CN117535436B - 基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a‑RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合及应用，属于病原微生物检测技术领域，提供了一种检测水稻细菌性条斑病菌的RPA引物对和特异性crRNA序列的序列组合，还提供了一种基于CRISPR/Cas12a‑RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒、检测方法和应用。本发明的检测方法将RPA扩增方法与CRISPR/Cas12a的检测方法结合来检测水稻细菌性条斑病菌，通过蓝光切胶仪和侧流层析试纸条实现了可视化检测；本发明的检测方法具有良好的特异性和敏感性，只需要简单的仪器便可以进行检测，具有在现场和田间快速对水稻细菌性条斑病菌核酸进行检测的优势。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合及应用，具体地是一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合、检测试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
水稻细菌性条斑病是一种由水稻黄单胞菌引起的细菌性病害，严重破坏水稻产量。水稻细菌性条斑病分布于亚洲的热带和亚热带，西非和东非地区；在我国，主要分布于华中、华南和西南地区。水稻细菌性条斑病在我国南方已经多次被报道，其导致水稻产量损失10%-20%，有时甚至损失高达40%，甚至绝收，严重威胁水稻生产安全。在出现明显的症状之前，早期感染水稻细菌性条斑病菌的水稻，难以通过非专业知识进行物理诊断，导致水稻细菌性条斑病的爆发引起水稻作物的大量死亡。因此，通过分子技术在水稻种子带菌阶段或者在水稻幼苗期检测到这种病害，对于水稻的生产，农民的增收有着重要的意义。
目前，检测水稻细菌性条斑病的方法主要是传统的检测方法和近些年发展的分子检测技术等。传统的检测方法主要有噬菌体检测法、育苗生长观察法、致病性测定、直接分离法、血清学检测技术等；近些年发展的分子检测技术主要有：普通PCR、数字PCR、荧光定量PCR法等。传统的检测方法耗时长，检测不方便，并且需要专门的技术人员进行检测。目前，我国检测水稻细菌性条斑病的国家标准是基于含铁细胞接受因子基因利用PCR技术来检测。
CRISPR/Cas（簇状规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关）是细菌和古细菌等原核生物中一种自然发生的适应性免疫***，随着不断发现具有不同活性的Cas蛋白，CRISPR/Cas***已被广泛应用于各种传染性微生物（包括病毒和细菌）的诊断。此外，该***还可用于检测microRNAs（miRNAs）、单核苷酸多态性（SNPs）和DNA甲基化等方面。II类CRISPR蛋白中的Cas12a酶，除了具有特异性靶向外，还表现出对邻近核酸非特异性切割的能力，已经结合等温扩增技术广泛应用于各种微生物的诊断。由于其特异性强、灵敏度高、方便快速，使得该方法可以在田间进行水稻细菌性条斑病的快速检测和诊断。
发明内容
针对上述问题，本发明提供是一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合及应用，具体地是一种基于CRISPR/Cas12a技术结合RPA技术快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合、检测试剂盒、检测方法和应用，具有特异性好、灵敏度高、简单快速、样本要求低、高效等特点，可以实现在田间快速检测的要求，提高了检测效率，为水稻细菌性条斑病菌的检测方法提供一种新的选择。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合，包括根据avrRxo1基因设计的RPA引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列；
其中，RPA引物对序列为：
正向引物RPA-avrRxo1-F2的序列为：5’-CCGACCGGTTTGAAGGCGGACTTCGCTCTC-3’（SEQ ID NO：1）；
反向引物RPA-avrRxo1-R2的序列为：5’-CCTGTCTATCACGTACATTCTATTGCTCCG-3’（SEQ ID NO：2）；
crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUGCAAAACUCCCACCAAAGAA（SEQ ID NO：3）；
所述ssDNA探针序列是用于荧光定量PCR仪器检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列、用于可视化荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列或用于侧流层析试纸条检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列。
进一步的，用于荧光定量PCR仪器检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM或ssDNA-reporter-CY5；
其中，ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；
ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
用于可视化荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM-2，具体为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
