CN110669140A - 疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白及其构建与应用 - Google Patents

疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白及其构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种疏水蛋白‑荧光蛋白融合蛋白及其构建与应用，其构建为：(1)化学合成改良过的疏水蛋白mHGFI、荧光蛋白smURFP及HO‑1的核苷酸序列；(2)将荧光蛋白基因smURFP的核苷酸序列与HO‑1的核苷酸序列连接；再将疏水蛋白基因mHGFI的核苷酸序列和荧光蛋白基因smURFP与HO‑1基因的核苷酸序列连接得到融合序列；(3)将融合序列连接到大肠杆菌表达载体上，得到重组表达载体；(4)将重组表达载体转入宿主大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；(5)破菌后，通过Ni亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层蛋白纯化方法得到疏水蛋白‑荧光蛋白融合蛋白。本发明对从大肠杆菌中纯化出的融合蛋白进行凝血酶检测，与其他检测方法相比具有生产成本低、生产效率高、操作简便、反应迅速、检测特异性与灵敏度高的优势。

Description

疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白及其构建与应用
技术领域
本发明涉及酶的基因工程领域，尤其涉及一种应用于凝血酶检测的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的构建与应用。
背景技术
凝血酶是一种参与凝血、止血等多种生理病理活动的重要蛋白酶，当生物凝血和抗凝血功能因机体损伤或疾病而导致不平衡时，生物体内的凝血酶活性会发生变化。因此，进行凝血酶含量的定量检测对于在临床医学和疾病诊断中对生物体凝血能力的评估具有重要意义[1]。
目前凝血酶检测的方法有荧光法、比色法、阻抗法、极谱法等，但检测灵敏度较差，普遍在nM水平。2017年，Alessandra Piscitelli等人发明了一种基于荧光蛋白的凝血酶检测方法，其检测限可达2.3aM，是目前已知的最低凝血酶检测限。然而该检测方法仍然存在制备复杂，成本高昂，血清中检测特异性相对较差的缺点[2]。
参考文献：
[1]Liu,Y.,et al.,Detection of Thrombin Based on Fluorescence EnergyTransferbetween Semiconducting Polymer Dots and BHQ-Labelled Aptamers.Sensors(Basel),2018.18(2).
[2]Piscitelli,A.,et al.,Rapid and ultrasensitive detection of activethrombinbased on the Vmh2hydrophobin fused to a Green FluorescentProtein.BiosensBioelectron,2017.87:p.816-822.
发明内容
本发明的目的是在降低成本、提高生产效率的同时，提高凝血酶检测特异性和灵敏度，扩大其应用范围，实现应用的普遍性，提供一种可应用于凝血酶检测的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的实际应用方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的构建，包括如下步骤：
(1)化学合成SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的改良过的疏水蛋白mHGFI、荧光蛋白smURFP及HO-1的核苷酸序列；
(2)利用OverlapPCR，以RBS序列为linker 1将荧光蛋白基因smURFP的核苷酸序列与HO-1的核苷酸序列连接；再以凝血酶酶切位点为linker 2将疏水蛋白基因mHGFI的核苷酸序列和荧光蛋白基因smURFP与HO-1基因的核苷酸序列连接得到融合序列；
(3)将融合序列连接到大肠杆菌表达载体上，得到重组表达载体；
(4)将重组表达载体转入宿主大肠杆菌中，得到表达应用于凝血酶检测的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的重组大肠杆菌；
(5)破菌后，通过Ni亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层一系列蛋白纯化方法得到应用于凝血酶检测的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白。
所述的linker 1为SEQ ID No.4所述的RBS序列，linker 2为SEQ ID No.5所述的凝血酶酶切位点。
所述大肠杆菌表达载体为pET28a。
上述构建方法构建的应用于凝血酶检测的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白。
上述疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白在凝血酶检测中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过overlapPCR的方法构建以凝血酶酶切位点为linker 2的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白，此融合蛋白为多功能蛋白——疏水蛋白的自组装性质可将融合蛋白在疏水界面进行固定，且选择的疏水蛋白mHGFI为可在原核表达的传统疏水蛋白突变体，该性质大大提高了融合蛋白的生产效率并降低了生产成本；荧光蛋白作为指示标签，可用来检测融合蛋白的固定效果，在向固定的融合蛋白加入不同浓度的凝血酶并经多次洗涤后，通过检测荧光强度的变化绘制的凝血酶检测的标准曲线，可以实现凝血酶的有效定量检测，由于选择的荧光蛋白为远红外荧光蛋白，与传统荧光蛋白相比，该荧光蛋白不受血清内自发荧光物质的干扰，进一步提高了凝血酶检测的特异性和灵敏度,检测限可达0.2aM。
