CN109988860B

CN109988860B - 一种用于检测冬生疫霉的引物及探针组合物及其试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN109988860B
Application number: CN201910194831.XA
Authority: CN
Inventors: 戴婷婷; 焦彬彬; 胡涛; 徐月; 廖婷婷; 田雯
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: CN109988860A

Abstract

本发明公开了一种用于检测冬生疫霉的引物及探针组合物及其试剂盒和检测方法，该引物和探针序列为：RPA‑PSYPT‑F：5'‑TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAGG‑3'，RPA‑PSYPT‑R：5’‑[Biotin]TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGGTCACCCCAGA‑3’，SYPT‑P：5’‑[FAM]CTTCTGTGATTTATCCAGAAAATCCGTACGAT‑THE‑GAGCTGGACGGCAAGA[C3‑spacer]‑3’。本发明所使用的引物探针组RPA扩增效果好，条带特异性强，与其他病菌无交叉反应，在检测区的有阳性反应，增加了检测的灵敏性。

Description

一种用于检测冬生疫霉的引物及探针组合物及其试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，基于RPA-侧流层析技术检测冬生疫霉，专用于海关进出境水果所带冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的高灵敏度快速检测，同时可用于林间冬生疫病的早期诊断和病菌的监测。具体涉及一种用于检测冬生疫霉的引物及探针组合物及其试剂盒和检测方法。

背景技术

冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)是我国重要的植物检疫性病原菌，最早在澳大利亚西部的柑橘果实上发现，目前主要分布在以色列、土耳其、南非、法国、英国、西班牙、希腊、意大利、葡萄牙、美国、阿根廷、委内瑞拉、特立尼达和多巴哥、澳大利亚、新西兰、斐济等国家。其近似种丁香疫霉曾在2011年和2012年2次被我国天津口岸截获，同时各口岸也加大了对冬生疫霉的检查力度。

传统的检测冬生疫霉的方法费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于PC R的方法已经成功用于检测冬生疫霉，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h,同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amlification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白- DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR 技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。目前，RPA技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测，但在植物病原卵菌的检测方面，尤其是对于检疫性冬生疫霉的RPA检测，未见相关应用报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于冬生疫霉的RPA-侧流层析检测的引物和探针组合，满足RPA-侧流层析检测的使用需求。本发明的另一目的是提供一种基于上述引物和探针组合的试剂盒。本发明还有一目的是提供一种基于RPA-侧流层析技术的大豆疫霉菌检测方法，以建立冬生疫霉的快速检测新方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于冬生疫霉的RPA-侧流层析检测的引物和探针组合，具体如下：正向引物为RPA-PSYPT-F：5'-TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAGG-3'；反向引物为RPA-PSYPT-R：5’-[Biotin]TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGGTCACC CCAGA-3’；探针为PSYPT-P：5’-[FAM]CTTCTGTGATTTATCCAGAAAATCC GTACGAT-THF -GAGCTGGACGGCAAGA[C3-spacer]-3’。

所述的引物和探针组合在检测冬生疫霉中的应用。

一种检测冬生疫霉的试剂盒，包含由所述的引物和探针组成的引物探针混合液。

所述的试剂盒，所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为 0.42μmol/L，探针的终浓度为0.06μmol/L。

所述的试剂盒，还包括：标准阳性DNA、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条。

所述的试剂盒，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、冬生疫霉RPA相应的引物探针液4.8μL、无菌双蒸水11.2μL、待测样本DNA为阳性对照分别为 2μL或以无菌双蒸水为空白对照2μL、反应驱动液2.5μL。

一种基于RPA-侧流层析技术检测冬生疫霉的方法，步骤如下：

1)提取待测样本DNA；

2)以DNA为模板，进行RPA扩增，其中，RPA扩增的正向引物为RPA-P SYPT-F：5'-TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAGG-3'；反向引物为RP A-PSYPT-R：5’-[Biotin]TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGGTCACCCCAGA-3’；探针为PSYPT-P：5’-[FAM]CTTCTGTGATTTATCCAGAAAATCCGTACGAT-THF -GAGCTGGACGGCAAGA[C3-spacer]-3’；

3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有冬生疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉。

步骤2)中，扩增条件为：38℃金属浴4min后，混匀，再38℃金属浴16mi n。

步骤2)中，RPA扩增反应过程包括：在装有RPA核酸扩增试剂检测干粉的反应单元管中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探针0.6μL，DNA 2.0μL；为了保证反应同时进行，MgAc 2.5 μL应该加在八连管的盖子上，小心翻转盖上，将RPA扩增体系充分混匀，5,00 0×g离心10s，置于38℃金属浴上反应，温育4min后拿出反应管再次混匀，离心3-5s，放入金属浴继续反应16min。

与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。Ypt1基因是一个 Ras相关的基因，其在酵母中编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。Ypt1基因包含有多个内含子，其保守序列和进化区域相互间隔，适合作为疫霉菌分子检测的靶标。为实现上述发明目的，本发明首先针对冬生疫霉的Ypt1基因作为靶标序列，采用Primer Premier 5.0软件设计了一系列的RPA引物，并通过实验对所设计的引物进行优化筛选，获得了一对用于RPA检测冬生疫霉的专用引物和探针。

