル中の水の異なる集団が時間の関数として変化するかを示す3D表面を作成することにより、これらの曲線を、3Dデータセットを形成するようコンパイルした。図20は、Bruker minispecで収集した患者サンプル29328及び29350についての3Dデータセットを示している。3Dデータは、未凝固血液に相当する250〜500msのT2時間の初期水集団を示した。5分〜30分の間の時間で、単一水集団が二つの有意な水集団に分岐した。これらの二つの水集団は、血餅の二つの構成要素、すなわち、退縮した血餅及び退縮した血餅を囲む血清に相当する。第1の血餅関連水集団は80〜400msのT2時間を有し、退縮した血餅に相当する。第2の血餅関連水集団は400〜3000msのより広範囲のT2時間を有し、退縮した血餅を囲む血清に相当した。いくつかのサンプルについて、これらの二つのピークは完全には分解されなかった。凝固サンプルの水集団と構成要素との間の相関を、周囲血清から退縮した血餅を分離し、これらの二つの構成要素についてのT2データを別々に測定することにより確認した。
アブシキシマブを使用した血小板活性の阻害
全血サンプルの凝固を、抗血栓薬アブシキシマブ(ReoPro(登録商標))を使用して摂動させた。アブシキシマブは、ヒト血小板のIIb/IIIa受容体に結合し、血小板凝集を阻害するヒト-マウスモノクローナル抗体のFabフラグメントである。アブシキシマブは、凝固プロセス中に血餅の退縮を阻害するよう作用する。
1. 血液を正常ドナーから6本のクエン酸塩添加管に採取した。正常ドナーは過去2週間にアスピリンも任意の抗血小板薬物も服用していてはならない。
2. 6本の管の血液をプールし、8〜10回穏やかに反転させることにより混合した。サンプルは収集してから2時間以内に使用した。
3. アブシキシマブ溶液(10mg/5mL)を希釈剤として生理食塩水を使用して1:4の比で希釈して「溶液1」を形成した。
4. 血液に、表5に従って、溶液1及び生理食塩水を添加した。
5. いずれかのサンプルをT2リーダー又はBruler minispecで測定する前にサンプルを少なくとも5分間静置した。
データ品質及びフィット品質の評価
単一サンプルについてのT2凝固データは、S観察T2 CPMG緩和曲線{fj(t):0<t<T、j=0、1、2、3、…、S}(式中、j=0、1、2、…、Sはサンプルの凝固/血餅形成プロセスを通した時間の点であり、j=0は凝固開始に相当し、j=Sはサンプルが予想された凝固イベントを受けた後の点に相当する)の集合からなる。T2凝固アルゴリズムは、減衰関数のこの集合をT2×凝固時間領域にわたって減衰定数ポテンシャルの面に変換し、次いでこれらのポテンシャルからサンプルについての有用な情報を抽出する。
この課題に対処するために、変換の前に、各T2CPMGデータセットを試験して、データセットと変換が成功する全体的尤度の両方の品質を確立することができる。信号対雑音比(SNR)は、緩和データの遅くに(すなわち、T近くのt)観察された変動と比べてt=0でのCPGM強度に基づいて推定する。初期シグナルの減少から生じた低いSNR値は、データから検討の資格を奪う装置及びオペレータのエラーに関連する。低いSNRは、CPMGデータの遅くの変動の増加から又は減衰プロセスの観察期間が短すぎる場合にも生じ得る。後者の場合は、所与のデータセットにおける減衰定数が予想よりも大きくなることが示唆される。Tikhonov正則化法は予想される最大T2値の知識を要するので、最大予測T2値(CONTINのパラメータ)を増加させることにより、T2アルゴリズムはCOMG曲線の遅くの線形傾向による低SNRの場合を適合させる(accommodate)。
いくつかのCONTINパラメータは逆ラプラス変換の品質に劇的に影響を及ぼす。表6は、T2 CPMGデータを最良適合させるためにT2凝固アルゴリズムにより使用されるパラメータ及び値を記述している。正則化値(α)は、二つ以上のT2ピークを分解する能力において主要な役割を果たす。T2凝固アルゴリズムは、水分子の亜集団が自身を他の集団から識別し始めた場合の識別するための狭いピークを要する。表6に明示するα値の特定の範囲は、CONTINにこの亜集団識別を可能にする正則化加重を用いた解法を検索させる。
いったん各ILTを行ったら、曲線{lj(τκ):1<τκ<最大T2、κ=1、2、3、…、N、j=0、1、2、3、…、Sの集合はCPMG曲線フィットの元の集合を置換する。所与のCPMG曲線fjについては、減衰定数τκはlj(τκ)を多指数関数分解に与えると推定される(式13参照):
一般に、所与のjについて、ILT振幅値lj(τκ)を、値が非ゼロである小(<6)領域の周りのT2領域にクラスタ化する。理想的には、非ゼロ強度のこれらの島は単峰であり、反転を行ったT2値の範囲の境界から離れている。これは常に当てはまるわけではないので、lj(τκ)を正確に解釈するよう注意しなければならない。
乾燥又は凍結試薬の使用
乾燥又は凍結試薬を本発明の方法に使用してもよい。以下の結果は、試薬を乾燥させること及び試薬を凍結することが、T2緩和により観察される凝固プロセスに識別可能な影響を及ぼさなかったことを示す。