用于侧流层析试纸条检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列为FB-reporter，具体为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，所述试剂盒包含RPA引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列。
进一步的，所述试剂盒还包含Rehydration Buffer、MgOAC、酶干粉、LbCas12a和ddH2O；
所述酶干粉用于RPA反应。
进一步的，所述试剂盒含有多个独立单元的八连排PCR反应管，所述PCR反应管中含有酶干粉；
所述试剂盒包括用于进行RPA扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系。
进一步的，用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系中包括：正向引物RPA-avrRxo1-F1、反向引物RPA-avrRxo1-R1、Rehydration buffer、ddH2O和模板DNA，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的PCR反应管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入MgOAC；其中，模板DNA即为对待测样本提取获得；
具体的用于进行RPA扩增反应的反应体系为：2.4μL浓度为10μM的正向引物RPA-avrRxo1-F1、2.4μL浓度为10μM的反向引物RPA-avrRxo1-R1、29.5μL的Rehydrationbuffer、11.2μL的ddH2O、2μL模板DNA，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的PCR反应管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入2.5μL的MgOAC；
用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL；用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系为用于进行RPA/Cas12a荧光检测的反应体系、用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系或者用于进行RPA/Cas12a-LFA反应的反应体系；所述体系选自如下任一种：
用于进行RPA/Cas12a荧光检测的体系包括：SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-CY5或者ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）或者2μL的ssDNA-reporter-FAM（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水；
或者，用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的体系包括： SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水；
再或者，用于进行RPA/Cas12a-LFA反应（即侧流层析试纸条检测反应）的体系包括：包括：SF缓冲液、RNA酶抑制剂、FB-reporter、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2.5μL的FB-reporter（100nM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，10.5μL的DEPC处理水。
一种上述快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒在检测田间水稻细菌性条斑病菌中的应用。
一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法，包括以下步骤：
1）提取水稻细菌性条斑病菌疑似样品的基因组DNA；
2）以基因组DNA为模板DNA，利用上述检测试剂盒进行RPA扩增反应，得RPA扩增产物；
3）利用上述检测试剂盒，取RPA扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应，然后进行荧光检测（即RPA/Cas12a荧光检测或RPA/Cas12a可视化荧光检测）或者侧流层析试纸条检测（即RPA/Cas12a-LFA反应）。
进一步的，步骤1）中，提取水稻细菌性条斑病菌疑似样品的基因组DNA的方法是取水稻细菌性条斑病的疑似样品，剪成细小的碎片，放在干净的1.5 mL无菌离心管中，加入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，用灭菌的研磨棒将叶片捣烂，在室温下静置1min，使用TEBuffer（Tris-EDTA）稀释50倍，即得水稻细菌性条斑病菌疑似样品的基因组DNA；
步骤2）中，用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，具体的反应体系为2.4μL浓度为10μM的正向引物RPA-avrRxo1-F1、2.4μL浓度为10μM的反向引物RPA-avrRxo1-R1、29.5μL的Rehydration buffer、11.2μL的ddH2O、2μL模板DNA，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的PCR反应管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入2.5μL的MgOAC，迅速离心到管底，RPA扩增反应条件为：39℃扩增10 min；
步骤3）中，用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL；用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系为用于进行RPA/Cas12a荧光检测的反应体系、用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系或者用于进行RPA/Cas12a-LFA反应的反应体系；具体的所述体系选自如下任一种：