该引物组和探针可被用于生产实践中发病组织及土壤中冬生疫霉的快速可靠的检测鉴定。当用于发病组织中存在冬生疫霉时，采用NaOH快速裂解法提取冬生疫霉的DNA，具体过程如下：取一段发病的组织样品，每毫克组织加入 10μL 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mM Tris(pH8.0)，混匀后取1μL直接用于RPA反应。每个反应至少重复三次。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)本发明系首次采用RPA-侧流层析技术建立快速检测冬生疫霉的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测，为冬生疫霉的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。本发明选用的YPT1基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与其它病原菌无交叉反应。本发明所使用的引物探针扩增效果良好，条带特异性强，能够在检测区形成较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应，增加检测的灵敏度，本发明所建立检测方法可检测1 00pg的冬生疫霉基因组。

2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测冬生疫霉的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的冬生疫霉快速筛查检测。

3)检测速度快：与常规PCR相比，不必经过变性、退火、延伸三个步骤， RPA反应的最适温度在37℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。

4)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。实现了恒温扩增，不像PCR 法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源RPA 反应就可以发生，极大的扩展了RPA使用的范围，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

5)本发明可以用于带菌植株组织中冬生疫霉的快速检测，只需约2h即可完成检测过程，是一种检测冬生疫霉的有效手段。

6)本发明检测方法用于冬生疫霉的发病前期检测与病害的预测预报，对于确定防治适期、有效防治病害具有十分重要的意义。

附图说明

图1是RPA灵敏性的侧流层析试纸条在不同疫霉种间的特异性检测结果图；图中，1：冬生疫霉(P.hibernalis)；2：丁香疫霉(Phytophthora syringae)；3：寄生疫霉(P.parasitica)；4：致病疫霉(P.infestans)；5：木香疫霉(P.tent aculata)；6：；荔枝疫霉(P.litchii)；7：苎麻疫霉(P.boehmeriae)；8：阴性对照；

图2是RPA灵敏性的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；图中，1：冬生疫霉(P.hibernalis)；2：终极腐霉(Pythium ultimum)；3：木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)；4：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)； 5：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；6：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；7：稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；8：阴性对照；

图3是RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度试验结果图和普通PCR灵敏度试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限制。

实施例1

1、根据冬生疫霉的Ypt1序列(P.hibernalis KJ755160.1)，使用Primer Pre mier5.0设计正向引物和反向引物、以及探针组成RPA引物和探针组合。具体如下：

正向引物为RPA-PSYPT-F：5'-TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAG G-3'；反向引物为RPA-PSYPT-R：5’-[Biotin]TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGG TCACCCCAGA-3’；探针为PSYPT-P：5’-[FAM]CTTCTGTGATTTATCCAGAA AATCCGTACGAT-THF -GAGCTGGACGGCAAGA[C3-spacer]-3’。

2、提取供试病原菌菌株的基因组DNA。具体提取过程如下：

取少量菌丝粉，加900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清液加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清液转移至新管中，加入等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。取上清液转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg mL^-1RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。对于土壤中DNA的提取，首先将每个土样晾干碾碎，然后分别称取0.5g土样作为提取样品，采用

SPIN试剂盒(Q-Biogene Ltd,USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取的具体步骤参见试剂盒说明书。

3、以提取的DNA为模板，采用设计的RPA引物，在下述反应体系中进行RPA反应：

样品检测：向装有检测干粉的反应单元管中加入Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探针0.6μL，DNA 2.0μL；MgAc 2.5μL加在反应单元管盖子上，小心翻转盖上，将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g 离心10s，置于38℃金属浴上反应，温育4min后拿出反应管再次混匀，离心3- 5s，放入金属浴继续反应16min。

阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μL模板DNA改为加入2.0μL灭菌 ddH₂O。

RPA反应结束后，应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有冬生疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉。

实施例2

为了验证RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性，以2株冬生疫霉菌株和 14种其它卵菌以及17种病原真菌为供试材料(表1)，RPA侧流层析试纸条检测方法的结果显示2株冬生疫霉的试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，其余14种卵菌以及17种病原真菌的试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉。选择与冬生疫霉不同种(丁香疫霉；寄生疫霉；致病疫霉；木香疫霉；荔枝疫霉；苎麻疫霉等)和不同属的菌(平头炭疽菌；茄镰刀菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮枝菌；终极腐霉)的DNA作为模板，进行RPA侧流层析试纸条检测。

表1用于检测冬生疫霉特异性的真菌和卵菌菌株

检测结果如图1和图2所示。图1是RPA灵敏性的侧流层析试纸条在不同疫霉种间的特异性检测结果，图中，1：冬生疫霉(P.hibernalis)；2：丁香疫霉 (Phytophthorasyringae)；3：寄生疫霉(P.parasitica)；4：致病疫霉(P.inf estans)；5：木香疫霉(P.tentaculata)；6：；荔枝疫霉(P.litchii)；7：苎麻疫霉(P.boehmeriae)；8：阴性对照；试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有冬生疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉。图中显示第1条显2条带，呈阳性；其余1条带，呈阴性。