コラーゲンは、血小板の強力な活性化因子であり、細胞マトリックスから露出したコラーゲンの認識は血小板活性化についてのインビボシグナルの一つである。本発明者らは、マイクロチューブの底で乾燥させた小分割量のコラーゲンが全血とRBC-枯渇血漿の両方でT2MR血餅ピークを有効に生成することができることを示した。チューブを調製するために、2μg(1mg/ml溶液2μL)をマイクロチューブの底に堆積させ、チューブを37℃2〜5時間に置いた。このように調製したチューブを室温又は37℃で数週間保持することができる。T2MRサインを測定するために、クエン酸塩添加全血(又はRBC-枯渇血液)34μLを37℃でチューブに添加した。1分後、0.2M CaCl2 2μLを添加し、サンプルを緩和測定及び分析のために磁石に置いた。
本発明者らは、ヘパリン添加を使用してトロンビン活性を制御し、それによってトロンビンを介して血小板活性化の変動を最小化するクエン酸塩添加全血中の血小板のADP活性のための標準的製剤を開発した。このような系の凝固は、カルシウム(クエン酸塩を断つため(overcome))及びレプチラーゼ/第XIIIa因子(トロンビンを置換するため)の組み合わせで開始される。ADPを介して血小板を活性化し、それゆえ、P2Y12 ADP受容体の状態をプロービングするのに有用な完全なワンポット活性化混合物は、ヘパリン、レプチラーゼ、第XIIIa因子、カルシウム及びADPを含有する。また、0.5〜1.0mMアラキドン酸で血小板を活性化した。
カオリン実行により、血清及び血餅シグナルの分解が可能になる。患者サンプルにわたり、これらの実行は、使用者のエラーからの絶対T2値の変動を示し得る。乾燥試薬の使用により、ピペット操作エラーが回避され、すべての湿潤試薬実験中に通常遭遇する試薬添加変動が低減する。さらに、乾燥試薬を使用することにより、より単純なアッセイプロトコルがもたらされ、ここでは血液を、追加のピペット操作ステップなしで乾燥試薬を含有するチューブに直接添加する。
アスピリンの効果
この実験では、AA+RFによる活性化の前に600μMアスピリンをex vivoでヘパリン血液に添加することにより、血小板阻害をモニタリングした(サンプルを、アスピリンを用いて及び用いないで試験した)。血餅関連T2シグナルが、アスピリンをドープされたサンプルの存在下で劇的に減少又はなくなることが認められた。これらの試験により、血餅サインは血小板活性に依存することが確認された。これらの試験はまた、血小板阻害を測定するためのT2MRサインの有用性も示している。
2-チオメチルAMP(MeSAMP)の効果
この実験では、血小板活性のPlavix阻害についての模倣物としてex vivoで添加したMeSAMP(2-チオメチルAMP、不可逆ADP P2Y12受容体阻害因子)を使用することによる血小板のP2Y12経路の阻害を試験した。
組織プラスミノーゲン活性化因子の効果
T2MR表面はまた全血線溶にも感受性である。これを評価するために、健常ドナーサンプルに組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を添加した。線溶をもたらす高い感度及び迅速な時間が証明された。
強固な血液血餅における水交換
凝固血サンプルを観察して、特有の低T2緩和率を有する追加の血餅関連ピークを生成した。我々は、この追加のシグナルは、水の高度に統制された状況、したがって低T2緩和率を生成する、から生じると仮定した。この仮説を試験するために、我々は、追加のシグナルを起こす血餅環境と関連している水が、周囲の水(すなわち、血清水)と容易に交換するかどうかを研究した。交換速度を、凝固血サンプルにD2Oを添加し、どれくらい速く各シグナルが洗い流されるかを観察することによって測定した。
定性的凝血モデル
正常なクエン酸塩添加患者サンプル(ヘマトクリット=36.7%、血小板レベル=299,000/ul)を、11.8mMカルシウム及び0.1u/mlトロンビン(Chronolog)で37℃で活性化した。この実験を、合計2時間の間、20秒/ポイントで行った。いくらか上昇した血小板レベルは、血餅退縮を約20分で開始させ、3つのピークサインを可能にした(図30参照)。
コーティングされたサンプル管
本発明の方法は、血小板誘導血餅収縮の観察を通して止血性の状態及びパラメータを評価するための尺度を含む。これらは、数ある中で、血小板活性、凝固亢進及び凝固低下状態、並びに血餅溶解を含む。これらの反応と関連している動態及びシグナルは、変数の少なくとも3つのカテゴリーに依存している:(1)血小板活性、因子欠損、及び治療薬などの、サンプル内の固有の生物学的特徴、(2)サンプル中の凝固を開始するために使用される特異的な活性化因子の種類及び濃度、並びに(3)どのように血餅が形成し、サンプル管内で収縮するかにおける多様性。本発明の方法の1つの目標は、観察された実験値における変動性が、サンプルの固有の生物学的特徴(カテゴリー1)における変動性のみを反映していることを保証することである。この目的を達成するために、標準試薬製剤を使用して、任意の所与のサンプル測定に関する、凝固開始の所定の状態(カテゴリー2)から生じる変動性を調節及び減少させることができる。我々は、サンプル管の内部表面へのフィブリン接着(カテゴリー3)における変動性が、本発明の方法の感度及び再現性を減少し得るサンプル測定に変動性を導入し得ることを観察した。