附图说明
图1为融合蛋白SDS-PAGE结果；
图2为融合蛋白接触角测定结果；
图3为融合蛋白在紫外光下荧光结果；
图4为凝血酶在血清中检测的标准曲线。
具体实施方式
本发明所涉及的荧光蛋白基因序列来自Genbank pET28a市售。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1：疏水蛋白mHGFI-荧光蛋白smURFP融合蛋白的构建
重组质粒构建：
化学合成SEQ ID No.2所示的荧光蛋白smURFP的核苷酸序列；
根据SEQ ID No.2、SEQ ID No.4序列设计上游引物smURFP-F1和下游引物smURFP-R；
smURFP-F1：5’-3’CGGGATCCATGGCGAAAACCAGCGAA
smURFP-R：5’-3’CTCCTTCTTTCAATGGTGATGGTGATGATGGAATTCTTAGCTCATCGCCTTGATG
化学合成SEQ ID No.3所示的HO-1的核苷酸序列；
根据SEQ ID No.3、SEQ ID No.4序列设计上游引物HO-1-F和下游引物HO-1-R；
HO-1-F：5’-3’CATCACCATTGAAAGAAGGAGATATACATACCCATGAGTGTCAACTTAGCTTCC
HO-1-R：5’-3’CCGCTCGAGTTAGCCTTCGGAGGTGGC
以人工合成的smURFP基因和HO-1基因为模板，smURFP-F1/smURFP-R及HO-1-F/HO-1-R为引物进行PCR扩增获得目的基因smURFP和HO-1。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；34个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
利用OverlapPCR，将smURFP的核苷酸序列与HO-1的核苷酸序列连接,加入等质量的smURFP和HO-1的PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min30s；12个循环后72℃保温10min。
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，smURFP-F1及HO-1-R为引物扩增目的基因smURFP-HO-1。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸2min30s；22个循环后72℃；保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
化学合成SEQ ID No.1所示的疏水蛋白mHGFI的核苷酸序列；
根据SEQ ID No.1、SEQ ID No.5序列设计上游引物mHGFI-F和下游引物mHGFI-R；
mHGFI-F：5’-3’CGGGATCCCAGCAGTCTACCACCGGTCAG
mHGFI-R：5’-3’TCGCCATGCTGCCACGCGGCACCAGAACGTTAACCGGAACAGAACCGAT
根据SEQ ID No.2、SEQ ID No.5序列设计上游引物smURFP-F2；
smURFP-F2：5’-3’TAACGTTCTGGTGCCGCGTGGCAGCATGGCGAAAACCAGCGAACAG
以人工合成的mHGFI基因和回收的smURFP-HO-1基因为模板,mHGFI-F/mHGFI-R及smURFP-F2/HO-1-R为引物进行PCR扩增获得目的基因mHGFI和smURFP-HO-1。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min30s；34个循环后72℃保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
利用OverlapPCR，将mHGFI的核苷酸序列和smURFP-HO-1基因的核苷酸序列连接得到融合序列，加入等质量的mHGFI和smURFP-HO-1的PCR产物，反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；12个循环后72℃保温10min。
第三轮PCR以第二轮overlap产物为模板，mHGFI-F及HO-1-R为引物扩增目的基因mHGFI-smURFP-HO-1。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸3min；22个循环后72℃；保温10min。将PCR产物跑胶验证，回收目的条带。
PCR纯化产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET28a连接构建质粒，4℃过夜。取10μL连接产物转化到100μl EscherichiacoliDH5α感受态细胞中，涂布于含卡那的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取几株单菌落，接种于5ml含有100μg/mL卡那抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h。取600μL菌液加入400μL甘油混匀冻存，并用剩余菌液提取质粒送金唯智公司测序，从而获得重组质粒。
