CN114317787A

CN114317787A - 吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法

Info

Publication number: CN114317787A
Application number: CN202111643015.6A
Authority: CN
Inventors: 李建; 赵琦; 赵锋; 詹文瑶; 李之琦; 肖雪怡; 李锐
Original assignee: Chengdu University
Current assignee: Chengdu University
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-04-12
Also published as: CN116287139A

Abstract

本发明涉及一种吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法。所述吸附磁珠选自Ni‑聚甲基丙烯酸酯磁珠，所述Ni‑聚甲基丙烯酸酯磁珠通过His‑tag标签序列与Amidase 3‑CBD蛋白相连。该吸附磁珠可特异性结合金黄色葡萄球菌，对样本中的金黄色葡萄球菌进行捕获，方便后续获取和/或检测样本中的金黄色葡萄球菌。

Description

吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法。

背景技术

近年来，因食用被有害细菌污染的食物而导致的食源性疾病暴发急剧增加，检测食品中的有害细菌已成为预防食品安全和保护公众健康相关的重要因素。金黄色葡萄球菌为最常见的食源性病原菌之一，它能够产生肠毒素，引起食物中毒。食物中毒一直是困扰一些偏远地区的严重问题，传统的方法，如平板计数和聚合酶链式反应，既耗时又依赖于仪器，严重限制了偏远地区食源性病原菌的快速检测。

因此，需要开发快速检测且方便使用的产品或方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法，该吸附磁珠可特异性结合金黄色葡萄球菌，对样本中的金黄色葡萄球菌进行捕获，方便后续获取和/或检测样本中的金黄色葡萄球菌。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

现如今开发了几种快速检测和鉴定食品样品中金黄色葡萄球菌的方法，如聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫传感器以及基于核酸的分子生物学方法，这些先进的微生物检测方法将检测时间从几天缩短到几个小时，但仍然存在一些局限性，例如，这些方法通常价格昂贵，需要高科技实验室设备和熟练的技术人员，并且不能用作现场检测方法。此外，在偏远地区，实验设备的缺乏严重的限制了食源性疾病的检测。

噬菌体是一种具有宿主特异性和裂解性的细菌病毒，内溶素是在噬菌体裂解周期后期合成的细菌细胞壁肽聚糖水解酶，介导宿主细胞的裂解和后代噬菌体的释放，通常由两个模块结构域：N端催化结构域(EAD)和C端细胞壁结合结构域(CBD)组成。内溶素的CBD负责通过碳水化合物配体的非共价结合将水解酶连接到细菌细胞壁中的特定底物上。据报道，一个细菌细胞上的CBD结合位点的数量可以达到10⁷或更多。

基于此，发明人采用带有Amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠，其可以结合待测样本中的金黄色葡萄球菌，从而达到捕获金黄色葡萄球菌的目的，其相对于传统的检测方法，可减少对待测样本中金黄色葡萄球菌的扩增培养步骤，并且具有操作简单和节省检测时间等优点。进一步地，将上述培养液和金黄色葡萄球菌噬菌体的内溶素(endolysin)通过水煮对培养液中的金黄色葡萄球菌的基因组进行提取，该内溶素能特异性裂解金黄色葡萄球菌细胞壁，导致金黄色葡萄球菌胞内物质释放，从而可以极大提升金黄色葡萄球菌基因组的提取量。然后通过重组酶聚合酶扩增(RPA)和cas12/crRNA切割机制，对提取的基因组进行扩增和鉴定，进而只需采用紫外灯照射器即可实现鉴定。采用上述方法对金黄色葡萄球菌的检测，其特异性强和敏感性高，检测灵敏度可达10¹CFU/mL，优于常规的10²CFU/mL的灵敏度，并且具有超灵敏、快速、直观检测食源性病原菌等优点，该方法对金黄色葡萄球菌的检测不依赖实验仪器，对于控制食源性疾病爆发具有重要意义。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种吸附磁珠。根据本发明的实施例，所述吸附磁珠选自Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠通过His-tag标签序列与Amidase 3-CBD蛋白相连。

发明人经过大量实验发现，Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的Ni离子可以与Amidase 3-CBD蛋白所带有的His-tag标签序列结合，形成带有Amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠，即为吸附磁珠。并且发明人还发现，该吸附磁珠中的Amidase 3-CBD蛋白可特异性结合金黄色葡萄球菌，将该吸附磁珠加入到样本中，其可特异性捕获金黄色葡萄球菌，以便实现金黄色葡萄球菌的捕获和富集，有助于后续对其进行检测，减少菌种培养步骤，缩短检测时间，提高检测效率。并且，发明人经过试验发现，Amidase 3-CBD蛋白对金黄色葡萄球菌的捕获效果优于CBD蛋白对金黄色葡萄球菌的捕获效果。

