CN103290042A - 内毒素检测及去除关键分子中国鲎c因子克隆和序列分析 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域,具体是一种用于内毒素检测和去除的丝氨酸蛋白酶原-中国鲎C因子(Factor C from Tachypleus tridentatus)编码基因的制备方法和序列特异性位点比对分析。具体为具有序列表SEQ ID NO.1中的核酸碱基序列,同时中国鲎C因子基因编码的蛋白具有SEQ ID NO.2中的氨基酸序列。本发明的制备方法包括中国鲎血细胞的总RNA抽提,用RT-PCR(逆转录PCR)的方法得到中国鲎C因子的cDNA,并设计一对引物,用PCR的方法扩增了中国鲎血细胞中编码C因子蛋白的基因序列,并对其核酸、蛋白序列与美国鲎C因子进行了序列特异性位点比对分析。本发明可用于构建中国鲎C因子的表达载体,用于中国鲎C因子重组蛋白的表达。
Description
技术领域:
本发明涉及生物工程领域,具体是指中国鲎C因子基因的克隆和序列特异性位点分析。
背景技术:
临床输液反应以热原反应危害最大,发生率最高。内毒素(即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子,lipopolysaccharide,LPS)是研究最透彻也是最常见的生物热原,同时更是各大药厂必须面对的难题,因为注射时即使是pg级别的痕量LPS,也会导致病人严重的热原反应。因此,灵敏可靠的内毒素诊断技术是非常必须的。
海鲎的阿米巴样细胞(amoebocytes)对LPS具有超强敏感性,在革兰氏阴性细菌入侵时,它能通过一系列的酶促反应,对外来入侵的细菌产生级联凝集反应,使入侵的微生物失效(1,2)。这一过程(如图1所示)包括酶原状态的C因子(Factor C)识别并结合内毒素而被激活,变成活性酶的状态后,将下游的B因子激活,活化的B因子将凝固酶原转化为凝固酶,凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白,凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶(3,4)。
利用海鲎血液阿米巴样细胞溶解物制成的鲎试剂,能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素。自上世纪70年代中期,这一内毒素测试方法开始用于医药领域,并且很快被世界各国广泛采用,中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法。经过几十年的发展和改良,鲎试剂内毒素检测法已应用于制药、医疗器械、非内服制剂、医药制品、生物制剂、水质、食品检测以及科研等各大领域(5)。
目前世界上仅有四种海鲎,即美国鲎(Limulus polyphemus),中国鲎(Tachypleus tridentatus),马来鲎(Tachypleus gigas)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)。而能够用于鲎试剂生产的仅有美国鲎和中国鲎两种,对应的鲎试剂分别称之为LAL(Limulus amoebocyte lysate)和TAL(Tachypleus Amebocyte Lysate),二者反应原理及功效相同,但也存在理化特性的差别,如与内毒素反应的最适pH值等(6)。
虽然鲎试剂检测法(LAL/TAL)具有高灵敏度(可检测飞克级内毒素)、快速等优点,但是由于采用成分复杂的细胞裂解物作为反应原料,同样具有无法克服的缺陷。比如,非特异性干扰问题:如图1所示,鲎试剂除了能与内毒素反应外,还会与(1-3)-β-D-葡聚糖反应(1)。(1-3)-β-D-葡聚糖是在真菌、酵母、蘑菇、高等植物中广泛存在的一种多糖,是构成细胞壁的结构大分子。因此鲎试剂检测过程中很容易遇到(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性干扰,造成假阳性结果,这对于成分复杂的药物,尤其是中药,是一个很大的检测挑战(7)。再比如,批次稳定性问题:鲎试剂采用海鲎血液作为生产原料,由于季节、地域等差异,使得鲎试剂的 批次差异成为常见现象。而且,由于环境污染、过度捕捞等原因海鲎的种群数量近年来急剧减少,接近灭绝(8),使得生产鲎试剂的原材料面临日益匮乏的危险。
鲎试剂的主要成分是一系列的丝氨酸蛋白酶原(9,10),其中C因子在内毒素检测方法中是关键分子,在内毒素介导的鲎血凝集反应***中,它特异性识别内毒素,并第一个被内毒素激活,从而启动整个鲎血细胞中的凝集级联反应(11,12)。因此,以鲎试剂的关键分子C因子作为基础,利用其识别并结合内毒素后,由蛋白酶原被激活为活性酶形式,从而能够水解发光底物的特点,结合化学/荧光发光定量技术,可以发展出以C因子作为单一成分的内毒素检测定量技术(13),与传统的LAL测定技术比较,重组C因子在相同的分析条件下对内毒素具有更低的背景、更高的灵敏度(14)。