用于进行RPA/Cas12a荧光检测的体系包括：SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-CY5或者ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）或者2μL的ssDNA-reporter-FAM（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水，反应于实时荧光定量PCR仪器进行，37℃反应1 h；
或者，用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的体系包括： SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水；反应条件为：37℃反应5min，在470 nm蓝光切胶仪观察荧光结果；
再或者，用于进行RPA/Cas12a-LFA反应（即侧流层析试纸条检测反应）的体系包括：SF缓冲液、RNA酶抑制剂、FB-reporter、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2.5μL的FB-reporter（100nM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，10.5μL的DEPC处理水，37℃反应20min，用DEPC处理水补足至50μL，混匀，将其滴入试纸条的结合垫端，观察试纸条上检测线（T线）和控制线（C线）的颜色。
一种上述快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法在水稻细菌性条斑病菌检测方面的应用。
本发明的一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合及应用的有益效果为：
本发明通过将RPA扩增方法与CRISPR/Cas12a的检测方法结合来检测水稻细菌性条斑病菌，通过RPA/Cas12a荧光检测实现荧光检测，或者通过蓝光切胶仪和侧流层析试纸条实现可视化检测；本发明的检测方法简单快速，具有良好的特异性、敏感性、只需要简单的仪器便可以进行检测，不需要昂贵的仪器设备，具有快速检测的优势，更有利于对水稻细菌性条斑病的分子检测技术在农田间的推广和应用，可以做到对水稻细菌性条斑病的有效监测和防控；
本发明通过筛选特异性基因靶点，设计出特异性RPA引物，扩增之后进行Cas12a切割反应，偶联两级扩增达到高效和可视化的检测水稻细菌性条斑病菌的目的；利用等温扩增技术与CRISPR/Cas12a检测技术相结合能够更好的适应水稻细菌性条斑病菌等入侵性害虫的田间快速检测技术，并且相比单独的等温扩增技术而言，能够进一步缩短检测时间，检测精确度进一步提高，并且结果可视化，从而能够在有限的时间中完成更多的检测样品，为采取更好的防控措施提供参考，保护本土生态环境以及农业经济发展，有利于对水稻细菌性条斑病菌的分子检测技术在农田间的推广和应用，可以做到对水稻细菌性条斑病菌的有效监测和防控。
附图说明
图1是本发明中的基于RPA/Cas12a检测水稻细菌性条斑病菌的检测操作流程示意图；
图2是本发明实施例1中的LbCas12a-avrRxo1 crRNA序列的间隔序列比对结果；其中，PAM（原间隔序列相邻基序）：TTTN，Protospacer：间隔序列；
图3是本发明实施例2中的Cas12a荧光检测***针对水稻细菌性条斑病菌的特有基因avrRxo1基因的crRNA检测效率结果图；LbCas12a-avrRxo1是根据avrRxo1基因设计的crRNA，LbCas12a-avrRxo1-BC是以ddH2O作空白对照；荧光比值是通过酶标仪每隔5 min反应时检测到的荧光强度与0 min时检测到的荧光强度的比值；
图4是本发明实施例2中的RPA引物琼脂糖凝胶电泳结果图；M代表DL600；1代表RPA-avrRxo1-F1/R1；2代表RPA-avrRxo1-F1/R1的阴性对照；3代表RPA-avrRxo1-F2/R2；4代表RPA-avrRxo1-F2/R2的阴性对照；5代表RPA-avrRxo1-F3/R3；6代表RPA-avrRxo1-F3/R3的阴性对照；阴性对照均以ddH2O作为对照；
图5是本发明实施例3中的RPA/Cas12a反应时间的优化结果图；其中，A图是RPA反应时间的优化结果图；B图是Cas12a可视化荧光检测反应时间的优化结果图；BC是以ddH2O作为空白对照；
图6是本发明实施例5中的RPA Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果；其中，A图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果图，B图是avrRxo1基因的PCR检测反应的灵敏度分析结果图，C图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a可视化荧光检测反应的灵敏度分析结果图；A图、B图和C图中的1-9分别代表：20 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100 fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的稻细菌性条斑病菌的标准基因组DNA稀释液，BC代表空白对照；误差线代表三次测量信号强度的标准误； P<0.0001；/> P<0.001；/> P<0.01；/> P<0.05；
图7是本发明实施例5中的RPA/Cas12a荧光检测反应的特异性分析结果；其中，A图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a荧光检测反应的特异性分析结果图，B图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a可视化荧光检测反应的特异性分析结果图；A图和B图中的BC是以ddH2O为空白对照；