蛋白纯化：
将测序正确的重组质粒转化到100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含卡那抗性的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取大而圆的菌落接种至5mL含卡那的LB培养基小试管中，此过程在超净工作台中操作，然后放置恒温培养箱37℃、220rpm过夜培养。
将培养混浊的菌液转移至超净工作台中操作，吸取600μL菌液到400μL 50％的甘油中制成甘油菌，-20℃保存甘油菌。再吸取200μL菌液到干净的1.5mL离心管中，用于制成诱导前样。最后往菌液中加入20μLIPTG，37℃、220rpm诱导4h，诱导结束后，吸取200μL菌液到干净的1.5mL离心管中，用于制成诱导后样。诱导前后样的处理方法：吸取的200μL诱导前和诱导后的样放入离心机中，12,000rpm离心5min，弃上清，然后向沉淀中加入50μL ddH2O，用枪反复吹吸至菌体重悬，使其混合均匀，吸取20μL重悬的菌液到另一个干净的1.5mL离心管中，加入6×SDS-PAGE上样缓冲液，混合均匀，100℃金属浴10min，12,000rpm离心5min后取上清制成诱导前和诱导后的样。
各吸取5μL制备好的蛋白质诱导前和诱导后的样进行13％的聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，观察蛋白质诱导前后的变化。
根据试表达中聚丙烯酰氨凝胶电泳的结果，选取试表达蛋白量较高的甘油菌接种5μL到含有卡那的5mL LB培养基小试管中，37℃、220rpm过夜培养。待菌液混浊后，将菌液转移到含有卡那抗性的1L LB培养基大瓶中，37℃、220rpm培养，大约5-6h后，菌液OD值达到0.4-0.6时，将培养温度调至16℃，大约30-60min，菌液温度降至16℃，向菌液中加入500μL1M IPTG，此时，IPTG诱导蛋白质表达的终浓度为0.5mM，继续16℃、220rpm培养16-18h。
将诱导结束后的菌液倒入收菌瓶中配平，4000rpm离心20min，倒掉上清，每瓶加入约15mL的50mM Tris、300mM NaCl悬菌缓冲液，置于摇床上重悬菌体。将重悬好的菌体转移到50mL离心管中，利用低温超高压连续流细胞破碎机破菌3-4次，保证菌体破碎彻底，破碎后的菌液倒入高速离心管中配平，18000rpm，4℃离心30min，舍弃沉淀，收集破菌后的上清。在4℃冷库中，将破菌后收集到的上清倒入50mL离心管中，同时取大约2mL经过预处理的Ni介质到上清中，将含有破菌上清和Ni介质的离心管置于4℃垂直混合仪上轻摇混合30min。然后将离心管中的破菌上清和Ni介质倒入Ni柱子内，待菌液完全流出后，用20mM，30mM，100mM，200mM，300mM，1M咪唑缓冲液各15mL进行梯度洗脱，每个梯度下的洗脱缓冲液均与介质结合2-3min，洗脱液分开收集，每个梯度下均取20μL样品于1.5mL离心管中，每个梯度洗完后，用下一个梯度的缓冲液7.5mL悬匀介质后取10μL介质于1.5mL离心管中加入10μL灭菌双蒸水，取的每个样品均加入4μL蛋白上样缓冲液，100℃金属浴5min，然后12,000rpm离心5min，取上清进行SDS-PAGE电泳来检测。
根据上一步进行的蛋白胶凝胶电泳结果，选取目的蛋白洗脱液，此时大约获得30mL目的蛋白洗脱液，是在200mM咪唑缓冲液条件下洗脱下来。将获得的洗脱液转移至10KD的浓缩管中，配平后，3400rpm，4℃浓缩至5mL，将5mL的目的蛋白洗脱液转移至几个1.5mL的离心管中，4℃，12,000rpm离心10min后用于使用AKTA FPLC***进行阳离子交换层析，首先使用预先用0.22μm滤膜抽滤过的分子筛缓冲液(TrisA、B缓冲液)平衡阳离子交换柱，将离心好的目的蛋白溶液上样至Q柱内,不断地用盐浓度线性上升的A,B缓冲液以2mL/min的速度冲洗Q柱。并用Fraction 900溶液收集器每管1.5mL收集蛋白。对于收集到的目的蛋白样品，每管吸取20μL到新的1.5mL离心管中，加入5μL蛋白上样缓冲液，100℃金属浴10min，然后12,000rpm离心2min，取上清进行SDS-PAGE电泳来检测蛋白。然后根据电泳结果收集目的蛋白。
阳离子交换层析后，将收集样转移至10KD的浓缩管中，配平后，3400rpm，4℃浓缩至500μL再选择使用AKTA FPLC***和分子筛superdex200 10/300进行凝胶过滤层析。首先使用预先用0.22μm滤膜抽滤过的分子筛缓冲液(TrisA、B缓冲液)平衡superdex200 10/300约36mL，此时紫外检测值和电导检测值不变。将离心好的目的蛋白溶液上样至分子筛柱子内，观察记录280nm的紫外吸收曲线。在这个过程中，不断地用分子筛缓冲液以0.5mL/min的速度冲洗分子筛，并用Fraction 900溶液收集器每管0.5mL收集蛋白。对于收集到的目的蛋白样品，每管吸取20μL到新的1.5mL离心管中，加入5μL蛋白上样缓冲液，100℃金属浴10min，然后12,000rpm离心2min，取上清进行SDS-PAGE电泳来检测蛋白纯度，图1中可以看到蛋白胶上有清晰的单一条带出现在预期的蛋白大小的位置上，此结果说明纯化得到了高纯度的目的蛋白。接下来根据电泳结果收集纯度较高、分子量大小均一的目的蛋白。将收集样转移至10KD的浓缩管中，配平后，3400rpm，4℃浓缩，液氮冻存后，于-80℃保存。
接触角测定：
为验证融合蛋白在硅化玻璃、云母片表面的自组装成膜性质，通过测量玻璃、云母表面接触角改变的情况，判断融合蛋白成膜的性质。
配置0.2mg/mL的融合蛋白溶液，取300μL滴在数块硅化玻璃的表面，室温静置过夜后，用移液器移去蛋白溶液，用氮气将硅化玻璃表面的剩余液体吹干。