血小板機能試験プラットフォームとしてのT2磁気共鳴
光透過凝集測定法(LTA)を使用した血小板機能の臨床評価は、部分的にはエクスビボの操作への血小板の感受性のために、専門研究室に限定される。LTA結果の分析及び報告は、十分に標準化されておらず、結果は、インビボでの止血に対する最小の効果を有する薬剤に過度に感受性があり、アッセイは、血小板過敏性の状況を診断すること及び抗血小板療法をモニタリングすることに制限された有用性を示した。ここで、我々は、40μL未満の血液を必要とし、採取後にサンプル調製を必要としない全血中の血小板機能を試験するためのT2磁気共鳴(T2MR)に基づく簡単に使えるプラットフォームを導入する。我々は、2-メチルチオアデノシン5'-一リン酸(2-MeSAMP)又はアスピリンの存在下又は非存在下でのアデノシン二リン酸(ADP)及びアラキドン酸(AA)で試験した陽性及び陰性サンプルにわたる、LTAとの優れた相関を実証する。我々のデータは、LTAによっては明らかでない血餅退縮への血小板の寄与への洞察も提供する。
フィブリノーゲンアッセイ
T2MRは、トロンビンの存在下での全血又は血漿中のフィブリンの形成を直接的に測定する。トロンビン(STAGO、5U/mL)の溶液を、血漿(又は血液)の希釈液に添加し、T2シグナルの変化をモニタリングする。サンプルは、トロンビンの添加時にすぐに凝固し始め、T2シグナルの急速な減少を結果として生じる。測定されるT2シグナルにおけるより良好なサンプル緩和率を達成し、ノイズを減少させるために、常磁性の材料(MnSO4)を、45μMの希釈剤におけるMnSO4の最終濃度で、緩衝希釈剤(STAGO、Owren-Koller緩衝液)に添加する。常磁性の材料は、凝固プロセスに対する有意な効果を有さない。常磁性の材料を含有する緩衝希釈剤を使用して、80U/mLストックを希釈することによってトロンビン5U/mLストックを調製し、較正曲線のための標準希釈物を調製する。
エピネフリン活性化滴定曲線
5〜20μMの範囲のエピネフリンの滴定を、活性化カクテル(レプチラーゼ、第XIIIa因子、カルシウム、及び血小板活性化因子からなる)に添加した。4μLの活性化カクテルを、コーティングされた管において36μLの全血に添加した。反応を含有する管を、T2MRリーダーに置いた。T2MR緩和曲線データを、逆ラプラス変換アルゴリズムで処理した。図38で示すように、サンプルは、エピネフリン濃度の範囲にわたって応答性であり、血餅収縮のタイミングは、用量依存的であった。
TRAP活性化滴定曲線
3.12〜100μMの範囲のPAR-1受容体特異的ペプチド(SFLLRN)(TRAP)の滴定を、活性化カクテル(レプチラーゼ、第XIIIa因子、カルシウム、及び血小板活性化因子からなる)に添加した。4μLの活性化カクテルを、コーティングされた管において36μLの全血に添加した。反応を含有する管を、T2MRリーダーに置いた。T2MR緩和曲線データを、逆ラプラス変換アルゴリズムで処理した。図39に示すように、サンプルは、TRAPの全範囲にわたって反応性である。試験した濃度範囲にわたって、血餅収縮のタイミングへの用量依存性はなかった。
本明細書に言及する全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各独立の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別的に示されているのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (55)
- 第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法であって、
(i)前記血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと、
(ii)第1の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、前記測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の値を有する1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられるステップと、
(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、強固に結合している血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
を含む、方法。 - 第1の血液サンプルが、多血小板血漿サンプル、全血サンプル、又は凝固血サンプルである、請求項1に記載の方法。
- ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、フィブリノーゲンを添加する、請求項1又は2に記載の方法。