根据本发明的实施例，所述Amidase 3-CBD蛋白上连接有荧光基团，优选EGFP基团。由此，有助于蛋白的追踪。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠；具有His-tag标签序列的Amidase 3-CBD蛋白。

发明人经过大量实验发现，Amidase 3-CBD蛋白可特异性结合金黄色葡萄球菌，将试剂盒中的Ni-NTA磁珠和具有His-tag标签序列的Amidase 3-CBD蛋白接触，Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的Ni离子可以与Amidase 3-CBD蛋白所带有的His-tag标签序列结合，形成带有Amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠。该吸附磁珠可特异性捕获金黄色葡萄球菌，以便分离获取金黄色葡萄球菌，有助于进一步对金黄色葡萄球菌进行检测，提高检测效率。并且，发明人经过试验发现，Amidase 3-CBD蛋白对金黄色葡萄球菌的捕获效果优于CBD蛋白对金黄色葡萄球菌的捕获效果。

根据本发明的实施例，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠与Amidase 3-CBD蛋白是以Ni和His-tag标签序列相结合的方式提供的。

需要说明的是，本发明试剂盒中Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和具有His-tag标签序列的Amidase 3-CBD蛋白的提供方式不做严格限定，既可以单独提供，待使用时，将两者接触，从而实现两者的结合；也可以直接以偶联物的形式提供，即，Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠与Amidase 3-CBD蛋白是以Ni和His-tag标签序列相结合，也即是以前述的吸附磁珠的形式提供。待使用时，直接将该偶联物与样本接触，实现捕获目的。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种上述吸附磁珠或上述试剂盒在检测金黄色葡萄球菌中的应用。如前所述，利用前述吸附磁珠或试剂盒可特异性结合金黄色葡萄球菌，从而实现金黄色葡萄球菌的捕获和富集，因此无需对其进行菌种培养，简化检测步骤和时间，提高检测效率。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种检测金黄色葡萄球菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：步骤1：采用上述吸附磁珠或上述试剂盒处理待测样本，得到含有所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的处理液；步骤2：将所述富集菌液进行DNA提取处理，得到提取产物；步骤3：将所述提取产物进行扩增处理，得到扩增产物；步骤4：将所述扩增产物进行检测，以便检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌。如前所述，利用前述吸附磁珠或试剂盒可特异性结合金黄色葡萄球菌，从而实现金黄色葡萄球菌的捕获和富集，因此无需对其进行菌种培养，简化检测步骤和时间，提高检测效率。

根据本发明的实施例，步骤1进一步包括：将所述吸附磁珠或预先相连的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和具有His-tag标签序列的Amidase 3-CBD蛋白与所述待测样本进行混合并反应，得到所述处理液。由此，可实现对待测样本中金黄色葡萄球菌的捕获。

根据本发明的实施例，所述反应的温度为2-30℃。由此，可提高吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获效率。

根据本发明的实施例，所述反应的pH值为5-9。由此，可提高吸附磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获效率。

根据本发明的实施例，所述反应前加入NaCl，所述NaCl的终浓度为50-200mM。由此，吸附磁珠上的Amidase 3-CBD蛋白与金黄色葡萄球菌的结合效果较佳；并且，发明人经过试验发现，随着NaCl浓度的增高，蛋白与金黄色葡萄球菌的结合效果不断减弱。

根据本发明的实施例，所述DNA提取处理包括：将所述处理液与内溶素进行水煮。发明人经过大量试验发现，内溶素能特异性裂解金黄色葡萄球菌细胞壁，导致金黄色葡萄球菌胞内物质释放，然后通过水煮即可对金黄色葡萄球菌中的DNA进行提取，并可极大提升金黄色葡萄球菌DNA的提取量，具有缩短提取时间、方便操作、提取量大等优点。

根据本发明的实施例，所述水煮之前，将所述内溶素和所述处理液反应20-40min。由此，可充***解金黄色葡萄球菌细胞壁，提高对金黄色葡萄球菌DNA的提取量。

根据本发明的实施例，所述水煮的时间为5-20min。由此，金黄色葡萄球菌DNA的提取效果较佳。

根据本发明的实施例，所述内溶素和所述待测样本的体积比为1：(40-60)，其中，所述内溶素的浓度为1-3mg/ml。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，金黄色葡萄球菌DNA的提取效果较佳。