基于C因子的内毒素检测技术成分单一,可以使用生物工程技术进行生产和严格的质量控制,从而避免了由原材料引起的批次不稳定性,同时保护了海鲎这一古老的“活化石”物种。尤为重要的是,这一新技术消除了传统鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性反应,可以大大增强内毒素检测的特异性,降低“假阳性”结果的发生概率。此外,通过与内毒素的特异结合,重组C因子还可以进一步应用于医药产品、生物制品等内毒素去除。综上,用分子生物学手段克隆C因子基因以应用于内毒素检测试剂的产品开发,具有重要的临床意义和巨大的商业价值。
参考文献:
1.Iwanaga,S.(1993)Curr Opin Immunol 5,74-82
2.Muta,T.,and Iwanaga,S.(1996)Curr Opin Immunol 8,41-47
3.Ding,J.L.,and Ho,B.(2001)Trends Biotechnol 19,277-281
4.Iwanaga,S.,and Lee,B.L.(2005)J Biochem Mol Biol 38,128-150
5.Novitsky,T.J.(1994)J.Endotoxin Res 1,253-263
6.高国政,颜锦.(1998)中国药学杂志33(3),162
7.霍启录,邵红霞.(2003)中国中药杂志28(03),199-201
8.Widener,J.W.,and Barlow,R.B.(1999)Biol Bull 197,300-302
9.Muta,T.,and Iwanaga,S.(1996)Curr Opin Immunol 8,41-47
10.Iwanaga,S.(1993)Curr Opin Immunol 5,74-82
11.Nakamura,T.,Morita,T.,and Iwanaga,S.(1986)Eur J Biochem 154,511-521
12.Iwanaga,S.,Miyata,T.,Tokunaga,F.,and Muta,T.(1992)Thromb Res 68,1-32
13.Ding,J.L.,and Ho,B.(2010)Subcell Biochem 53,187-208
14.Ding,J.L.,and Ho,B.(2001)Trends Biotechnol 19,277-281
发明内容:
本发明主要是克隆了内毒素识别和去除的关键分子--中国鲎C因子的cDNA,并对其进行了序列特异性位点比对分析。因为鲎试剂的产量及批次稳定性均受原材料海鲎的限制,而且本身固有的非特异性缺陷,使得用分子克隆的方法得到C因子就很有必要。现在的发明主要是通过RT-PCR的方法克隆了中国鲎C因子的cDNA,并对其基因序列和蛋白序列与美国鲎进行了位点特异性分析,为进一步研究、开发中国鲎C因子的内毒素检测技术奠定了基础。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:制备中国鲎C因子基因:具有序列表SEQ IDNO.1中核酸碱基序列。制备中国鲎C因子基因编码的蛋白质具有:具有序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列。
中国鲎FC基因的克隆:通过RNA抽提得到中国鲎C因子的血细胞总RNA;以此总RNA为模板,用合成的单链多聚T引物,通过逆转录反应扩征C因子的总cDNA;以此鲎血细胞总cDNA为模板,以合成的正反向引物,通过聚合酶链式反应,即扩增得到具有序列表EQ ID NO.1中的碱基序列的中国鲎C因子基因。其中采用的引物为:
F:5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’
R:5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’
通过PCR反应扩增得到具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
本发明具有以下优点:
1.本发明采用RT-PCR的方法克隆了中国鲎C因子的完整基因序列。
2.本发明对中国鲎C因子的核酸碱基序列及氨基酸序列与美国鲎C因子进行了位点特异
性分析,发现了二者之间存在的多处核酸碱基及氨基酸位点差异。
附图说明:
下面结合附图和实施例对本专利进行进一步说明。
图1是鲎血细胞变形裂解物形成凝胶的原理。内毒素直接激活C因子,从而启动凝集级联反应。虚线箭头表明(1-3)β-葡聚糖也可以激活凝固酶原,引起非特异性反应。
图2是克隆中国鲎C因子基因的流程图。利用RT-PCR的方法经特异性引物扩增后得到全长的C因子基因。
图3是RT-PCR扩增得到的鲎血细胞C因子基因产物的琼脂糖凝胶电泳图,1和2为总cDNA稀释5倍后作为模板扩增后得到的条带;m为核酸分子量标签,自上到下分别为5kb,3kb,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp,100bp;3和4为总cDNA稀释10倍后作为模板扩增得到的条带。箭头所指为目的条带。