- ステップ(i)の前又は後に、第1の血液サンプルに、凝固開始剤又は凝固阻害剤を添加する、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の血液サンプルに、RF、AA、ADP、CK、TRAP、エピネフリン、コラーゲン、組織因子、セライト、エラグ酸、及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する、又は第1の血液サンプルに、血小板凝集阻害剤である凝固阻害剤を添加する、又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、アプロチニン、アブシキシマブ(レオプロ)、又はサイトカラシン-Dを添加する、請求項4に記載の方法。
- (iv)前記対象からの第2の血液サンプル中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと、
(v)第2の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、第2の緩和率測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられ、各磁気共鳴パラメータが、1つ以上の値を有するステップと、
(vi)ステップ(ii)及びステップ(v)の結果に基づいて、強固に結合している血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
をさらに含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。 - 第1の血液サンプルが血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである;第1の血液サンプルが多血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである;第1の血液サンプルが乏血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである;又は第1の血液サンプルが単離及び洗浄した血小板を含み、第2の血液サンプルが全血サンプルである、請求項6に記載の方法。
- ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板阻害剤を添加し、血小板阻害剤を第2の血液サンプルに添加しない;又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板活性化因子を添加し、血小板活性化因子を第2の血液サンプルに添加しない;又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに組織因子、セライト、エラグ酸、RF、AA、及びCKから選択される凝固開始剤を添加し、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルにADP及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する;又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加し、ステップ(iv)の前に第2の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加する、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記磁気共鳴パラメータ値が、前記血液サンプル中の強固な血餅関連水分子に特有である、又は前記2つ以上の別個の水集団の少なくとも1つが、強固に結合している血餅の存在と正に相関する、又は前記アルゴリズムが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、及び非負最小二乗アルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含む、又は前記緩和率が、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho、及びT2 *からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上の水集団が、血清関連T2シグナルを有する水集団及び強固に結合している血餅関連T2シグナルを有する水集団を含む、請求項9に記載の方法。
- 強固に結合している血餅関連T2シグナルを有する前記水集団が、40から250msの範囲のT2緩和率によって特徴づけられる、又は前記2つ以上の水集団が、血餅関連T2シグナルを有する水集団をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記緩和率測定がT2測定を含み、前記測定が減衰曲線を提供する、請求項9に記載の方法。
- 前記凝固又は溶解プロセスの開始後の所定の時点でのT2緩和スペクトルを、前記減衰曲線から計算するステップをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後、(a)前記プロセス中の前記血液サンプルに関する複数の緩和率測定を行って、複数の減衰曲線を作成するステップと、(b)複数のT2緩和スペクトルを前記複数の減衰曲線から計算するステップとをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後の時間の関数としての前記血液サンプル中の2つ以上の水集団に関する(a)T2緩和時間の変化と、(b) T2シグナル強度の変化とを示す3次元データセットを、前記複数のT2緩和スペクトルから計算するステップをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 第1の血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスをモニタリングする方法であって、