需要说明的是，待测样本在采用上述吸附磁珠或上述试剂盒处理之前可预先进行前处理，前处理包括但不限于稀释处理和去杂处理，具体方式不受限制。

根据本发明的实施例，所述扩增处理是采用重组酶聚合酶扩增方法进行的。由此，采用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，简称RPA)方法可在低温恒温下工作，不需要模板的热变性，无需使用仪器，具有操作简单等优点。具体地，本发明对于重组酶聚合酶扩增方法的具体步骤和所需试剂不做严格限定，可以采用本领域常规手段获得。

根据本发明的实施例，所述检测包括：将所述扩增产物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQreporter进行反应；所述反应产生可检测的荧光信号，是所述待测样本中含有金黄色葡萄球菌的指示；所述反应不产生可检测的荧光信号，是所述待测样本中不含有金黄色葡萄球菌的指示。其中，Cas12a蛋白与crRNA结合形成复合物后，与扩增产物结合，当复合物识别到扩增产物中目的序列后，Cas12a中的Dnase区域被激活，先切割掉目的序列片段，然后切割单链ssDNA，并产生可检测的荧光信号。由此，在常温(30-40℃)条件下，将扩增产物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ reporter进行混合并反应，可快速对扩增产物中DNA片段进行检测，无需使用仪器，操作简单。

根据本发明的实施例，所述crRNA具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列90％以上同源性的核苷酸序列。发明人经过对大量不同序列的crRNA进行筛选，发现采用上述crRNA激活cas12a/crRNA复合体切割ssDNA-FQreporter所产生的荧光值最强。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例1中80αendolysin不同结构域与克隆片段示意图；

图2为本发明实施例2中80αendolysin不同结构域蛋白纯化图；

图3为本发明实施例3中荧光显微镜、流式细胞仪检测对不同蛋白和金黄色葡萄球菌的结合情况分析结果图；

图4为本发明实施例3中Western检测对不同蛋白和金黄色葡萄球菌的结合情况分析结果图；

图5为本发明实施例4中不同浓度的NaCl对EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性的分析结果；

图6为本发明实施例4中不同温度对EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性的分析结果；

图7为本发明实施例4中不同pH对EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性的分析结果；

图8为本发明实施例5中带有Amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠捕获金黄色葡萄球菌的结果图；

图9为本发明实施例5中Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠捕获示意图与回收效率；

图10为本发明实施例6中endolysin+水煮法与水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的分析结果；

图11为本发明实施例7中RPA方法对不同细菌的nuc片段扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；

图12为本发明实施例7中RPA方法对不同浓度的金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；

图13为本发明实施例8中RPA方法对不同来源的样本中的金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；

图14为本发明实施例9中crRNA-1、crRNA-2、crRNA-3纯化后琼脂糖凝胶电泳图；

图15为本发明实施例9中cas12a/crRNA切割检测的示意图和检测结果分析；

图16为本发明实施例10中Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测特异性分析；

图17为本发明实施例10中Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测结果。

具体实施方式

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：80αendolysin生物信息学分析

从噬菌体80α基因组(Genbank登录号码DQ908929)中分析查找到80αEndolysin基因，用Interpro分析80αEndolysin结构域，使用计算pI/Mw程序ExPASy计算蛋白质的分子量和等电点。

从噬菌体80α基因组(Genbank登录号码DQ908929)中分析查找到80αEndolysin基因序列，用Interpro进行功能结构域的搜索，结果显示，80αEndolysin基因由N端CHAP催化结构域、中心酰胺酶3催化结构域和C末端SH3b细胞结合域三个结构域所构成，如图1所示。因此，本发明后续选择Amidase 3-CBD与CBD这两段基因进行克隆表达。

实施例2：EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD蛋白的克隆、表达与纯化

将Amidase 3-CBD、CBD克隆于PET28a-EGFP载体中，利用大肠杆菌基因表达***与亲和层析Ni-NTA柱纯化获取重组蛋白，分别得到带有EGFP的Amidase 3-CBD和CBD，将其命名为EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD，并进行SDS-PAGE分析。

如图2所示，结果表明EGFP-Amidase 3-CBD蛋白质的大小大约在60kDa左右(即为图2A中泳道8的纯化产物)，EGFP-CBD蛋白质的大小大约在40kDa左右(图2B中泳道7的纯化产物)，两者的在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质大小与生物信息学预测的64和40.1kDa相匹配(图2A和图2B)，同时，阴性对照EGFP蛋白质在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质大小(大约33KDa)与生物信息学预测(33.2KDa)相匹配(图2C中泳道8的纯化产物)。