图8是本发明实施例6中RPA/Cas12a的荧光检测反应田间样品检测结果；其中，A图是16份田间样品的基于avrRxo1基因的PCR扩增反应结果图；B图是16份田间样品基于RPA/Cas12a可视化荧光检测水稻细菌性条斑病的结果图；A图和B图中的N是以健康叶子的DNA作阴性对照，P是以水稻细菌性条斑病菌的DNA作阳性对照；
图9是本发明实施例4-6中的RPA/Cas12a-LFA检测反应结果图；其中，A图是本发明实施例4中RPA/Cas12a的LFA检测反应的初步建立结果图；B图是本发明实施例5中avrRxo1基因的RPA/Cas12a-LFA检测反应的灵敏度分析结果图；B图中的1-9分别代表：20g/μL、10ng/μL、1 ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的稻细菌性条斑病菌的标准基因组DNA稀释液，BC代表空白对照；C图是本发明实施例5中的avrRxo1基因的RPA/Cas12a-LFA检测反应的特异性分析结果图；C图中的BC代表空白对照；D图是本发明实施例6中的16份田间样品基于RPA/Cas12a-LFA检测水稻细菌性条斑病的结果图；D图中的N是以健康叶子的DNA作阴性对照；P是以水稻细菌性条斑病菌的DNA作阳性对照。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
另，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为常规可购买产品。
本发明所提供的基于CRISPR/Cas12a检测水稻细菌性条斑病菌的检测操作流程示意图如图1：首先采集疑似样品并进行DNA的粗提，然后通过RPA扩增技术扩增靶标序列，再通过CRISPR/Cas12a反应，非特异性切割ssDNA探针，最后通过荧光定量PCR仪器、试纸条和蓝光灯来读取结果。
实施例1 特异性基因的靶标保守性分析和引物设计
本发明通过查阅文献和在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查找水稻细菌性条斑病菌特异的基因，经过进行同源性分析以及在NCBI网站BLAST，筛选出水稻细菌性条斑病菌特有的基因：avrRxo1基因。
crRNA序列由直接重复序列和间隔序列等两部分组成。将avrRxo1基因序列在CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）网站进行打靶，为了保证crRNA序列的工作的高效性，选取了分值高的间隔序列来设计crRNA。该间隔序列为：GCUGCAAAACUCCCACCAAAGAA。为了保证可以检测出大部分地区的病原菌，选取了不同地区典型的15个菌株通过DNAMAN软件来比对间隔序列，各个菌株的间隔序列完全一致（如图2所示）。送去生工生物公司合成crRNA序列：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUGCAAAACUCCCACCAAAGAA（SEQ ID NO：3）。通过Primer Primer 5.0软件设计avrRxo1基因的RPA和PCR引物，其包含PAM序列。具体设计的RPA引物和PCR引物见下表：
表1 本实施例中设计的PCR引物和RPA引物一览表
由此，获得引物对为RPA-avrRxo1-F1/R1、RPA-avrRxo1-F2/R2、RPA-avrRxo1-F3/R3。
其中，RPA-avrRxo1-F1、RPA-avrRxo1-F2（SEQ ID NO：1）、RPA-avrRxo1-F3均为正向引物，RPA-avrRxo1-R1、RPA-avrRxo1-R2（SEQ ID NO：2）、RPA-avrRxo1-R3均为反向引物。
实施例2 crRNA序列的有效性验证和RPA扩增反应
S1、水稻细菌性条斑病菌DNA快速提取的方法
取水稻细菌性条斑病样品，用剪刀剪去待测叶片的叶中脉区域（约0.5 cm×2cm），剪成细小的碎片，放在干净的1.5 mL无菌离心管中，加入500μL浓度为0.5M的NaOH溶液，用灭菌研磨棒将叶片捣烂，在室温下静置1 min，使用TE buffer（Tris-EDTA）稀释50倍，得水稻细菌性条斑病菌基因组DNA模板。
S2、crRNA序列的有效性验证
根据avrRxo1基因的引物对分别设计合成荧光定量PCR仪器检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列（其中ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’），首先通过PCR反应扩增含PAM序列的靶标序列，得PCR扩增产物；
PCR反应体系为：Green Master Mix酶12.5μL、10 μM的相应的引物对各1μL（即正向引物1μL、反向引物1μL）、水稻细菌性条斑病菌基因组DNA模板1μL，用ddH2O补足至25μL。
PCR反应程序设置为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。
然后进行CRISPR/Cas12a反应。其中，CRISPR/Cas12a反应的反应体系（20μL）为：2μL的10×Buffer 2.1、1μL的crRNA序列（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA探针序列（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2 μL的PCR产物，11μL的DEPC处理水，于酶标仪（λex:485nm；λem: 535nm）上进行反应，每隔5min检测一次荧光值，37℃反应1h，每组实验重复三次，使用GraphPad Prism 8作图。
采用ddH2O作为avrRxo1基因设计的crRNA的空白对照，以保证实验未被污染。