图4是中国鲎C因子测序后得到的核酸序列(即中国鲎C因子的基因序列),一共为3057 个碱基。□为与报道的美洲鲎C因子序列有差别的核酸碱基位点。下划线所示分别为与正向和反向引物配对的序列。 图4-1为图4的缩略图。
图5是中国鲎C因子基因的酶切位点分布图谱。
图6是中国鲎C因子的蛋白质序列。□为与报道的美洲鲎C因子序列有差别的氨基酸残基位点。
具体实施方式:
实施方式1抽提中国鲎血细胞的总RNA。
将中国鲎从关节穿刺取血,同时加入10mmol/L咖啡因防止血凝集。在4℃,4000rpm离心10min收集血细胞。鲎血细胞总RNA的抽提如下进行:
1)取细胞沉淀(~60mm dish细胞量),加入1ml Trizol,室温放置5min,使细胞充***解;
2)加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀后室温放置5min,使其自然分相;
3)4℃,12000rpm离心15min,样品分三层,将上层水相小心吸出300μl转移至新的EP管中,加入等体积的异丙醇,混匀后室温静置10min;
4)4℃,12000rpm离心15min,弃上清,RNA沉淀于管底;
5)往RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇,温和振荡离心管。4℃,12000rpm离心5min,弃上清,短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,室温放置5min,晾干沉淀;
6)加入适量(20μl)RNase Free水,充分溶解RNA;
7)溶解的RNA取2μl稀释20倍后测浓度,测得浓度为195ng/μl,储液为3.9μg/μl,用RNase Free水稀释至2μg/μl,放-70℃保存。
实施方式2逆转录PCR(RT-PCR)得到鲎血细胞的总cDNA。
1)在EP管中配制下列模板RNA/引物混合物
2)70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min;
3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于管底;
4)在上述EP管中配制下列反转录反应液:
5)42℃保温1hr;
6)70℃保温15min后冰上冷却,得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
实施方式3PCR扩增中国鲎血细胞C因子的DNA序列。
参考相关文献报道的鲎C因子基因序列设计一对特异性引物,以中国鲎血细胞总cDNA为模板,PCR扩增C因子的DNA序列。其中设计的正向引物为5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTTTT-3’,设计的反向引物为5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’。以反转录得到的cDNA为模板,用Prime Star为聚合酶,进行PCR反应(参见TakaRa公司Prime Star说明书)。50μl体系:
PCR扩增程序如下:
PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳条件为:120V电泳30分钟,再80V电泳至溴酚蓝条带至凝胶边缘,停止电泳。凝胶成像,得到的条带大于3kb,小于5kb,为单一条带。将条带割下,用胶回收试剂盒回收(参见生工公司胶回收试剂盒说明书)。PCR条带割胶回收后,合成几条测序引物,进行全长测序。通过PCR扩增后的中国鲎C因子cDNA序列经过分段测序序列拼接,得到全长FC基因序列。
Claims (5)
1.一种中国鲎C因子基因,其特征在于:由SEQ ID NO.1核酸碱基序列表所示,其中序列由3057bp组成。
2.一种按权利要求1中国鲎C因子基因,其特征在于:基因编码的蛋白具有SEQ IDNo.2中氨基酸序列。
3.一种按权利要求1所述的C因子基因的制备方法,其特征在于:
a)通过RNA抽提得到中国鲎C因子的血细胞总RNA:
将中国鲎从关节穿刺取血,同时加入10mmol/L咖啡因防止血凝集;在4℃,4000rpm离心10min收集血细胞;鲎血细胞总RNA的抽提如下进行:取细胞沉淀,加入1mlTrizol,室温放置5min,使细胞充***解;加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀后室温放置5min,使其自然分相;4℃,12000rpm离心15min,样品分三层,将上层水相(300μl)转移至新的EP管中,加入等体积的异丙醇,混匀后室温静置10min;4℃,12000rpm离心15min,弃上清,RNA沉淀于管底;往RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇,温和振荡离心管;4℃,12000rpm离心5min,弃上清,短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,室温放置5min,晾干沉淀;加入适量(20μl)RNase Free水,充分溶解RNA;溶解的RNA取2μl稀释20倍后测浓度,用RNase Free水稀释至2μg/μl;