实施例3：EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD结合活性分析

实验方法：将金黄色葡萄球菌在37℃震荡培养的条件下生长至对数中期，然后将培养物以12000rpm离心5min，加入50mMTris-HCl洗涤一次后离心，利用50mMTris-HCl重悬细菌并将OD600调至0.8。取200ul OD600＝0.8的菌液于离心管中，分别加入100ul浓度为0.5mg/ml的EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD蛋白，并在室温下孵育20分钟。通过离心(10000rpm，3min)用50mM的Tris-HCl洗涤金黄色葡萄球菌3次以去除未结合的蛋白质，将洗涤后的沉淀重新悬浮在100μL浓度为50mMTris-HCl中，得到细菌蛋白混合悬液，通过利用荧光显微镜、流式细胞仪、western进行检测。

荧光显微镜检测：在载玻片上加入10μl最终的细菌蛋白混合悬液，并盖上盖玻片，通过配备U-RFL-T光源(放大倍数1000倍)的落射荧光显微镜下，在明场和FITC滤光片下观察(激发BP 470-490nm；发射：LP 516nm)蛋白与金黄色葡萄球菌结合效果，同时制备EGFP蛋白用作阴性对照。为了评估EGFP-Amidase 3-CBD的特异性和敏感性，将金黄色葡萄球菌菌株、Escherichia coli O157:H、Salmonella typHimurium、Bacillus cereus、Propionibacterium acnes、Listeria monocytogenes所列出的细菌分别与该蛋白一起孵育(具体步骤同上述实验方法)，按照上述相同程序并在落射荧光显微镜下观察，结果如表1所示。

表1：80αendolysin、EGFP-amidase 3-CBD对不同微生物细胞壁的裂解情况

注：^a+，有裂解活性；-，没有裂解活性；^b+，有细胞壁结合活性；-，没有细胞壁结合活性。

流式细胞术检测：取50ul最终的细菌蛋白混合悬液，使用配备有二极管蓝色激光器(激发波长为488nm)的Accuri C6 Plus流式细胞仪分析样品，采集40000个事件。通过FL1通道上的525/50nm带通滤波器检测荧光，并使用FlowJo-V10软件进行了数据分析。

western检测：吸取5ul 5ⅹSDS loading buffer加入到20ul最终细菌蛋白混合悬液中，100℃下煮沸5分钟，使用SDS-PAGE预制凝胶进行电泳分析，再通过转膜技术将蛋白转移到PVDF膜上，使用抗组氨酸抗体进行蛋白质印迹分析。

荧光显微镜检测的结果表明，融合蛋白EGFP-Amidase 3-CBD、EGFP-CBD都能与金黄色葡萄球菌细胞结合；显微镜下的荧光强度观察结果显示，EGFP-Amidase 3-CBD具有比EGFP-CBD更强的结合能力。而阴性对照EGFP在荧光显微镜下没有观察到荧光细胞，具体参见图3A。

如图3B和图3C所示，流式细胞的检测结果显示，EGFP-Amidase 3-CBD的峰值比阳性对照的峰值出现了明显的右移，且EGFP-Amidase 3-CBD的平均荧光强度比EGFP-CBD的平均荧光强度大，两者具有极显著差异(P<0.0001)，说明EGFP-Amidase 3-CBD具有比EGFP-CBD更强的结合能力，而在图3C中阴性对照EGFP也出现平均荧光强度值，分析是由于在蛋白结合金黄色葡萄球菌后，没有将未结合的蛋白洗涤干净所导致的，属于正常的实验误差。

如图4所示，EGFP-Amidase 3-CBD条带的灰度值要高于EGFP-CBD，并且从非特异性条带的比较也可以看出，EGFP-Amidase 3-CBD的非特异性条带比EGFP-CBD的要淡许多，说明EGFP-Amidase 3-CBD具有比EGFP-CBD更强的结合能力。

实施例4：EGFP-amidase 3-CBD蛋白稳定性考察

将EGFP-amidase 3-CBD蛋白分别于温度为4-60℃、pH值为3-12和NaCl浓度为0-1000mM的范围下进行稳定性考察，每种条件下蛋白处理时间为30min，使用80αEndolysin C端的功能分析中测定方法测定amidase 3-CBD与金黄色葡萄球菌结合活性。

其中，不同pH条件通过不同pH的缓冲液实现：甘氨酸-HCl pH＝3、乙酸钠pH＝5、Tris-HCl pH＝7、甘氨酸-NaOH pH＝9、KCL-NaOH pH＝12。

其中，每种条件下，蛋白处理时间为30min，使用80αEndolysin C端的功能分析中测定方法测定amidase 3-SH3b与细菌结合活性。

如图5所示，结果表明，在100mM的NaCl处理后的结合能力是最强的，随着NaCl的浓度的不断增加，EGFP-amidase 3-CBD蛋白与金黄色葡萄球菌的结合能力逐渐减弱，在流失细胞仪检测中，100mM的NaCl处理后的EGFP-amidase 3-CBD蛋白的荧光峰值和平均荧光强度最大。当NaCl浓度超过200mM时，EGFP-amidase 3-CBD结合能力显著下降。