结果如图3所示，LbCas12a-avrRxo1的crRNA（即根据avrRxo1基因设计的crRNA）在5min左右就可以出峰，在25 min左右荧光比值达到最高，其荧光比值最高为5左右，说明此crRNA具有活性。因此，可以用于后续的CRISPR/Cas12a实验中。
其中，图3中仅选择了检测效率较高的引物对（RPA-avrRxo1-F2/R2）检测效率较高的结果进行制图；LbCas12a-avrRxo1代表以RPA-avrRxo1-F2/R2作为引物对，检测的avrRxo1基因的效率结果；LbCas12a-avrRxo1-BC代表avrRxo1基因对照的效率结果。
S3、RPA扩增反应
以步骤S1中获得的水稻细菌性条斑病菌基因组DNA模板直接作为RPA模板，分别采用实施例1中获得的各引物对进行RPA扩增反应，得相应的RPA扩增产物；
其中，RPA扩增反应过程如下：
RPA扩增反应体系的总体积为50 μL，反应体系为：2.4 μL正向引物（10 μM）、2.4 μL反向引物（10 μM）、29.5 μL Rehydration Buffer、11.2 μL的ddH2O、2 μL水稻细菌性条斑病菌基因组DNA模板，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，在管盖上加入2.5 μL的MgOAC，迅速离心到管底，反应条件为：39℃进行反应20 min。
RPA扩增反应结束后，取5μL的RPA扩增产物和1μL的6×loading buffer混匀，加至加样孔中，使用2%的琼脂糖凝胶，设置电压120V，电泳30min后取出琼脂糖凝胶，在凝胶电泳成像***进行拍照保存，得RPA-avrRxo1-F1/R1、RPA-avrRxo1-F2/R2、RPA-avrRxo1-F3/R3及相应的阴性对照扩增后，经琼脂糖凝胶电泳实验测定的结果。如图4所示，只有用RPA-avrRxo1-F2/R2引物进行反应时，水稻细菌性条斑病菌能够被特异性检测到，目标产物是290 bp，并且阴性对照不产生任何杂带。而RPA-avrRxo1-F1/R1、RPA-avrRxo1-F3/R3相应的阴性对照均产生了杂带，证明这两对引物特异性较差。因此，选择引物对RPA-avrRxo1-F2/R2用于后续实验。
其中，图4中，M代表DL600；1代表RPA-avrRxo1-F1/R1；2代表RPA-avrRxo1-F1/R1的阴性对照；3代表RPA-avrRxo1-F2/R2；4代表RPA-avrRxo1-F2/R2的阴性对照；5代表RPA-avrRxo1-F3/R3；6代表RPA-avrRxo1-F3/R3的阴性对照；阴性对照均以ddH2O作为对照，以保证实验未被污染。
实施例3 RPA/Cas12a荧光检测反应时间的优化
一、RPA反应时间的优化
采用实施例2步骤S3中的方法，在RPA扩增反应过程中，保持39℃不变，将RPA扩增反应时间分别调整为5min、10 min、15min、20min，得不同反应时间的RPA扩增产物。
将不同反应时间的RPA扩增产物加入CRISPR/Cas12a反应体系中，进行切割反应。
其中，CRISPR/Cas12a反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10 μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM，ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’）、1 μL的LbCas12a（1 μM）、2μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水，反应于实时荧光定量PCR仪器进行，37℃反应1h。
结果如图5中的A图所示，当RPA反应5min时，便可以引起CRISPR/Cas12a检测反应；当RPA反应10min左右，Cas12a反应的荧光信号强度已经几乎可以达到最大值，即RPA反应10min以上时，实时荧光检测的最大信号强度值变化不大。因此，为提高检测效率无需再延长RPA反应时间，在后续实验中RPA反应时间都设为10 min。
二、Cas12a反应时间的优化
使用RPA反应10 min时的RPA扩增产物，将其加入CRISPR/Cas12a反应体系中，孵育时间内保持37℃不变，将Cas12a切割反应时间分别设为5 min、10 min、15 min、20 min。
其中，CRISPR/Cas12a反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10 μM，ssDNA-reporter-FAM-2为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’）、1μL的LbCas12a（1μM）、2 μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水。通过蓝光切胶仪（470 nm）观察荧光结果。如图5中的B图所示，当Cas12a切割反应为5 min时，便可以达到几乎饱和的荧光。因此若后续用肉眼观察Cas12a切割反应结果时，可以将Cas12a反应时间设为5 min。
最终，将优化的CRISPR/Cas12a反应***与优化的RPA体系相结合，建立最佳RPA/Cas12a反应体系。
实施例4 基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的方法的建立
1）采集水稻细菌性条斑病菌样品，用剪刀剪去待测叶片的叶中脉区域（约0.5cm×2cm），剪成细小的碎片，放在干净的1.5mL无菌离心管中，加入500μL的0.5mol/L的NaOH溶液，用灭菌研磨棒将叶片捣烂，在室温下静置1min，使用TE buffer（Tris-EDTA）稀释50倍，得水稻细菌性条斑病菌基因组DNA模板，直接作为RPA模板。并以ddH2O作为空白对照。
2）取RPA模板采用引物对RPA-avrRxo1-F2/R2进行RPA扩增反应；
其中，RPA扩增反应过程如下：