(i)血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管における前記血液サンプル中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップと、
(ii)第1の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、前記測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の値を有する1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられるステップと、
(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
を含み、
サンプル管の内部表面がフィブリン接着を制御する、方法。 - 内部表面が、フッ素化材料、PEG化材料、又はコーティングされていない基材と比較してフィブリン接着を減少させる材料でコーティングされた基材を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記基材が、ガラス又はベースポリマーである、請求項17に記載の方法。
- 前記基材が、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、及びポリアロマーから選択されるベースポリマーである、又は前記基材が、シラン処理されていないガラスと比較してフィブリン接着を減少させる材料でのシラン処理によってコーティングされたガラスである、請求項18に記載の方法。
- 前記材料が、界面活性剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリエチレングリコール、フッ素化材料、炭水化物、又はそれらの混合物を含む、請求項17から19のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の血液サンプルが、血漿サンプル、乏血小板血漿サンプル、多血小板血漿サンプル、全血サンプル、凝固血サンプルである、又は第1の血液サンプルが、単離及び洗浄した血小板を含む、又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、フィブリノーゲンを添加する、又はステップ(i)の前又は後に、第1の血液サンプルに、凝固開始剤又は凝固阻害剤を添加する、請求項16から20のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の血液サンプルに、RF、AA、ADP、CK、TRAP、エピネフリン、コラーゲン、組織因子、セライト、エラグ酸、及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する、又は第1の血液サンプルに、血小板凝集阻害剤である凝固阻害剤を添加する、又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)を添加する、請求項21に記載の方法。
- (iv)前記対象からの第2の血液サンプル中の水の一連の第2の緩和率測定を行うステップと、
(v)第2の血液サンプル内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、第2の緩和率測定値を変換するステップであり、各別個の水集団が、1つ以上の磁気共鳴パラメータによって特徴づけられ、各磁気共鳴パラメータが、1つ以上の値を有するステップと、
(vi)ステップ(ii)及びステップ(v)の結果に基づいて、血餅が、前記プロセス中に形成又は溶解したかどうかを決定するステップと
をさらに含む、請求項16から22のいずれか1項に記載の方法。 - 第1の血液サンプルが血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである;第1の血液サンプルが多血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである;第1の血液サンプルが乏血小板血漿サンプルであり、第2の血液サンプルが全血サンプルである;又は第1の血液サンプルが単離及び洗浄した血小板を含み、第2の血液サンプルが全血サンプルである;又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板阻害剤を添加し、血小板阻害剤を第2の血液サンプルに添加しない;又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに血小板活性化因子を添加し、血小板活性化因子を第2の血液サンプルに添加しない;又はステップ(i)の前に、第1の血液サンプルに組織因子、セライト、エラグ酸、RF、AA、及びCKから選択される凝固開始剤を添加し、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルにADP及びトロンビンから選択される凝固開始剤を添加する、請求項23に記載の方法。