如图6-7所示，在不同的温度与pH处理EGFP-amidase 3-CBD蛋白的结果中显示，当温度为4℃，pH＝7时，EGFP-amidase 3-CBD蛋白结合金黄色葡萄球菌的效果最佳。

实施例5：带有Amidase 3-CBD蛋白的Ni-NTA磁珠捕获金黄色葡萄球菌效率的考察

实验方法：Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠(无锡百迈格生物科技有限公司)在其表面具有Ni-聚甲基丙烯酸酯基团，Ni-聚甲基丙烯酸酯磁性上的亲和配体Ni离子可以与蛋白上的N端6×His-tag标签进行结合的特性，将100ul含有His-tag标签的EGFP-amidase 3-CBD蛋白(缓冲液配方：50mMtris-Hcl、100mMNaCl、pH＝7.4)与100ul Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠进行孵育结合在混合器中混合20min，其中，与Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠相比，EGFP-amidase3-CBD蛋白添加过量；然后通过磁力架分离Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠，用T100洗涤两次。再用50mM Tris-HCl进行洗涤2次，最终将磁珠重悬于100ul浓度为50mMTris-HCl中，并储存于4℃，采用荧光显微镜观察Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的涂覆情况。然后测试涂有EGFP-amidase3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠捕获金黄色葡萄球菌效率，将捕获金黄色葡萄球菌的磁珠进行平板培养并计数，具体操作如下：将1ml金黄色葡萄球菌(10⁴-10¹CFU/ml)与100ul磁珠悬浮液于混合器上孵育40min，通过磁力架分离磁珠，用50mM Tris-HCl进行洗涤2次，最终将磁珠重悬于1ml浓度为50mM Tris-HCl中，将1ml磁珠悬液直接涂板，37℃孵育24h后，通过菌落计数细胞。

如图8所示，通过荧光显微镜观察，发明人惊喜地发现，EGFP-amidase 3-CBD蛋白非常均匀的覆盖在Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠表面，而在加入RFP-amidase 3-CBD后观察发现，在激发光峰值为488nm与532nm时，所观察到的绿色荧光、红色荧光与明场的金黄色葡萄球菌的位置是一一对照的。以上结果表明，本发明得到的EGFP-amidase 3-CBD蛋白容易实现Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠表面均匀涂覆。

如图9所示，涂有EGFP-amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠在金黄色葡萄球菌生物负荷(bioburden)在1×10⁴CFU/ml时的捕获效率为25％；随着细菌载量逐渐减少，磁珠的捕获效率也在不断上升，在1×10¹CFU/ml时，磁珠的捕获效率出现了78％的情况，基本上可实现很好的捕获效果。

实施例6：采用不同的提取方法对金黄色葡萄球菌基因组提取的考察

1、endolysin+水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：

从噬菌体80α基因组(Genbank登录号码DQ908929)中分析查找到80αEndolysin基因，由华大基因进行合成并克隆于PMV载体中，通过双酶切(BamHI/XhoI)的方式将80αEndolysin基因克隆在PET28a载体中，将构建好的PET28a-endolysin转化BL21中，在OD600＝0.6时加入1mM IPTG，19℃诱导20h。10000RPM，5min收集已诱导细菌，再将细菌悬浮于裂解缓冲液中(50mMTris-HCl、500mMNaCl、5mM咪唑)中，超声处理3min，离心10000RPM，30min获得可溶性蛋白上清，然后通过Ni-NTA纯化得到目的蛋白，在此之后，使用Amicon Ultra-4centrifugal filters Ultracel-30K浓缩蛋白，并置换洗脱缓冲液(50mMTris-HCl、500mM咪唑、100mM Nacl)，将蛋白储存于50mMTris-HCl中。纯化后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)预制凝胶分析蛋白质，如图10A所示，纯化后的80αendolysin蛋白在SDS-PAGE分析显示大约为57KDa左右(即为图10A中泳道9的纯化产物)，与80αendolysin蛋白的生物信息学预测大小相匹配(57.3kDa)。

取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，10000rpm，离心3min，弃掉上清；加入100ulTris-HCl(pH＝7.4)缓冲液将细菌悬浮起来；加入上述获得的40ul 400ug/ml endolysin蛋白，反应30min；沸水水浴10min，离心10000r，3min，吸取上清进行qPCR。

其中，qPCR体系如下所示：

基因组DNA	总体积10ul
		Sybergreen mix	5ul
Nuc(F)：5’-GGCATATGTATGGCAATTGTTTC-3’(SQE ID NO:1)	0.3ul
		Nuc(R)：5’-CGTATTGCCCTTTCGAAACATT-3’(SQE ID NO:2)	0.3ul
H<sub>2</sub>O	3.4ul