RPA反应体系的总体积为50μL，反应体系为：2.4μL的RPA-avrRxo1-F2（10μM）、2.4μL的RPA-avrRxo1-R2（10μM）、29.5μL的Rehydration Buffer、11.2μL的ddH2O、2μL水稻细菌性条斑病菌基因组DNA模板，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，在管盖上加入2.5μL的MgOAC，迅速离心到管底，反应条件为：39℃反应10min，得RPA扩增产物。
3）三种不同的检测方法
A、第一种检测方法——RPA/Cas12a荧光检测
根据引物对RPA-avrRxo1-F2/R2设计合成用于荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-CY5，具体为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
取RPA扩增产物进行RPA/Cas12a荧光检测。
用于RPA/Cas12a荧光检测的反应体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40 U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水，置于荧光定量PCR仪器上进行反应，将程序设置为65℃反应1h，反应过程中每隔1min收集荧光一次，即得水稻细菌性条斑病菌的荧光检测结果。
或者，也可以采用2μL的ssDNA-reporter-FAM（10μM）代替2μL的ssDNA-reporter-CY5（10μM）进行RPA/Cas12a荧光检测，其它工艺过程及参数完全一致；其中，ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。
B、第二种检测方法——RPA/Cas12a可视化荧光检测
根据引物对RPA-avrRxo1-F2/R2设计合成用于可视化荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-FAM-2，具体为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
取RPA扩增产物进行RPA/Cas12a可视化荧光检测。
用于RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL的ssDNA-reporter-FAM-2（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水，于37℃反应5min，反应结束后使用蓝光切胶仪观察，即得水稻细菌性条斑病菌的可视化荧光检测结果。
C、第三种检测方法——RPA/Cas12a-LFA检测反应（即侧流层析试纸条检测）
根据引物对RPA-avrRxo1-F2/R2设计合成用于侧流层析试纸条检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列FB-reporter，具体为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’；
取RPA扩增产物进行RPA/Cas12a-LFA检测反应（即侧流层析试纸条检测）。
用于侧流层析试纸条检测的反应体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2.5μL的FB-reporter（100nm）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物，10.5μL的DEPC处理水，37℃反应20min，反应结束后，用DEPC处理水补足至50μL，所得产物滴入试纸条结合垫端，可以在控制线处观察是否出现红色条带，如图9中的A图所示，左侧为样品检测结果，右侧为空白对照，本实施例中样品检测结果在控制线处未观察到红色条带，说明检测的结果是该样品为水稻细菌性条斑病菌。
实施例5 RPA/Cas12a的检测方法的灵敏度和特异性分析
一、DNA的提取：用广州美格生物科技有限公司HiPure Bacterial DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒提取水稻细菌性条斑病菌的基因组DNA。
步骤如下：
（1）取过夜振荡培养的水稻细菌性条斑病菌菌液2mL，转移至2mL无菌离心管中，10000r/min离心1min收集细菌，将残留的培养基尽量倒净。
（2）向沉淀的菌中加入220μL的Buffer STE Plus、10μL的RNaseA和30μL的Lysozyme，涡旋混匀，充分重悬细菌，室温静置10~15min，然后向所得细菌重悬液中加入10μL的Proteinase K和250μL的Buffer DL，涡旋混匀，70℃水浴10 min。
（3）加入250μL无水乙醇至裂解液中，涡旋混匀15s，这一步若有絮状沉淀出现，用移液枪吸打几次尽量打散沉淀，得混合液（包括沉淀）。
（4）把HiPure DNA Mini Columnl装在2mL收集管中，再把步骤（3）中获得的混合液（包括沉淀）转移至柱子（即DNA结合柱）中，10000 r/min离心1 min；若柱子出现堵塞，提高离心速度至13000 r/min，离心3 min。
（5）倒弃流出液，把柱子装回收集管中，加入500μL的Buffer GW1（已用乙醇稀释）至柱子上，10000r/min离心1 min。
（6）倒弃滤液，把柱子装回收集管中，加入650μL的Buffer GW2（已用乙醇稀释）至柱子中，10000 r/min离心1 min。
（7）倒弃流出液，把柱子装回收集管中，10000 r/min离心2 min，将柱子装在新的1.5mL无菌离心管中，加入30~100μL预热至70℃的Buffer AE至柱子膜中央，放置3min，然后10000 r/min离心1 min。
（8）丢弃DNA结合柱。将提取的水稻细菌性条斑病菌的标准基因组DNA用超微量分光光度计测浓度和质量。
二、RPA/Cas12a的检测方法的灵敏度分析
将水稻细菌性条斑病菌的标准基因组DNA稀释到20ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，并以ddH2O作为空白对照，按照实施例4中的方法分别进行RPA/Cas12a荧光检测反应、RPA/Cas12a可视化荧光检测和RPA/Cas12a-LFA检测反应，实现灵敏度评价，试验重复3次。同时使用avrRxo1-F/R引物进行PCR实验，比较二者之间的灵敏度差异。