- ステップ(i)の前に、第1の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加し、ステップ(iv)の前に、第2の血液サンプルにフィブリノーゲンを添加する;又は前記磁気共鳴パラメータ値が、前記血液サンプル中の血液血餅関連水分子に特有である;又は前記2つ以上の別個の水集団の少なくとも1つが、血餅の存在と正に相関する;又は前記アルゴリズムが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、及び非負最小二乗アルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含む;又は前記緩和率が、T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho、及びT2 *からなる群から選択される、請求項23又は24に記載の方法。
- 前記2つ以上の水集団が、血清関連T2シグナルを有する水集団及び血餅関連T2シグナルを有する水集団を含む、又は前記2つ以上の水集団が、血餅関連T2シグナルを有する水集団をさらに含む、又は前記緩和率測定がT2測定を含み、かつ前記測定が減衰曲線を提供する、請求項25に記載の方法。
- 前記凝固又は溶解プロセスの開始後の所定の時点でのT2緩和スペクトルを、前記減衰曲線から計算するステップをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後、(a)前記プロセス中の前記血液サンプルに関する複数の緩和率測定を行い、複数の減衰曲線を作成するステップと、(b)複数のT2緩和スペクトルを、前記複数の減衰曲線から計算するステップとをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記血液サンプル中の凝固又は溶解プロセスの開始後の時間の関数としての前記血液サンプル中の2つ以上の水集団に関するa)T2緩和時間の変化と、(b) T2シグナル強度の変化とを示す3次元データセットを、前記複数のT2緩和スペクトルから計算するステップをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- (i)前記血液サンプルに関するADP濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(ii)部分的な血餅形成を生じるADP濃度を決定するステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとをさらに含む、請求項16から29のいずれか1項に記載の方法。
- (i)前記血液サンプルに関するAA濃度の関数としての血餅形成を測定するステップと、(ii)部分的な血餅形成を生じるAA濃度を決定するステップと、(iii)ステップ(ii)の結果に基づいて、対象が正常であるか、出血性状態を有するか、又は血栓形成促進性状態を有するかどうかを決定するステップとをさらに含む、請求項16から29のいずれか1項に記載の方法。
- 血液サンプル中の凝固プロセスをモニタリングする方法であって、(a)凝固開始剤を、血液サンプルと接触している内部表面を有するサンプル管における前記血液サンプルに添加するステップと、(b)血餅が、前記プロセス中に形成したかどうかを決定するステップとを含み、サンプル管の内部表面が、フィブリン接着を制御する、方法。
- ステップ(b)が、核磁気共鳴、光学的、トロンボエラストグラフィー、ターボデンシトメトリー、発色性、免疫性、比濁法、比濁分析、凝集、インピーダンス、機械的血餅検出、血小板凝集、電気化学的検出、凝固時間、フォトメカニカル、及び/又は電気機械的測定を含む、請求項32に記載の方法。
- ステップ(b)が、T2磁気共鳴測定を含む、請求項33に記載の方法。
- フィブリン接着を制御する内部表面を有するサンプル管。
- 内部表面が、フッ素化材料を含む、又は内部表面が、PEG化材料を含む、又は内部表面が、コーティングされていない基材と比較してフィブリン接着を減少させる材料でコーティングされた基材を含む、請求項35に記載のサンプル管。
- 前記基材が、ガラス又はベースポリマーである、請求項36に記載のサンプル管。
- 前記基材が、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、及びポリアロマーから選択されるベースポリマーである、又は前記基材が、シラン処理されていないガラスと比較してフィブリン接着を減少させる材料でのシラン処理によってコーティングされたガラスである、請求項37に記載のサンプル管。
- 前記材料が、界面活性剤、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリエチレングリコール、フッ素化材料、炭水化物、又はそれらの混合物を含む、請求項35から38のいずれか1項に記載のサンプル管。
- 前記サンプル管が、50μLから2mLの最大容量を保持する、請求項35から39のいずれか1項に記載のサンプル管。