循环体系为：95℃、15min；95℃、15s，60℃、20s，30个循环，72℃、45s。

2、水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：

取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，10000rpm，离心3min，弃掉上清；加入140ulTris-HCl(pH＝7.4)缓冲液将细菌悬浮起来；100℃水浴10min，离心10000r，3min，吸取上清进行qPCR。

其中，qPCR体系如下所示：

基因组DNA	总体积10ul
		Sybergreen mix	5ul
Nuc(F)：5’-GGCATATGTATGGCAATTGTTTC-3’(SQE ID NO:1)	0.3ul
		Nuc(R):5’-CGTATTGCCCTTTCGAAACATT-3’(SQE ID NO:2)	0.3ul
H<sub>2</sub>O	3.4ul

循环体系为：95℃、15min；95℃、15s，60℃、20s、30个循环，72℃、45s。

图10B所示，endolysin蛋白(浓度为400ug/ml)对金黄色葡萄球菌ATCC29213进行的裂解实验中，80αendolysin可以在400ug/ml下60分钟内将600nm处的吸光度从1.0降低到0.2，结果表明，endolysin蛋白有很好的裂解活性。

图10C和图10D所示，当QPCR中的Ct Threshold设定为2000时，endolysin+水煮法与水煮法的Ct值分别为10和15，这表明endolysin+水煮法的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取量是远远高于水煮法，这是由于金黄色葡萄球菌细胞壁较厚，普通的水煮法无法有效的破除金黄色葡萄球菌细胞壁，从而导致基因组DNA效率低，而endolysin是噬菌体编码的肽聚糖水解酶，可特异性裂解宿主细菌细胞壁，从而导致胞内物质的释放，因此，endolysin与水煮法联用时要比单独的水煮法提取得率更高，对后续快速检测提供了非常重要的作用。

实施例7：RPA扩增金黄色葡萄球菌基因组nuc片段

RPA扩增金黄色葡萄球菌基因组nuc片段实验方法：

1、吸取混匀的100ul Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠于EP管中，用500ul T100洗涤2次，每次2min，弃去上清，悬浮于100ul的T100。

2、加入100ul浓度为1mg/ml的EGFP-amidase 3-CBD蛋白孵育20min，每隔2min，将EP管倾斜50°，用手轻轻旋转晃动。

3、将孵育好的EGFP-amidase 3-CBD蛋白悬浮液放在磁力架上，静置去上清。用500ul的50mM Tris-HCl，洗2次，最后悬浮于100ul的50mM Tris-HCl。

4、取3ml金黄色葡萄球菌离心，用1ml Tris-HCl洗涤一次，再用Tris-HCl调至OD600＝0.6，再稀释成1×10⁴CFU/ml、1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml、1×10¹CFU/ml，得到四种稀释度的菌液。

5、分别取1ml的上述四种稀释度的菌液于EGFP-amidase 3-CBD蛋白悬浮液中，孵育20min，每隔2min，将EP管倾斜50°，用手轻轻旋转晃动。

6、将孵育好的EGFP-amidase 3-CBD蛋白-金黄色葡萄球菌，悬浮液放在磁力架上，弃去上清，加入500ul 50mM Tris-HCl洗2次，每次2min，再悬浮于40ul的50mM Tris-HCl。

7、加入10ul 2mg/ml的endolysin蛋白，孵育30min，然后再放入沸水水浴10min，吸取上清液得到粗提液。

8、将粗提液进行RPA，具体步骤如下：

RPA反应使用的引物由Primer Premier 5.0进行设计，引物长度在30nt-35nt之间。

其中，RPA-1-F：5’-GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-3’(SQE ID NO:3)；

RPA-1-R：5’-ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT-3’(SQE ID NO:4)；

RPA-2-F：5’-CATCACAAACAGGTAACGGCGTAAATAGAAGT-3’(SQE ID NO:5)；

RPA-2-R：5’-TCTCTACACCTTTTTTAGGATGCTTTGTTTCA-3’(SQE ID NO:6)。

RPA的反应体系为：10uM的上游引物(RPA-1-F或RPA-2-F)和10uM的下游引物(RPA-1-R或RPA-2-R)、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM醋酸钾、14mM醋酸镁、2mM二硫苏糖醇(DTT)、5％聚乙烯二醇、200uM dNTP、3mM ATP、1ul 5000units/ml Bsu DNA聚合酶和2ul的扩增产物。将上述混合物在常规水浴中在37℃下孵育以进行RPA反应，其中，上述混合物中各物质的浓度均为终浓度，RPA-1-F和RPA-1-R扩增得到nuc片段1、RPA-2-F和RPA-2-R扩增得到nuc片段2。