b)以a中的总RNA为模板,用合成的单链Oligo(dT)引物,通过逆转录反应扩增中国鲎血细胞的总cDNA;
c)以此鲎血细胞总cDNA为模板克隆中国鲎C因子全长基因。
4.按权利要求3所述的中国鲎C因子基因的克隆,其特征在于:
采用引物
F:5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’
R:5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’
以中国鲎血细胞总cDNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增得到具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
5.按权利要求4中所述的FC基因的制备方法,其特征在于聚合酶链式反应的PCR体系:
F:100pmol,R:100pmol,dNTP:各50pmol,5×Prime star DNA聚合酶buffer:10μl,Prime star DNA聚合酶:2-5U,无菌水补足50μl;
PCR反应条件:将上述PCR反应体系混匀,第一阶段95℃预变性3min;第二阶段95℃,1min;54℃,1min;72℃,3min20s;,共进行30个循环;第三阶段72℃延伸10min。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5858706A (en) * | 1994-08-19 | 1999-01-12 | National University Of Singapore | Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor C in eukaryotes |
US6645724B1 (en) * | 1997-09-19 | 2003-11-11 | National University Of Singapore | Assays for endotoxin |
CN1529711A (zh) * | 2001-06-28 | 2004-09-15 | ά | 检测内毒素的方法和试剂 |
-
2012
- 2012-02-27 CN CN2012100461418A patent/CN103290042A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5858706A (en) * | 1994-08-19 | 1999-01-12 | National University Of Singapore | Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor C in eukaryotes |
US6645724B1 (en) * | 1997-09-19 | 2003-11-11 | National University Of Singapore | Assays for endotoxin |
CN1529711A (zh) * | 2001-06-28 | 2004-09-15 | ά | 检测内毒素的方法和试剂 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
MUTA,T. ET AL: "GenBank: D90271.1", 《NCBI GENBANK》, 7 December 2007 (2007-12-07) * |
TATSUSHI MUTA ET AL: "Limulus factor C. An endotoxin-sensitive serine protease zymogen with a mosaic structure of complement-like, epidermal growth factor-like, and lectin-like domains", 《THEJO URNAL OF BIOLOGICCAHLE MISTRY》, vol. 266, no. 10, 31 December 1991 (1991-12-31), pages 2 * |
WANG,D.N. ET AL: "GenBank: AF467804.1", 《NCBI GENBANK》, 6 February 2002 (2002-02-06) * |
王东宁 等: "东方鲎C因子的分段克隆及表达", 《生物化学与生物物理学报》, vol. 34, no. 1, 31 December 2002 (2002-12-31) * |
魏京广 等: "鲎C 因子的研究进展", 《安徽农业科学》, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 639 - 640 * |
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