图2是RPA灵敏性的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果，图中，1：冬生疫霉(P.hibernalis)；2：终极腐霉(Pythium ultimum)；3：木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)；4：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；5：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；6：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；7：稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；8：阴性对照；试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有冬生疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉。图中显示第9条显2条带，呈阳性；其余1条带，呈阴性。

可见，以实施例1设计的引物进行RPA扩增反应后，侧流层析试纸条结果显示2条棕色条带(图1，图2)，目标条带清析，能有效检测出冬生疫霉。而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。

实施例3

使用Nanodro 2000微量分光光度计测定出实施例3提取DNA的浓度为10 0ngμL^-1。

将其依次稀释为100pgμL^-1、10pgμL^-1、1pgμL^-1和100fgμL^-1，根据上述实施例采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行RPA和PC R检测。

实验结果如图3所示，25μL的反应体系中分别含有100ngμL^-1、10ngμL^-1、 1ngμL^-1、100pgμL^-1冬生疫霉DNA的试纸条出现两条棕色条带，呈阳性反应， 25μL的反应体系中分别含有10pgμL^-1、1pgμL^-1、100fgμL^-1冬生疫霉DNA的纸条出现一条棕色条带，呈阴性反应。显色结果表明RPA等温扩增反应的灵敏度达到100pgμL^-1。用同样浓度的冬生疫霉菌的标准菌株的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增反应，比较两种方法的灵敏度。重复实验3次，以确定 PCR法检测冬生疫霉菌基因组DNA的灵敏度。3次重复实验的结果一致。在基因组DNA浓度为1ngμL^-1时，PCR检测能够检测出特异性条带，证明发生特异性扩增，检测结果判为阳性。而在基因组DNA浓度为100pgμL^-1时，PCR产物经检测没有发现特异性条带，证明没有发生特异性扩增，检测结果判为阴性，即 PCR法检测冬生疫霉菌基因组DNA的灵敏度为1ngμL^-1。由此可见，RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度要比PCR方法高出10倍。

结果表明RPA检测浓度为10pgμL^-1，而PCR检测浓度为1ngμL^-1时仍能看到目标条带，说明RPA检测的灵敏度高于PCR。但PCR检测过程需要2.5h，而RPA检测时间仅需30min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种用于检测冬生疫霉的引物及探针组合物及其试剂盒和检测方法

<130> 201903

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

ttccaccctt ccaccagact gctgaggagg 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Biotin修饰

<400> 2

tgttagctgc gtgttcgttg gtcaccccag a 31

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> FAM修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> THF 修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> C3-spacer修饰

<400> 3

cttctgtgat ttatccagaa aatccgtacg atgagctgga cggcaaga 48

Claims

1.一种用于冬生疫霉的RPA-侧流层析检测的引物和探针组合，其特征在于，具体如下：正向引物为RPA-PSYPT-F：5'-TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAGG-3'；反向引物为RPA-PSYPT-R：5’-Biotin- TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGGTCACCCCAGA-3’；探针为PSYPT-P：5’-FAM-CTTCTGTGATTTATCCAGAAAATCCGTACGAT-THF -GAGCTGGACGGCAAGA- C3-spacer-3’。

2.权利要求1所述的引物和探针组合在检测冬生疫霉中的应用。

3.一种检测冬生疫霉的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含由权利要求1所述的引物和探针组成的引物探针混合液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为0.42μmol/L，探针的终浓度为0.06μmol/L。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：标准阳性DNA、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条。

6.一种基于RPA-侧流层析技术检测冬生疫霉的方法，其特征在于，步骤如下：

1)提取待测样本DNA；

2)以DNA为模板，进行RPA扩增，其中，RPA扩增的正向引物为RPA-PSYPT-F：5'-TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAGG-3'；反向引物为RPA-PSYPT-R：5’-Biotin-TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGGTCACCCCAGA-3’；探针为PSYPT-P：5’-FAM- CTTCTGTGATTTATCCAGAAAATCCGTACGAT-THF -GAGCTGGACGGCAAGA- C3-spacer-3’；

7.根据权利要求6所述的基于RPA-侧流层析技术检测冬生疫霉的方法，其特征在于，步骤2)中，扩增条件为：38℃金属浴4min后，混匀，再38℃金属浴16min。

8.根据权利要求7所述的基于RPA-侧流层析技术检测冬生疫霉的方法，其特征在于，步骤2)中，RPA扩增反应过程包括：在装有RPA核酸扩增试剂检测干粉的反应单元管中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探针0.6μL，DNA 2.0μL；为了保证反应同时进行，MgAc 2.5μL加在反应单元管的盖子上，小心翻转盖上，将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于38℃金属浴上反应，温育4min后拿出反应管再次混匀，离心3-5s，放入金属浴继续反应16min。