RPA扩增大肠杆菌基因组nuc片段实验方法与RPA扩增金黄色葡萄球菌基因组nuc片段实验方法相同，区别仅在于选择的菌液不同。

将上述金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的扩增产物分别用苯酚/氯仿提取，1％琼脂糖凝胶电泳，结果参见图11。

图11结果显示，金黄色葡萄球菌泳道上可以看到清晰的条带，而大肠杆菌泳道上没有条带，这说明了nuc基因是金黄色葡萄球菌特异性的基因，并且能通过RPA等温扩增的方式扩增出来。

如图12所示，对于RPA的灵敏度，采用10倍连续稀释的金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板进行RPA等温扩增，在琼脂糖凝胶电泳显示RPA的检测下限为10²aM。

实施例8：探索带有Amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠捕获金黄色葡萄球菌是否受食品基质的影响

实验方法：采用实施例7中的方法对样本中的金黄色葡萄球菌进行捕获和提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，将1×10⁴CFU/ml金黄色葡萄球菌污染Tris-HCl、牛奶、橙汁和奶酪，利用涂有EGFP-Amidase 3-CBD蛋白的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠结合并捕获金黄色葡萄球菌，使用endolysin+水煮的方法提取基因组DNA，紧接着利用RPA等温扩增nuc片段，并于1％琼脂糖凝胶电泳跑胶，如图13所示。

结果显示，被污染的Tris-HCl、牛奶、橙汁和奶酪都能扩增出nuc片段，并且条带的亮度几乎相同。因此，以上试验结果表明，本发明磁珠捕获金黄色葡萄球菌不受食品基质的影响。

实施例9：cas12a/crRNA切割检测

选取了三种不同的crRNA(参见图15A)对实施例7中得到的nuc片段1和nuc片段2进行cas12a/crRNA切割检测，cas12a/crRNA切割检测方法如下所示：

将500nM crRNA、250nM Cas12a、2.5uM ssDNA-FQ reporter(序列为5’-FAM-TTATT-BHQ-1-3’)、2μL NEB buffer 3.1、3μL的实施例7中得到的扩增产物进行混合，加入ddH₂O至20μL。反应在37℃下进行，在qPCR机器上进行30min，每1min进行一次荧光测量，检测结果具体参见图14-15。其中，crRNA-1用于识别nuc片段1，crRNA-2和crRNA-3用于识别nuc片段2，crRNA如下所示：

如图15C所示，crRNA-1激活cas12a/crRNA切割ssDNA-FQ reporter所产生的荧光值最强，因此这也就说明crRNA-1是三种crRNA最优的选择。如图15B所示，在cas12a/crRNA切割反应的不同组分分析中可以看出，只有当反应体系中的所有溶剂全部加入时，才能产生荧光值，缺一不可。

实施例10：磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测牛奶中的金黄色葡萄球菌

为了快速检测出食品中的金黄色葡萄球菌，防止由金黄色葡萄球菌导致的食源性疾病的发生，利用上游的磁珠-EGFP-Amidase 3-CBD对金黄色葡萄球菌进行捕获，并结合下游的RPA、cas12a切割检测，在紫外光的照射下，通过肉眼观测并评估食品是否被污染，并考察了该方法的特异性和灵敏性。

试验方法：将500nM crRNA-1(具体参见实施例9)、250nM Cas12a、2.5uM ssDNA-FQreporter(序列为5’-FAM-TTATT-BHQ-1-3’)、2μL NEB buffer 3.1、3μL的实施例7中得到的扩增产物进行混合，加入ddH₂O至20μL。反应在37℃下进行，在qPCR机器上进行30min，每1min进行一次荧光测量。

特异性考察及结果：选取1×10⁴CFU/ml大肠杆菌和金黄色葡萄球菌污染无菌牛奶，采用实施例7中的方法对样本中的金黄色葡萄球菌进行捕获、提取金黄色葡萄球菌基因组DNA和RPA扩增金黄色葡萄球菌基因组nuc片段，并以cas12a/crRNA切割检测是否特异性的检测金黄色葡萄球菌。

如图16所示，只有金黄色葡萄球菌激活了cas12a，并切割ssDNA-FQ reporter产生荧光值，结果表明，本发明磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测可特异性地检测出金黄色葡萄球菌。