结果如图6和图9中的B图所示，其中，图6中的A图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a荧光检测反应的灵敏度分析结果图，B图是avrRxo1基因的PCR检测反应的灵敏度分析结果图，C图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a可视化荧光检测反应的灵敏度分析结果图；图9的中的B图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a-LFA检测反应的灵敏度分析结果图；图6的A图、B图和C图及图9的B图中的1-9分别代表：20g/μL、10ng/μL、1 ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的稻细菌性条斑病菌的标准基因组DNA稀释液，BC代表空白对照。误差线代表三次测量信号强度的标准误； P<0.0001；/> P<0.001；/> P<0.01；/>P<0.05。
图6和图9的B图可以表明，通过荧光定量PCR仪观察结果，RPA/Cas12a荧光检测反应检测水稻细菌性条斑病菌的下限为10fg/μL，而PCR扩增反应的灵敏度仅为1pg/μL，RPA/Cas12a荧光检测反应比PCR反应的灵敏度高100倍；通过蓝光切胶仪观察结果，RPA/Cas12a可视化荧光检测反应检测水稻细菌性条斑病菌的下限为1fg/μL，比PCR灵敏度高1000倍；RPA/Cas12a-LFA检测水稻细菌性条斑病菌的下限为1pg/μL，与PCR反应的灵敏度一致。
可见，本发明的RPA/Cas12a检测方法的灵敏度明显优于或等于PCR反应。
三、RPA/Cas12a的检测方法的特异性分析
使用同属黄单胞菌属的其它近缘菌株的菌悬液（OD600=0.8）（菌株详细信息见表2），并以这些菌株的菌悬液作为RPA扩增的模板，以ddH2O为空白对照，水稻细菌性条斑病菌的标准基因组DNA（缩写为Xoc）作为实验菌株，按照实施例4中的方法分别进行RPA/Cas12a荧光检测反应、RPA/Cas12a可视化荧光检测和RPA/Cas12a-LFA检测反应，以评价特异性。
结果如图7和图9中的C图所示，其中图7中的A图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a荧光检测反应的特异性分析结果图，B图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a可视化荧光检测反应的特异性分析结果图；图9的中的C图是avrRxo1基因的RPA/Cas12a-LFA检测反应的特异性分析结果图；图7的A图和B图及图9的C图中的BC代表空白对照，Xoo菌株为隔壁实验室分离获得的水稻细菌性白叶枯病菌的标准基因组DNA。
从图7的A图中可以看出，通过荧光定量PCR仪器特异性检测水稻细菌性条斑病菌的菌株时，产生显著的荧光信号，近缘菌株会有微弱信号强度，与空白对照相差较近。从图7的B图中可以看出，通过蓝光切胶仪可视化观察结果时，只有水稻细菌性条斑病菌可以观察到显著的肉眼可见的荧光，近缘菌株和空白对照都不会产生肉眼可见的荧光。从图9的C图中可以看出，通过试纸条观察时，只有水稻细菌性条斑病菌菌株在测试线处没有红色条带，近缘菌株和空白对照在控制线处都有红色条带。因此，本发明的RPA/Cas12a的荧光检测反应和侧流试纸条检测反应具有较强的特异性。
表2 特异性分析中所用的同属黄单胞菌属的近缘菌株一览表
实施例6 田间样品检测
从海南省三亚市周围不同水稻田中采集16份有疑似症状的样品，分别对采集到的叶片进行表面消毒、DNA粗提取后，按照实施例4中的方法分别进行RPA/Cas12a可视化荧光检测以及试纸条分析，并使用avrRxo1-F/R引物进行PCR扩增实验，比较验证。
结果如图8和图9中的D图所示，其中，图8中的A图是16份田间样品的基于avrRxo1基因的PCR扩增反应结果图；B图是16份田间样品基于RPA/Cas12a可视化荧光检测水稻细菌性条斑病的结果图；图9中的D图是16份田间样品基于RPA/Cas12a-LFA检测水稻细菌性条斑病的结果图；图8的A图和B图及图9的D图中的N是以健康叶子的DNA作阴性对照；P是以水稻细菌性条斑病菌的DNA作阳性对照。
从图8的A图中可以看出，5个样品（编号为3、6、7、10和13的样品）表现出了水稻细菌性条斑病菌阳性扩增，其余样品均显示为阴性。从图8的A图和图9的D图中可以看出，RPA/Cas12a荧光检测可视化检测反应和RPA/Cas12a-LFA检测反应，16个样品检测结果与avrRxo1基因PCR检测结果保持完全一致。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas.oryzaepv.oryzicola）的序列组合，其特征在于，包括根据avrRxo1基因设计的RPA引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列；
其中，RPA引物对序列为：
正向引物RPA-avrRxo1-F2的序列如SEQ ID NO：1所示；
反向引物RPA-avrRxo1-R2的序列如SEQ ID NO：2所示；
crRNA序列如SEQ ID NO：3所示；
所述ssDNA探针序列是用于荧光定量PCR检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列、用于可视化荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列或用于侧流层析试纸条检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列；
所述用于荧光定量PCR检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM或ssDNA-reporter-CY5；