- (i)閉鎖部分と、(ii)縦軸及び該縦軸を概ね取り囲む壁を有する本体部分であって、そこを通してサンプルを分注することができる開口部を有する頭部分を備える本体部分とを含む、請求項35から39のいずれか1項に記載のサンプル管。
- 前記開口部が、約1cm未満の内径を有する、又は前記壁が、約0.05から約0.75mmの厚さを有する、又は前記サンプル管が、前記開口部の遠位にある閉鎖された端であって、前記開口部の前記内径の60%未満である幅までだんだんと細くなっている前記閉鎖された端を含む、請求項41に記載のサンプル管。
- 血液サンプルを、永久磁石及びRFパルスシーケンスを使用して生み出されたバイアス磁界に曝露することによって生成されるシグナルを検出するように構成されたRFコイルをさらに含む、請求項35から42のいずれか1項に記載のサンプル管。
- RFコイルにおける又はRFコイルとの電気通信における可融性連結であって、可融性連結に過電流を印加した後に壊れ、RFコイルを動作不能にするように構成された可融性連結をさらに含む、請求項43に記載のサンプル管。
- (a)血液サンプルを保持するためのウェルを規定し、使い捨てのサンプル管内に含有されウェルのあたりに配置されたRFコイルを有する使い捨てのサンプル管であり、前記RFコイルが、永久磁石及びRFパルスシーケンスを使用して生み出されたバイアス磁界に血液サンプルを曝露することによって生成されたシグナルを検出するように構成され、使い捨てのサンプルホルダーが1つ以上の可融性連結を含む、使い捨てのサンプル管と、
(b)(b1)磁界を規定する永久磁石と、(b2)RFパルスシーケンス及び検出コイルと、(b3)RFコイルと連通している1つ以上の電気素子であり、シグナルを増幅する、整流する、伝達する、及び/又はデジタル化するように構成された電気素子と、(b4)可融性連結と連通しており、過電流を可融性連結に印加するように構成され、所定の耐用年数後に連結を壊し、コイルを動作不能にする1つ以上の電気素子とを含むMRリーダーと
を備えたシステムであって、使い捨てのサンプル管が、請求項59から74のいずれか1項に記載のサンプル管である、システム。 - RFコイルと連通している電気素子が、RFコイルに誘導結合している、請求項45に記載のシステム。
- 対象からの血液サンプルを評価する方法であって、
(i)血液サンプルの1つ以上のアリコート中の水の一連の磁気共鳴緩和率測定を行うステップであり、1つ以上のアリコートの少なくとも1つが、凝固開始剤と組み合わされているステップと、
(ii)血液サンプルの1つ以上のアリコート内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムを使用して、前記測定値を変換するステップと、
(iii)以下の測定:(a)血液サンプルに関するヘマトクリットの測定と、(b)血液サンプルに関するフィブリノーゲンレベルの測定と、(c)血液サンプルに関する凝固時間の測定と、(d)血液サンプルの血小板活性の測定であり、血液サンプル中の強固に結合している血餅の形成のモニタリングを含む測定、を行うステップと
を含む、方法。 - 前記アルゴリズムが、多指数関数アルゴリズム、双指数関数アルゴリズム、三指数関数アルゴリズム、減衰指数関数アルゴリズム、ラプラス変換、逆ラプラス変換、適合度アルゴリズム、SSEアルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、及び非負最小二乗アルゴリズムからなる群から選択されるアルゴリズムを含む、請求項47に記載の方法。
- 血液サンプルの1つ以上のアリコート内の2つ以上の別個の水集団を識別するアルゴリズムが、多指数関数又は逆ラプラス変換分析を含む、請求項48に記載の方法。
- 複数の測定値が、血液サンプルの複数のアリコートから同時に収集される、又は複数の測定値が、血液サンプルの複数のアリコートから連続して収集される、又は複数の測定値が、血液サンプルへの凝固開始剤の添加前及び後に作られた血液サンプルの単一のアリコートから収集される、請求項47に記載の方法。
- ステップ(iii)の結果に基づいて、対象における凝固障害を診断するステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記凝固障害が、希釈性凝固障害、ショックの致死的三徴、アシドーシス及び低体温症、並びに外傷ショックの急性凝固障害(ACoTS)から選択される、請求項51に記載の方法。
- ステップ(iii)の結果に基づいて、対象が、凝固亢進、凝固低下、又は正常であるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(iii)の結果に基づいて、対象が、血栓性合併症のリスクがあるか、又は対象が、抗血小板療法に抵抗性があるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(iii)の結果に基づいて、対象における抗血小板療法をモニタリングする及び/又は凝血促進療法をモニタリングするステップをさらに含む、請求項47から50のいずれか1項に記載の方法。
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