灵敏性考察及结果：分别将1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml、1×10¹CFU/ml金黄色葡萄球菌污染无菌牛奶，然后加入100ul EGFP-Amidase 3-CBD涂覆后的磁珠，利用endolysin+水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，在37℃下进行RPA反应30min后，在37℃下进行Cas12a切割30min。在紫外光的照射下，通过肉眼检查荧光信号；并用GraphPad Prism 8.0软件进行分析数据并用平均值±标准偏差进行呈现，其中，数据均值之间的差异性通过t检验进行分析，P<0.05时则表示差异显著。

如图17所示，图A、B、C分别为利用磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割的方法检测牛奶中1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml、1×10¹CFU/ml金黄色葡萄球菌，图中的曲线为切割反应在设定为37℃30min的QPCR仪器中所显示出的荧光累积曲线，曲线中的试管图为对应的在37℃切割30min后在紫外光照射下的荧光图，结果显示，磁珠捕获结合cas12a/crRNA切割检测的最低检测限为1×10¹CFU/ml。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都大学

<120> 吸附磁珠及其试剂盒和用途以及检测金黄色葡萄球菌的方法

<130> BI3212533

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

ggcatatgta tggcaattgt ttc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2

<400> 2

cgtattgccc tttcgaaaca tt 22

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3

<400> 3

gcatcacaaa cagataacgg cgtaaataga ag 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4

<400> 4

acattaattt aaccgtatca ccatcaatcg ct 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5

<400> 5

catcacaaac aggtaacggc gtaaatagaa gt 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 6

<400> 6

tctctacacc ttttttagga tgctttgttt ca 32

<210> 7

<211> 61

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 7

<400> 7

uaauacgacu cacuauaggg uaauuucuac uaaguguaga uguugaaguu gcacuauaua 60

c 61

<210> 8

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8

<400> 8

taatacgact cactataggg taatttctac taagtgtaga tgttgaagtt gcactatata 60

c 61

<210> 9

<211> 63

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 9

<400> 9

uaauacgacu cacuauaggg aauuucuacu guuguagaua uuaaagcgau ugauggugau 60

acg 63

<210> 10

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 10

<400> 10

taatacgact cactataggg aatttctact gttgtagata ttaaagcgat tgatggtgat 60

acg 63

<210> 11

<211> 59

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 11

<400> 11

uaauacgacu cacuauagga auuucuacua aguguagaua uuaaugucgc agguucuuu 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12

<400> 12

taatacgact cactatagga atttctacta agtgtagata ttaatgtcgc aggttcttt 59

Claims

1.一种吸附磁珠，其特征在于，所述吸附磁珠选自Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠通过His-tag标签序列与Amidase 3-CBD蛋白相连；

任选地，所述Amidase 3-CBD蛋白上连接有荧光基团，优选EGFP基团。

2.一种试剂盒，其特征在于，包括：

Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠；

具有His-tag标签序列的Amidase 3-CBD蛋白；

任选地，所述Amidase 3-CBD蛋白上连接有荧光基团，优选EGFP基团；

任选地，所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠与Amidase 3-CBD蛋白是以Ni和His-tag标签序列相结合的方式提供的。

3.权利要求1所述的吸附磁珠或权利要求2所述的试剂盒在检测金黄色葡萄球菌中的应用。

4.一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括：

步骤1：采用权利要求1所述的吸附磁珠或权利要求2所述的试剂盒处理待测样本，得到含有所述Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠的处理液；

步骤2：将所述处理液进行DNA提取处理，得到提取产物；

步骤3：将所述提取产物进行扩增处理，得到扩增产物；

步骤4：将所述扩增产物进行检测，以便检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1进一步包括：

将所述吸附磁珠或预先相连的Ni-聚甲基丙烯酸酯磁珠和具有His-tag标签序列的Amidase 3-CBD蛋白与所述待测样本进行混合并反应，得到所述处理液；

任选地，所述反应的温度为2-30℃；

任选地，所述反应的pH值为5-9；

任选地，所述反应前，向混合体系中加入NaCl，所述NaCl的终浓度为50-200mM。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA提取处理包括：将所述处理液与内溶素进行水煮处理；

任选地，所述水煮处理之前，将所述内溶素和所述处理液反应20-40min；

任选地，所述水煮处理的时间为5-20min；

任选地，所述内溶素和所述待测样本的体积比为1：(40-60)，其中，所述内溶素的浓度为1-3mg/ml；

任选地，所述内溶素来源于所述金黄色葡萄球菌中的噬菌体。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增处理是采用重组酶聚合酶扩增方法进行的。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测包括：

将所述扩增产物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ reporter进行反应；

所述反应产生可检测的荧光信号，是所述待测样本中含有金黄色葡萄球菌的指示；

所述反应不产生可检测的荧光信号，是所述待测样本中不含有金黄色葡萄球菌的指示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述crRNA具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列90％以上同源性的核苷酸序列。