其中，ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；
ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
所述用于可视化荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM-2，其序列为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
所述用于侧流层析试纸条检测的水稻细菌性条斑病菌的ssDNA探针序列为FB-reporter，其序列为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
2.一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的RPA引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含Rehydration Buffer、MgOAC、酶干粉、LbCas12a酶和ddH2O；
所述酶干粉用于RPA反应。
4.根据权利要求2或3所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于进行RPA扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系。
5.根据权利要求4所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系包括：正向引物RPA-avrRxo1-F1、反向引物RPA-avrRxo1-R1、Rehydration buffer、ddH2O和模板DNA，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的PCR反应管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入MgOAC；
用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL：
所述体系包括：SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-CY5或者ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；
或者，所述体系包括：SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；
或者，所述体系包括：SF缓冲液、RNA酶抑制剂、FB-reporter、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水。
6.权利要求2-5中任一项所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒在检测田间水稻细菌性条斑病菌中的应用。
7.一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取水稻细菌性条斑病菌疑似样品的基因组DNA；
2）以基因组DNA为模板DNA，利用权利要求2-5中任一项所述的检测试剂盒进行RPA扩增反应，得RPA扩增产物；
3）利用权利要求2-5中任一项所述的检测试剂盒，取RPA扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应进行荧光检测或者侧流层析试纸条检测。
8.根据权利要求7所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法，其特征在于，
步骤1）中，提取水稻细菌性条斑病菌疑似样品的基因组DNA的方法是取水稻细菌性条斑病的疑似样品，剪碎，加入NaOH溶液，捣烂，在室温下静置，使用TE Buffer稀释，即得水稻细菌性条斑病菌疑似样品的基因组DNA；
步骤2）中，用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系包括：正向引物RPA-avrRxo1-F1、反向引物RPA-avrRxo1-R1、Rehydration buffer、ddH2O和模板DNA，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的PCR反应管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入MgOAC，迅速离心到管底，RPA扩增反应条件为：39℃扩增10 min；
步骤3）中，用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL：
所述体系包括：SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-CY5或者ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水，37℃反应1h，利用实时荧光定量PCR仪器检测；
或者，所述体系包括：SF缓冲液、crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水，反应条件为：37℃反应5min，在470 nm蓝光切胶仪观察荧光结果；
或者，所述体系包括：SF缓冲液、RNA酶抑制剂、FB-reporter、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水，37℃反应20min，用DEPC处理水补足至50μL，混匀，利用试纸条进行检测。
9.权利要求7或8所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法在水稻细菌性条斑病菌检测方面的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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