配置0.2mg/mL的融合蛋白溶液，取300μL滴在云母片的表面，室温静置过夜后，用移液器移去蛋白溶液，用氮气将云母片表面的剩余液体吹干。
接触角的测量采用KSV Cam200角度检测器，将5μL的超纯水迅速滴在测量玻璃的表面，并同时进行照相；前10张照片，每张间隔66ms，以后的照片每张间隔1sec，共拍照1min；将照片中水滴与玻璃片接触的两点做直线作为基线，通过KSV Contact AngleMeasurementSystem测量接触角。分别测量硅化玻璃、云母片的接触角；融合蛋白处理后的硅化玻璃的接触角；融合蛋白处理后的云母片的接触角。
图2展示了融合蛋白在硅化玻璃及云母片上的自组装。可以看到未经修饰的硅化玻璃和云母片分别保持着本身的特性，当超纯水被滴到其表面时，硅化玻璃展示出了很强的疏水性质，而云母片表现出了很强的亲水性质。在经融合蛋白修饰后，硅化玻璃及云母片的亲疏水性发生明显改变，硅化玻璃的接触角由103°变为了20°，而云母片的接触角由2°增加到23°，这表明融合蛋白仍然保持了良好的疏水蛋白能力，可以很好的通过疏水补丁在界面上进行修饰从而改变界面的亲疏水性。
荧光测定：
配置0.4mg/mL的融合蛋白溶液1mL于1.5mL EP管，并于紫外光下观测，如图3所示，紫外光下，融合蛋白发出明显荧光。
实施例2在凝血酶检测的应用：
用pH＝5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液分别配置浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/mL的融合蛋白溶液，取96孔板，每个孔分别加入200μL不同浓度的融合蛋白溶液，45个孔为一组，4℃过夜孵育后用相同pH的缓冲溶液洗涤两次后以酶标仪检测荧光强度，再向各孔中分别加入浓度为1.2、1.2×101、1.2×102、1.2×103、1.2×104、1.2×105、1.2×106、1.2×107、1.2×108、1.2×109、1.2×1010、1.2×1011、1.2×1012、1.2×1013、1.2×1014aM且含有20％血清的凝血酶溶液，3个孔为一组，37℃切割15min后，用pH＝5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤两次后以酶标仪检测荧光强度，并根据凝血酶切割前后荧光强度的差值绘制凝血酶检测标准曲线，在融合蛋白溶液浓度为0.4mg/mL处得到符合线性关系的凝血酶检测标准曲线，如图4所示。
用pH＝5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配置浓度为0.4mg/mL的融合蛋白溶液，取96孔板，每个孔分别加入200μL融合蛋白溶液，3个孔为一组，4℃过夜孵育后用相同pH的缓冲溶液洗涤两次后以酶标仪检测荧光强度，再向各孔中加入待检测液，3个孔为一组，37℃切割15min后，用pH＝5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤两次后以酶标仪检测荧光强度，并根据凝血酶切割前后荧光强度的差值对照标准检测曲线实现凝血酶的定量检测。
表1.基因以及其核苷酸序列
Figure BDA0002210014790000071
Figure BDA0002210014790000081
序列表
<110> 天津大学
<120> 疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白及其构建与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cagcagtcta ccaccggtca gctgcagtct tctgaatcta cctctaccgc taacgacccg 60
gctacctctg aactgctggg tctgatcggt gttgttatct ctgacgttga cgctctggtt 120
ggtctgacct cttctccgat ctctgttatc ggtgttggtt ctggttctgc ttctaccgct 180
aacccggttt cttctgactc ttctccgatc ggtggtctgg tttctatcgg ttctgttccg 240
gttaacgtt 249
<210> 2
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggcgaaaa ccagcgaaca gcgcgtgaac attgcaaccc tgctgaccga aaacaaaaag 60
aagatcgtgg ataaagcgag ccaggattta tggcgccgcc atccggattt aattgcgcct 120
ggcggcattg catttagcca gcgtgatcgt gcgctgtgct tacgcgatta tggctggttt 180
ctgcatctga ttaccttttg cctgctggcg ggtgataaag gcccgattga aagcattggc 240
ctgattagca ttcgcgaaat gtataacagc ctgggcgttc ctgttcctgc gatgatggaa 300
agcattcgct gcctgaaaga agcgagcctg agcctgctgg atgaagaaga tgcgaacgaa 360
accgcgccgt actttgatta tatcatcaag gcgatgagct aa 402
<210> 3
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgagtgtca acttagcttc ccagttgcgg gaagggacga aaaaatccca ctccatggcg 60
gagaacgtcg gctttgtcaa atgcttcctc aagggcgttg tcgagaaaaa ttcctaccgt 120
aagctggttg gcaatctcta ctttgtctac agtgccatgg aagaggaaat ggcaaaattt 180
aaggaccatc ccatcctcag ccacatttac ttccccgaac tcaaccgcaa acaaagccta 240
gagcaagacc tgcaattcta ttacggctcc aactggcggc aagaagtgaa aatttctgcc 300
gctggccaag cctatgtgga ccgagtccgg caagtggccg ctacggcccc tgaattgttg 360
gtggcccatt cctacacccg ttacctgggg gatctttccg gcggtcaaat tctcaagaaa 420
attgcccaaa atgccatgaa tctccacgat ggtggcacag ctttctatga atttgccgac 480
attgatgacg aaaaggcttt taaaaatacc taccgtcaag ctatgaatga tctgcccatt 540
gaccaagcca ccgccgaacg gattgtggat gaagccaatg acgcctttgc catgaacatg 600
aaaatgttca acgaacttga aggcaacctg atcaaggcga tcggcattat ggtgttcaac 660
agcctcaccc gtcgccgcag tcaaggcagc accgaagttg gcctcgccac ctccgaaggc 720
taa 723
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gaattccatc atcaccatca ccattgaaag aaggagatat acataccc 48
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ctggtgccgc gtggcagc 18
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cgggatccat ggcgaaaacc agcgaa 26
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ctccttcttt caatggtgat ggtgatgatg gaattcttag ctcatcgcct tgatg 55
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
catcaccatt gaaagaagga gatatacata cccatgagtg tcaacttagc ttcc 54
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ccgctcgagt tagccttcgg aggtggc 27
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
cgggatccca gcagtctacc accggtcag 29
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
tcgccatgct gccacgcggc accagaacgt taaccggaac agaaccgat 49
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
taacgttctg gtgccgcgtg gcagcatggc gaaaaccagc gaacag 46

Claims (5)

1.一种疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)化学合成SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的改良过的疏水蛋白mHGFI、荧光蛋白smURFP及HO-1的核苷酸序列；
(2)利用OverlapPCR，以RBS序列为linker 1将荧光蛋白基因smURFP的核苷酸序列与HO-1的核苷酸序列连接；再以凝血酶酶切位点为linker 2将疏水蛋白基因mHGFI的核苷酸序列和荧光蛋白基因smURFP与HO-1基因的核苷酸序列连接得到融合序列；
(3)将融合序列连接到大肠杆菌表达载体上，得到重组表达载体；
(4)将重组表达载体转入宿主大肠杆菌中，得到表达疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的重组大肠杆菌；
(5)破菌后，通过Ni亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层一系列蛋白纯化方法得到应用于凝血酶检测的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的构建方法，其特征是所述linker1为SEQ ID No.4所述的RBS序列，linker 2为SEQ ID No.5所述的凝血酶酶切位点。
3.根据权利要求1所述的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白的构建方法，其特征是所述大肠杆菌表达载体为pET28a。
4.权利要求1-3构建的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白。
5.权利要求4的疏水蛋白-荧光蛋白融合蛋白在凝血酶检测的用途。
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